JP2003299489A

JP2003299489A - 核酸構築物

Info

Publication number: JP2003299489A
Application number: JP2003030680A
Authority: JP
Inventors: Naoto Nemoto; 直人根本; Toru Sasaki; 亨佐々木; Yoshikazu Shiratori; 美和白鳥
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 2002-02-08
Filing date: 2003-02-07
Publication date: 2003-10-21

Abstract

(57)【要約】【課題】煩雑な操作をすることなくin vitro virus g
enomeにタグを付けｍＲＮＡ側でin vitro virus virion
の精製に有用で、かつmRNAを支持体に固定化してプロテ
インチップ作成する際においても有用な技術を提供する
こと。【解決手段】一本鎖ＲＮＡの３'末端側の配列とアニ
ーリングすることができる一本鎖ＤＮＡ配列を３'末端
側に含み、該一本鎖ＤＮＡ配列が、その３'末端に、該
一本鎖ＲＮＡの逆転写のためのプライマー配列を有し、
かつ核酸誘導体を末端に有するスペーサー配列が枝分か
れした状態で結合しており、該一本鎖ＤＮＡ配列の５'
末端側に親和性物質が結合している、一本鎖ＲＮＡとそ
れがコードするタンパク質との複合体を作製するための
核酸構築物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、核酸とタンパク質
との複合体の作製のために使用する核酸構築物に関す
る。より詳細には、本発明は、標的ｍＲＮＡと結合させ
た後に翻訳することにより、該標的ｍＲＮＡとそれがコ
ードするタンパク質との複合体を作製させることができ
る核酸構築物に関する。本発明はさらに、該核酸構築物
を用いて作製された、ＲＮＡ−ＤＮＡ結合体、並びに核
酸とタンパク質との複合体にも関する。

【０００２】

【従来の技術】１９９０年に開発されたファージディス
プレイ法（例えば、非特許文献１参照）は、様々なタン
パク質を大腸菌ファージ表面に提示して特定のターゲッ
ト分子に特異的に結合するタンパク質を迅速に見い出す
ことができる進化分子工学的手法の一つである。ファー
ジディスプレイ法の実用化により、この手法を利用して
様々な応用が始まった。また、大腸菌等の細胞表面の膜
タンパク質を利用してこのようなランダムな配列のペプ
チドを提示し、機能ペプチドを取得する方法も開発され
た（例えば、非特許文献２参照）。これらの方法はいず
れも機能ペプチドを取得する有効な方法であるが、生細
胞を用いるため、提示するペプチド配列に片寄りが生じ
るなどの問題点も有している。

【０００３】一方、１９９７年に開発されたin vitro v
irus法は、無細胞翻訳系中においてｍＲＮＡとそれによ
りコードされたタンパク質をｍＲＮＡの３’末端側にピ
ューロマイシン付スペーサを介して連結させる方法であ
る（例えば、非特許文献３および４参照）。このように
して作成されたｍＲＮＡとタンパク質との複合体（以
下、これを単に「ＲＮＡ−タンパク質複合体」と称する
ことがある）では、無細胞翻訳系でタンパク質を発現さ
せるために、生細胞を用いた場合に問題となる配列の片
寄りが生じにくく、また、１回でスクリーニングするラ
イブラリーサイズが大きいという利点を有する。しかし
ながら、下記するような幾つかの問題点も有している。

【０００４】ファージディスプレイ法又は大腸菌の表面
にペプチド等を提示する方法の場合には、培地中からの
タンパク質又はペプチドの精製が容易であるが、無細胞
翻訳系は細胞を破砕した中からの抽出物であるため、Ｒ
ＮＡ分解酵素やＤＮＡ分解酵素等のような夾雑物の含有
量が極めて多い。また、in vitro virus法で作製される
in vitro virus virionは、核酸とタンパク質が結合し
た形態であるが、このうちの核酸部分は遺伝子情報をコ
ードしているため分解されることで大きなダメージを受
ける。従って、in vitro virus法では、in vitro virus
virion（核酸とタンパク質の複合体）を無細胞翻訳系
から迅速に分離することが重要な課題である。また、in
vitro virus virionのｍＲＮＡはなるべく早くＤＮＡ
に転化して分解されにくくすることが望ましい。しか
し、無細胞翻訳系の中での逆転写は困難であるため、無
細胞翻訳系からin vitro virus virionを迅速に分離す
ることが望ましい。

【０００５】従来のin vitro virus virionの精製技術
としては大きく２つに分けることができる。一つは、po
ly Aを含むpuromycinスペーサを利用してoligo dTで精
製する方法（例えば、非特許文献５参照）であり（図１
の（１）を参照）、もう一つは、遺伝子の両端にFLAGと
His×６タグを連結させておき翻訳後、FLAG抗体及びNi-
NTAカラムで精製するやり方である（例えば、非特許文
献６参照）（図１の（２）を参照）。これらのスペーサ
によって精製は可能であるが、in vitro virusvirionを
安定化するために逆転写することが難しい。

【０００６】そこで、逆転写可能なT型のpuromycinスペ
ーサが提案された（例えば、非特許文献７参照）（図１
の（３）を参照）。このようなT型のpuromycinスペーサ
を用いることにより、逆転写が可能になりin vitro vir
us virionをＤＮＡ化して安定化することができる。し
かし、この場合、精製に際し、図１の（１）の場合のよ
うにスペーサを用いて精製することができない。また、
図１の（２）の場合のようにタンパク質側で精製するこ
とは可能であるが、ｍＲＮＡにアフィニティータグをコ
ードさせることが必要になる。

【０００７】

【非特許文献１】Scott JK &Smith GP, (1990) Scienc
e, 249; 386-390

【非特許文献２】Lu, Z. et al. (1995) Bio/Technolog
y 13: 366-372

【非特許文献３】Nemoto, N. et al. (1997) FEBS Let
t. 414, 405-408

【非特許文献４】Roberts, R. W. et al (1997) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 94, 12297-12302

【非特許文献５】RW Roberts & JW Szostack (1997) Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 12297-12302

【非特許文献６】AD Keefe & JW Szostak, (2001) Natu
re, 410, 715-718

【非特許文献７】I Tabuchi, et al. (2001) FEBS let
t. 508(3); 309-312

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記した従
来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とし
た。即ち、本発明は、煩雑な操作をすることなくin vit
ro virus genomeに親和性物質を付け、in vitro virus
virionの精製に有用で、かつ支持体に固定化してプロテ
インチップを作成する際においても有用な技術を提供す
ることを解決すべき課題とした。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために鋭意検討した結果、一本鎖ＲＮＡの３’
末端側の配列とアニーリングすることができる一本鎖Ｄ
ＮＡ配列が、その３’末端に、該一本鎖ＲＮＡの逆転写
のためのプライマー配列を有し、かつ核酸誘導体を末端
に有するスペーサー配列が枝分かれした状態で結合した
Ｔ字型の構造を有する核酸構築物（以下、T-スペーサー
とも称する）において、５’末端側に親和性物質と制限
酵素認識部位を導入したT-スペーサーを用いることによ
り、親和性物質が付加した一本鎖ＲＮＡとそれがコード
するタンパク質との複合体を簡単に作製でき、かつ該親
和性物質を利用して簡単に精製できることを見出し、本
発明を完成するに至った。

【００１０】即ち、本発明によれば、一本鎖ＲＮＡの
３’末端側の配列とアニーリングすることができる一本
鎖ＤＮＡ配列を３’末端側に含み、該一本鎖ＤＮＡ配列
が、その３’末端に、該一本鎖ＲＮＡの逆転写のための
プライマー配列を有し、かつ核酸誘導体を末端に有する
スペーサー配列が枝分かれした状態で結合しており、該
一本鎖ＤＮＡ配列の５’末端側に親和性物質が結合して
いる、一本鎖ＲＮＡとそれがコードするタンパク質との
複合体を作製するための核酸構築物が提供される。好ま
しくは、該一本鎖ＤＮＡ配列の５’末端側に制限酵素認
識部位が存在する。

