WO2021015234A1 - キメラ分子、医薬組成物、標的核酸の切断方法、及び、標的核酸切断用又は診断用キット - Google Patents

キメラ分子、医薬組成物、標的核酸の切断方法、及び、標的核酸切断用又は診断用キット Download PDF

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健彦 和田
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Definitions

  • the present invention relates to a chimeric molecule, a pharmaceutical composition, a method for cleaving a target nucleic acid, and a kit for cleaving the target nucleic acid or for diagnosis.
  • the present application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2019-136414 filed in Japan on July 24, 2019, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • nucleic acid drugs have been attracting attention as next-generation molecular-targeted drugs as well as antibody drugs.
  • nucleic acid drugs also cover diseases that cannot be treated with antibody drugs.
  • it has many advantages such as being able to be supplied at a relatively low cost by chemical synthesis, and like antibody drugs, its position as a post-small molecule drug is being established.
  • nucleic acid drugs For example, antisense nucleic acid (ASO) targets messenger RNA (mRNA), microRNA (miRNA), and SIRNA (siRNA) that are involved in disease progression. By selectively recognizing the target and forming a complex, the function of the target RNA is suppressed and a therapeutic effect is exhibited.
  • ASO antisense nucleic acid
  • mRNA messenger RNA
  • miRNA microRNA
  • SIRNA siRNA
  • Non-Patent Document 1 a nucleic acid drug having a catalyst-like function utilizing RNase H, which cleaves a target RNA like a catalyst with a small amount of ASO, has attracted attention.
  • the present invention comprises a chimeric molecule capable of suppressing the function of the target nucleic acid and suppressing the off-target effect at a low concentration, a pharmaceutical composition containing the chimeric molecule, a method for cleaving the target nucleic acid using the chimeric molecule, and the chimeric molecule. It is an object of the present invention to provide a kit for cleaving target nucleic acids or a diagnostic kit containing the same.
  • the present inventors considered that an increase in turnover number is effective for improving the cleavage efficiency of target RNA by RNase. From this point of view, by focusing on the dissociation process after RNA cleavage, we proposed a design method that contributes to the construction of an oligonucleic acid system capable of rapid dissociation from the complex of target RNA after cleavage, and succeeded in a demonstration experiment.
  • the present invention has been completed because it has been found that the function of the target nucleic acid can be suppressed and the off-target effect can be suppressed by using this method at a low concentration.
  • the present invention includes the following aspects.
  • [4] The chimeric molecule according to any one of [1] to [3], wherein the main clavicle of the second nucleic acid or a derivative thereof is a sugar-phosphate skeleton.
  • [5] The chimeric molecule according to any one of [1] to [4], wherein the first nucleic acid or a derivative thereof is fused to the 5'end of the second nucleic acid or a derivative thereof.
  • [6] The chimeric molecule according to any one of [1] to [4], wherein the first nucleic acid or a derivative thereof is fused to the 3'end of the second nucleic acid or a derivative thereof.
  • [14] A pharmaceutical composition containing the chimeric molecule according to any one of [1] to [13] as an active ingredient.
  • [16] A method for cleaving a target nucleic acid, which cleaves the target nucleic acid using the chimeric molecule and nuclease according to any one of [1] to [13].
  • a kit for cleaving a target nucleic acid or a diagnostic kit containing the chimeric molecule according to any one of [1] to [13] and a nuclease [19] The kit according to [18], wherein the nuclease is ribonuclease H.
  • a chimeric molecule capable of suppressing the function of the target nucleic acid at a low concentration and suppressing the off-target effect
  • a pharmaceutical composition containing the chimeric molecule a method for cleaving the target nucleic acid using the chimeric molecule, and the chimera.
  • a kit for cleaving a target nucleic acid containing a molecule or for diagnosis can be provided.
  • Lane 1 is the rudder and base sequence of RNA1
  • lane 2 is when RNase H is added to the complex of DNA 1 and RNA 1 at 60 U / ⁇ L
  • lane 3 is when RNase H is added to the complex of DNA 1 and RNA 1 at 6 U / ⁇ L.
  • lane 4 If you complex added RNaseH of 60U / [mu] L of the P R PD1 and RNA1, lane 5 of RNA1 cuttings by RNaseH in the case of complex added RNaseH of 6U / [mu] L of the P R PD1 and RNA1 Shows a polyacrylamide gel electrophoresis pattern. It is a figure which showed the cleavage position of RNA1 of RNase H in the case of the complex of DNA1-RNA1. In the case of the complex of the P R PD1-RNA1, a diagram showing a cutting position of the RNA1 of RNase H.
  • RNA1 control
  • Lane 6 shows the ladder and base sequence of RNA1.
  • Lane 1 shows the ladder and nucleotide sequence of RNA2, respectively Lanes 2-5 RNA2 (control), DNA2, P R PD7, the PD1 RNA2 cuttings by RNaseH when adding polyacrylamide gel electrophoresis pattern of each ..
  • Lane 1 shows the ladder and nucleotide sequence of RNA1, lanes 2-8 RNA1 (control), P R PD5 (10nM) , P R PD5 (1nM), P R PD5 (0.1nM), DP R P1 ( 10 nM), indicating DP R P1 (1nM), the polyacrylamide gel electrophoresis pattern of RNA1 cleavage product by RNaseH in the case of adding DP R P1 (0.1nM), respectively. It is a figure which showed the cleavage position of RNA of DP R P1-RNA1 complex of RNase H. Show antisense activity of P R PD2 and DNA2 in a cell-free system the translation system.
  • Lanes 1 to 3 show the results in the absence of RNase H, and lanes 4 to 6 show the results in the presence of RNase H. Lanes 1 and 4 are controls, lanes 2 and 5 DNA 2, lanes 3 and 6 show the case of adding P R PD2. Show antisense activity of P R PD5 and DP R P2 in a cell-free system the translation system. Lanes 1, 3 and 5 show the results in the absence of RNase H, and lanes 2, 4 and 6 show the results in the presence of RNase H. Lanes 1 and 2 are controls, lanes 3 and 4 show the case where P R PD5, lanes 5 and 6 with the addition of DP R P2.
  • the chimeric molecule of the present invention has a first nucleic acid or a derivative thereof having an ability to bind to a target nucleic acid and a second nucleic acid having an ability to bind to the target nucleic acid and having an anionic main clavicle. Nucleic acid or a derivative thereof is fused.
  • the nucleic acid derivative is not particularly limited, but the base portion bound to the nucleic acid is uracil, cytosine, thymine, adenine, guanine, a halogenated derivative of a purine ring or a pyrimidine ring, a deamino derivative, and the like.
  • a derivative having a sulfur atom instead of the oxygen atom of each nucleobase can be mentioned.
  • the first nucleic acid or its derivative having the ability to bind to the target nucleic acid preferably has a neutral or cationic main chain skeleton, and more preferably neutral.
  • the neutral main clavicle skeleton is not particularly limited, and examples thereof include an amide skeleton.
  • examples of the nucleic acid having an amide skeleton or a derivative thereof include a peptide nucleic acid or a derivative thereof (hereinafter, may be referred to as Peptide nucleic acid; PNA), a peptide ribonucleic acid or a derivative thereof (Peptide ribonucleic acid; hereinafter, referred to as PRNA).
  • PNA / PRNA a combination of PRNA and PNA (hereinafter, also referred to as PNA / PRNA) and the like.
  • PNA / PRNA the binding position of PRNA in PNA may be any position of PNA, and it may be bound in the middle of PNA. For example, it may be a combination such as PNA-PRNA-PNA.
  • the cationic main clavicle is not particularly limited, and examples thereof include an imino skeleton, a phosphate amide, and a phosphoramidite skeleton.
  • examples of the nucleic acid having each skeleton or a derivative thereof include morpholino-type nucleic acid and the like.
  • the main chain skeleton of the second nucleic acid or a derivative thereof having the ability to bind to the target nucleic acid and having an anionic main chain skeleton is not particularly limited, but a sugar-phosphate skeleton is preferable.
  • the nucleic acid having a sugar-phosphate skeleton or a derivative thereof include ribonucleic acid (Ribonucleic acid; hereinafter also referred to as RNA), deoxyribonucleic acid (Deoxyribonucleic acid; hereinafter also referred to as DNA) and the like.
  • the target nucleic acid is not particularly limited as long as it is a nucleic acid having a target sequence to which the chimeric molecule of the present invention can bind or a derivative thereof, but RNA or DNA is preferable, and the chimeric molecule of the present invention is used as a pharmaceutical composition.
  • the target nucleic acid is preferably RNA or DNA encoding a protein that causes a disease to be treated with the pharmaceutical composition.
  • the first nucleic acid or its derivative may be fused to any of the 3'ends and 5'ends of the second nucleic acid or its derivative.
  • Examples of the chimeric molecule obtained by fusing the first nucleic acid or its derivative of the present invention with the second nucleic acid or its derivative include, for example, the first nucleic acid or its derivative PNA and the second nucleic acid or the second nucleic acid or Fusion with DNA which is the derivative (hereinafter, also referred to as PNA-DNA chimeric molecule), fusion of the first nucleic acid or PNA / PRNA which is a derivative thereof and DNA which is the second nucleic acid or a derivative thereof.
  • PNA-DNA chimeric molecule examples include, for example, the first nucleic acid or its derivative PNA and the second nucleic acid or the second nucleic acid or Fusion with DNA which is the derivative (hereinafter, also referred to as PNA-DNA chimeric molecule), fusion of the first nucleic acid or PNA / PRNA which is a derivative thereof and DNA which is the second nucleic acid or a derivative thereof.
  • the body etc. can be mentioned.
  • a chimeric molecule in which PNA / PRNA is fused on the 5'side of the DNA (hereinafter, , PNA / PRNA-DNA chimeric molecules, also referred to as P R PD), DNA 3 'chimeric molecule (hereinafter the PNA / PRNA is fused to side, DNA-PNA / PRNA chimeric molecules, also referred to as DP R P) or the like include Be done.
  • the chimeric molecule of the present invention can be produced as follows.
  • the PNA-DNA chimeric molecule which is PNA as the first nucleic acid and DNA as the second nucleic acid, can be produced, for example, as follows.
  • the PNA oligomer can be synthesized by a known solid-stranded peptide synthesis method.
  • it can be synthesized by the Fmoc-solid phase peptide synthesis method (Solid phase peptide synthesis; hereinafter also referred to as the Fomc-SPPS method) using a benzoyl group-protected Fmoc PNA monomer by the following steps.
  • the N-terminal or C-terminal lysine residue is introduced to improve water solubility and suppress the acyl transfer reaction.
  • the synthesis can be carried out by a known method using NovaSyn (registered trademark) TGR resin or the like.
  • the condensation reaction of the benzoyl group-protected Fmoc-PNA monomer is, for example, Fmoc-PNA (Bz) -OH (10 equivalents), HATU (1- [bis (dimethylamino) methylilyl] -1H-1,2,3-triazolo [ 4,5-b] pyridine-3-oxide hexafluorophosphate; 10 eq It can be carried out by treating with a solution (-methylpyrrolidone) for 30 minutes. The Fmoc group can be removed by treatment with an NMP solution containing 20% piperidine for 20 minutes. These coupling and Fmoc group removal steps are repeated until the desired sequence is reached.
  • Deprotection of the benzoyl group can be performed by treating with 28% aqueous ammonia at 60 ° C. Finally, dissociation and deprotection of the Boc group of the lysine residue is performed by treatment with a TFA (trifluoroacetic acid) / TIPS (triisopropylsilane) / phenol / water (94: 3: 1: 2) mixture.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • TIPS triisopropylsilane
  • phenol / water 94: 3: 1: 2
  • the PNA-DNA chimeric molecule can be synthesized by applying a benzoyl-protected Fmoc monomer synthesized by a known method to a target sequence, for example, as follows.
  • the N-terminal of the PNA molecule is modified with glycine to suppress the acyl rearrangement reaction.
  • Synthesis begins with the construction of DNA molecules by a DNA / RNA automated synthesizer using a CPG resin attached to an adenine residue for DNA synthesis.
  • the DNA molecule can be extended by the usual phosphoamidate method using 5-BMT as an activator.
  • the 5'-amino-modified deoxynucleotide derivative is introduced into the 5'end of the DNA molecule using a 5'-MMTr (monomethoxytrityl) aminodeoxynucleotide phosphoamidate prepared by a known method.
  • the MMTr group at the 5'end of the DNA is removed by treatment with a 3% TCA / DCM solution for 15 minutes.
