JPH08508473A

JPH08508473A - 核酸の配列決定に有用な新規誘導体

Info

Publication number: JPH08508473A
Application number: JP6521745A
Authority: JP
Inventors: キヤナール，ブリユノ; サールフアテイ，シモン
Original assignee: アンステイテユ・パストウール
Priority date: 1993-03-26
Filing date: 1994-03-28
Publication date: 1996-09-10
Also published as: US5798210A; FR2703052A1; FR2703052B1; EP0690928A1; WO1994023064A1; EP0850949A2; CA2158975A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ゲルを使用しない核酸配列決定方法で使用することができ、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）のうちの１つを有するデオキシリボヌクレオチド５’−三リン酸（ｄＮＴＰ）又はリボヌクレオチド５’−三リン酸（ＮＴＰ）エステルに関する。

Description

【発明の詳細な説明】核酸の配列決定に有用な新規誘導体本発明は、４種のヌクレオチド塩基Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧに対応するデオキシリボースの３’位を置換された２’−デオキシリボヌクレオチド５’−三リン酸の合成に関する。３’位は各ヌクレオチドに特定蛍光特性を与える特定誘導体によりエステル化される。このような化合物の化学的合成はヌクレオチドｄＡＴＰについてＳａｆａｒｔｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９０）２６５，ｐｐ．１８９０２−１８９０６により既に報告されている。このような化合物の存在及び種々のスペクトル特性を有する蛍光を発するエステルをもつ類似の化合物の存在［Ｈｉｒａｔｓｕｋａ（１９８２），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７，ｐｐ．１３３５４−１３３５８］により、当業者は本発明の目的である配列決定方法に使用可能な「リポーター」分子の３’位をエステル化できると予想できる。これらのエステル化ヌクレオチド三リン酸（３’−ＲＴ−ｄＮＴＰ）は、取り込まれるとポリヌクレオチド鎖を停止するＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼの基質である。これらの３’−ＲＴ−ｄＮＴＰは３種の異なる反応、即ち核酸ポリメラーゼによる伸長中の鎖への取り込み、デオキシリボースの３’ヒドロキシルの脱保護及びその結果として後続３’−ＲＴ−ｄＮＴＰの取り込みに適合し得る。これらの特性はヌクレオチド配列を決定するため又はＤＮＡ配列中の突然変異を検出するためにゲルの使用に依存しない新規非放射性方法で使用可能である。これらのエステル化ヌクレオチド三リン酸の重要な特徴の１つは、このエステル化のｉｎｓｉｔｕ可逆性により遊離３’ヒドロキシ基を復元できることであり、ポリヌクレオチド鎖はｄＮＴＰ及びＤＮＡポリメラーゼの混合物と共にインキュベートすると、更に伸長し得る。各ヌクレオチドエステルは所与の塩基に固有の蛍光特性を有するので、この蛍光マーカーの除去及び特徴付け後にどのヌクレオチド塩基が挿入されたかを決定することが可能である。プロセスを反復することにより、ヌクレオチド配列の決定方法、ヌクレオチド配列中の点突然変異の検出方法、変異体の調査方法、又はサンプル中の特定オリゴヌクレオチド配列の存在の診断方法が得られる。慣用配列決定方法は約１５年前にＳａｎｇｅｒ，Ｆ．，Ｎｉｃｋｌｅｎ，Ｓ．及びＣｏｕｌｓｏｎ，Ａ．Ｒ．［（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４，ｐｐ．５４６３−５４６７］並びにＭａｘａｍＡ．Ｍ．及びＧｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．［（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４，ｐｐ．５６０−５６４］により導入された。Ｓａｎｇｅｒのジデオキシ配列決定は現在広く使用されており、今日も尚、１本鎖ＤＮＡ鋳型からヌクレオチド配列を決定するための優れた方法である。この方法は以下のように要約される。４種の酵素的鎖伸長中にジデオキシヌクレオチドをそれらの対応するデオキシヌクレオチドの位置にランダムに挿入する。配列決定反応により生成された複合混合物をその後、ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動により分離する。