【００１１】本発明の第一の好ましい態様によれば、一
本鎖ＲＮＡの３’末端側の配列とアニーリングすること
ができる一本鎖ＤＮＡ配列を３’末端側に含む、一本鎖
ＲＮＡとそれがコードするタンパク質との複合体を作製
するための核酸構築物において、（１）該一本鎖ＤＮＡ
配列が、その３’末端に、該一本鎖ＲＮＡの逆転写のた
めのプライマー配列を有し、かつ核酸誘導体を末端に有
するスペーサー配列が枝分かれした状態で結合してお
り、（２）該核酸構築物において該一本鎖ＲＮＡとアニ
ーリングしない５’末端側は、ループ領域を介して互い
に相補的な二本鎖配列を形成しており、（３）該ループ
領域に親和性物質が結合している、ことを特徴とする上
記の核酸構築物が提供される。

【００１２】本発明の第二の好ましい態様によれば、一
本鎖ＲＮＡの３’末端側の配列とアニーリングすること
ができる一本鎖ＤＮＡ配列を３’末端側に含む、一本鎖
ＲＮＡとそれがコードするタンパク質との複合体を作製
するための核酸構築物において、（１）該一本鎖ＤＮＡ
配列が、その３’末端に、該一本鎖ＲＮＡの逆転写のた
めのプライマー配列を有し、かつ核酸誘導体を末端に有
するスペーサー配列が枝分かれした状態で結合してお
り、（２）該核酸構築物において該一本鎖ＲＮＡとアニ
ーリングしない５’末端側は、相補ＤＮＡ鎖と化学的に
結合して互いに相補的な二本鎖配列を形成しており、
（３）該相補ＤＮＡ鎖の３’末端に親和性物質が結合し
ている、ことを特徴とする上記の核酸構築物が提供され
る。

【００１３】好ましくは、上記の二本鎖配列中には制限
酵素認識部位が存在する。好ましくは、核酸誘導体は、
ピューロマイシン、3’-N-アミノアシルピューロマイシ
ンアミノヌクレオシド、3’-N-アミノアシルアデノシン
アミノヌクレオシドの化学構造骨格を含む化合物又はそ
れらの類縁体である。好ましくは、スペーサーはポリエ
チレン又はポリエチレングリコールなどの高分子であ
る。好ましくは、親和性物質はビオチン又はポリＡ配列
である。

【００１４】本発明の別の側面によれば、上記した核酸
構築物と一本鎖ＲＮＡとをアニーリングさせ、該核酸構
築物の二本鎖領域の５’末端と一本鎖ＲＮＡの３’末端
とをライゲーションさせることを含む、ＲＮＡ−ＤＮＡ
結合体の作製方法が提供される。好ましくは、ライゲー
ションはＴ４ＲＮＡリガーゼを用いて行なう。好ましく
は、一本鎖ＲＮＡはｍＲＮＡ又はｍＲＮＡライブラリー
である。好ましくは、一本鎖ＲＮＡは、（１）プロモー
ター配列、（２）翻訳の際にリボソームによって認識さ
れるＤＮＡ配列、及び（３）目的タンパク質をコードす
る配列を有する。

【００１５】本発明のさらに別の側面によれば、上記方
法により得られるＲＮＡ−ＤＮＡ結合体、並びに該ＲＮ
Ａ−ＤＮＡ結合体を支持体上に固定化したチップが提供
される。本発明のさらに別の側面によれば、上記方法に
より得られるＲＮＡ−ＤＮＡ結合体を逆転写反応に付し
てＤＮＡ結合体を製造する方法、上記方法により得られ
るＤＮＡ結合体、並びに該ＤＮＡ結合体を支持体上に固
定化したチップが提供される。本発明のさらに別の側面
によれば、上記のＲＮＡ−ＤＮＡ結合体をタンパク質翻
訳系に導入してＲＮＡをタンパク質に翻訳することを特
徴とする、ＲＮＡと該ＲＮＡによりコードされるタンパ
ク質から成るＲＮＡ−タンパク質複合体の製造方法が提
供される。好ましくは、翻訳は無細胞翻訳系で行なう。

【００１６】本発明のさらに別の側面によれば、上記の
ＲＮＡ−ＤＮＡ結合体をタンパク質翻訳系に導入してＲ
ＮＡをタンパク質に翻訳することにより得られる、ＲＮ
Ａと該ＲＮＡによりコードされるタンパク質から成るＲ
ＮＡ−タンパク質複合体、並びに該ＲＮＡ−タンパク質
複合体を支持体上に固定化したチップが提供される。本
発明のさらに別の側面によれば、上記のＲＮＡ−タンパ
ク質複合体を逆転写反応に付することを特徴とする、核
酸と核酸によりコードされるタンパク質から成る核酸−
タンパク質複合体の製造方法、該製造方法により得られ
る核酸−タンパク質複合体、並びに、該核酸−タンパク
質複合体を支持体上に固定化したチップが提供される。

【００１７】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
てより詳細に説明する。（１）本発明の核酸構築物本発明の核酸構築物は、一本鎖ＲＮＡとそれがコードす
るタンパク質との複合体又は核酸−タンパク質複合体を
作製するために使用するものであり、その構造は、一本
鎖ＲＮＡの３’末端側の配列とアニーリングすることが
できる一本鎖ＤＮＡ配列を３’末端側に含み、該一本鎖
ＤＮＡ配列の３’末端に、該一本鎖ＲＮＡの逆転写のた
めのプライマー配列を有し、さらに核酸誘導体を末端に
有するスペーサーが該一本鎖ＤＮＡのいずれかに枝分か
れした状態で結合しており、該一本鎖ＤＮＡ配列の５’
末端側に親和性物質が結合していることを特徴とする。
親和性物質は、ＲＮＡ−タンパク質複合体又は核酸−タ
ンパク質複合体を固相に結合させるためや、精製を行な
うために用いられる。

【００１８】本発明の核酸構築物の一例の模式図を図２
に示す。図２に示す核酸構築物は、固定化したＲＮＡ−
タンパク質複合体又は核酸−タンパク質複合体（以下、
これらを「in vitro virus virion」と称することがあ
る。）を親和性物質を介して結合している固相（支持
体）上から切り離すための制限酵素認識部位をもつ２本
鎖ＤＮＡと、親和性物質としてビオチンまたはpoly Aを
有している。なお、図２は、該核酸構築物に一本鎖ＲＮ
Ａ（ｍＲＮＡ）をアニーリングさせた状態を示してい
る。

【００１９】親和性物質をin vitro virus virionの精
製に用いる例としては、親和性物質としてpolyAを用い
る場合、dTカラムによって精製する方法や、親和性物質
としてHis-tagを用いる場合はＮｉを用いて精製する方
法、並びに親和性物質としてFLAGペプチドを用いる場合
はこの抗体を用いて精製する方法などがある。

【００２０】本発明の核酸構築物の具体例の構造を図３
に示す。一本鎖ＤＮＡ配列の５’末端側の構造として
は、一本鎖ＤＮＡ配列がループ領域を介して互いに相補
的な二本鎖配列を形成しており、該ループ領域に親和性
物質が結合しており、該二本鎖配列中に制限酵素認識部
位が存在している構造（図３のT-splint1FB、T-splint4
FB）、あるいは、相補ＤＮＡ鎖と化学的に結合して互い
に相補的な二本鎖配列を形成しており、該相補ＤＮＡ鎖
の３’末端に親和性物質が結合しており、該二本鎖配列
中に制限酵素認識部位が存在している構造（図３のT-sp
lint3FB、T-splint3FA、T-splint6FB、T-splint6FA）な
どが挙げられる。

【００２１】なおここで言う「化学的に結合」の具体例
としては、Psoralenを有する核酸と別の核酸とを混合し
て、紫外線を照射することによって両核酸を化学的に結
合する場合、架橋剤により結合する場合、ＲＮＡリガー
ゼなどによって結合する場合、あるいは前述のＹ−ライ
ゲーションによって結合する場合などが挙げられる。架
橋剤として具体的には、Ｎ−（６−マレイミドカプロイ
ルオキシ）スクシイミド等の２価性試薬が挙げられる。