  • Fmoc-SPPS method using the 5'amino group of DNA.
  • Condensation reaction with benzoyl-protected FmocPNA is performed in NMP solution containing Fmoc-PNA (Bz) -OH (10 eq), HATU (10 eq), HOAt (10 eq) and DIEA (20 eq) for 30 minutes. Do. Acetyl capping of unreacted amino groups on the resin can be done with 25% acetic anhydride / DCM. The Fmoc group can be removed by 20% piperidine / NMP treatment. These coupling, acetyl capping, and Fmoc removal steps are repeated until the target sequence is obtained.
  • the RPNA monomer can be introduced at a specific position of the PNA molecule based on the Fmoc-SPPS method.
  • the PRNA monomer (Fmoc- ⁇ PRNA-OH) can be prepared, for example, by the following steps.
  • the crude product is purified by reverse phase HPLC, and the purified product can be identified by MALDI-TOF-MS.
  • Synthesis was performed using NovaSyn (registered) using a condensing reagent of 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylarbodiimide hydrochloride (EDC ⁇ HCl) and 4-dimethylaminopyridine in a DMF (N, N-dimethylformamide) solution. Trademark) Start by introducing Fmoc-Gly-OH on TGA reagent.
  • Fmoc-Gly functional TGA resin for the Fmoc-SPPS method.
  • PNA / PRNA molecules can be synthesized by extension by the Fmoc-SPPS method using benzoyl-protected Fmoc-PNA and Fmoc- ⁇ PRNA monomers.
  • the coupling conditions the same conditions as those for the PNA-DNA chimeric molecule can be used.
  • the 2', 3'-hydroxy groups of the PRNA molecule are protected with acetyl groups.
  • the DNA molecule After removal of the N-terminal Fmoc group, the DNA molecule is extended from the N-terminal amino group of the PNA / PRNA molecule bound by a phosphoamidate bond by a known phosphoamidate method using a DNA synthesizer. Finally, dissociation and deprotection are performed with 28% ammonia.
  • the obtained crude product can be purified by reverse phase HPLC, and the purified product can be identified by MALDI-TOF-MS.
  • the complex consisting of the chimeric molecule of the present invention and the target nucleic acid bound to the chimeric molecule specifically binds to a nuclease.
  • ribonuclease H is preferably used, but the nuclease is not limited to this, and it is sufficient that it specifically binds to the complex, and there is no particular limitation on the type of ribonuclease.
  • the nuclease has a site that recognizes the second nucleic acid or a derivative thereof (hereinafter, also referred to as a nucleic acid recognition site) and a nuclease active site that cleaves the target nucleic acid. Since the nucleic acid recognition site of the nuclease has a channel structure composed of basic amino acid residues, it binds to the second nucleic acid or a derivative thereof having an anionic skeleton. When the second nucleic acid or its derivative binds to the nucleic acid recognition site, the first nucleic acid or its derivative fused with the second nucleic acid or its derivative is attracted to the cleavage active site of the nuclease.
  • the target nucleic acid can be selectively cleaved at the fusion (junction) site between the first nucleic acid or its derivative and the second nucleic acid or its derivative.
  • the chimeric molecule of the present invention can cleave the target sequence bound to the chimeric molecule of the present invention at the fusion (junction) site between the first nucleic acid or its derivative and the second nucleic acid or its derivative.
  • the target nucleic acid can be cleaved at a target position.
  • the melting temperature (Tm) of both target nucleic acid fragments after cleavage with the nuclease is preferably body temperature or lower, for example, 38 ° C. or lower, 37 ° C. or lower, 30 ° C. or lower, 25 ° C. It may be as follows. By setting the Tm of both target nucleic acid fragments to body temperature or lower, both target nucleic acid fragments generated by cleaving in one place with the nuclease can be rapidly dissociated from the nuclease. On the other hand, after cleavage of the target nucleic acid by nuclease, the chimeric molecule of the present invention rapidly dissociates from the nuclease.
  • the chimeric molecule of the present invention is rapidly used for cleavage of the next target nucleic acid, and cleavage of the target nucleic acid by the nuclease. Highly efficient turnover is possible. Therefore, the chimeric molecule of the present invention can cleave the target nucleic acid at a low concentration, so that the off-target effect can be reduced.
  • composition of the present invention contains the chimeric molecule of the present invention as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition is not particularly limited, and examples thereof include pharmaceutical compositions for treating diseases caused by proteins encoded by the target nucleic acid targeted by the chimeric molecule of the present invention, and examples thereof include anti-pharmaceutical compositions. Examples include tumor agents and therapeutic agents for ischemic brain diseases. Since the pharmaceutical composition of the present invention can cleave the target nucleic acid by the endogenous nuclease and suppress the expression of the protein encoded by the target nucleic acid, the disease caused by the protein encoded by the target nucleic acid can be treated. can do. In principle, any protein encoded by the target nucleic acid can be used as long as it is a target of the pharmaceutical composition of the present invention.
  • TGF ⁇ or cancer which is a therapeutic target for idiopathic pulmonary fibrosis.
  • the protein targeted by the pharmaceutical composition of the present invention include p53, which is a therapeutic target of the above, oncogene ras, and VEGF165, which is a therapeutic target of age-related macular degeneration.
  • the diseases are not particularly limited, and are cancer, ischemic brain disease, age-related yellow spot degeneration, familial hypercholesterolemia, muscular dystrophy, dementia, NASH, liver cirrhosis, idiopathic pulmonary fibrosis, liver disease, and self.
  • Immune diseases, renal diseases, hematopoietic diseases, atopic skin diseases, psoriasis and the like can be mentioned.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be in various forms, such as liquid (for example, injection), dispersant, suspension, tablet, pill, powder, suppository and the like.
  • a preferred embodiment is an injection, which is preferably administered parenterally (eg, intravenously, transdermally, intraperitoneally, intramuscularly).
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not only used as a single agent depending on the above dosage form, but also the dosage form and delivery system used for administration such as a nucleic acid drug having a different composition or a combination drug with a small molecule drug or an antibody drug. You just have to choose the most suitable one. Further, by using the pharmaceutical composition of the present invention as it is or by modifying it, various administration methods such as encapsulation in micelles and a form bound to an antibody drug can be selected.
  • the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on the type of disease, the type of target nucleic acid, etc., but is, for example, 0.025 to 50 mg / kg, preferably 0.1 to 50 mg / kg, and more preferably 0.1 to 50 mg / kg. It can be 25 mg / kg, more preferably 0.1-10 mg / kg or 0.1-3 mg / kg, but is not limited to this.
  • the method for cleaving the target nucleic acid of the present invention uses the chimeric molecule of the present invention and a nuclease. Examples of the nuclease include those described above. Since the target sequence can be specifically cleaved by the method for cleaving the target nucleic acid of the present invention, sequence-selective target nucleic acid cleavage, genome editing tools, and other diseases caused by the protein encoded by the target nucleic acid can be used. It can be used for diagnosis.
  • the target nucleic acid cleavage or diagnostic kit of the present invention comprises the chimeric molecule of the present invention and a nuclease.
  • the nuclease include those described above.
  • the target nucleic acid cleavage kit of the present invention includes other components necessary for detecting the target nucleic acid fragment, such as acrylamide gel, reaction buffer, and reaction vessel. Can be done. Since the target nucleic acid can be specifically cleaved by the target nucleic acid cleavage kit of the present invention, it can be used as a sequence-selective target nucleic acid cleavage and genome editing tool.
  • the diagnostic kit of the present invention can be used for diagnosing a disease caused by a protein encoded by a target nucleic acid targeted by the chimeric molecule of the present invention.
  • the protein encoded by the target nucleic acid targeted by the chimeric molecule of the present invention include those described above.
  • the diagnostic kit of the present invention for example, by detecting whether or not the nucleic acid in the biological sample of the subject can be cleaved by the diagnostic kit of the present invention, the target nucleic acid is contained in the biological sample of the subject.
  • the biological sample is not particularly limited, and examples thereof include blood, saliva, urine, cerebrospinal fluid, bone marrow fluid, pleural effusion, ascites, joint fluid, tear fluid, aqueous humor, vitreous fluid, and lymph fluid.
  • the components of the diagnostic kit of the present invention into the body, structural changes and physicochemical changes of the detection probe molecules caused by the internal environment, the presence / absence of target molecules, the concentration, etc. are detected in vitro.
  • Example 1 Production of PNA-DNA chimeric molecule
  • the PNA-DNA chimeric molecule was synthesized by automatic DNA synthesis and the Fmoc-SPPS method using a CPG resin. Synthesis started with the construction of DNA molecules using an automated DNA synthesizer. CPG resin carrying a 2'-deoxyadenosine residue For DNA synthesis, a CPG resin (1 ⁇ M scale) bound to an adenine residue is introduced into a DNA synthesizer, and 5-BMT is used with the DNA molecule as an activator. It was elongated by the usual phosphoamidate method. The concentration of the phosphoamidate solution was 70-78 mM in aceronitrile.
  • the 5'-amino-modified deoxycytidine derivative was introduced into the 5'end of the DNA molecule using 5'-MMTrNH deoxycytidine phosphoamidate prepared by a known method. After introduction of the 5'-amino-modified derivative by the DNA synthesizer using the final trityl "ON" step, the resin was removed from the DNA synthesizer and transferred to the reaction column for the Fmoc-SPPS step. The MMTr group at the 5'end of the DNA was removed by treatment with 3% TCA / DCM solution for 15 minutes.
  • PNA was extended by the Fmoc-SPPS method using the 5'amino group of DNA as the basis of the amide bond.
  • the resin was treated with 20% piperidine / NMP to make the surface amino groups basic, filtered, and washed with NMP 5 times or more.
  • Condensation reactions using benzoyl group-protected Fmoc PNA monomers are NMP solutions containing Fmoc-PNA (Bz) -OH (10 eq), HATU (10 eq), HOAt (10 eq) and DIEA (20 eq). It was carried out by a treatment using (300 ⁇ L). After reacting at room temperature for 30 minutes with occasional vigorous stirring, the solution was removed and the resin was washed 3 or more times with NMP.
  • the resin was removed from the DNA synthesizer and transferred to the reaction column for the Fmoc-SPPS step.
  • the MMTr group at the 5'end of the DNA was removed by treatment with 3% TCA / DCM solution for 15 minutes.
  • the PNA was then extended by the Fmoc-SPPS method using the 5'amino group of DNA as the basis for the amide bond.
  • the resin was treated with 20% piperidine / NMP to make the surface amino groups basic, filtered, and washed with NMP 5 times or more.
  • Condensation reactions using benzoyl group-protected Fmoc PNA monomers are NMP solutions containing Fmoc-PNA (Bz) -OH (10 eq), HATU (10 eq), HOAt (10 eq) and DIEA (20 eq). The treatment was performed using (300 ⁇ L). After reacting at room temperature for 30 minutes with occasional vigorous stirring, the solution was removed and the resin was washed 3 or more times with NMP.
  • Example 3 DP R P manufacturing Fmoc-Gly-OH (30mg, 100 ⁇ mol) and EDC ⁇ HCl (19mg, 100 ⁇ mol) was dissolved in DMF (1.0 mL), the solution was stirred under ice cooling for 35 minutes. Remove ice cooling and add NovaSyn® TGA resin (42 mg, 10 ⁇ mol of hydroxy group) in DMF and DMAP (1.2 mg, 10 ⁇ mol) to the solution to obtain DMF and DMAP (1.2 mg, 10 ⁇ mol). The resulting mixture was stirred at room temperature for 1.5 hours. The resin was filtered and washed continuously with NMP, DCM / ethanol (1: 1, v / v) and DCM.
  • the Fmoc-Gly functional TGA resin (1 ⁇ mol scale) obtained above was washed with NMP and treated with 20% piperidine / NMP at room temperature for 20 minutes to remove the Fmoc protecting group. After thorough washing with NMP, the resin is prepared with Fmoc-PNA (Bz) -OH or Fmoc- ⁇ RPNA-OH (10 eq), HOAt (10 eq), HATU (10 eq) and DIEA (20 eq). It was added to NMP solution (300 ⁇ L) and the mixture was left at room temperature for 30 minutes with occasional shaking, and this coupling step was repeated twice. After washing with NMP and DCM, the resin was treated with 25% acetic anhydride / DCM at room temperature for 10 minutes.