この方法は、ジデオキシヌクレオチドの取り込み後の段階に関して特にゲル上の分解とデータの獲得との点で比較的複雑である。実際に、種々多様な生成物が伸長により生成される。その後、この方法は必要な実験操作を単純化及び軽減する目的で種々の改良が加えられた。例えばヨーロッパ特許出願公開第０５３１１６９Ａ１号によると、著者らはパルス場の電気泳動法を使用することにより電気泳動段階を単純化及び改善する方法を開発した。配列決定方法のもっと最近の他の改良も文献に記載されている。例えば、以下の２件の文献を挙げることができる。ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅ”［Ｇ．Ｍ．Ｃｈｕｒｃｈ及びＳ．Ｋｉｅｆｆｅｒ−Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０，ｐｐ．１８５−１８８（１９８８）］であり、この方法は種々の標識化オリゴヌクレオチドに隣接する多重ベクターに挿入したフラグメントの混合物から人工ゲノムを形成し、その後、ＤＮＡを化学的に切断し、電気泳動にかけた後、膜に移し、最後にベクター内の標識化配列の相補的オリゴヌクレオチドで探査するものである。第２の周知の方法はＯ．Ｏｈａｒａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，ｐｐ．６８８３−６８８７（１９８９）により記載されており、この方法もゲル及び膜システムを使用し、オリゴマープローブとハイブリダイズしたフラグメントを探査する。国際公開第ＷＯ９３／０２２１２号には、ＤＮＡ及びＲＮＡを１段階で増幅及び配列決定する方法が記載されている。この方法は鎖を停止するデオキシ型のヌクレオチドの類似体を反復的に使用した後、ポリアクリルアミドゲル上で反応生成物を分離する。配列決定方法は、主にゲノムの設計開発を考慮して鋭意研究されている。これらの段階のいくつかのレベルでジデオキシ法に多数の改良が提案されている。例えば、Ｖｅｎｔｅr，Ｃ．Ｊ．ら［（１９９２）Ｔ．Ｉ．Ｂ．Ｓ．１０，ｐｐ．８−１１］、Ｐｒｏｂｅｒ，Ｊ．Ｍ．ら［（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３８，ｐｐ．３３６−３４１］並びにＭａｔｈｉｅｓ，Ｒ．Ａ．及びＨｕａｎｇ，Ｘ．Ｃ．［（１９９２），Ｎａｔｕｒｅ３５９，ｐｐ．１６７−１６９］の論文を挙げることができる。ハイブリダイゼーションによる配列決定［Ｓｔｒｅｚｏｓｋａ，Ｚ．ら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８，ｐｐ．１００８９−１００９３］又はトンネル効果型顕微鏡［Ｄｒｉｓｃｏｌｌ，Ｒ．Ｊ．ら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ３４６，ｐｐ．２９４−２９６］といった新規アプローチが出現しつつあり、ゲル上の電気泳動を省き、その代わりに本発明の方法のように単純且つ廉価な方法を使用するならば、このようなアプローチは著しく進展するであろう。核酸中の所定位置に存在するヌクレオチドの同定方法については、国際公開第ＷＯ９３／０２２１２号がジデオキシヌクレオチドの取り込みによるこのような同定方法を記載しているが、この方法は点突然変異は検出できるとしても、成長中の鎖に修飾ヌクレオチドを取り込んだ後に正常ヌクレオチドを復元することができない限り、配列決定は全く不可能である。更に、この方法は該当ヌクレオチドに隣接してプライマーを配置する必要があり、小さい挿入又は欠失のような複雑な突然変異を特徴付けることはできない。更に、ジデオキシヌクレオチドは製造及び使用費用が高価である。国際公開第ＷＯ９１／０６６７８号は、ゲルを使用しないＤＮＡ法及びこの方法を実施するための装置を記載している。反応には３’遮断ｄＴＮＰが必要である。しかしながら、記載されている酵素及びその使用方法（特にｓｅｑｕｅｎａｓｅ）は３’エステル化ヌクレオチドを同時に使用できないばかりでなく、配列決定すべきＤＮＡが所与のヌクレオチドの反復を有する場合には方法を実施することができず、ｓｅｑｕｅｎａｓｅは実際に固有のエステラーゼ活性を有する。理想的な配列決定反応は制御下にただ１種の付加生成物を生成することができ、方法を反復する前に付加ヌクレオチドを同定することができ、段階を追ってリアルタイムで配列を決定できるような方法である。伸長中のＤＮＡ分子の３’末端を可逆的に保護することができるのであれば、このような反応に所望される特性を与えることができよう。更に、３’末端を修飾された各ヌクレオチドが個々別々の標識を有するならば、リアルタイムで徐々に配列を決定することができる。本発明は核酸鎖の成長停止剤として使用することが可能なｄＮＴＰ又はＮＴＰの新規誘導体の開発に関し、この停止は化学的又は酵素（特にエステラーゼ）的加水分解により可逆的であり、方法の段階は安定している。これらの誘導体は、任意の１段階でゲルを使用するか又は使用しないことを特徴とする上記のような全配列決定方法で使用できるという利点を有する。