【００２２】以下、本発明の核酸構築物の各構成要素に
ついて説明する。（ＲＮＡに相補的な一本鎖ＤＮＡ配列）本発明の核酸構
築物は、一本鎖ＲＮＡの３’末端側の配列とアニーリン
グすることができる一本鎖ＤＮＡ配列を３’末端側に含
む。これにより、本発明では、互いに相補的な配列を有
する一本鎖ＲＮＡと一本鎖ＤＮＡとを好適な条件下でア
ニーリングすることにより両者をアニーリングさせ、次
いで、ＲＮＡリガーゼで処理することにより両者を効率
よく連結することができる。

【００２３】一本鎖ＲＮＡの３’末端側の配列とアニー
リングすることができる一本鎖ＤＮＡ配列とは、互いに
アニーリングすることができる配列であり、ＲＮＡ配列
に相補的な配列を有するＤＮＡ配列を言う。このような
相補的な配列の長さは、両鎖がアニーリングすることが
できるのに十分な長さであれば特に限定されないが、一
般的には１０から５０塩基、より好ましくは１０から３
０塩基程度である。本発明で用いる一本鎖ＤＮＡとして
は、天然由来のＤＮＡから作成した一本鎖ＤＮＡでもよ
いし、遺伝子組換え技術により作成した一本鎖ＤＮＡで
もよいし、化学合成により作成した一本鎖ＤＮＡでもよ
い。

【００２４】また、一本鎖ＤＮＡの構成要素である核酸
の全てがデオキシリボヌクレオチドである必要はなく、
その一部のみがＤＮＡタイプであるものでもよく、それ
以外の領域は、リボヌクレオチド（２’−Ｏ−メチルリ
ボヌクレオチドなどのＲＮＡタイプ）でもデオキシリボ
ヌクレオチド誘導体でもＰＮＡタイプでもよい。また、
ペプチドや糖などが結合したものでもよい。本発明で用
いる一本鎖ＤＮＡの長さは、特に限定されないが、一般
的には、数塩基から数百塩基程度であり、例えば１０塩
基から５００塩基程度であり、より好ましくは２０塩基
から２００塩基程度である。

【００２５】（プライマー配列）本発明の核酸構築物の
一本鎖ＤＮＡ配列の３’末端には、ＲＮＡの逆転写のた
めのプライマー配列が結合している。本明細書で言う
「一本鎖ＲＮＡの逆転写のためのプライマー配列」と
は、核酸構築物（T-スペーサー）と一本鎖ＲＮＡとのラ
イゲーションにより得られる核酸構築物を逆転写反応系
に導入した場合に、逆転写反応を開始するためのプライ
マー配列として作用する塩基配列を意味し、一般的に
は、一本鎖ＲＮＡの配列と相補的な配列から構成される
ことが好ましい。

【００２６】このようなＲＮＡの逆転写のためのプライ
マーを有することにより、本発明の核酸構築物を用いれ
ばＲＮＡ−タンパク質複合体のＲＮＡのＤＮＡ化も容易
に可能である。即ち、本発明の核酸構築物は、逆転写プ
ライマーの役割も持つため、in vitro virus virionを
カラム等の固相に固定化するなどしてバッファー交換
後、ただちに逆転写してＲＮＡをＤＮＡ化し、in vitro
virus virionを安定化することができる。従来のin vi
tro virus virionではタンパク質翻訳系の反応液中から
精製できず、しかも外から添加した逆転写プライマーを
一本鎖ＲＮＡにハイブリダイゼーションさせるために温
度を上げることが必要であったが、これは連結させたタ
ンパク質を変性させる可能性があり大きな問題となって
いた。本発明の核酸構築物ではこのような問題がなく、
in vitro virus virionのＤＮＡ化による安定化が容易
である。

【００２７】（核酸誘導体を末端に有するスペーサー）
本発明の核酸構築物の一本鎖ＤＮＡ配列には、核酸誘導
体を末端に有するスペーサーが、枝分かれした状態で結
合している。このような一本鎖ＤＮＡの誘導体を使用し
て無細胞タンパク質翻訳系又は生細胞中でタンパク質の
翻訳を行った場合、２本鎖でリボソームを止め、核酸誘
導体（例えば、ピューロマイシンなど）がリボソームの
Ａサイトに入れることによりタンパク質と結合させるこ
とができる。

【００２８】この核酸誘導体としては、無細胞タンパク
質翻訳系又は生細胞中でタンパク質の翻訳が行われた時
に、合成されたタンパク質のＣ末端に結合する能力を有
する化合物である限り限定されないが、その３’末端が
アミノアシルtRNAに化学構造骨格が類似しているものを
選択することができる。代表的な化合物として、アミド
結合を有するピューロマイシン（Puromycin）、３’-N-
アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（3'
-N-Aminoacylpuromycin aminonucleoside 、 PANS-アミ
ノ酸）、たとえば、アミノ酸部がグリシンのPANS-Gly、
アミノ酸部がバリンのPANS-Val、アミノ酸部がアラニン
のPANS-Ala、その他、アミノ酸部が全ての各アミノ酸に
対応するPANS−アミノ酸化合物が挙げられる。

【００２９】また、３’−アミノアデノシンのアミノ基
とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合して形成される
アミド結合で連結した３’-N-アミノアシルアデノシン
アミノヌクレオシド（3'-Aminoacyladenosine aminonuc
leoside, AANS-アミノ酸）、たとえば、アミノ酸部がグ
リシンのAANS-Gly、アミノ酸部がバリンのAANS-Val、ア
ミノ酸部がアラニンのAANS-Ala、その他、アミノ酸部が
全アミノ酸の各アミノ酸に対応するAANS-アミノ酸化合
物を使用できる。

【００３０】また、ヌクレオシドあるいはヌクレオシド
とアミノ酸のエステル結合したものなども使用できる。
さらにまた、核酸あるいは核酸に類似した化学構造骨格
及び塩基を有する物質と、アミノ酸に類似した化学構造
骨格を有する物質とを化学的に結合した化合物は、すべ
て本発明で用いられる核酸誘導体に含まれる。

【００３１】核酸誘導体としては、ピューロマイシン、
ＰＡＮＳ−アミノ酸もしくはＡＡＮＳ−アミノ酸がリン
酸基を介してヌクレオシドと結合している化合物がより
好ましい。これらの化合物の中でピューロマイシン、リ
ボシチジルピューロマイシン、デオキシシチジルピュー
ロマイシン、デオキシウリジルピューロマイシンなどの
ピューロマイシン誘導体が特に好ましい。

【００３２】本発明では、核酸誘導体はスペーサーを介
して一本鎖ＤＮＡに結合している。スペーサーとして
は、ポリエチレン又はポリエチレングリコールあるいは
その誘導体などの高分子物質や、オリゴヌクレオチドや
ペプチドあるいはその誘導体などの生体高分子物質等が
用いられ、好ましくはポリエチレングリコールが用いら
れる。スペーサーの長さは特に限定されないが、好まし
くは、分子量１５０〜６０００であるか、または主鎖の
原子数は１０原子から４００原子であり、さらに好まし
くは、分子量６００〜３０００であるか、または主鎖の
原子数が４０原子から２００原子である。

【００３３】上記したような核酸誘導体は、それ自体既
知の化学結合方法によって製造することができる。具体
的には、リン酸ジエステル結合で合成ユニットを結合さ
せる場合は、ＤＮＡ合成機に一般的に用いられているホ
スホアミダイド法などにより固相合成で合成することが
可能である。ペプチド結合を導入する場合は、活性エス
テル法などにより合成ユニットを結合させるが、ＤＮＡ
との複合体を合成する場合は、両方の合成法に対応が可
能な保護基が必要になる。