  • the resin was washed with DCM and then with NMP. Fmoc was then removed by 20% piperidine / NMP treatment for 20 minutes at room temperature. The same Fmoc removal, coupling and capping steps were used to extend the PNA-PRNA strand.
  • the resin was thoroughly washed with NMP and DCM and washed with pyridine. Acetic anhydride / DCM (2: 3, v / v) was then added to the resin and left at room temperature for 2 hours with occasional shaking to protect the 2'3'hydroxy groups of the PRNA molecule.
  • the resin was transferred to an empty column for an automated DNA / RNA synthesizer and the resin-containing column was placed in the DNA / RNA synthesizer.
  • the DNA strand was extended by a conventional phosphoamidate method using a 5'-O-DMTr-3'-O- (2-cyanoethyl) phosphoamidate construction block.
  • RNA cleavage activity by RNase measurement P R PD ⁇ RNA complex of RNase activity was examined as follows. Nucleotide sequence of target, 5'-FAM label RNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 12; the (5'-FAM-GAAUCUUAUAGUCUUGCA-3 'RNA1), the P R PD1 obtained in Example 2 Mixed with 0.1 eq. The mixture was annealed to form a P R PD ⁇ RNA complex. Next, 60 U / ⁇ L of RNase H was added to the mixture and reacted at 37 ° C. to cleave RNA1.
  • RNA1 As shown in FIGS. 1 and 4, in the case of DNA1 using 60 U / ⁇ L of RNase H, 54% of RNA1 was cleaved. In contrast, in the case of P R PD1, it is cut RNA1 of 99% or more, which means saturation of the activity of RNase H. Therefore, the same RNA cleavage experiment was performed by reducing the amount of RNase H to 6 U / ⁇ L. As a result, as shown in FIG. 1 and Table 4, in the case of DNA1, whereas the extent of cleavage of RNA1 was reduced to 12% in the case of P R PD1, cleavage of RNA1 is 90% or more It was maintained. As a result, RNase H, as compared to DNA1 ⁇ RNA1 complex, it has been found that shows the 8-fold higher RNA1 cleavage activity in P R PD1 ⁇ RNA1 complex.
  • DNA1 as shown in FIG. 2A, it was cleaved at a plurality of positions.
  • the minimum DNA base length to which RNase H binds is 5-6 bases, which corresponds to the distance between the DNA binding channels of RNase H.
  • DNA molecules of P R PD1 is accurately recognized by the DNA binding channel of RNaseH to introduce one cutting position, consisted 7DNA nucleobase.
  • a DNA / RNA heterocomplex using 5 to 6 base pairs can be bound at several positions. This induces RNA cleavage at multiple sites. Based on these, the promotion of RNA cleavage is explained as follows.
  • RNase H does not have nucleotide sequence selectivity for the target RNA, in the case of DNA1, there are various cleavage sites of the complex with the target RNA, and it is highly possible that one cleavage does not induce dissociation of the complex, and ASO- From the cleaved RNA-RNase H complex, the cleaved RNA cannot be dissociated and the number of DNA1 turnovers is low.
  • the P R PD1 is a chimeric molecule of the present invention
  • one portion of the target RNA particularly any complex stability after cutting can be realized cutting before and after sequence of body temperature (37 ° C.) or less
  • the complex can be efficiently dissociated by one cleavage and can be bound to other uncut target RNAs, and the number of turnovers can be dramatically improved. This was demonstrated by calculating the Tm of the complex of ASO and both fragments of the cleaved RNA1 and DNA1 complex after cleavage by actual measurement and the closest base method using thermodynamic parameters.
  • the Tm of the complex of RNA fragment and DNA1 after cleavage was 37 ° C. or lower, but the probability of formation was not high. For this reason, a plurality of RNase H cleavages are generally required for complex dissociation, and the turnover number of RNase H cleavages is suppressed.
  • RNA1 ⁇ P R PD1 greatly reduces the temperature stability of the complex compared to the previous RNA cleavage. Therefore, a single RNase H cleavage dissociates the complex, allowing ASO to immediately form a complex with an uncut target RNA, resulting in an increased number of RNase H cleavage turnovers for all RNA1 in this experiment. Is disconnected. To confirm this, it was calculated Tm of the cut RNA ⁇ P R PD1 complex.
  • the major cleavage site was one of site a.
  • the generated fragments, complexes with DNA molecules of P R PD1 cleaved RNA ⁇ DNA complex
  • PNA / PRNA molecule P R PD1 cleaved RNA ⁇ PNA / PRNA to form different types of complex and complex with P R PD1 such as complexes.
  • RNA1 has been reported to form an unstable complex with DNA / RNA under physiologically high salt concentration conditions. From this, it is considered that this low temperature stability of the cleaved RNA / PNA / PRNA complex is reasonable. From the above, the cutting of RNA1 in selective one position in PNA-DNA fusion unit generates a RNA fragment having a temperature stability of body temperature (37 ° C.) or less, efficient for P R PD1 Recognized as a turnover.
  • RNA1 the (1 [mu] M) and RNaseH (0.6U / ⁇ L), was reacted DNA1, P R PD4, P R PD1 or PD2 (10nM) 37 °C 30 minutes in the presence.
  • the results are shown in FIG. 3 and Table 5.
  • RNA1 cleavage In the case of DNA1, the amount of RNA1 cleavage was very small. In contrast, cleavage of more than 90% of RNA1 at 10nM presence of P R PD4 and P R PD1 was observed. For even PD2, RNase H activity of the same level are shown as compared to P R PD4 and P R PD1.
  • RNA2 (5'-FAM-UAAGAAGGAGAUAUAUC-3') having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 14.
  • FIGS. 4 and 6 The results are shown in FIGS. 4 and 6.
  • RNA2 In the case of DNA2, 52% of RNA2 was cleaved. The P R PD7 presence, cleavage of RNA2 of 76% was observed, which was compared to 1.5 times the RNaseH activity and DNA 2. The contrast in the case of PD1, RNA2 cutting amount is 40%, which was 1.9 times lower than P R PD7.
  • the introduction of PRNA into the chimeric molecule makes it possible to promote RNase H activity, which is believed to be due to RNA-selective binding to the formation of type A complexes with the target RNA.
  • RNA1 was mixed with 1/100, 1/1000 or 1/10000 equivalent amount of DP R P1 or P R PD5, to form a respective annealed complex. Then, 6 ⁇ 10 -3 U / ⁇ L of RNase H was added and reacted at 37 ° C. for 30 minutes. The results are shown in FIGS. 5 and 7.
  • DP R P1 is, RNA was cut at a position 3-4 bases from the 3 'end of the RNA.
  • the main cutting sites are shown in FIG. Cleavage activity was 43% in the case of 10nM of DP R P1, which, as compared with the case of the DP R P5 (73%), was 1.7-fold lower.
  • the lower cleavage activity of DP R P1 is believed to be due to limiting RNA1 cutting position.
  • the cutting position is one point of the PNA-DNA junction.
  • k cat values of RNA cleavage reaction by the P R PD1 ⁇ RNA1 complex and RNaseH was 1.9 times than DNA ⁇ RNA complex.
  • RNase H as compared to the corresponding DNA ⁇ RNA complexes, although P R PD1 ⁇ RNA1 complex slight cleavage efficiency shows that the improved, target RNA cleavage as shown in FIG. 3 The improvement rate is clearly lower than in the experiment.
  • RNaseH indicates P R PD1 ⁇ RNA1 complex and high cleavage activity, binding Mika Erishisu Menten multiplier and P R PD1 ⁇ RNA1 complex of RNaseH (Km) is, DNA. It was larger than the RNA complex.
  • DP R P1 For DP R P1, k cat values for RNA cleavage activity by RNaseH was smaller than DNA ⁇ RNA complex. This result, DP R P1 indicates that exhibit low cleavage activity compared to the corresponding DNA.
  • the Vmax value of RNA cleavage was 1.7 times or more that of the DNA / RNA complex, but the Km value was 5.2 times or more that of the DNA / RNA complex.
  • the higher Km value compared to this DNA / RNA complex is thought to be due to the fact that the natural DNA skeleton induces a decrease in RNase H recognition by substituting for the PNA-PRNA skeleton.
  • Km values of DP R P1 ⁇ RNA1 complex is lower than P R PD1-RNA1, which is recognized of RNaseH of DP R P1 ⁇ RNA1 complex, compared to the P R PD1 ⁇ RNA1 complex Shows that it is being promoted.
  • the Km values are different between the DP R P1 ⁇ RNA1 and P R PD1 ⁇ RNA1 the recognition sites of DP R P1 ⁇ RNA1 complex by RNaseH is different from the recognition site for P R PD1-RNA1 complex I support that.
  • the cleavage reaction shown in FIG. 5 also supports that the recognition sites are different. Different RNaseH activity between the P R PD and DP R P is not only RNA cleavage positions are considered to be dependent on the recognition of and RNaseH catalytic cleavage activity of RNaseH (k cat / Km). This kcat / Km value can be determined by the substrate concentration, which depends on the kinetic analysis of the RNA cleavage reaction of RNase H. As shown in Table 8, P k cat / Km values of R PD and DP R P were almost the same order (P R PD ⁇ RNA: 1.67 ⁇ 10 6 s -1 M -1, DP R P ⁇ RNA: 1.97 ⁇ 10 6 s -1 M -1).
  • the turnover efficiency of the chimeric molecule is mainly controlled by the cleavage position of RNA. From these results, it was found that the cleavage position of RNase H is important for promoting RNA cleavage activity and chimeric turnover efficiency.
  • a chimeric molecule capable of suppressing the function of the target nucleic acid at a low concentration and suppressing the off-target effect
  • a pharmaceutical composition containing the chimeric molecule a method for cleaving the target nucleic acid using the chimeric molecule, and the chimera.
  • a kit for cleaving a target nucleic acid containing a molecule or for diagnosis can be provided.