本発明のｄＮＴＰ又はＮＴＰはより特定的には、アントラニレート又は、各塩基に各々対応する４種の異なる発蛍光団によりアミド化されたカプロン酸又は、同様に両者とも４種の異なる発蛍光団によりアミン基を置換された５−アミノ− ２，５−ジデオキシ−Ｄ−リボン酸もしくは６−アミノ−２，３，６−トリデオキシ−Ｄ−グルコン酸により３’エステル化されていることを特徴とする。これらの４種のエステルは下式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶにより表される。糖の３’ヒドロキシル基は、式Ｉ及び式ＩＩの化合物の場合塩基（例えば水酸化ナトリウム）、又は酵素の作用により復元され得る。式ＩＩＩ及びＩＶの化合物については、本発明はヌクレオチドの３’位から２又は３個の炭素遠いサイトで発蛍光団を開裂する。この化学反応により反応性の基が生成し、その後この基は３’ヒドロキシルを復元する二次反応を起こす。即ち、ビシナルジオールの過ヨウ素酸酸化段階と、化合物ＩＩＩの場合にはエノール化とこうして３’位に形成されたアルデヒドの β脱離段階、化合物ＩＶの場合にはヒドラジンの作用下の脱離段階（詳細については図９参照）の２段階からなる反応を起こす。本発明は更に、これらの種々の類の３’エステル化ｄＮＴＰを合成し、種々の蛍光特性を有する４種のエステルを合成する方法に関する。本発明は更に、配列決定すべきＤＮＡ鋳型を製造するためにＰＣＲで使用されるプライマーと同一の３’配列の一部を有する５’リン酸化「ヘアピン」型プライマーの構築及び使用に関する（下記実施例参照）。プライマーなる用語は、核酸鋳型とハイブリダイズすると、ポリメラーゼによる相補鎖の合成を開始することが可能な任意のオリゴヌクレオチド配列を意味する。ヘアピン型プライマーはその３’末端を介して所期配列を有する核酸鎖の５’ 末端に共有結合している。この「ヘアピン」型プライマーを使用すると、挿入したヌクレオチドの間接的決定段階毎にプライマーを加えずに、方法の反復に適合可能な３’ヒドロキシルの脱保護塩基性条件を使用することができる。実際に、プライマーのリハイブリダイゼーションは分子内で即座に起こる。更に、本発明はゲルの使用に依存しないヌクレオチド配列の決定方法におけるこれらのエステル化ヌクレオチドの使用に関する。前記配列はＰＣＲ法により予め増幅しておいてもよい。これらのエステル化ヌクレオチドの使用は、点突然変異の検出、欠失もしくは付加型の小さい突然変異の検出、又は所与の遺伝子配列中の変異体の調査にも適用することができる。更に、これらの修飾ヌクレオチド三リン酸はサンプル中の特定オリゴヌクレオチド配列の存在を検出するための診断法でも使用することができる。更に本発明は、任意要素としてＰＣＲプライマー、配列決定用プライマー、可逆的に３’エステル化された４種の２’−デオキシリボヌクレオチド、任意要素として標的核酸もしくはプライマーを固定するための固相、及びプライマーに応じて選択される核酸ポリメラーゼを含む診断ツール（キット）に関する。発明の詳細な説明以下、下記添付図に関して本発明を詳細に説明する。図１はアントラニル酸エステルの構造を示し、図中、Ｒ１〜Ｒ４は該当３’− ＲＴ−ｄＮＴＰに依存して−Ｈ基又は−ＣＨ₃基であり、３’−Ａｎｔ−ｄＡＴＰの場合にはＲ１＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｒ４＝Ｈであり、Ｎ−メチル−３’−Ａｎｔ− ｄＣＴＰの場合にはＲ１＝ＣＨ₃、Ｒ２＝Ｒ３＝Ｒ４＝Ｈであり、３−メチル− ３’−Ａｎｔ−ｄＴＴＰの場合にはＲ１＝Ｒ３＝Ｒ４＝Ｈ、Ｒ２＝ＣＨ₃であり、５−メチル−３’−Ａｎｔ−ｄＣＴＰの場合にはＲ１＝Ｒ２＝Ｒ４＝Ｈ、Ｒ４＝ＣＨ₃である。アントラニル環上の置換基の他の全組み合わせも本発明に属する。図２はカプロン酸エステルの構造及びこれらのエステルの合成経路を示す。図３はアミン基上を４種の異なる発蛍光団により置換された５−アミノ−２，５−ジデオキシ−Ｄ−リボン酸により３’エステル化された誘導体の式及び、過ヨウ素酸塩の作用とそれに次ぐエノール化後のβ脱離により糖の３’ＯＨ基を復元する方法を示す。図４はＤＮＡポリメラーゼの種々の量の関数として伸長中の鎖への３’−Ａｎｔ−ｄＡＴＰ誘導体の取り込みの変化を示す。図５は各酵素１単位と共に３７℃で６０分間インキュベーションを実施した際の種々のＤＮＡポリメラーゼの存在下の３’−Ａｎｔ−ｄＡＴＰの取り込みを示す。図６、７及び８は本発明の３’−ＲＴ−ｄＮＴＰを使用する配列決定方法の３種の態様を示し、符号は図６に示す意味を有する。図９はアミン基上を種々の蛍光色素によりアミン基上を置換された６−アミノ −２，３，６−トリデオキシ−Ｄ−グルコン酸により３’アシル化された２’− デオキシヌクレオチド三リン酸の３’ヒドロキシル及びラベルの遊離機序を示す。図１０及び１１は蛍光色素により置換された６−アミノカプロン酸により３’ アシル化された２’−デオキシアデノシン三リン酸及び２’−デオキシグアノシン三リン酸の合成図式を夫々示す。使用した材料及び方法は以下の通りである。 −誘導体の合成用物質：イサト酸無水物、Ｎ−メチルイサト酸無水物、２−アミノ−３−メチル安息香酸、２−アミノ−５−メチル安息香酸及び２−アミノ−６−メチル安息香酸はＡｌｄｒｉｃｈから入手した。対応する無水物は酸にホスゲン又はクロロギ酸エチルを作用させることにより調製した（Ｅｒｄｍａｎｎ）。ヌクレオチド三リン酸ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍから入手した。 −取り込み反応：エキソヌクレアーゼをもたない修飾ＤＮＡポリメラーゼ（ｓｅｑｕｅｎａｓｅ２，０）はＵＳＢ社（米国）から入手した。２’，３’−ジデオキシヌクレオチド／２’−デオキシヌクレオチド５’−三リン酸、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素はＢｏｈｒｉｎｇｅｒ（フランス）から入手した。ＤＮＡポリメラーゼＴ７はＰｈａｒｍａｃｉａ（フランス）から入手し、Ｋｌｅｎｏｗ酵素はＡｍｅｒｓｈａｍ（フランス）から入手した。１単位は、鋳型としてポリ（ｄ（Ａ−Ｔ））を用いて３７℃で１分間に酸不溶性物質に全ヌクレオチド１．０ｎｍｏｌを取り込む酵素活性である。ストレプトアビジンを被覆した磁気ビーズ（Ｍ−２８０Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）はＤｙｎａｌ（ノルウェー）から入手した。α−³²Ｐ−ｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、α−³⁵Ｓ−ｄＡＴＰ（６００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、³Ｈ−ｄＧＴＰ（１４Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、³Ｈ−ｄＣＴＰ（１７Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、³Ｈ−ｄＴＴＰ（４５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）はＡｍｅｒｓｈａｍ（フランス）から入手した。オリゴヌクレオチドはＡＢＩ合成器で合成し、使用前に精製する。 −スペクトル測定：吸収スペクトルは、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）の存在下で複光束スペクトロフォトメーターで２５℃で記録する。蛍光発光スペクトル及び励起スペクトルはＰｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＬＳ５０Ｂ蛍光スペクトロフォトメーターで２５℃で測定する。遊離酸の全誘導体は３１０ｎｍで励起し、デオキシヌクレオチドの３’−アントラニロイル及び３’−メチルアントラニロイルは３３０ｎｍで励起する。励起及び発光の溝（ｆｅｎｔｅ）の幅は２．５ｎｍである。非置換誘導体の波長と比較したこれらのアントラニロイルｄＮＴＰ誘導体の各々の吸収及び発光波長を下表Ｉに要約する。表中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は図１の残基に対応する。 −可逆的に３’標識された２’−デオキシヌクレオチド５’−三リン酸（３’− ＲＴ−ｄＮＴＰ）の合成、精製及び特徴付け：ａ）アントラニル酸ｄＡＴＰ：アントラニル酸ｄＡＴＰは、Ｈｉｒａｔｓｕｋａ［Ｔ．Ｈｉｒａｔｓｕｋａ（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７，ｐｐ．１３３５４−１３３５８］によりアントラニル酸ＡＴＰの合成について記載されているのと同様の方法によりｄＡＴＰ及びイサト酸無水物から調製し、１ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウムを溶離剤として使用することによりＬｉｃｈｒｏｐｒｅｐＲＰ１８（２５〜４０μｍ）上でクロマトグラフィー精製した。反応しなかったｄＡＴＰをまず最初に溶離する。次に、１ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウムとアセトニトリルの混合物（９：１ｖ／ｖ）でＡｎｔ−ｄＡＴＰを溶離する。混合物ＣＨＣｌ₂／ＭｅＯＨ／ＮＨ₄ＯＨ（６５：３５：１０ｖ／ｖ／ｖ）を溶媒として使用することによりシリカゲル上で薄層クロマトグラフィーにより純粋なＡｎｔ−ｄＡＴＰを含有するフラクションを試験した後、凍結乾燥する。ｄＡＴＰ２４ｍｇ（０．０４ｍｏｌ）から純粋なヌクレオチド２０ｍｇ（０．０３２ｍｏｌ）が得られ、これは８０％の最終収率に相当する。化合物の同一性及び純度はＵＶスペクトル分析（Ａ₂₅₃ ／Ａ₃₃₃＝４．３、ξ²⁵³ｍＭ＝２０）、質量スペクトル分析（ＦＡＢ＋）Ｍ＋６１０、ｍ／ｅ６１１、（Ｍ＋Ｈ）＋により確認する。生成物の陽子及びリンのＮＭＲスペクトル特性は以下の通りである。３００ＭＨｚ：（３００ＭＨｚ；Ｄ₂Ｏ）８．