【００３４】（制限酵素認識部位）本発明の核酸構築物
の好ましい態様においては、５’末端側には、制限酵素
認識部位が存在する。５’末端側とは親和性物質に隣接
する位置を意味する。制限酵素認識部位は通常は、DNA
の２本鎖から構成される。このような制限酵素認識部位
を導入することにより、in vitro virus virionを親和
性物質から切り離すことができる。例えば、in vitro v
irus virionを親和性物質を介して固相に結合させてい
る場合、in vitro virus virionを固相（支持体）上か
ら切り離すことが可能になる。即ち、親和性物質同士
（例えば、ビオチン−ストレプトアビジンなど）の結合
等により支持体に強く結合したin vitro virus virion
を３７℃という温和な条件下で制限酵素によって切り離
し精製することができる。制限酵素認識部位の配列は特
に限定されず、PvuIIなど任意の制限酵素認識配列を使
用することができる。

【００３５】（親和性物質）本発明の核酸構築物には、
親和性物質が結合している。親和性物質を導入すること
により、本発明の核酸構築物を作成したin vitro virus
virion並びにそれを用いて作成した各種核酸構築物を
固相（支持体）に容易に結合させることができる。親和
性物質の種類は特に限定されないが、例えば、ビオチ
ン、ポリＡ、各種の抗原又は抗体、FLAG、Hisタグなど
が挙げられる。親和性物質は核酸構築物に上記したよう
なスペーサーを介して結合していてもよい。

【００３６】（２）ＲＮＡ−ＤＮＡ結合体とその製造本発明によれば、上記（１）に記載した核酸構築物と一
本鎖ＲＮＡとをアニーリングさせ、該核酸構築物の二本
鎖領域の５’末端と一本鎖ＲＮＡの３’末端とをライゲ
ーションさせることを特徴とする、ＲＮＡ−ＤＮＡ結合
体の製造方法、並びに当該製造方法により製造されるＲ
ＮＡ−ＤＮＡ結合体が提供される。

【００３７】本発明では、互いに相補的な配列を有する
一本鎖ＲＮＡと一本鎖ＤＮＡとを好適な条件下でアニー
リングすることにより両者をアニーリングさせ、次い
で、ＲＮＡリガーゼで処理することにより両者を効率よ
く連結することができる。本発明の方法では先ず、上記
した互いに相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡと本発明
の核酸構築物とをアニーリングさせる。アニーリングは
上記した２種の核酸を適当な緩衝液（以後の操作の便宜
上から言うと、ＲＮＡリガーゼ用の緩衝液が好ましい）
に溶解し、高温から段階的に低温にすることにより行な
うことができる。このような温度変化はＰＣＲ装置など
を用いて行なうこともできる。アニーリング条件の一例
としては、９４℃から２５℃まで１０分かけて冷却する
という条件が挙げられるが、これは一例にすぎず、温度
および時間は適宜変更することができる。アニーリング
の条件（緩衝液の組成、アニーリング温度、及びアニー
リング時間など）は、アニーリング配列の長さや塩基組
成などに応じて適宜設定することができる。

【００３８】アニーリング反応における一本鎖ＲＮＡ
と、核酸構築物とのモル比はアニーリング反応が進行す
る限り、特に限定されないが、反応効率の観点からは、
１：１〜１：２．５程度であることが好ましい。

【００３９】一本鎖ＲＮＡと核酸構築物とのアニーリン
グ後、アニーリング産物では、一本鎖ＲＮＡの３’末端
と核酸構築物の５’末端とが連結される。この連結は、
一本鎖ＲＮＡの３’末端と核酸構築物の５’末端とが連
結すればいずれの方法によってもよいが、例えば、ＲＮ
Ａリガーゼ、架橋剤等、上述の「科学的結合」を行う具
体例に挙げた方法等を用いることができる。本発明で用
いるＲＮＡリガーゼは２つの一本鎖核酸同士を連結でき
るものであればよく、好ましくはＴ４ＲＮＡリガーゼを
使用できる。

【００４０】なお、アニーリングの際の溶液としてＲＮ
Ａリガーゼの緩衝液として適当なものを使用した場合に
は、アニーリング生成物を含む溶液をそのままリガーゼ
反応に使用することができ、そうでない場合には、アニ
ーリング生成物を通常の核酸精製方法により回収した
後、ＲＮＡリガーゼ用の緩衝液に溶解してリガーゼ反応
用の溶液を調製する。

【００４１】連結反応（リガーゼ反応）の条件は、使用
するＲＮＡリガーゼの活性が発揮される条件であればよ
く、例えば、好適な緩衝液（例えば、T4 RNA ligase bu
ffer(50mM Tris-HCl, pH7.5, 10mM MgCl₂, 10mM DTT, 1
mM ATP)など）中で、２５℃の温度一定で反応させた
り、あるいは２５℃で３０分間と４５℃で２分間のサイ
クルを反復した後に２５℃で３０分間反応させたりする
ことができる。ここに示した温度及び反応時間は一例に
過ぎず反応効率が高くなるように適宜設定変更すること
ができる。

【００４２】反応後にエタノール沈殿などの常法により
反応生成物を精製することにより、ＲＮＡ−ＤＮＡ結合
体を得ることができる。このようにして得られるＲＮＡ
−ＤＮＡ結合体自体も本発明の範囲内である。

【００４３】本発明で用いる一本鎖ＲＮＡの種類は特に
限定されず、天然の組織又は細胞由来のＲＮＡでも、Ｄ
ＮＡからインビトロで発現させたＲＮＡでもよい。ま
た、一本鎖ＲＮＡの構成要素である核酸の全てがリボヌ
クレオチドである必要はなく、その一部のみがＲＮＡタ
イプであるものでもよく、それ以外の領域は、リボヌク
レオチド誘導体でもデオキシリボヌクレオチドタイプで
もＰＮＡタイプでもよい。また、ペプチドでも糖などが
結合したものでもよい。

【００４４】本発明で用いる一本鎖ＲＮＡの長さは、連
結反応が可能である限り、特に限定されない。一般的に
は、一本鎖ＲＮＡの長さは、数十塩基から数十キロ塩基
程度であり、例えば１０塩基から５０，０００塩基程度
であり、より好ましくは２０塩基から１０，０００塩基
程度である。

【００４５】本発明で用いる一本鎖ＲＮＡは、タンパク
質をコードする配列を含むことが好ましく、具体的には
ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡライブラリーであることが好まし
い。本発明の方法で得られるＲＮＡ−ＤＮＡ連結体を転
写翻訳系に導入するような場合には、連結すべき一本鎖
ＲＮＡは、（１）プロモーター配列、（２）翻訳の際に
リボソームによって認識されるＤＮＡ配列、及び（３）
目的タンパク質をコードする配列が含まれていることが
好ましい。さらに、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓタグ等のタグをコ
ードする配列、あるいはＰＣＲにより増幅するための共
通配列を含むこともできる。

【００４６】プロモーター配列の種類は、適用する発現
系に適したものを適宜選択すればよく特に限定されな
い。例えば、大腸菌ウイルスT7のRNA polymeraseによっ
て認識されるT7プロモーター配列、ＳＰ６プロモーター
配列などが挙げられる。

【００４７】翻訳の際にリボソームによって認識される
ＤＮＡ配列としては、翻訳の際に真核細胞のリボソーム
によって認識されるＲＮＡ配列（Kozak配列）に対応す
るＤＮＡ配列や原核細胞のリボソームによって認識され
るシャイン・ダルガノ配列（Shine-Dalgarno）、オメガ
配列等のtabacco mosaic virusのリボソームによって認
識される配列、rabbitβ−globlin、Xenopusβ-globlin
あるいはbromo mosaic virusのリボゾーム認識領域な
どが挙げられる。目的タンパク質をコードする配列の種
類は特に限定されず、目的に応じて適宜選択できる。

【００４８】（３）ＲＮＡ−タンパク質複合体とその製
造さらに、本発明によれば、上記（２）に記載のＲＮＡ−
ＤＮＡ結合体をタンパク質翻訳系に導入して一本鎖ＲＮ
Ａをタンパク質に翻訳することを特徴とする、ＲＮＡと
該ＲＮＡによりコードされるタンパク質から成るＲＮＡ
−タンパク質複合体の製造方法、並びに当該製造方法に
より製造されるＲＮＡ−タンパク質複合体が提供され
る。