Abstract

標的核酸に対して結合する能力を有する第１の核酸又はその誘導体と、前記標的核酸に対して結合する能力を有し、主鎖骨格が陰イオン性である第２の核酸又はその誘導体とが融合したキメラ分子、前記キメラ分子を含む医薬組成物、前記キメラ分子を用いる標的核酸の切断方法、及び、前記キメラ分子を含む標的核酸切断用又は診断用キット。

Description

キメラ分子、医薬組成物、標的核酸の切断方法、及び、標的核酸切断用又は診断用キット
　本発明は、キメラ分子、医薬組成物、標的核酸の切断方法、及び、標的核酸切断用又は診断用キットに関する。
　本願は、２０１９年７月２４日に、日本に出願された特願２０１９－１３６４１４号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　近年、核酸医薬が抗体医薬と同様に次世代型分子標的薬として注目されている。特に、核酸医薬は、抗体医薬では治療できない疾患も対象となる。また化学合成により比較的安価に供給できること等多数の利点を有し、抗体医薬同様に、ポスト低分子医薬としての地位が確立されつつある。
　核酸医薬には多数の薬剤戦略が報告されているが、例えば、アンチセンス核酸（ＡＳＯ）は疾患進行に関与するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）やマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、エスアイＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）などを標的とし、塩基配列選択的に標的を認識し、複合体を形成することで標的ＲＮＡの機能を抑制し治療効果を発現する。これら核酸医薬が有効に薬効発現するためには、１）高い生体内安定性、２）標的核酸への高い特異性と複合体安定性が求められ、天然型ＤＮＡ／ＲＮＡに化学修飾を施した修飾オリゴ核酸／人工オリゴ核酸の開発が精力的に研究されている。
　これまで優れた修飾あるいは人工核酸が報告されているものの、標的核酸と類似配列を有する非標的核酸への結合に起因する副作用（狭義のオフターゲット効果）、標的核酸認識に依存しない核酸医薬特有の毒性（広義のオフターゲット効果）の発現が実用化に向けて解決すべき課題として指摘され、その低減・改善が世界的に研究されている。
　広義のオフターゲット効果の克服へ向けた方法論として、核酸医薬の投与量の低減が提案されている。しかし、投与量を低減すると当然標的ＲＮＡとの複合体形成量の低下が起こり、効果的な薬効発現は期待出来ない。具体的には、細胞内導入量がｓｕｂ－ｎＭレベルが限界と報告されているＡＳＯを用いて、発現量がｓｕｂ－μＭレベルのｍＲＮＡを標的とする系ではもちろん、ｎＭ－ｐＭレベルの細胞内発現量で機能を発揮するｍｉＲＮＡを標的とする系でもフィードバック機構が報告され、標的ＲＮＡとＡＳＯの１：１複合体形成に基づく薬効発現戦略では、十分な治療効果が期待できないことが指摘されている。
　本課題の解決法として、少量のＡＳＯで標的ＲＮＡを触媒のように切断する、ＲＮａｓｅＨを活用した触媒様の機能を有する核酸医薬が注目されている（非特許文献１）。
Liang, X. et al., Mol. Ther. 2017, 25, 2075
　本発明は、低濃度で標的核酸の機能を抑止でき、オフターゲット効果を抑制できるキメラ分子、前記キメラ分子を含む医薬組成物、前記キメラ分子を用いる標的核酸の切断方法、及び、前記キメラ分子を含む標的核酸切断用又は診断用キットを提供することを目的とする。
　本発明者らは、ＲＮａｓｅによる標的ＲＮＡの切断効率向上には、代謝回転数の増加が有効であると考えた。この観点から、ＲＮＡ切断後の解離過程に着目することで、切断後標的ＲＮＡの複合体から迅速解離可能なオリゴ核酸系構築に資する設計法を提案し、実証実験に成功した。本方法を利用すれば、低濃度で標的核酸の機能を抑止でき、オフターゲット効果を抑制できることを見出したことから、本発明を完成させた。
　本発明は以下の態様を含む。
［１］　標的核酸に対して結合する能力を有する第１の核酸又はその誘導体と、前記標的核酸に対して結合する能力を有し、主鎖骨格が陰イオン性である第２の核酸又はその誘導体とが融合したキメラ分子。
［２］　前記第１の核酸又はその誘導体の主鎖骨格が、中性又は陽イオン性である、［１］に記載のキメラ分子。
［３］　前記第１の核酸又はその誘導体の主鎖骨格が、アミド骨格である、［２］に記載に記載のキメラ分子。
［４］　前記第２の核酸又はその誘導体の主鎖骨格が、糖－リン酸骨格である、［１］～［３］のいずれか一項に記載のキメラ分子。
［５］　前記第１の核酸又はその誘導体が、前記第２の核酸又はその誘導体の５’末端に融合している、［１］～［４］のいずれか一項に記載のキメラ分子。
［６］　前記第１の核酸又はその誘導体が、前記第２の核酸又はその誘導体の３’末端に融合している、［１］～［４］のいずれか一項に記載のキメラ分子。
［７］　前記キメラ分子と前記キメラ分子に結合した前記標的核酸とからなる複合体が、ヌクレアーゼに対して特異的に結合する、［１］～［６］のいずれか一項に記載のキメラ分子。
［８］　前記ヌクレアーゼが、前記第１の核酸又はその誘導体と、前記第２の核酸又はその誘導体との融合部分で前記標的核酸を切断する、［７］に記載のキメラ分子。
［９］　前記ヌクレアーゼで切断後の標的核酸両断片の融解温度Ｔｍが、３８℃以下である、［８］に記載のキメラ分子。
［１０］　前記ヌクレアーゼが、リボヌクレアーゼＨである、［７］～［９］のいずれか一項に記載のキメラ分子。
［１１］　前記第１の核酸又はその誘導体が、ペプチド核酸又はペプチドリボ核酸もしくはそれらの誘導体である、［１］～［１０］のいずれか一項に記載のキメラ分子。
［１２］　前記第２の核酸又はその誘導体が、ＤＮＡである、［１］～［１１］のいずれか一項に記載のキメラ分子。
［１３］　前記標的核酸が、ＲＮＡ又はＤＮＡである、［１］～[１２]のいずれか一項に記載のキメラ分子。
［１４］　［１］～［１３］のいずれか一項に記載のキメラ分子を有効成分とする医薬組成物。
［１５］　前記医薬組成物が、がん又は虚血性脳疾患である、［１４］に記載の医薬組成物。
［１６］　［１］～［１３］のいずれか一項に記載のキメラ分子とヌクレアーゼとを用いて標的核酸を切断する、標的核酸の切断方法。
［１７］　前記ヌクレアーゼが、リボヌクレアーゼＨである、［１６］に記載の標的核酸の切断方法。
［１８］　［１］～［１３］のいずれか一項に記載のキメラ分子とヌクレアーゼとを含む標的核酸切断用又は診断用キット。
［１９］　前記ヌクレアーゼが、リボヌクレアーゼＨである、［１８］に記載のキット。
　本発明によれば、低濃度で標的核酸の機能を抑止でき、オフターゲット効果が抑制できるキメラ分子、前記キメラ分子を含む医薬組成物、前記キメラ分子を用いる標的核酸の切断方法、及び、前記キメラ分子を含む標的核酸切断用又は診断用キットを提供することができる。
各々の１０倍量の５’末端を蛍光色素で標識したＲＮＡと混合した系を用い、ＰＲＰＤ－ＲＮＡ複合体のＲＮａｓｅＨによる切断物をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した図である。レーン１はＲＮＡ１のラダーと塩基配列、レーン２はＤＮＡ１とＲＮＡ１との複合体にＲＮａｓｅＨを６０Ｕ／μＬ添加した場合、レーン３はＤＮＡ１とＲＮＡ１との複合体にＲＮａｓｅＨを６Ｕ／μＬ添加した場合、レーン４はＰＲＰＤ１とＲＮＡ１との複合体にＲＮａｓｅＨを６０Ｕ／μＬ添加した場合、レーン５はＰＲＰＤ１とＲＮＡ１との複合体にＲＮａｓｅＨを６Ｕ／μＬ添加した場合のＲＮａｓｅＨによるＲＮＡ１切断物のポリアクリルアミドゲル電気泳動パターンを示す。 ＤＮＡ１－ＲＮＡ１の複合体の場合の、ＲＮａｓｅＨのＲＮＡ１の切断位置を示した図である。 ＰＲＰＤ１－ＲＮＡ１の複合体の場合の、ＲＮａｓｅＨのＲＮＡ１の切断位置を示した図である。 各々の１０倍量の５’末端を蛍光色素で標識したＲＮＡと混合した系を用い、ＤＮＡ１、ＰＲＰＤ４、ＰＲＰＤ１又はＰＤ２とＲＮＡ１との複合体のＲＮａｓｅＨによる切断物をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した図である。レーン１はそれぞれＲＮＡ１（対照）、ＤＮＡ１、ＰＲＰＤ４、ＰＲＰＤ１、ＰＤ２を添加した場合のＲＮａｓｅＨによるＲＮＡ１切断物のポリアクリルアミドゲル電気泳動パターンを示す。レーン６はＲＮＡ１のラダーと塩基配列を示す。 各々の１０倍量の５’末端を蛍光色素で標識したＲＮＡと混合した系を用い、ＤＮＡ２、ＰＲＰＤ７又ＰＤ１とＲＮＡ２との複合体のＲＮａｓｅＨによる切断物をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した図である。レーン１はＲＮＡ２のラダーと塩基配列を示し、レーン２～５はそれぞれＲＮＡ２（対照）、ＤＮＡ２、ＰＲＰＤ７、ＰＤ１を添加した場合のＲＮａｓｅＨによるＲＮＡ２切断物のポリアクリルアミドゲル電気泳動パターンをそれぞれ示す。 各々の１０倍量の５’末端を蛍光色素で標識したＲＮＡと混合した系を用い、ＤＰＲＰ１又ＰＲＰＤ５とＲＮＡ１との複合体のＲＮａｓｅＨによる切断物をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した図である。レーン１はＲＮＡ１のラダーと塩基配列を示し、レーン２～８はそれぞれＲＮＡ１（対照）、ＰＲＰＤ５（１０ｎＭ）、ＰＲＰＤ５（１ｎＭ）、ＰＲＰＤ５（０．１ｎＭ）、ＤＰＲＰ１（１０ｎＭ）、ＤＰＲＰ１（１ｎＭ）、ＤＰＲＰ１（０．１ｎＭ）を添加した場合のＲＮａｓｅＨによるＲＮＡ１切断物のポリアクリルアミドゲル電気泳動パターンをそれぞれ示す。 ＲＮａｓｅＨのＤＰＲＰ１－ＲＮＡ１複合体のＲＮＡの切断位置を示した図である。 無細胞系翻訳システムにおけるＰＲＰＤ２とＤＮＡ２のアンチセンス活性を示す。レーン１～３はＲＮａｓｅＨ非存在下、レーン４～６はＲＮａｓｅＨ存在下での結果を示す。レーン１及び４は対照、レーン２及び５はＤＮＡ２、レーン３及び６はＰＲＰＤ２を添加した場合を示す。 無細胞系翻訳システムにおけるＰＲＰＤ５とＤＰＲＰ２のアンチセンス活性を示す。レーン１、３及び５はＲＮａｓｅＨ非存在下、レーン２、４及び６はＲＮａｓｅＨ存在下での結果を示す。レーン１及び２は対照、レーン３及び４はＰＲＰＤ５、レーン５及び６はＤＰＲＰ２を添加した場合を示す。
［キメラ分子］
　本発明のキメラ分子は、標的核酸に対して結合する能力を有する第１の核酸又はその誘導体と、前記標的核酸に対して結合する能力を有し、主鎖骨格が陰イオン性である第２の核酸又はその誘導体とが融合している。
　本発明において、核酸の誘導体としては、特に制限はされないが、核酸に結合している塩基部が、ウラシル、シトシン、チミン、アデニン、グアニン若しくはプリン環やピリミジン環のハロゲン化誘導体、脱アミノ誘導体、または各核酸塩基の酸素原子に代えて硫黄原子を有する誘導体などを挙げることができる。
　前記標的核酸に対して結合する能力を有する第１の核酸又はその誘導体は、その主鎖骨格が中性又は陽イオン性であることが好ましく、中性であることがより好ましい。前記中性の主鎖骨格としては、特に制限はないが、例えば、アミド骨格が挙げられる。前記アミド骨格を有する核酸又はその誘導体としては、例えば、ペプチド核酸又はその誘導体（以下、Ｐｅｐｔｉｄｅ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ；ＰＮＡと称することがある）、ペプチドリボ核酸又はその誘導体（Ｐｅｐｔｉｄｅ　ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ；以下、ＰＲＮＡと称することがある）、ＰＲＮＡとＰＮＡの組み合わせ（以下、ＰＮＡ／ＰＲＮＡとも称する）等が挙げられる。ＰＮＡ／ＰＲＮＡにおいて、ＰＮＡにおけるＰＲＮＡの結合位置は、ＰＮＡのいずれの位置でもよく、ＰＮＡの途中に結合されていてもよい。例えば、ＰＮＡ－ＰＲＮＡ－ＰＮＡのような組み合わせであってもよい。