４４（ｓ’，１Ｈ，Ｈ−８），８．１１（ｓ，１Ｈ，Ｈ−２），７．８３（ｄ，１Ｈ，Ｈ−６Ａ），７．２４（ｔ，１Ｈ，Ｈ−４Ａ），６．７２（ｄ，１Ｈ，Ｈ−３Ａ），６．６６（ｔ，１Ｈ，Ｈ−５Ａ），６．４８（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−１），５．６２（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−３’），４．３８（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４’），４．１９（ｍ，１Ｈ，Ｈ−５’），４．０９（ｍ，１Ｈ，Ｈ−５”），２．８３（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２’），２．６９（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２”）。 ³Ｐ（１２１．５ＭＨ₂；Ｄ₂Ｏ）−１０．０２（ｄ，Ｐγ），−１０．８４（ｄ，Ｐα），−２２．４８（ｔ，Ｐβ）。ｂ）アントラニル酸ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ：同様の方法により合成、精製及び特徴付けを実施した。３−メチル、５−メチル及び６−メチルイサト酸無水物はＥｒｄｍａｎｎ［Ｅ．Ｅｒｄｍａｎｎ（１８９９）Ｂｅｒｉｃｈｔｅ３，ｐｐ．２１５９−２１７２］に記載の方法により調製した。前記メチルイサト酸並びにＮ−メチルＡｎｔ−ｄＧＴＰ、３−メチルＡｎｔ− ｄＣＴＰ、６−メチルＡｎｔ−ｄＴＴＰ及び５−メチルＡｎｔ−ｄＣＴＰのスペクトル特性も同様に測定した。ｃ）発蛍光団によりアミド化したｄＮＴＰとカプロン酸のエステルの合成：反応図式は図２に示す。２’−デオキシヌクレオシドの５’ヒドロキシルはジメトキシトリチル基により保護し、３’アルコールはカプロン酸無水物を作用させることによりエステル化し、カプロン酸のアミンはベンジルオキシカルボニル基により予めブロックしておいた。５’第１アルコールは弱酸性媒体中で遊離後、リン酸化する。カプロン酸エステルのアミン基は水素化分解により遊離後、発蛍光団により置換する。最終段階で、ピロリン酸のテトラ−トリ−ｎ−ブチルアンモニウム塩の作用により、ホスホロイミダゾレート形態の活性化一リン酸塩を三リン酸塩に変換する。ｄ）種々の蛍光色素により置換された６−アミノカプロン酸により３’アシル化されたプリン三リン酸の合成：２’−デオキシアデノシン（図１０）：３’アシル化された２’−デオキシアデノシンの５’ヒドロキシルを塩化リン酸ジベンジルによりリン酸化し、リン酸及びアミンを水素化分解により遊離させる。２’−デオキシグアノシン（図１１）：２’−デオキシグアノシンの場合は特殊である。実際に、塩化リン酸ジベンジルは５’ＯＨと反応しない。ジシクロカルボジイミドの存在下でリン酸シアノエチルを作用させることにより５’ＯＨをリン酸化した。ベンジルオキシカルボニル基の水素化分解中に、ホスホジエステルはシアノエチル基の分子内脱離によりホスホモノエステルに変換される。反応図式を図１１に示す。 −３’−ＲＴ−ｄＮＴＰの取り込み：約２ピコモルの５’−ビオチン化２１量体（５’−Ｂｉｏ−ＡＴＡＣＴＴＴＡＡＧＧＡＴＡＴＧＴＡＴＣＣ−３’）を製造業者により記載されているようにＭ −２８０Ｄｙｎａｂｅａｄｓと結合し、５’（ｄＴ）₁₀、（ｄＣ）₅、（ｄＧ）₅又は（ｄＡ）₅テールを有する過剰（約５０ピコモル）の相補的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションは１ＭＮａＣｌ、５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び０．５ｍＭＥＤＴＡの存在下で室温で１時間実施する。結合しなかったオリゴヌクレオチドの除去後、ビーズを洗浄して製造業者により提供される緩衝液に懸濁させ、５００μＭの１種類の３’−ＲＴ−ｄＮＴＰ及びＤＮＡポリメラーゼの存在下で５０℃でインキュベートする。２０ｍＭＥＤＴＡ、０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加えて反応を停止させ、ビーズを洗浄し、顕微鏡と血球測定器を併用してその濃度を測定後、放射能の取り込みを決定する（以下参照）。これらのヌクレオチド類似体は３’−ヒドロキシ基を含まないので、伸長ＤＮＡ鎖にこれらの類似体を取り込むと、鎖が停止する。これを図４に示し、同図ではまず最初にＤＮＡ基質を３’−ＲＴ−ｄＡＴＰ及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼで種々の時間処理した後、洗浄し、鎖の伸長に使用可能な遊離３’−ヒドロキシ基を決定する。これらの条件下では酵素１０単位で１０分間にＤＮＡ基質の約８０％の付加的伸長が阻止され、その後、使用可能な３’−ヒドロキシ基の量は安定してゆっくりと減少する。３’−ＲＴ−ｄＧＴＰ、３’−ＲＴ−ｄＴＴＰ又は３’−ＲＴ−ｄＣＴＰを夫々の鋳型で試験すると、同様のプロフィルが得られる。