【００４９】核酸からそれがコードするタンパク質を人
工的に生成させるための転写翻訳系は当業者に公知であ
る。具体的には、適当な細胞よりタンパク質合成能を有
する成分を抽出し、その抽出液を用いて目的のタンパク
質を合成させる無細胞タンパク質合成系が挙げられる。
このような無細胞タンパク質合成系には、リボゾ−ム、
開始因子、伸長因子及びｔＲＮＡ等の転写・翻訳系に必
要な要素が含まれている。

【００５０】このような無細胞タンパク質合成系（細胞
溶解物由来の系）としては、原核又は真核生物の抽出物
により構成される無細胞翻訳系が挙げられ、例えば大腸
菌、ウサギ網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液などが使
用できるが、ＤＮＡ又はＲＮＡから目的とするタンパク
質を産生するものであればいずれでもよい。また、無細
胞翻訳系はキットとして市販されているものを使用する
ことができ、例えば、ウサギ網状赤血球抽出液 (Rabbit
Reticulocyte Lysate Systems, Nuclease Treated, Pr
omega)や小麦胚芽抽出液 (PRETEIOS, TOYOBO；Wheat Ge
rm Extract, Promega)などが挙げられる。

【００５１】タンパク質翻訳系としては、生細胞を使用
してもよく、具体的には、原核又は真核生物、例えば大
腸菌の細胞などが使用できる。無細胞翻訳系又は生細胞
などは、その中にタンパク質をコードする核酸を添加又
は導入することによってタンパク質合成が行われるもの
である限り制限されない。本発明では、ＲＮＡ−ＤＮＡ
連結体を上記したような転写翻訳系に導入して一本鎖Ｒ
ＮＡをタンパク質に翻訳した後、リボゾームを除去する
ことによって、ＲＮＡと該ＲＮＡによりコードされるタ
ンパク質から成るＲＮＡ−タンパク質複合体を製造する
ことができる。

【００５２】（４）逆転写反応とその産物本発明によれば、上記（２）に記載のＲＮＡ−ＤＮＡ結
合体または上記（３）に記載のＲＮＡ−タンパク質複合
体を逆転写反応に付することを特徴とする、核酸−タン
パク質複合体の製造方法、並びに当該製造方法により製
造される核酸−タンパク質複合体が提供される。ＲＮＡ
部分を含む核酸を逆転写酵素で処理することにより、Ｒ
ＮＡからＤＮＡへの逆転写が起こり、ＲＮＡ部分の塩基
配列をＤＮＡに転換することができる。逆転写反応に必
要な試薬及び反応条件は当業者に周知であり、必要に応
じて適宜選択することができる。

【００５３】即ち、ＲＮＡと該ＲＮＡによりコードされ
るタンパク質から成るＲＮＡ−タンパク質複合体を逆転
写酵素で処理することにより、ＲＮＡからＤＮＡへの逆
転写が起こり、ＲＮＡとＤＮＡおよび該ＲＮＡとＤＮＡ
によりコードされるタンパク質から成るＲＮＡ−ＤＮＡ
−タンパク質複合体が製造されることになる。さらに得
られたＲＮＡ−ＤＮＡ−タンパク質複合体のＲＮＡをＲ
ＮＡ分解酵素などを用いて分解することによればＤＮＡ
−タンパク質複合体が製造される。本明細書では、上記
ＲＮＡ−ＤＮＡ−タンパク質複合体およびＤＮＡ−タン
パク質複合体をあわせて「核酸−タンパク質複合体」と
称することがある。

【００５４】（５）本発明の核酸構築物を用いて作製し
た核酸含有産物を固定化したチップ本発明によれば、上記（２）に記載のＲＮＡ−ＤＮＡ結
合体、上記（３）に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体、
並びに上記（４）に記載の核酸−タンパク質複合体を支
持体上に固定化したチップが提供される。本発明の核酸
構築物には親和性物質が結合している。従って、この親
和性物質に親和性を有する物質を予め固定化した支持体
に、本発明の核酸構築物を用いて作製した上記の核酸−
タンパク質複合体を接触させることにより、当該核酸−
タンパク質複合体を支持体上に容易に固定化することが
できる。このようにして作製されるチップは、核酸の機
能の解析などにおいて有用である。

【００５５】親和性物質の組み合わせとしては、ビオチ
ン／ストレプトアビジン、ポリＡ配列／オリゴｄＴ配
列、抗原／抗体、Hisタグ配列／Ｎｉ、リガンド／レセ
プター、ＦＬＡＧ／抗ＦＬＡＧ抗体などが挙げられる
が、これらに限定されるものではない。

【００５６】チップの作製に用いる支持体としては、通
常の核酸またはタンパク質の固定化に用いることができ
る支持体であれば特に限定されない。支持体としては、
親和性物質同士の間の結合形成に悪影響を及ぼさないも
のであれば、その形状は特に限定されず、例えば、平
板、マイクロウエル、ビーズ等の任意の形態をとること
ができる。支持体の材質としては、例えば、ガラス、セ
メント、陶磁器等のセラミックス；ポリエチレンテレフ
タレート、酢酸セルロース、ビスフェノールＡのポリカ
ーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート
等のポリマー類；シリコン、活性炭、多孔質ガラス、多
孔質セラミックス、多孔質シリコン、多孔質活性炭、織
編物、不織布、濾紙、短繊維、メンブレンフィルター等
の多孔質物質を挙げることができる。以下の実施例によ
り本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例
によって限定されることはない。

【００５７】

【実施例】実施例１：スペーサーの作製法以下のような修飾DNAをスペーサーの原料としてDNA合成
機で合成した。 DNA 1: (thiol)(Spc)(Spc)(Spc)(Spc)CC(ZFP) DNA 2: CCCGGTGCAGCTGTTTCATC(Bt)CGGAAACAGCTGCACCCCCC(Ft)CCGCCCCCCG(At)CCGC DNA 3: (Pso)TACGCCAGCTGCACCCCCCGCCGCCCCCCG(At)CCGC DNA 4: CCCGG(Ft)GCAGCTGGCGTATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

【００５８】上記配列中の(thiol)、(Spc)、(Bt)、(F
t)、(At)及び(Pso)はユニットの略称であり、すべてグ
レンリサーチ社製の合成試薬を用いて配列中に導入し
た。これらユニットの略称、合成（導入）試薬の品名及
びその化学名は、それぞれ次の通りである。

【００５９】 (thiol) 5'-Thiol-modifier C6 (S-Trityl-6-mercaptohexyl)-(2-cyanoehyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramid ite (Spc) Spacer Phosphoramidite 18 18-O-Dimethoxytritylhexaethyleneglycol,1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropy l)]-phosphoramidite (Bt) Biotin-dT 5'-Dimethoxytrityl-5-[N-((4-t-butylbenzoyl)-biotinyl)-aminohexyl)-3-acry limido]-2'-deoxyUridine,3'-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoram idite

【００６０】 (Ft) Fluorescein-dT 5'-Dimethoxytrityl-5-[N-((3',6'-dipivaloylfluoresceinyl)-aminohexyl)-3-a crylimido]-2'-deoxyUridine,3'-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phospho ramidite (At) Amino-modifier C6 dT 5'-Dimethoxytrityl-5-[N-(trifluoroacetylaminohexyl)-3-acrylimido]-2'-deo xyUridine,3'-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite (Pso) Psoralen C6 Phosphoramidite 2-[4'-(hydroxymethyl)-4,5',8-trimethylpsoralen]-hexyl-1-O-(2-cyanoethyl) -(N,N-diisopropyl)-phosphoramidite

【００６１】また、(ZFP)はN-α-(N-α-benzyloxycarbo
nyl-L-phenylalanyl)-puromycin残基を示し、支持体CPG
に固定してDNA合成機上で使えるようにしたものを特願2
002-044955号明細書に記載の方法に準じて次の通り合成
して配列の3'末端に導入した。