　前記陽イオン性の主鎖骨格としては、特に制限はないが、例えば、イミノ骨格やリン酸アミド若しくはフォスホロアミダイト骨格等が挙げられる。前記各骨格を有する核酸又はその誘導体としては、例えば、モルホリノ型核酸等が挙げられる。
　前記標的核酸に対して結合する能力を有し、主鎖骨格が陰イオン性である第２の核酸又はその誘導体の主鎖骨格としては、特に制限はないが、糖－リン酸骨格が好ましい。前記糖－リン酸骨格を有する核酸又はその誘導体としては、例えば、リボ核酸（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ；以下、ＲＮＡとも称する）、デオキシリボ核酸（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ；以下、ＤＮＡとも称する）等が挙げられる。
　前記標的核酸としては、本発明のキメラ分子が結合できる標的配列を有する核酸又はその誘導体であれば、特に制限はないが、ＲＮＡ又はＤＮＡが好ましく、本発明のキメラ分子を医薬組成物として用いる場合は、前記標的核酸は、前記医薬組成物を用いて治療する疾患の原因となる蛋白質をコードするＲＮＡ又はＤＮＡが好ましい。
　前記第１の核酸又はその誘導体は、前記第２の核酸又はその誘導体の３’末端、５’末端のいずれに融合していてもよい。
　本発明の前記第１の核酸又はその誘導体と、前記第２の核酸又はその誘導体が融合したキメラ分子としては、例えば、前記第１の核酸又はその誘導体であるＰＮＡと、前記第２の核酸又はその誘導体であるＤＮＡとの融合体（以下、ＰＮＡ－ＤＮＡキメラ分子とも称する）、前記第１の核酸又はその誘導体であるＰＮＡ／ＰＲＮＡと、前記第２の核酸又はその誘導体であるＤＮＡとの融合体等が挙げられる。前記前記第１の核酸又はその誘導体であるＰＮＡ／ＰＲＮＡと、前記第２の核酸又はその誘導体であるＤＮＡとの融合体としては、ＤＮＡの５’側にＰＮＡ／ＰＲＮＡが融合したキメラ分子（以下、ＰＮＡ／ＰＲＮＡ－ＤＮＡキメラ分子、ＰＲＰＤとも称する）、ＤＮＡの３’側にＰＮＡ／ＰＲＮＡが融合したキメラ分子（以下、ＤＮＡ－ＰＮＡ／ＰＲＮＡキメラ分子、ＤＰＲＰとも称する）等が挙げられる。
　本発明のキメラ分子は以下のようにして製造することができる。
　前記第１の核酸としてＰＮＡ、前記標第２の核酸としてＤＮＡである、ＰＮＡ－ＤＮＡキメラ分子は、例えば、以下のようにして製造することができる。
（ＰＮＡオリゴマーの合成）
　ＰＮＡオリゴマーは、公知の固相ペプチド合成法により合成することができる。例えば、ベンゾイル基保護ＦｍｏｃＰＮＡモノマーを用いて、Ｆｍｏｃ－固相ペプチド合成法（Ｓｏｌｉｄ　ｐｈａｓｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；以下、Ｆｏｍｃ－ＳＰＰＳ法とも称する）により、下記に示す工程により合成することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　上記において、Ｎ末又はＣ末のリジン残基は、水溶性の向上と、アシル転移反応抑制のために導入している。合成は、ＮｏｖａＳｙｎ（登録商標）ＴＧＲレジン等を用い、公知の方法により行うことができる。ベンゾイル基保護Ｆｍｏｃ－ＰＮＡモノマーの縮合反応は、例えば、Ｆｍｏｃ－ＰＮＡ（Ｂｚ）－ＯＨ（１０等量）、ＨＡＴＵ（１－［ｂｉｓ（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｍｅｔｈｙｌｉｕｍｙｌ］－１Ｈ－１，２，３－ｔｒｉａｚｏｌｏ［４，５－ｂ］ｐｙｒｉｄｉｎｅ－３－ｏｘｉｄｅ　ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ；１０等量）、ＨＯＡｔ（１－ｈｙｄｒｏｘｙ－７－ａｚａｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ；１０等量）及びＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ－ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ；２０等量）を含むＮＭＰ（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）溶液で３０分間処理することにより行うことができる。Ｆｍｏｃ基は、２０％ピペリジンを含むＮＭＰ溶液で２０分間処理することにより除去することができる。これらのカップリング、Ｆｍｏｃ基の除去工程は、目的とする配列に到達するまで繰り返す。ベンゾイル基の脱保護は、２８％アンモニア水で、６０℃で処理することにより行うことができる。最後に、リジン残基のＢｏｃ基の解離と脱保護をＴＦＡ（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ）／ＴＩＰＳ（ｔｒｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｓｉｌａｎｅ）／フェノール／水（９４：３：１：２）混合液で処理することにより行う。得られた粗生成物は、逆相ＨＰＬＣにより精製することができ、ＥＳＩ－ＴＯＦ－ＭＳにより精製物を同定することができる。
（ＰＮＡ－ＤＮＡキメラ分子の合成）
　ＰＮＡ－ＤＮＡキメラ分子は、公知の方法で合成したベンゾイル保護Ｆｍｏｃモノマーを目的配列に適用し、例えば、下記のようにして合成することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　ＰＮＡ分子のＮ末は、アシル転移反応を抑制するためにグリシンで修飾している。合成は、ＤＮＡ合成のためにアデニン残基に結合しているＣＰＧレジンを用いてＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機によりＤＮＡ分子の構築から開始する。
　ＤＮＡ分子は、アクチベータとして５－ＢＭＴを用いる通常のホスホアミデート法により伸長させることができる。５’－アミノ修飾デオキシヌクレオチド誘導体は、公知の方法により調製した５’－ＭＭＴｒ（モノメトキシトリチル）アミノデオキシヌクレオチドホスホアミデートを用いてＤＮＡ分子の５’末端に導入する。ＤＮＡ合成機による５’アミノ修飾誘導体の導入後、３％ＴＣＡ／ＤＣＭ溶液で１５分間処理することによりＤＮＡの５’末端のＭＭＴｒ基を除去する。次に、ＰＮＡをアミド結合で結合するため、ＤＮＡの５’アミノ基を用いてＦｍｏｃ－ＳＰＰＳ法により伸長させる。
　ベンゾイル保護ＦｍｏｃＰＮＡを用いる縮合反応は、Ｆｍｏｃ－ＰＮＡ（Ｂｚ）－ＯＨ（１０等量）、ＨＡＴＵ（１０等量）、ＨＯＡｔ（１０等量）及びＤＩＥＡ（２０等量）を含むＮＭＰ溶液で３０分間行う。レジン上で未反応のアミノ基のアセチルキャッピングは、２５％無水酢酸／ＤＣＭで行うことができる。Ｆｍｏｃ基は、２０％ピペリジン／ＮＭＰ処理により除去することができる。これらカップリング、アセチルキャッピング、Ｆｍｏｃ除去工程を、目的配列になるまで繰り返す。最後に、ベンゾイル基、及びＤＮＡ分子のシアノエチル基の解離と脱保護を、２８％アンモニアで６０分間処理することにより行う。得られた粗生成物は、逆相ＨＰＬＣにより精製することができ、精製物は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳにより同定することができる。
（ＰＮＡ／ＰＲＮＡ－ＤＮＡキメラ分子；ＰＲＰＤの合成）
　ＤＮＡの５’側にＰＮＡ／ＰＲＮＡが融合した、ＰＲＰＤの合成は、前記ＰＮＡ－ＤＮＡキメラ分子の合成と同様の方法により、例えば、下記に示した工程により行うことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　ＲＰＮＡモノマーは、Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ法に基づきＰＮＡ分子の特定の位置に導入することができる。ＰＲＮＡモノマー（Ｆｍｏｃ－γＰＲＮＡ－ＯＨ）は、例えば、下記の工程により調製することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　粗生成物は逆相ＨＰＬＣ精製し、精製物は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳにより同定することができる。
（ＤＮＡ－ＰＮＡ／ＰＲＮＡキメラ分子；ＤＰＲＰの合成）
　ＤＮＡの３’末端にＰＮＡ／ＰＲＮＡを融合した、ＤＰＲＰの合成は、例えば、Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ法を用い、ＤＮＡ合成機を用いて、以下の工程により行うことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　合成は、１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルアルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）と４－ジメチルアミノピリジンのＤＭＦ（Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）溶液の縮合試薬を用いてＮｏｖａＳｙｎ（登録商標）ＴＧＡレジン上でＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨを導入することにより開始する。
　合成は、Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ法のためにＦｍｏｃ－Ｇｌｙ機能性ＴＧＡレジンを用いることが好ましい。ＰＮＡ／ＰＲＮＡ分子は、ベンゾイル保護Ｆｍｏｃ－ＰＮＡとＦｍｏｃ－γＰＲＮＡモノマーを用いてＦｍｏｃ－ＳＰＰＳ法により伸長することにより合成することができる。カップリング条件は、ＰＮＡ－ＤＮＡキメラ分子と同様の条件を用いることができる。Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳの完了後、ＰＲＮＡ分子の２’、３’－ヒドロキシ基は、アセチル基で保護する。Ｎ末のＦｍｏｃ基の除去後、レジンをＤＮＡ合成機により、公知のホスホアミデート法によりホスホアミデート結合で結合したＰＮＡ／ＰＲＮＡ分子のＮ末端のアミノ基からＤＮＡ分子を伸長する。最後に、解離と脱保護を２８％アンモニアにより行う。得られた粗生成物は、逆相ＨＰＬＣにより精製することができ、精製物は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳにより同定することができる。
（ヌクレアーゼに対する作用）
　本発明のキメラ分子と前記キメラ分子に結合した前記標的核酸とからなる複合体は、ヌクレアーゼに特異的に結合する。前記ヌクレアーゼとしては、リボヌクレアーゼＨが好ましく用いられるが、それに限らず前記複合体に特異的に結合すればよく、特にリボヌクレアーゼの種類に関しての制限はない。
　前記ヌクレアーゼは、前記第２の核酸又はその誘導体を認識する部位（以下、核酸認識部位とも称する）と、標的核酸を切断するヌクレアーゼ活性部位を有する。前記ヌクレアーゼの前記核酸認識部位は、塩基性アミノ酸残基から構成されているチャネル構造を有するため、陰イオン性の骨格を有する前記第２の核酸又はその誘導体と結合する。前記第２の核酸又はその誘導体が、前記核酸認識部位に結合すると、前記第２の核酸又はその誘導体と融合している第１の核酸又はその誘導体が、前記ヌクレアーゼの切断活性部位に引き込まれ、前記第１の核酸又はその誘導体と、前記第２の核酸又はその誘導体の融合（接合）部位において、選択的に標的核酸を切断することができる。