所与の３’−ＲＴ−ｄＮＴＰをＤＮＡポリメラーゼ及びその固有の塩基対合に対応しない鋳型と共にインキュベートする場合にはその後の鎖停止は観察されないので、３’基は酵素の認識メカニズムを変更しないと考えられる。これらの結果から明らかなように、比較的嵩高な３’基にも拘わらず、これらの修飾ヌクレオチドは依然として酵素により許容される。多数の鎖停止ヌクレオチド類似体が種々のＤＮＡポリメラーゼの基質である。そのＤＮＡ鎖を鋳型としてヌクレオチド基質の適正な塩基対合が生じること、及びβ−Ｌ−リボシドのエナンチオマーで同一ホスホジエステル結合が形成されることは報告されており［ＶａｎＤｒａａｎｅｎ，Ｎ．ら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，ｐｐ．２５０１９−２５０２４］、従って、酵素による糖部分の結合は恐らく特異的ではないと考えられる。本発明の修飾ヌクレオチドは更に複数のＤＮＡポリメラーゼにより基質として許容される。図５は、本発明で合成される類似体が種々のＤＮＡポリメラーゼの基質であることを示し、ｓｅｑｕｅｎａｓｅ及びＭ−ＭｕＬＶ逆転写酵素は本発明の試験条件下で夫々最高及び最低の効力を有する。非修飾ＤＮＡポリメラーゼＴ７、Ｔａｑポリメラーゼ及び市販のＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントもこれらの基質を使用することが可能である。本出願人は、３’→５’−エキソヌクレアーゼ活性、分配係数の関数としての処理能力又は縮合速度に関して所与のＤＮＡポリメラーゼで取り込みを最適化する試みは行わなかった。しかしながら、酵素が３’ヌクレオチドを有効に縮合し且つ新たに縮合されたヌクレオチドを除去し得る３’→５’エキソヌクレアーゼ活性をもたない場合にしか後続塩基で方法を反復できないことは明らかである。ＤＮＡポリメラーゼがそのポリペプチド鎖に固有のエステラーゼ活性をもたないことも本発明の方法に重要であると思われる。このような活性は、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント及び修飾又は非修飾Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼに存在する。この活性は酵素の精製度から独立しており、従って、ポリメラーゼ活性を有するタンパク質と同一のタンパク質により保有される。このエステラーゼ活性はヌクレオチドが適正に対合し且つ３’エステル化される重合中に作用するので、４種の３’−ＲＴ−ｄＮＴＰを同時に使用する場合にはこのエステラーゼ活性は鎖停止の制御を不可能にする。しかしながら、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは本明細書に記載するような所定の反応条件下ではこのエステラーゼ活性をもたないので、下記配列決定法の優れた酵素である。−蛍光マーカーの除去及び３’ヒドロキシルの復元：ａ）アントラニル酸エステル：この段階では、挿入ヌクレオチドの３’位のマーカーは、４種の可能な挿入ヌクレオチド塩基を区別し、その後の伸長を阻止するという２つの主要な役割を有する。マーカーを除去すると、挿入塩基を間接的に同定し、方法の反復に使用可能な遊離３’−ヒドロキシ基を再生することができる。リボシル部分とアントラニロイル置換基との化学結合の性質は特に重要である。カルボン酸エステルは１本鎖ＤＮＡの化学的安定性に適合可能な当量の水酸化物イオンにより容易に加水分解される［ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ｌ．Ｂ．及びＴｉｐｓｏｎ，Ｓ．Ｒ．編，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎ，Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ並びにＪｅｎｃｋｓ，Ｗ．Ｐ．（１９６９）ＣａｔａｌｙｓｉｓｉｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｄｏｖｅｒｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ］。更に、プロテイナーゼＫが上記Ｉ及びＩＩ型の３’−アントラニロイル−２’ −ｄＡＭＰに作用するのと同様に、種々多様なエステラーゼ及びセリンプロテアーゼが多種多様なこれらのエステルの加水分解を触媒する［Ｈｅｙｍａｎｎ，Ｅ．及びＭｅｎｔｌｅｉｎ，Ｒ．（１９８１）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．７７，ｐｐ．３３３−３４４］。酵素又は化学的方法で容易且つ有効に除去できるように特別に設計したスペーサーアームを有するマーカーで３’位をエステル化することができよう。次に、上述のようにＤＮＡ鋳型の遊離３’−ヒドロキシ基に３’−ＲＴ−ｄＡＭＰを加えた後、カルボン酸エステルを０．