【００６２】ピューロマイシン２塩酸塩（和光純薬工
業）250 mgを水3 mlに溶かし、ジメトキシエタン (DME)
2 ml、10%炭酸ナトリウム水溶液0.5 mlを加えた。撹拌
しながらこの溶液にZ-Phe-OSu (N-α-benzyloxycarbony
l-L-phenylalanine N-hydroxysuccinimide ester; BACH
EM社) 200 mg（1.1当量）をDME 2 mlに溶かした溶液を
加え、さらに10%炭酸ナトリウム水溶液0.5 mlを加え
た。１時間室温で撹拌したのち析出した固体をグラスフ
ィルター上で濾取し、50％DME水溶液2 mlで2回、水2 ml
で3回、冷却したDME 2 mlで2回洗浄したのち真空ポンプ
で乾燥してN-α-(N-α-benzyloxycarbonyl-L-phenylala
nyl)-puromycin (ZF-puromycin)を330 mg得た。

【００６３】ZF-puromycin 315 mgをピリジン2.5 mlに
溶かし、塩化ジメトキシトリチル149mgを加えて室温で
１時間撹拌した。氷浴で冷却してから水0.1 mlを加え、
10分撹拌したのち水と酢酸エチルで分液し、有機層を水
で3回洗ってから濃縮し、真空ポンプで乾燥して粗5'-di
methoxytrityl ZF-puromycin (DMTr-ZF-puromycin)を45
0 mg得た。

【００６４】DMTr-ZF-puromycin 450 mgをピリジン2 ml
に溶かし、無水コハク酸61 mg、ジメチルアミノピリジ
ンの0.5 Mピリジン溶液40μlを加えて、窒素雰囲気下、
室温で３日間撹拌した。氷浴で冷却してから水0.1 mlを
加え、10分撹拌したのち水と酢酸エチルで分液し、有機
層を水で3回、飽和食塩水で1回洗ったのち濃縮した。酢
酸エチルを展開溶媒としてシリカゲルクロマトグラフィ
で精製し、目的物であるDMTr-ZF-puromycin-3'-succina
teを385 mg得た。

【００６５】DMTr-ZF-puromycin-3'-succinate 255 mg
をジメチルホルムアミド(DMF) 0.4 mlに溶かし、ジイソ
プロピルカルボジイミド(DIC)の1.0 M DMF溶液0.2 mlと
N-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)の0.5 M DMF溶
液0.4 mlを加え、16時間室温で撹拌した。この溶液にCP
G (CPG LCA00500A ; 0.17 mmol/g) 500 mgを加えて2時
間室温で撹拌し、さらにDICの1.0 M DMF溶液0.15 mlとH
OBtの0.5 M DMF溶液0.3 mlを加えて16時間室温で撹拌し
た。CPGをグラスフィルター上に濾取し、DMF、50% DMF
水溶液、アセトニトリルで洗ったのちポンプで乾燥し
た。全量をDMF 2 mlに懸濁させ、ピリジン0.5 ml、無水
酢酸125 mgを加えて１時間室温で撹拌したのちCPGを濾
取してDMFとアセトニトリルで洗浄した。真空ポンプで
乾燥し、ZF-puromycin CPGを520 mg得た。一部を固相反
応用の容器に入れ、トリクロロ酢酸の3%塩化メチレン溶
液を加えて室温で１分撹拌し、アセトニトリルで洗浄し
たのち濃アンモニア水を加えて室温で2時間撹拌した。
回収されたZF-puromycinを定量し、CPG 1グラム当たり2
8 μmolと算出した。

【００６６】（１）T-splint1FB DNA 2 (4 nmol)を0.1 M リン酸水素2ナトリウム水溶液1
5μlに溶かし、N-(6-maleimidocaproyloxy)succinimide
（EMCS）（架橋剤；同仁化学製）の5 mM DMF溶液4μlを
加えて20分室温で撹拌した。この溶液にDNA 1（20 nmo
l）を0.1 Mリン酸緩衝液（pH 7.1）40μlに溶かした溶
液を加え、さらに室温で16時間撹拌した。逆相高速液体
クロマトグラフィ（逆相HPLC）でDNA 1とDNA 2が架橋剤
を介して結合した目的物を単離し、50 mMリン酸緩衝液
（pH 8.0）に溶かしてキモトリプシン溶液を基質に対し
て酵素の重量比が10％程度になるように加えて36℃で１
時間放置した。逆相HPLCで精製し、T-splint1FBを得
た。

【００６７】（２）T-splint3FA DNA 3 (12 nmol)とDNA 4 (12 nmol)をTBS緩衝液 (25 mM
Tris-HCl、pH7.0、100 mM NaCl) 0.48 mlに溶かし、85
℃で40秒加熱したのち室温で放冷した。氷浴上で5分放
置したのちハンディUVランプ（365 nm）で8分間光照射
し、反応生成物を逆相HPLCで精製した。これをT-splint
1FB調製の際と同様にEMCSでDNA 1と架橋し、キモトリプ
シン処理ののち精製してT-splint3FAを得た。

【００６８】実施例２：転写用DNAの構築とmRNAの作製転写効率の高い大腸菌ウィルスT7のRNA polymeraseによ
って認識されるDNA配列（T7プロモーター配列）と翻訳
の際に真核細胞のリボソームによって認識されるDNA配
列（Kozak配列）と原核細胞のリボソームによって認識
される（シャイン・ダルガノ配列：Shine-Dalgarno）を
有し、その下流にOct-1の一部 (POU)とFLAG配列、T-ス
ペーサーと連結するための配列（Y-tag）をコードしたD
NAを構築した。

【００６９】 GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTTGAAAT AATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATTCCACCATGGACCTTGAGGAGCTTGAGCAGTTT GCCAAGACCTTCAAACAAAGACGAATCAAACTTGGATTCACTCAGGGTGATGTTGGGCTC GCTATGGGGAAACTATATGGAAATGACTTCAGCCAAACTACCATCTCTCGATTTGAAGCC TTGAACCTCAGCTTTAAGAACATGGCTAAGTTGAAGCCACTTTTAGAGAAGTGGCTAAAT GATGCAGAGGGGGGAGGCAGCGATTACAAGGATGACGATGACAAGGGCGGAAGCGGACGG GGGGCGGCGGGAAA （配列番号１）

【００７０】上記の方法で作製したDNAを、反応液100μ
lあたり10μgを加え、RNA合成キットRibomax Large Sca
le RNA Production System（Promega製）を使ってmRNA
に転写した。翻訳効率をあげるためにキャップアナログ
（RNA Capping Analog ; Gibco BRL製）を最終濃度が7.
2mMになるように加え、mRNAの5'側を修飾した。キャッ
プアナログおよび過剰のNTP（ヌクレオチド３リン酸）
を除去するために、プライマー除去剤（Primer Remover
; Edge Biosystems製）を使ってエタノール沈澱を行っ
た。

【００７１】実施例３：mRNAとT-スペーサーとのライゲ
ーション上記の実施例２で作製したT-スペーサー (T-splint3FA)
と上記の実施例２で作製したmRNAとのライゲーション
は、特願2002-012820号明細書に記載の方法に準じて行
なった。具体的には以下の通りである。上記で作製した
mRNAとT-スペーサーを1：1.2〜1.5の割合（モル比）で
混合し、T4 RNA ligase buffer (50mM Tris-HCl、pH7.
5、10mM MgCl₂、10mM DTT、1mMATP)に溶解し、特異性を
あげるため変性剤としてDMSO (Dimethyl sulfoxide)を
最終濃度5％になるように加えた。得られた混合物は、P
CR装置を用いて、94℃〜25℃まで10分かけて冷却するこ
とによりアニーリングした。

【００７２】つづけて、上記のアニーリングした溶液中
にT4 Polynucleotide Kinase (Takara製)とT4 RNA liga
se（Takara製）を至適量加え、25℃で30分間反応させ
た。反応後、RNeasy Mini Kit (QIAGEN製)を使って、ラ
イゲーション産物を精製した。ライゲーションの効率を
確認するために、4％アクリルアミド8M尿素変性ゲル電
気泳動、65℃、250Vの条件でサンプルを泳動し、Vistra
Green (Amersham pharmacia製)で染色し、Molecular I
mager (Bio Rad)で画像化した。また、T-スペーサーに
導入してある蛍光(Fluoroscein)についても確認した。
この結果から、mRNAとT-スペーサーとの結合率（RNA-DN
A結合体の形成率）は80〜90％であることが確認され
た。