　本発明のキメラ分子は、前記第１の核酸又はその誘導体と、前記第２の核酸又はその誘導体の融合（接合）部位で、本発明のキメラ分子に結合している標的配列を切断できるため、前記誘導部位を標的核酸の切断部位とするキメラ分子を設計することにより、標的核酸を目的とする位置で切断することができる。
　本発明のキメラ分子は、前記ヌクレアーゼで切断後の標的核酸両断片の融解温度（Ｔｍ）が好ましくは、体温以下、例えば、３８℃以下であってよく、３７℃以下、３０℃以下、２５℃以下であってもよい。前記標的核酸両断片のＴｍを体温以下とすることにより、前記ヌクレアーゼで１か所切断されて生ずる標的核酸両断片は、速やかにヌクレアーゼから解離することができる。一方、ヌクレアーゼによる標的核酸の切断後、本発明のキメラ分子は、ヌクレアーゼから速やかに解離するため、本発明のキメラ分子は、速やかに次の標的核酸の切断に用いられ、標的核酸のヌクレアーゼによる切断の高効率なターンオーバーが可能となる。そのため、本発明のキメラ分子は、低濃度で標的核酸を切断することが可能となるため、オフターゲット効果を軽減することができる。
［医薬組成物］
　本発明の医薬組成物は、本発明のキメラ分子を有効成分として含有する。
　本発明において、医薬組成物としては、特に制限はないが、本発明のキメラ分子が標的とする標的核酸がコードする蛋白質が原因となる疾患を治療する医薬組成物等が挙げられ、例えば、抗腫瘍剤、虚血性脳疾患治療剤等が挙げられる。本発明の医薬組成物は、内在性のヌクレアーゼにより、標的核酸を切断し、標的核酸がコードする蛋白質の発現を抑制することができるため、前記標的核酸がコードする蛋白質が原因となる疾患を治療することができる。
　前記標的核酸がコードする蛋白質としては、本発明の医薬組成物の標的になるものであれば原理的には全て可能であり、例えば、特発性肺繊維症の治療標的とされるＴＧＦβやがんの治療標的であるｐ５３ならびにがん遺伝子ｒａｓ、加齢性黄斑変性症の治療標的であるＶＥＧＦ１６５等が、本発明の医薬組成物の標的となる蛋白質の例として挙げられる。
　前記疾患としては、特に制限はなく、がん、虚血性脳疾患、加齢性黄斑変性、家族性高コレステロール血症、筋ジストロフィー、認知症、ＮＡＳＨ、肝硬変、特発性肺線維症、肝疾患、自己免疫疾患、腎疾患、造血系疾患、アトピー性皮膚疾患、乾癬等が挙げられる。
　本発明の医薬組成物は、様々な形態、例えば、液剤（例えば注射剤）、分散剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、粉末剤、坐剤等とすることができる。好ましい態様は、注射剤であり、非経口（例えば、静脈内、経皮、腹腔内、筋内）で投与することが好ましい。
　本発明の医薬組成物としては、上記剤型により単剤で用いるだけでなく、異なる組成の核酸医薬あるいは低分子薬剤や抗体医薬などとの合剤など、投与に用いられる剤型やデリバリーシステムは最適なものを選べばよい。また、本発明の医薬組成物をそのまま、あるいは修飾することで、ミセル内に封入したり、抗体医薬などと結合した形態等様々な投与方法を選択しうる。本発明の医薬組成物は、疾病の種類や標的核酸の種類等により異なるが、例えば、０．０２５～５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１～５０ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは０．１～２５ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは０．１～１０ｍｇ／ｋｇ又は０．１～３ｍｇ／ｋｇとすることができるが、これに限定されない。
［標的核酸の切断方法及び標的核酸切断用又は診断用キット］
　本発明の標的核酸の切断方法は、本発明のキメラ分子と、ヌクレアーゼを用いる。ヌクレアーゼとしては、前記したものが挙げられる。本発明の標的核酸の切断方法により、標的配列を特異的に切断することができるため、配列選択的な標的核酸の切断、ゲノム編集ツールの他、標的核酸がコードする蛋白質が原因となる疾患の診断に用いることができる。
　本発明の標的核酸切断用又は診断用キットは、本発明のキメラ分子と、ヌクレアーゼを含む。ヌクレアーゼとしては、前記したものが挙げられる。本発明の標的核酸切断用キットには、本発明のキメラ分子、及びヌクレアーゼの他に、標的核酸断片検出に必要な他の構成要素、例えば、アクリルアミドゲル、反応緩衝液、反応容器等を含むことができる。本発明の標的核酸切断用キットにより、標的核酸を特異的に切断することができるため、配列選択的な標的核酸の切断、ゲノム編集ツールとして用いることができる。また、本発明の診断用キットは、本発明のキメラ分子が標的とする標的核酸がコードする蛋白質が原因となる疾患の診断に用いることができる。本発明のキメラ分子が標的とする標的核酸がコードする蛋白質としては、前記したものが挙げられる。
　本発明の診断用キットは、例えば、被検者の生体試料中の核酸が、本発明の診断用キットにより切断できるか否かを検出することにより、被検者の生体試料中に標的核酸が含まれているかを判定することができるため、前記被検者が、本発明のキメラ分子が標的とする標的核酸がコードする蛋白質が原因となる疾患に罹患しているかを診断することができる。前記生体試料としては、特に制限はなく、例えば血液、唾液、尿、髄液、骨髄液、胸水、腹水、関節液、涙液、眼房水、硝子体液、リンパ液等が挙げられる。
　また、本発明の診断用キットの構成要素を体内に導入することで、体内環境や標的分子の存在の有無、濃度などにより生ずる、検出プローブ分子の構造変化や物理化学的変化を体外で検出することや、体外から照射あるいは暴露させる光や磁気、超音波、放射線等によるエネルギー変化の外部での検出で高感度に計測することや、画像として可視化する体外診断への応用も可能である。
　次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］ＰＮＡ－ＤＮＡキメラ分子の製造
　ＰＮＡ－ＤＮＡキメラ分子は、ＤＮＡ自動合成及び、ＣＰＧレジンを用いるＦｍｏｃ－ＳＰＰＳ法により合成した。
　合成は、自動ＤＮＡ合成機によりＤＮＡ分子の構築から開始した。２’－デオキシアデノシン残基を担持させたＣＰＧレジンＤＮＡ合成のためにアデニン残基に結合しているＣＰＧレジン（１μＭスケール）をＤＮＡ合成機に導入し、ＤＮＡ分子をアクチベータとして５－ＢＭＴを用いる通常のホスホアミデート法により伸長させた。ホスホアミデート溶液の濃度は、アセロニトリル中で７０～７８ｍＭとした。５’－アミノ修飾デオキシシチジン誘導体は、公知の方法により調製した５’－ＭＭＴｒＮＨデオキシシチジンホスホアミデートを用いてＤＮＡ分子の５’末端に導入した。最終のトリチル“ＯＮ”工程を用いて、ＤＮＡ合成器による５’－アミノ修飾誘導体の導入後、レジンをＤＮＡ合成機から外し、Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ工程のための反応カラムに移した。３％ＴＣＡ／ＤＣＭ溶液で１５分間処理することによりＤＮＡの５’末端のＭＭＴｒ基を除去した。
　次に、ＰＮＡをアミド結合の基礎としてのＤＮＡの５’アミノ基を用いてＦｍｏｃ－ＳＰＰＳ法により伸長させた。レジンは、表面のアミノ基を塩基性とするため２０％ピペリジン／ＮＭＰで処理し、ろ過し、ＮＭＰで５回以上洗浄した。ベンゾイル基保護ＦｍｏｃＰＮＡモノマーを用いた縮合反応は、Ｆｍｏｃ－ＰＮＡ（Ｂｚ）－ＯＨ（１０等量）、ＨＡＴＵ（１０等量）、ＨＯＡｔ（１０等量）及びＤＩＥＡ（２０等量）を含むＮＭＰ溶液（３００μＬ）を用いる処理により行った。時々強く撹拌しながら、３０分間室温で反応させた後、溶液を除去し、レジンをＮＭＰで３回以上洗浄した。
　次に、ＮＭＰ中２０％ピペリジン溶液をレジンに添加し、２０分間時々撹拌し、Ｆｍｏｃ基を除去した。Ｆｍｏｃ基除去の完了後、レジンをＮＭＰで５回以上洗浄した。縮合反応とＦｍｏｃ除去工程は目的のＰＮＡ－ＤＮＡキメラ分子の配列を構築するまで繰り返した。
　最後に、ＰＮＡ残基のＮ末アミノ基内の分子アシル転移を抑制するため、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨを上記と同じ縮合条件により導入した。Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ工程が完了後、レジンを２８％アンモニア溶液で６０℃下１６時間処理することにより、全ての保護基を除去し、レジンから分離した。次に、レジンをろ過により除去し、ろ液を濃縮した。粗生成物は、ＣＯＳＭＯＳＩＬ　５Ｃ１８－ＡＲ－IIカラム（ナカライテスク、１０Φ×２５０ｍｍ）を用い、流速３ｍＬ／ｍｉｎで、溶媒Ａ：０．１Ｍ　ＴＥＡＡ緩衝液（ｐＨ７．５）、溶媒Ｂ：０．１Ｍ　ＴＥＡＡ（ｐＨ７．５）／アセトニトリル（１：１、ｖ／ｖ）で５％から７０％のリニアグラジエントで３０分間の条件で逆相ＨＰＬＣを用いて精製した。
　上記の方法により、下記表１に示す２種のＰＮＡ－ＤＮＡキメラ分子（ＰＤ１、ＰＤ２）を製造した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
［実施例２］ＰＲＰＤの製造
　ＤＮＡの５’末端側にＰＮＡ／ＰＲＮＡが融合したＤＮＡ－ＰＮＡ／ＰＲＮＡキメラであるＰＲＰＤは、ＤＮＡ自動合成機とＣＰＧレジンを用いたＦｍｏｃ工程の組み合わせにより合成した。
　合成は、自動ＤＮＡ合成によりＤＮＡ分子の構築から開始した。２’デオキシヌクレオシド残基を担持したＣＰＧレジン（１μＭスケール）をＤＮＡ合成機に導入し、ＤＮＡ分子をアクチベータとして５－ＢＭＴを用いる通常のホスホアミデート法により伸長させた。ホスホアミデート溶液の濃度は、アセロニトリル中で７０～７８ｍＭとした。５’アミノ修飾デオキシヌクレオシド誘導体は、公知の方法により調製した５’－ＭＭＴｒＮＨデオキシシチジンホスホアミデートを用いてＤＮＡ分子の５’末端に導入した。
　最終のトリチル“ＯＮ”工程を用いてＤＮＡ合成機による５’アミノ修飾誘導体の導入後、レジンをＤＮＡ合成機から外し、Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ工程のための反応カラムに移した。３％ＴＣＡ／ＤＣＭ溶液で１５分間処理することによりＤＮＡの５’末端のＭＭＴｒ基を除去した。
　次に、ＰＮＡをアミド結合の基礎としてのＤＮＡの５’アミノ基を用いてＦｍｏｃ－ＳＰＰＳ法により伸長させた。レジンは、表面のアミノ基を塩基性とするため２０％ピペリジン／ＮＭＰで処理し、ろ過し、ＮＭＰで５回以上洗浄した。
　ベンゾイル基保護ＦｍｏｃＰＮＡモノマーを用いた縮合反応は、Ｆｍｏｃ－ＰＮＡ（Ｂｚ）－ＯＨ（１０等量）、ＨＡＴＵ（１０等量）、ＨＯＡｔ（１０等量）及びＤＩＥＡ（２０等量）を含むＮＭＰ溶液（３００μＬ）を用いる処理で行った。時々強く撹拌しながら、３０分間室温で反応させた後、溶液を除去し、レジンをＮＭＰで３回以上洗浄した。
　次に、ＮＭＰ中２０％ピペリジン溶液をレジンに添加し、２０分間時々撹拌し、Ｆｍｏｃ基を除去した。Ｆｍｏｃ基除去の完了後、レジンをＮＭＰで５回以上洗浄した。縮合反応とＦｍｏｃ除去工程は目的のＰＮＡ－ＤＮＡキメラの配列を構築するまで繰り返した。最後に、ＰＮＡ残基のＮ末アミノ基内の分子アシル転移を抑制するため、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ又はＦｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）－ＯＨを上記と同じ縮合条件により導入した。
　Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ工程が完了後、レジンを２８％アンモニア溶液で６０℃で１６時間処理することにより、全ての保護基を除去し、レジンから分離した。