１Ｍ水酸化ナトリウムで３７℃で５分間加水分解する（表２）。相補鎖のリハイブリダイゼーション後、ＤＮＡポリメラーゼは３’をブロックしていない同一鋳型に対して８３〜１０３％の放射能を取り込むことができる。常に１００％回収できる訳ではないのは、オリゴヌクレオチドのリハイブリダイゼーションが強アルカリ処理よりも不完全なためであると思われる。リボシルエステルの同様の加水分解条件も報告されている［Ｆａｌｂｒｉａｒｄ，Ｊ．Ｇ．，Ｐｏｓｔｅｒｎａｋ，Ｔ及びＳｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｅ．Ｗ．（１９６７）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１４８，ｐｐ．９９−１０５並びにＨｉｒａｔｓｕｋａ，Ｔ．（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏ１．Ｃｈｅｍ．２５７，ｐｐ．１３３５４−１３３５８］。本願出願人は取り込まれた４種の３’−ＲＴ−ｄＮＴＰ間にエステル加水分解の効力の目立った差異を認めなかった。ｂ）カプロン酸のエステル：発蛍光団により置換されたカプロン酸の遊離は、酵素（例えばリパーゼ又はヒドロラーゼ）の作用により実施する。特に多量の物質に適用する場合にリン酸の脱保護を助長するために、塩化リン酸ジベンジル（化合物Ｂ；図９）をリン酸化剤として使用する別の方法（Ｐ．Ｔ．Ｇｉｌｈａｍ及びＨ．Ｇ．Ｋｈｏｒａｎａ．Ｊ．Ａ．Ｃ．Ｓ．１９５８，８０：６２１２− ６２２２）を採用した。この方法は合成がかなり制限的（４８％）であるが、無視できない利点がある。実際に、化合物（１１）から出発すると、温和な条件（室温及び大気圧）下でただ１回の水素化分解段階で化合物（１２）が得られる。水素化分解（Ｐ．Ｔ．Ｇｉｌｈａｍ及びＨ．Ｇ．Ｋｈｏｒａｎａ．Ｊ．Ａ．Ｃ．Ｓ．１９５８，８０：６２１２−６２２２）により化合物（１１）を脱保護するために、下記の数種の実験条件を試みた。 −数種の溶媒：酢酸エチル、エタノール、９０％エタノール、及びテトラヒドロフラン； −２種の触媒：炭素担持パラジウム及び硫酸バリウム担持パラジウム。硫酸バリウム担持パラジウムの存在下で９０％エタノールが理想的な溶媒であることが判明した。実際に、この溶媒中で全体脱保護（ベンジル及びベンジルオキシカルボニルの損失）は定量的であり、３’エステル化ホスホモノエステル（化合物１２）の単離は十分助長される。チミジンではフルオレセイン（ＩＮＴＥＲＢＩＯｔｅｃｈ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ；“１９９２−１９９４Ｈａｎｄｂｏｏｋｏｆｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｂｅｓａｎｄｒｅｓｅａｒｃｈｃｈｅｍiｃａｌｓ”．１９９２，２０−４１）（ＦＩＴＣ）をラベルとして指定するように選択し、フルオレセインは上記基準即ち非放射性ラベルと、いずれも高い吸光（ＤＭＦ中ｐＨ＝９でλ_max=４９５ｎｍでξ＝７６．１０^-3ｌ．ｍｏｌ^-1．ｃｍ^-1）及び発光（λ_max＝５１９ｎｍ）に合致する。一般に、アミン基はｐＨ約１１のイソチオシアネート基と反応する（この反応は実験室で既に実施されている）（Ｓ．Ｒ．Ｓａｒｆａｔｉ及びＡ．Ｎａｍａｎｅ，Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．１９９０，３１：２５８１−２５８４）。一方、３’位にグラフトした脂肪族鎖がこのｐＨで加水分解されることは知られている。この欠点を解決するために、本発明者らは室温でピリジン／水混合物中で化合物（１２）をフルオレセイン５−イソチオシアネートと反応させた。これらの条件は、Ｆ．Ｓ．Ｗｕｓｔｅｍａｎ及びＰ．Ｇａｃｅｓａ（ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９３，２４１：２３７−２４４）により６−アミノカプロン酸及びフルオロセイン５−イソチオシアネートについて報告されている（下記図式）。この方法により、本発明者らはアルカリ媒体中で生じるようなＴＭＰの形成を観察しないと同時に、反応しなかった化合物（１２）のフラクションを回収することができた。他方、生成物の溶解度に関して困難が生じたため、逆相極性カラム上で高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により収率を評価しなければならず、この手段では生成物の特徴付けに必要な量しか精製することができなかった。化合物（１３）からチミジンの類似体の三リン酸塩（化合物１４）を製造するには２種類の方法をとることができた。第１の方法は、ホスホロモルホリデートを調製し、モルホリンをピロリン酸のテトラ−トリ−ｎ−ブチルアンモニウム塩で置換することからなり（Ｊ．Ｇ．Ｍｏｆｆａｔ及びＨ．Ｇ．Ｋｈｏｒａｎａ，Ｊ．Ａ．Ｃ．Ｓ．