【００７３】実施例４：T-スペーサーを用いたin vitro
virus virion形成 in vitro virus genomeが、実際にin vitro virus viri
onを形成できるかどうか確認した。in vitro virus gen
ome 4pmolを小麦胚芽無細胞翻訳系PROTEIOS (TOYOBO製)
を用いて、26℃で30分間反応し翻訳させ、ピューロマイ
シンに翻訳されたペプチドを結合させる（virion化）た
めに最終濃度が40mM MgCl₂、1 M KClになるように塩を
加え、26℃で1時間反応させた。Virion化の効率を確認
するために、5M尿素変性5％SDS-PAGEゲル、20mAの条件
でサンプルを泳動した。

【００７４】実施例５：T-スペーサーを用いた in vitr
o virusの精製 in vitro virus virionを形成した後、T-スペーサーを
用いて、実際に精製できるかどうかを確認した。（１）ビオチン (T-splint1FB) 8pmolのin vitro virus genomeを上記の方法でvirion化
し、buffer交換をするために、Micro BioSpin Column-6
(Bio-Rad製)を用いて脱塩後、1M NaCl、100mMTris-HCl
(pH8.0)、10mM EDTA、0.25% Triton-X100になるように
調整し、MAGNOTEX-SA (Takara製) 5μlと4℃、約２時間
結合させる。その後、上清をとり、洗浄buffer (1M NaC
l、100mM Tris-HCl (pH8.0)、10mM EDTA、0.25% Triton
-X100)20μlで3回洗い、その後、MAGNOTEX-SAを2つにわ
け、一方を制限酵素Pvu II (Takara製) 37℃、約１時間
処理し、その上清を得て、in vitro virus が精製でき
るかどうか確認した。

【００７５】精製効率を確認するために、5M尿素変性5
％SDS-PAGEゲル、20mAの条件でサンプルを泳動した。ス
ペーサーに導入してある蛍光(Fluoroscein)を使って、M
olecular Imager (Bio Rad製)で画像化した。その結果
を図４に示す。図４において、レーン１は、virion化し
BioSpin Column-6を用いて脱塩されたin vitro virusを
泳動したものを示し、レーン２は、MAGNOTEX-SAと結合
させた後の上清を泳動したものを示し、レーン３〜５
は、上清を除いた後のMAGNOTEX-SAを洗浄したものを泳
動し、レーン６は、洗浄した後のMAGNOTEX-SAを泳動
し、レーン７は、洗浄したMAGNOTEX-SAを制限酵素で処
理した後の上清を泳動し、レーン８は、MAGNOTEX-SAを
制限酵素で処理した後のMAGNOTEX-SAを泳動したものを
示す。洗浄したMAGNOTEX-SAを制限酵素で処理した後の
上清に、in vitro virusが存在することから、T-splint
スペーサーを使ってin vitro virusが精製できることが
確認された。

【００７６】（２）Poly A(T-splint3FA) 8pmolのin vitro virus genomeを上記（１）の方法でvi
rion化し、buffer交換をするために、Micro BioSpin Co
lumn-6 (Bio-Rad製)を用いて脱塩後、1M NaCl、100mM T
ris-HCl (pH8.0)、10mM EDTA、0.25% Triton-X100にな
るように調整し、Biotinylated Oligo(dT) Probe (Prom
ega製)を結合させたMAGNOTEX-SA (Takara製) 5μlと4
℃、約１時間結合させる。その後、上清をとり、洗浄bu
ffer A (1MNaCl、100mM Tris-HCl (pH8.0)、0.25% Trit
on-X100) 20μlで3回洗い、bufferB (500mM NaCl、100m
M Tris-HCl (pH8.0)、0.25% Triton-X100) 20μlで1回
洗い、 buffer C (250mM NaCl、100 mM Tris-HCl (pH8.
0)、0.25% Triton-X100) 20μlで1回洗い、その後、Dep
水 10μlで3回溶出してin vitro virus virionが精製で
きるかどうか確認した。

【００７７】精製効率を確認するために、5M尿素変性5
％SDS-PAGEゲル、20mAの条件でサンプルを泳動した。ス
ペーサーに導入してある蛍光(Fluoroscein)を使って、M
olecular Imager (Bio Rad製)で画像化した。その結果
を図５に示す。図５において、レーン１は、virion化し
BioSpin Column-6を用いて脱塩されたin vitro virus g
enomeを泳動したものを示し、レーン２は、Biotinylate
d Oligo(dT) Probeを結合させたMAGNOTEX-SAと結合しな
かった上清を泳動したものを示し、レーン３〜７は、上
清を除いた後のBiotinylated Oligo(dT) Probeを結合さ
せたMAGNOTEX-SAを洗浄したものを泳動し、レーン８〜
１０は、洗浄したBiotinylated Oligo(dT) Probeを結合
させたMAGNOTEX-SAを溶出したものを泳動し、レーン１
１は、溶出した後のBiotinylated Oligo(dT) Probeを結
合させたMAGNOTEX-SAを泳動したものを示す。Biotinyla
ted Oligo(dT) Probeを結合させたMAGNOTEX-SAを溶出し
たものin vitro virus virionが存在することから、T-s
plintスペーサーを使ってin vitro virus virionが精製
できることが確認された。

【００７８】実施例６：T-スペーサーを用いた in vitr
o virusの精製後の逆転写反応実施例５のT-スペーサーを用いた in vitro virusの精
製時の溶出画分の1と2をまぜ、TrueScript II Reverse
Transcriptase (sawady)を用いて逆転写した。さら
に、ネガティブコントロールとしてin vitro virus gen
ome、ポジティブコントロールとしてin vitro virus ge
nomeを逆転写したもの（図４）とともに、センスプライ
マー5'−GTT TAA CTT TAA GAA GGA GTT GCC ACC ATG−
3'（配列番号２）とアンチセンスプライマー5'−TTT CC
C GCC GCC CCC CGT CCG CTT CCGCCC TTG TCA TCG TCA T
CC TTG TAA TC−3'（配列番号３）をもちいて、ポリメ
ラーゼ連鎖反応 (PCR)を行った。 DNA合成酵素は、TaK
aRa Ex Taq (TAKARA)をもちいた。結果を確認するため
に、6M尿素変性6％ポリアクリルアミドゲル、250Vの条
件でサンプルを泳動し、Vistra Green (Amersham pharm
acia製)で染色し、Molecular Imager (Bio Rad)で画像
化した。結果を図６に示す。

【００７９】図６において、レーン１は、in vitro vir
us genome、レーン２は、in vitrovirus genome を逆転
写したもの、レーン３は、ビリオン化後に精製して逆転
写したin vitro virusを鋳型としてPCRを行ったサンプ
ルを泳動したものを示す。ビリオン化後に精製して逆転
写したin vitro virusが、in vitro virus genomeを逆
転写したものを鋳型としてPCRを行ったものと同様に、
目的のDNAが増幅できていたことより、ビリオン化後に
精製してin vitro virusが、T-スペーサーをもちいて、
逆転写できたことが確認された。

【００８０】

【発明の効果】本発明のT-スペーサーは、mRNAとライゲ
ーションすることにより、in vitro virus genomeを構
築することができ、さらにこれを翻訳することでin vit
ro virus virionを容易に作製することができる。ま
た、本発明のT-スペーサーには、mRNAの逆転写のための
プライマーとして作用するDNA配列を有していることか
ら、上記で得られたin vitro virus virionを逆転写反
応に付することにより、mRNAをDNAに転換することがで
きる。

【００８１】また、本発明のT-スペーサーは親和性物質
を有することにより、mRNA側でin vitro virus virion
の精製を行なうことができるだけでなく、mRNAを支持体
に固定化してプロテインチップ作成する際においても有
用である。さらに、本発明のT-スペーサーを用いて製造
されたＲＮＡ−タンパク質複合体及び核酸−タンパク質
複合体は、核酸の機能の解析などにおいて有用な材料と
なり得るものである。