　次に、レジンをろ過により除去し、ろ液を濃縮した。粗生成物は、ＣＯＳＭＯＳＩＬ　５Ｃ１８－ＡＲ－IIカラム（ナカライテスク、１０Φ×２５０ｍｍ）を用い、流速３ｍＬ／ｍｉｎで、溶媒Ａ：０．１Ｍ　ＴＥＡＡ緩衝液（ｐＨ７．５）、溶媒Ｂ：０．１Ｍ　ＴＥＡＡ（ｐＨ７．５）／アセトニトリル（１：１、ｖ／ｖ）で５％から７０％のリニアグラジエントで３０分間の条件で逆相ＨＰＬＣを用いて精製した。
　上記の方法により、表２に示す７種のＰＲＰＤ（ＰＲＰＤ１～ＰＲＰＤ７）を製造した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
［実施例３］ＤＰＲＰの製造
　Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ（３０ｍｇ、１００μｍｏｌ）とＥＤＣ・ＨＣｌ（１９ｍｇ、１００μｍｏｌ）をＤＭＦ（１．０ｍＬ）に溶解し、溶液を氷冷下３５分間撹拌した。氷冷を外し、ＤＭＦ及びＤＭＡＰ（１．２ｍｇ、１０μｍｏｌ）中のＮｏｖａＳｙｎ（登録商標）ＴＧＡレジン（４２ｍｇ、ヒドロキシ基の１０μｍｏｌ）をＤＭＦ及びＤＭＡＰ（１．２ｍｇ、１０μｍｏｌ）を溶液に添加し、得られた混合物を室温で１．５時間撹拌した。レジンをろ過し、ＮＭＰ、ＤＣＭ／エタノール（１：１、ｖ／ｖ）及びＤＣＭで連続的に洗浄した。
　レジンを十分に洗浄後、１．０ｍＬの安息香酸無水物（１１３ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）の２０％ピリジン／ＮＭＰ溶液をレジンに添加し、混合物を時々振盪しながら室温に放置した。１時間放置後、レジンをＮＭＰとＤＣＭで十分に洗浄した。エタノールで洗浄後、レジンを減圧下で、デシケーター中で乾燥させ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ機能性ＴＧＡレジンを得た（４１ｍｇ、９４％）。Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨの導入量は、２０％ピペリジン／ＮＭＰ処理によって遊離するＦｍｏｃ－ピペリジンの定量的ＵＶ（３０１ｎｍ）測定により算出した。
　上記で得られたＦｍｏｃ－Ｇｌｙ機能性ＴＧＡレジン（１μｍｏｌスケール）をＮＭＰで洗浄し、室温で２０分間２０％ピペリジン／ＮＭＰで処理し、Ｆｍｏｃ保護基を除去した。ＮＭＰで十分に洗浄後、レジンをＦｍｏｃ－ＰＮＡ（Ｂｚ）－ＯＨ又はＦｍｏｃ－γＲＰＮＡ－ＯＨ（１０等量）、ＨＯＡｔ（１０等量）、ＨＡＴＵ（１０等量）及びＤＩＥＡ（２０等量）のＮＭＰ溶液（３００μＬ）に添加し、混合物を時々振盪しながら、室温で３０分間放置し、このカップリング工程を２回繰り返した。ＮＭＰで洗浄し、ＤＣＭで洗浄後、レジンを室温で１０分間２５％無水酢酸／ＤＣＭで処理した。上記カップリング工程後、レジンをＤＣＭで洗浄し、ＮＭＰで洗浄した。続いて、Ｆｍｏｃを室温で２０分間２０％ピペリジン／ＮＭＰ処理により除去した。同じＦｍｏｃ除去、カップリング及びキャッピング工程をＰＮＡ－ＰＲＮＡ鎖の伸長に用いた。最後のカップリング工程後、レジンをＮＭＰとＤＣＭで十分に洗浄し、ピリジンで洗浄した。その後、無水酢酸／ＤＣＭ（２：３、ｖ／ｖ）をレジンに添加し、時々振盪しながら室温で２時間放置し、ＰＲＮＡ分子の２’３’ヒドロキシ基を保護した。
　Ｎ末のＦｍｏｃ保護基の除去後、レジンを自動ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機のために空のカラムに移し、レジンを含むカラムをＤＮＡ／ＲＮＡ合成機に設置した。ＤＮＡ鎖は、５’－Ｏ－ＤＭＴｒ－３’－Ｏ－（２－シアノエチル）ホスホアミデート構築ブロックを用いて通常のホスホアミデート法により伸長した。鎖の集合後、レジンを２８％アンモニア水で、６０℃で１８時間処理し、ＤＰＲＰを脱保護、解離させた。その後、メンブレンフィルターを通してろ過し、レジンを除去した。ろ液を真空で部分的に濃縮し、５Ｃ１８－ＡＲ－IIカラム（１０×２５０ｎｍ）で逆相ＨＰＬＣを用いて精製し、ＤＰＲＰを得た。
　上記の方法により、表３に示す２種のＤＰＲＰ（ＤＰＲＰ１、ＤＰＲＰ２）を製造した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
［実施例４］ＲＮａｓｅ活性の測定
　ＰＲＰＤ・ＲＮＡ複合体のＲＮａｓｅによるＲＮＡ切断活性を以下のように検討した。
　標的となる塩基配列が、配列番号１２で表される塩基配列を有する５’－ＦＡＭラベルＲＮＡ（５’－ＦＡＭ－ＧＡＡＵＣＵＵＡＵＡＧＵＣＵＵＧＣＡ－３’；ＲＮＡ１）を、実施例２で得られたＰＲＰＤ１の０．１等量と混合した。混合物をアニールし、ＰＲＰＤ・ＲＮＡ複合体を形成させた。
　次に、６０Ｕ／μＬのＲＮａｓｅＨを混合物に加え、３７℃で反応させ、ＲＮＡ１を切断させた。３０分間反応させた後、７Ｍ尿酸トリス塩酸緩衝液を加えて反応を止め、次にＲＮａｓｅＨの不活化を７０℃で１０分間行った。ＰＲＰＤ１の対照として、同じ処理をカウンターパートの配列番号１３で表される塩基配列を有するＤＮＡ１（５’－ＴＧＣＡＡＧＡＣＴＡＴＡＡＧＡＴＴＣ－３’）に対して行った。切断されたＲＮＡ断片は、２０％分解ポリアクリルアミドゲル電気泳動（分解ＰＡＧＥ）、蛍光イメージアナライザーによる可視化と定量により分析した。その結果を、図１及び表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　図１及び表４に示したように、ＲＮａｓｅＨの６０Ｕ／μＬを用いたＤＮＡ１の場合は、５４％のＲＮＡ１が切断された。それに対し、ＰＲＰＤ１の場合は、９９％以上のＲＮＡ１が切断され、これはＲＮａｓｅＨの活性の飽和を意味する。そこで、ＲＮａｓｅＨの量を６Ｕ／μＬまで減少させて同じＲＮＡの切断実験を行った。
　その結果、図１及び表４に示したように、ＤＮＡ１の場合は、ＲＮＡ１の切断の程度が１２％まで減少したのに対し、ＰＲＰＤ１の場合は、ＲＮＡ１の切断は、９０％以上に維持されていた。この結果、ＲＮａｓｅＨは、ＤＮＡ１・ＲＮＡ１複合体と比較して、ＰＲＰＤ１・ＲＮＡ１複合体において８倍高いＲＮＡ１切断活性を示していることが判明した。
　ＰＲＰＤ１の場合の切断位置は、図２Ｂに示したように、ＰＮＡ－ＤＮＡアミド結合近くの一つの位置であった。それに対し、ＤＮＡ１の場合は、図２Ａに示したように、複数の位置で切断されていた。ＲＮａｓｅＨが結合する最小のＤＮＡ塩基長は５～６塩基であり、これは、ＲＮａｓｅＨのＤＮＡ結合チャネル間の距離に対応している。従って、ＰＲＰＤ１のＤＮＡ分子は、一つの切断位置を導入するＲＮａｓｅＨのＤＮＡ結合チャネルにより正確に認識される、７ＤＮＡ核酸塩基からなっていた。５～６塩基対を用いるＤＮＡ・ＲＮＡヘテロ複合体は、幾つかの位置で結合させることが可能となる。これは、複数サイトのＲＮＡ切断を誘導する。これらに基づき、上記ＲＮＡ切断の促進は、次のように説明される。
　ＲＮａｓｅＨは標的ＲＮＡに対する塩基配列選択性を有しないため、ＤＮＡ１の場合、標的ＲＮＡとの複合体の切断部位は様々であり、一度の切断で複合体の解離が誘起されない可能性が高く、ＡＳＯ－切断ＲＮＡ－ＲＮａｓｅＨ複合体から、切断ＲＮＡは解離できず、ＤＮＡ１のターンオーバー回数は低くなる。一方、本発明のキメラ分子であるＰＲＰＤ１の場合は、標的ＲＮＡの一カ所、特に切断後の複合体の安定性がいずれも体温（３７℃）以下となる配列前後での切断を実現でき、一度の切断で複合体は効率よく解離し、他の切断されていない標的ＲＮＡに結合することが可能となり、ターンオーバー数の飛躍的な向上が可能となると考えらえる。このことを、切断されたＲＮＡ１・ＤＮＡ１複合体の切断後の両断片とＡＳＯとの複合体のＴｍを、実測定や熱力学的パラメータを用いた最近接塩基法により算出し、実証した。
　図２Ａに示したように、ＤＮＡ１の場合、切断は非特異的に様々な部位（ａ～ｅ）で観察された。切断後の複合体の安定性を計算すると、サイトａとサイトｄでの切断では、それぞれＤＮＡ１との切断後複合体はＴｍ＝３５．３℃、３７．２℃となった。これは、体温（３７℃）とほぼ同じで、切断後でも複合体は解離し難いことが予想される。他のサイトでの切断でも切断断片との複合体のＴｍは３７℃以上となるものが多かった。一部の切断断片（サイトｂやｃ）は、切断後のＲＮＡ断片とＤＮＡ１の複合体のＴｍは、３７℃以下になるものもあったが、その生成確率は高くなかった。このため、一般的に複数回のＲＮａｓｅＨ切断が複合体解離には必要となり、ＲＮａｓｅＨ切断のターンオーバー数の抑制が起こっている。
　それに対して、ＰＲＰＤ１は、ＰＮＡ－ＤＮＡジャンクションにおいて選択的な一つのＲＮＡ切断を示し、これは、ＲＮＡ切断前と比較してＲＮＡ１・ＰＲＰＤ１複合体の温度安定性を大きく減少させる。したがって、１度のＲＮａｓｅＨ切断で複合体は解離し、ＡＳＯは直ぐに切断されていない標的ＲＮＡとの複合体形成が可能となり、結果的にＲＮａｓｅＨ切断ターンオーバー数が促進され、この実験においてすべてのＲＮＡ１が切断される。このことを確認するため、切断されたＲＮＡ・ＰＲＰＤ１複合体のＴｍを算出した。
　図２Ｂに示したように、主要な切断サイトは、サイトａの一つであった。それにより、生成した断片は、ＰＲＰＤ１のＤＮＡ分子との複合体（切断されたＲＮＡ・ＤＮＡ複合体）、ＰＲＰＤ１のＰＮＡ／ＰＲＮＡ分子との複合体（切断されたＲＮＡ・ＰＮＡ／ＰＲＮＡ複合体）のようなＰＲＰＤ１との複合体とは異なるタイプの複合体を形成する。上記切断されたＲＮＡ・ＤＮＡ複合体の温度安定性は、ニアレストネイバーサーモダイナミックスパラメータにより算出したところ、Ｔｍ＝１３．２℃であった。上記切断されたＲＮＡ・ＰＮＡ／ＰＲＮＡ複合体の温度安定性は、ＵＶ温度融解解析によりＴｍ＝２２．３℃であった。ＰＮＡは、生理的に高い塩濃度条件下でＤＮＡ／ＲＮＡと不安定性の複合体を形成すると報告されている。このことから、切断されたＲＮＡ・ＰＮＡ／ＰＲＮＡ複合体のこの低い温度安定性は合理的であると考えられる。
　以上のことから、ＰＮＡ－ＤＮＡ融合部での選択的な一つの位置でのＲＮＡ１の切断は、体温（３７℃）以下の温度安定性を有するＲＮＡ断片を生成し、ＰＲＰＤ１の効率的なターンオーバーとして認識される。
　次に、ＲＮａｓｅＨ活性に関するキメラへのＰＲＮＡ導入の効果を検討した。ＲＮＡ１（１μＭ）とＲＮａｓｅＨ（０．６Ｕ／μＬ）を、ＤＮＡ１、ＰＲＰＤ４、ＰＲＰＤ１又はＰＤ２（１０ｎＭ）存在下で３７℃３０分間反応させた。その結果を図３及び表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　ＤＮＡ１の場合は、ＲＮＡ１切断の量は、非常に小さかった。それに対して、ＰＲＰＤ４及びＰＲＰＤ１の１０ｎＭ存在下ではＲＮＡ１の９０％を超える切断が観察された。ＰＤ２についても、ＰＲＰＤ４及びＰＲＰＤ１と比較して同じレベルのＲＮａｓｅＨ活性が示された。
　ＲＮａｓｅＨ活性に関しキメラのＰＲＮＡを導入した効果を、配列番号１４で表される塩基配列を有するＲＮＡ２（５’－ＦＡＭ－ＵＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＵＡＵＡＣ－３’）を用いた１６ｍｅｒＲＮＡを用いて検討した。ＲＮＡ２（１μＭ）とＲＮａｓｅＨ（６×１０－３Ｕ／μＬ）を配列番号１５で表される塩基配列を有するＤＮＡ２（５’－ＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡ－３’）、ＰＲＰＤ７又はＰＤ１（１０ｎＭ）存在下で、３７℃で３０分間反応させた。その結果を、図４及び表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　ＤＮＡ２の場合、５２％のＲＮＡ２が切断された。ＰＲＰＤ７存在下では、７６％のＲＮＡ２の切断が観察され、これはＤＮＡ２と比較して１．５倍のＲＮａｓｅＨ活性であった。それに対して、ＰＤ１の場合は、ＲＮＡ２切断量は、４０％であり、これは、ＰＲＰＤ７よりも１．９倍低かった。この結果、キメラ分子へのＰＲＮＡ導入は、ＲＮａｓｅＨ活性を促進させることを可能とし、これは、標的ＲＮＡとのＡ型の複合体が形成されるＲＮＡ選択的結合性に起因すると考えられる。
　次に、ＤＰＲＰ１のＲＮａｓｅＨによる標的ＲＮＡ１の切断活性を検討し、ＰＲＰＤ５の活性と比較した。ＤＰＲＰは、３’末端にＲＮＡ切断が誘導されると予想される。ＲＮＡ１をＤＰＲＰ１又はＰＲＰＤ５の１／１００、１／１０００又は１／１００００等量と混合し、それぞれアニールし複合体を形成させた。その後、６×１０－３のＵ／μＬのＲＮａｓｅＨを加え、３７℃で３０分間反応させた。その結果を、図５及び表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　図５に示したように、ＤＰＲＰ１は、ＲＮＡの３’末端から３～４塩基の位置でＲＮＡが切断した。主要な切断部位を図６に示した。切断活性は、ＤＰＲＰ１の１０ｎＭの場合で４３％であり、これは、ＤＰＲＰ５の場合（７３％）と比較して、１．７倍低かった。ＤＰＲＰ１のこの低い切断活性は、限定的なＲＮＡ１切断位置に起因すると考えられる。ＰＲＰＤ５の場合は、切断位置は、ＰＮＡ－ＤＮＡジャンクションの一つのポイントである。従って、ＲＮＡ１の効率的な解離と、ＰＲＰＤ５の効率的なターンオーバーが３７℃以下の低い温度安定性を有するＲＮＡ１の生成により実現された。
　それに対して、ＤＰＲＰ１の場合は、切断はＲＮＡ１の３’末端近くで見られ、そのため、長いＲＮＡ断片が切断後に生じ、それが３７℃を超える高い温度安定性を維持する。そのため、ＤＰＲＰ１のターンオーバー効率は、ＰＲＰＤ５と比較して低下した。
［実施例５］ＲＮａｓｅＨによるＲＮＡ切断反応の速度論的パラメータ
　ＰＲＰＤ５の高効率のＲＮＡ切断について検討するため、ＲＮａｓｅＨによるＲＮＡ切断の速度論的分析を実施した。
　ＲＮａｓｅＨ（１．５×１０－３Ｕ／μＬ＝４．１ｎＭ）を過剰量のＰＲＰＤ１・ＲＮＡ１（１、２、５、１０μＭ）存在下でｐｓｅｕｄｏ－ｆｉｒｓｔ－ｏｒｄｅｒ反応条件下で反応させ、各ＰＲＰＤ１・ＲＮＡ１の濃度で切断したＲＮＡ１量のタイムプロファイルをプロットした。得られた各々の基質濃度の初期速度を用いることにより、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ－Ｂｕｒｋプロットを行った。同じ実験を、ＤＰＲＰ１・ＲＮＡ１の場合も実施した。Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ－Ｂｕｒｋプロットから得られた速度論的パラメータを表８に纏めた。ＤＮＡ・ＲＮＡ複合体のパラメータは、大塚らにより報告された結果を参照し、抽出した。その結果を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　表８に示したように、ＰＲＰＤ１・ＲＮＡ１複合体とＲＮａｓｅＨとによるＲＮＡ切断反応のｋｃａｔ値は、ＤＮＡ・ＲＮＡ複合体よりも１．９倍程度であった。この結果は、ＲＮａｓｅＨは、対応するＤＮＡ・ＲＮＡ複合体と比較して、ＰＲＰＤ１・ＲＮＡ１複合体は若干切断効率が向上していることを示しているが、図３で示した標的ＲＮＡ切断実験よりも明確にその向上率は低い。ＲＮａｓｅＨはＰＲＰＤ１・ＲＮＡ１複合体と高い切断活性を示し、ＲＮａｓｅＨのＰＲＰＤ１・ＲＮＡ１複合体との結合のミカエリシスメンテン乗数（Ｋｍ）は、ＤＮＡ．ＲＮＡ複合体よりも大きかった。このことは、ＰＲＰＤ１・ＲＮＡ１複合体とＲＮａｓｅＨとの結合活性は、ＤＮＡ・ＲＮＡ複合体よりも低いことを示唆している。ｋｃａｔとＫｍ値との間のこの関係に従い、ＲＮａｓｅＨの認識性は、ＰＲＰＤ１の高いＲＮＡ切断活性に殆ど影響を与えないと思われる。また、ＰＲＰＤ１・ＲＮＡ１複合体のＶｍａｘ値は、ＤＮＡ・ＲＮＡ複合体よりも４倍大きいが、この値は、ゲル電気泳動から推定される値よりも小さい（例えば、図１により、約８倍高いＲＮＡ切断活性が観察される（レーン２と４の比較）。これらの結果から、基質（ＰＲＰＤ１－ＲＮＡ１複合体）とのＲＮａｓｅＨの結合は、律速ステップではなく、切断されたＰＲＰＤ１－ＲＮＡ１複合体のＲＮａｓｅＨからの解離工程がＲＮａｓｅＨの効率的なＲＮＡ切断活性に重要であると考えられる。
　ＤＰＲＰ１の場合は、ＲＮａｓｅＨによるＲＮＡ切断活性のｋｃａｔ値は、ＤＮＡ・ＲＮＡ複合体よりも小さかった。この結果は、ＤＰＲＰ１は、対応するＤＮＡと比較して低い切断活性を示すことを示している。ＲＮＡ切断のＶｍａｘ値は、ＤＮＡ・ＲＮＡ複合体よりも１．７倍以上であったが、Ｋｍ値は、ＤＮＡ・ＲＮＡ複合体の５．２倍以上であった。
　このＤＮＡ・ＲＮＡ複合体と比較して高いＫｍ値は、天然のＤＮＡ骨格が、ＰＮＡ－ＰＲＮＡ骨格へ置換することにより、ＲＮａｓｅＨの認識性の低下を誘導することに起因するものと思われる。しかしながら、ＤＰＲＰ１・ＲＮＡ１複合体のＫｍ値は、ＰＲＰＤ１－ＲＮＡ１よりも低く、これは、ＤＰＲＰ１・ＲＮＡ１複合体のＲＮａｓｅＨの認識性が、ＰＲＰＤ１・ＲＮＡ１複合体と比較して促進されていることを示している。ＤＰＲＰ１・ＲＮＡ１とＰＲＰＤ１・ＲＮＡ１との間でＫｍ値が異なっていることは、ＲＮａｓｅＨによるＤＰＲＰ１・ＲＮＡ１複合体の認識部位が、ＰＲＰＤ１－ＲＮＡ１複合体の認識部位と異なっていることを支持している。
　図５に示した切断反応も認識部位が異なっていることを支持している。ＰＲＰＤとＤＰＲＰとの間の異なるＲＮａｓｅＨ活性は、ＲＮＡ切断位置だけではなく、ＲＮａｓｅＨとの認識性及びＲＮａｓｅＨの触媒切断活性（ｋｃａｔ／Ｋｍ）に依存的であると考えられる。このｋｃａｔ／Ｋｍ値は、ＲＮａｓｅＨのＲＮＡ切断反応の速度論的解析に依存する基質濃度により決定することができる。上記表８に示したように、ＰＲＰＤとＤＰＲＰのｋｃａｔ／Ｋｍ値は、殆ど同じオーダーであった（ＰＲＰＤ・ＲＮＡ：１．６７×１０６ｓ－１Ｍ－１、ＤＰＲＰ・ＲＮＡ：１．９７×１０６ｓ－１Ｍ－１）。このことから、キメラ分子のターンオーバー効率は、ＲＮＡの切断位置により主に制御されると考えられる。これらのことから、ＲＮａｓｅＨの切断位置は、ＲＮＡ切断活性とキメラのターンオーバー効率の促進に重要であることが判明した。
［実施例６］無細胞系翻訳システムにおけるアンチセンス活性
　内在性のＲＮＡ切断への適用を確かめるため、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ無細胞系翻訳システムを用いて、ＰＲＰＤの蛋白質合成阻害活性（アンチセンス活性）を検討した。この検討で用いたＡＳＯであるＰＲＰＤ２とＤＮＡ２は、ルシフェラーゼレポーターアッセイのため、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子の上流のシャインダルガノ（ＳＤ）配列の相補配列である、５’－ＧＡＡＧＧＡ－３’を含む１６ｍｅｒである。ＡＳＯ（ＰＲＰＤ２又はＤＮＡ２）は、標的のｍＲＮＡに対して１／１０等量添加した。反応は、ＲＮａｓｅＨのＲＮＡ切断活性を評価するため、ＲＮａｓｅＨ存在下と非存在下で行った。その結果を図７に示す。
　図７に示したように、ＲＮａｓｅＨ非存在下では、アンチセンス活性は、ＤＮＡ２の場合、殆ど観察されなかった。ＤＮＡ２の阻害活性は、ＲＮａｓｅＨを加えることにより若干見られた（１２％）。それに対し、ＰＲＰＤ２の場合は、ＲＮａｓｅＨ非存在下で９％のアンチセンス活性が認められ、ＤＮＡ１よりも少し高かった。ＰＲＰＤ２のアンチセンス活性は、ＲＮａｓｅＨ添加により９１％まで著しく促進された。ＲＮａｓｅＨ非存在下の化学量論的な阻害レベルよりもこのように低いことは、阻害が１体１の複合体形成のみにより起こることを示唆している。わずか１／１０等量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを添加で、ＰＲＰＤ２の場合、１０％以上の蛋白質発現の阻害が認められた。このことは、ＰＲＰＤ２はＲＮａｓｅＨ活性によって、触媒様に作用することを示している。この結果は、ＰＲＰＤは、標的ｍＲＮＡを効率的に切断し、ＲＮａｓｅＨ活性を利用して蛋白質生産を阻害できることを示唆している。この結果は、ＲＮＡ断片のゲル電気泳動解析と一致している。従って、ＲＮＡの切断位置を検討することは、アンチセンス活性のためのより効果的なＡＳＯをデザインするために本質的であると考えられる。
　次に、無細胞系翻訳システムにおけるＰＲＰＤ５とＤＰＲＰ２のアンチセンス活性を、ＰＵＲＳＹＳＴＥＭ　Ｃｌａｓｓｉｃ　IIを用いて検討した。実験は、ＲＮａｓｅＨ非存在下と存在下で行った。その結果を図８に示す。
　ＰＲＰＤ５とＤＰＲＰ２は、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子をコードする標的のｍＲＮＡに対して１／１０等量添加した。ＰＲＰＤ５の場合、アンチセンス活性は、ＲＮａｓｅＨ添加により７５％まで促進された。それに対し、ＤＰＲＰ２の場合は、ＲＮａｓｅＨ添加によるアンチセンス活性の促進は１２％であり、ＰＲＰＤ５と比較して６倍低かった。
　本発明によれば、低濃度で標的核酸の機能を抑止でき、オフターゲット効果が抑制できるキメラ分子、前記キメラ分子を含む医薬組成物、前記キメラ分子を用いる標的核酸の切断方法、及び、前記キメラ分子を含む標的核酸切断用又は診断用キットを提供することができる。

Claims (19)

  1. 　標的核酸に対して結合する能力を有する第１の核酸又はその誘導体と、前記標的核酸に対して結合する能力を有し、主鎖骨格が陰イオン性である第２の核酸又はその誘導体とが融合したキメラ分子。
  2. 　前記第１の核酸又はその誘導体の主鎖骨格が、中性又は陽イオン性である、請求項１に記載のキメラ分子。
  3. 　前記第１の核酸又はその誘導体の主鎖骨格が、アミド骨格である、請求項２に記載に記載のキメラ分子。
  4. 　前記第２の核酸又はその誘導体の主鎖骨格が、糖－リン酸骨格である、請求項１～３のいずれか一項に記載のキメラ分子。
  5. 　前記第１の核酸又はその誘導体が、前記第２の核酸又はその誘導体の５’末端に融合している、請求項１～４のいずれか一項に記載のキメラ分子。
  6. 　前記第１の核酸又はその誘導体が、前記第２の核酸又はその誘導体の３’末端に融合している、請求項１～４のいずれか一項に記載のキメラ分子。
  7. 　前記キメラ分子と前記キメラ分子に結合した前記標的核酸とからなる複合体が、ヌクレアーゼに対して特異的に結合する、請求項１～６のいずれか一項に記載のキメラ分子。
  8. 　前記ヌクレアーゼが、前記第１の核酸又はその誘導体と、前記第２の核酸又はその誘導体との融合部分で前記標的核酸を切断する、請求項７に記載のキメラ分子。
  9. 　前記ヌクレアーゼで切断後の標的核酸両断片の融解温度Ｔｍが、３８℃以下である、請求項８に記載のキメラ分子。
  10. 　前記ヌクレアーゼが、リボヌクレアーゼＨである、請求項７～９のいずれか一項に記載のキメラ分子。
  11. 　前記第１の核酸又はその誘導体が、ペプチド核酸又はペプチドリボ核酸もしくはそれらの誘導体である、請求項１～１０のいずれか一項に記載のキメラ分子。
  12. 　前記第２の核酸又はその誘導体が、ＤＮＡである、請求項１～１１のいずれか一項に記載のキメラ分子。
  13. 　前記標的核酸が、ＲＮＡ又はＤＮＡである、請求項１～１２のいずれか一項に記載のキメラ分子。
  14. 　請求項１～１３のいずれか一項に記載のキメラ分子を有効成分とする医薬組成物。
  15. 　前記医薬組成物が、がん又は虚血性脳疾患である、請求項１４に記載の医薬組成物。
  16. 　請求項１～１３のいずれか一項に記載のキメラ分子とヌクレアーゼとを用いて標的核酸を切断する、標的核酸の切断方法。
  17. 　前記ヌクレアーゼが、リボヌクレアーゼＨである、請求項１６に記載の標的核酸の切断方法。
  18. 　請求項１～１３のいずれか一項に記載のキメラ分子とヌクレアーゼとを含む標的核酸切断用又は診断用キット。
  19. 　前記ヌクレアーゼが、リボヌクレアーゼＨである、請求項１８に記載のキット。
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