【００８２】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Mitsubishi Chemical Corporation <120> A nucleic acid construct <130> A31063A <160> 3

【００８３】 <210> 1 <211> 374 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 1 gatcccgcga aattaatacg actcactata gggagaccac aacggtttcc ctcttgaaat 60 aattttgttt aactttaaga aggagattcc accatggacc ttgaggagct tgagcagttt 120 gccaagacct tcaaacaaag acgaatcaaa cttggattca ctcagggtga tgttgggctc 180 gctatgggga aactatatgg aaatgacttc agccaaacta ccatctctcg atttgaagcc 240 ttgaacctca gctttaagaa catggctaag ttgaagccac ttttagagaa gtggctaaat 300 gatgcagagg ggggaggcag cgattacaag gatgacgatg acaagggcgg aagcggacgg 360 ggggcggcgg gaaa 374

【００８４】 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 2 gtttaacttt aagaaggagt tgccaccatg 30

【００８５】 <210> 3 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 3 tttcccgccg ccccccgtcc gcttccgccc ttgtcatcgt catccttgta atc 53

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、従来のin vitro virus virionの精製
技術の具体例を示す。

【図２】図２は、本発明の核酸構築物の構造を示す。

【図３】図３は、本発明の核酸構築物の具体例を示す。

【図４】図４は、本発明のT-スペーサー（親和性物資と
してビオチンを使用）を用いてin vitro virusを精製し
た結果を示す。

【図５】図５は、本発明のT-スペーサー（親和性物資と
してPoly Aを使用）を用いて in vitro virusを精製し
た結果を示す。

【図６】図６は、本発明のT-スペーサーを用いた in vi
tro virusの精製後の逆転写反応の結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者白鳥美和東京都町田市成瀬２−12−３ポプラヶ丘６号棟306号室Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA80 CA01 CA05 CA09 CA11 CA12 HA11 4B064 AG01 CB30 CC24 CD20 CD30 CE07 CE14 DA13 DA20 4H045 AA10 AA20 BA54 BA56 BA60 EA50 EA60 FA10 FA70 GA21 GA22 GA31

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】一本鎖ＲＮＡの３’末端側の配列とアニ
ーリングすることができる一本鎖ＤＮＡ配列を３’末端
側に含み、該一本鎖ＤＮＡ配列が、その３’末端に、該
一本鎖ＲＮＡの逆転写のためのプライマー配列を有し、
かつ核酸誘導体を末端に有するスペーサー配列が枝分か
れした状態で結合しており、該一本鎖ＤＮＡ配列の５’
末端側に親和性物質が結合している、一本鎖ＲＮＡとそ
れがコードするタンパク質との複合体を作製するための
核酸構築物。
【請求項２】該一本鎖ＤＮＡ配列の５’末端側に制限
酵素認識部位が存在する、請求項１に記載の核酸構築
物。
【請求項３】一本鎖ＲＮＡの３’末端側の配列とアニ
ーリングすることができる一本鎖ＤＮＡ配列を３’末端
側に含む、一本鎖ＲＮＡとそれがコードするタンパク質
との複合体を作製するための核酸構築物において、（１）該一本鎖ＤＮＡ配列が、その３’末端に、該一本
鎖ＲＮＡの逆転写のためのプライマー配列を有し、かつ
核酸誘導体を末端に有するスペーサー配列が枝分かれし
た状態で結合しており、（２）該核酸構築物において該一本鎖ＲＮＡとアニーリ
ングしない５’末端側は、ループ領域を介して互いに相
補的な二本鎖配列を形成しており、（３）該ループ領域に親和性物質が結合している、ことを特徴とする上記の核酸構築物。
【請求項４】一本鎖ＲＮＡの３’末端側の配列とアニ
ーリングすることができる一本鎖ＤＮＡ配列を３’末端
側に含む、一本鎖ＲＮＡとそれがコードするタンパク質
との複合体を作製するための核酸構築物において、（１）該一本鎖ＤＮＡ配列が、その３’末端に、該一本
鎖ＲＮＡの逆転写のためのプライマー配列を有し、かつ
核酸誘導体を末端に有するスペーサー配列が枝分かれし
た状態で結合しており、（２）該核酸構築物において該一本鎖ＲＮＡとアニーリ
ングしない５’末端側は、相補ＤＮＡ鎖と化学的に結合
して互いに相補的な二本鎖配列を形成しており、（３）
該相補ＤＮＡ鎖の３’末端に親和性物質が結合してい
る、ことを特徴とする上記の核酸構築物。
【請求項５】該二本鎖配列中に制限酵素認識部位が存
在する、請求項３又は４に記載の核酸構築物。
【請求項６】核酸誘導体が、ピューロマイシン、3’-
N-アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド、
3’-N-アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシドの化
学構造骨格を含む化合物又はそれらの類縁体である、請
求項１から５の何れかに記載の核酸構築物。
【請求項７】スペーサーがポリエチレン又はポリエチ
レングリコールなどの高分子である、請求項１から６の
何れかに記載の核酸構築物。
【請求項８】親和性物質がビオチン又はポリＡ配列で
ある、請求項１から７の何れかに記載の核酸構築物。
【請求項９】請求項１から８の何れかに記載の核酸構
築物と一本鎖ＲＮＡとをアニーリングさせ、該核酸構築
物の二本鎖領域の５’末端と一本鎖ＲＮＡの３’末端と
をライゲーションさせることを含む、ＲＮＡ−ＤＮＡ結
合体の作製方法。
【請求項１０】ライゲーションをＴ４ＲＮＡリガーゼ
を用いて行なう、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】一本鎖ＲＮＡがｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ
ライブラリーである、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】一本鎖ＲＮＡが、（１）プロモーター
配列、（２）翻訳の際にリボソームによって認識される
ＤＮＡ配列、及び（３）目的タンパク質をコードする配
列を有することを特徴とする、請求項９から１１の何れ
かに記載の方法。
【請求項１３】請求項９から１２の何れかに記載の方
法により得られるＲＮＡ−ＤＮＡ結合体。
【請求項１４】請求項１３に記載のＲＮＡ−ＤＮＡ結
合体を支持体上に固定化したチップ。
【請求項１５】請求項９から１２の何れかに記載の方
法により得られるＲＮＡ−ＤＮＡ結合体を逆転写反応に
付してＤＮＡ結合体を製造する方法。
【請求項１６】請求項９から１２の何れかに記載の方
法により得られるＲＮＡ−ＤＮＡ結合体を逆転写反応に
付することにより得られるＤＮＡ結合体。
【請求項１７】請求項１６に記載のＤＮＡ結合体を支
持体上に固定化したチップ。
【請求項１８】請求項１３に記載のＲＮＡ−ＤＮＡ結
合体をタンパク質翻訳系に導入してＲＮＡをタンパク質
に翻訳することを特徴とする、ＲＮＡと該ＲＮＡにより
コードされるタンパク質から成るＲＮＡ−タンパク質複
合体の製造方法。
【請求項１９】翻訳を無細胞翻訳系で行なう、請求項
１８に記載の作製方法。
【請求項２０】請求項１３に記載のＲＮＡ−ＤＮＡ結
合体をタンパク質翻訳系に導入してＲＮＡをタンパク質
に翻訳することにより得られる、ＲＮＡと該ＲＮＡによ
りコードされるタンパク質から成るＲＮＡ−タンパク質
複合体。
【請求項２１】請求項２０に記載のＲＮＡ−タンパク
質複合体を支持体上に固定化したチップ。
【請求項２２】請求項２０に記載のＲＮＡ−タンパク
質複合体を逆転写反応に付することを特徴とする、核酸
と該核酸によりコードされるタンパク質から成る核酸−
タンパク質複合体の製造方法。
【請求項２３】請求項２０に記載のＲＮＡ−タンパク
質複合体を逆転写反応に付することにより得られる核酸
−タンパク質複合体。
【請求項２４】請求項２３に記載の核酸−タンパク質
複合体を支持体上に固定化したチップ。