，１９６１，８３：６４９−６５８）、第２の方法は、化合物（１３）をカルボニルジイミダゾールで処理した後、イミダゾールを同一のピロリン酸塩により置換することからなる（Ｙ．Ｔｏｒ及びＰ．Ｄ．Ｄｅｒｖａｎ，Ｊ．Ａ．Ｃ．Ｓ．，１９９３，１１５：４４６１−４４６７；Ｒ．Ｔｉｐｓｏｎ及びＢ．Ｔｏｗｎｓｅｄ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐａｒｔ４（Ｗｉｌｅｙ−ＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ）１９９１，３３７−３４０）。第１の方法は３’位の脂肪族鎖を加水分解する恐れのある塩基性高温条件が必要であるので、本発明者らは第２の方法を選択した。化合物（１４）を単離するにはＨＰＬＣによる精製が必要であると思われるので、この段階は非精製ホスホモノエステル（化合物１３）上で小規模で実施した。特に有利な別の保護方法は２’−デオキシシチジンの三リン酸類似体の合成であり、この方法の利点は化合物（１９）の水素化分解可能な４個の基をただ１段階即ち段階（ｅ）で除去できるという点である。 −２’−デオキシシチジン三リン酸類似体の合成：ｄＣから出発し、本発明者らはテトラフルオロ硼酸１−（ベンジルオキシカルボニル）３−エチルイミダゾリウムを用いてＲａｐｐｏｐｏｒｔら（Ｂ．Ｅ．Ｗａｔｋｉｎｓ，Ｊ．Ｓ．Ｋｉｅｌｙ及びＨ．Ｒａｐｐｏｐｏｒｔ，Ｊ．Ａ．Ｃ．Ｓ．，１９８２，１０４：５７０２−５７０８）の条件に従って塩基の芳香族アミンを保護し、５’第１アルコール基をジメトキシトリチル化により保護した（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬＰｒｅｓｓａｔＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ），１９８４，２７−３４及び５１；Ｈ．Ｓｃｈａｌｌｅｒ，Ｇ．Ｗｅｉｍａｎｎ，Ｂ．Ｌｅｒｃｈ及びＨ．Ｇ．Ｋｈｏｒａｎａ，Ｊ．Ａ．Ｃ．Ｓ．１９６３，８５：３８２１−３８２７）（化合物１６；図１１）。次に、化合物（１６）に無水物（６’）を作用させることにより脂肪族鎖を導入した（Ｄ．Ｈ．Ｒａｍｍｌｅｒ及びＨ．Ｇ．Ｋｈｏｒａｎａ，Ｊ．Ａ．Ｃ．Ｓ．１９６３，８５：１９９７−２００２）。化合物（１７）のこの合成は、化学量論的条件下で１，８−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣＩ）の存在下で化合物（１６）上で化合物（６）を「直接」アシル化する方法でも実施し、同等の収率（８５％）を得た。記載されている（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬｐｒｅｓｓａｔＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ），１９８４，２７−３４及び５１；Ｈ．Ｓｃｈａｌｌｅｒ，Ｇ．Ｗｅｉｍａｎｎ，Ｂ．Ｌｅｒｃｈ及びＨ．Ｇ．Ｋｈｏｒａｎａ，Ｊ．Ａ．Ｃ．Ｓ．１９６３，８５：３８２１−３８２７）通りに酸性媒体中で化合物（１７）の５’第１ヒドロキシル基を脱保護後、本発明者らは塩化リン酸ジベンジル（化合物Ｂ；図９）の作用により化合物（１８）をリン酸化した（Ｐ．Ｔ．Ｇｉｌｈａｍ及びＨ．Ｇ．Ｋｈｏｒａｎａ．Ｊ．Ａ．Ｃ．Ｓ．１９５８，８０：６２１２−６２２２）。この段階はかなり制限的（４８％）であったが、所望の化合物（１９）を得ることができた。水素化分解によるその脱保護（Ｐ．Ｔ．Ｇｉｌｈａｍ及びＨ．Ｇ．Ｋｈｏｒａｎａ．Ｊ．Ａ．Ｃ．Ｓ．１９５８，８０：６２１２−６２２２；Ｂ．Ｅ．Ｗａｔｋｉｎｓ，Ｊ．Ｓ．Ｋｉｅｌｙ及びＨ．Ｒａｐｐｏｐｏｒｔ，Ｊ．Ａ．Ｃ．Ｓ．，１９８２，１０４：５７０２−５７０８；Ｊ．Ｈ．Ｒｉｇｂｙ，Ｔ．Ｌ．Ｍｏｏｒｅ及びＳ．Ｒｅｇｅ，Ｊ．Ｏ．Ｃ．１９８６，５１：２４００−２４０２）は、チミジンの類似体で使用した条件と同一条件下で実施し、高収率（７８％）を得た。次に、以下のいくつかの理由、即ちＮ−メチルイサト酸無水物の作用はｄＣのピリミジン塩基の芳香族アミンに影響せず（Ｂ．Ｃａｎａｒｄ及びＲ．Ｓ．Ｓａｒｆａｔｉ，１９９４（Ｇｅｎｅ，印刷中））、λ_max＝３３８ｎｍで励起されるこのラベルはフルオレセインの波長（発光λ_max＝５１９ｎｍ）とは異なる波長λ_max＝４１６．５ｎｍで発光し、化合物（２１）の合成により、脂肪族鎖（化合物６）を介して３’位をラベルされた一リン酸から三リン酸を得る本発明者らの手法が良好であるか否かを迅速に確認することができるといった理由から、本発明者らは２’−デオキシシチジン（ｄＣ）のラベルとしてＮ−メチルイサト酸（図１３）をまず選択した。フルオレセイン５−イソチオシアネートを用いたチミジンの類似体の合成（Ｆ．Ｓ．Ｗｕｓｔｅｍａｎ及びＰ．ＧａｃｅｓａＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９３，２４１：２３７−２４４）に使用されたと同一の実験条件下で合成した化合物（２１）から出発し、本発明者らは化合物（２１）をカルボニルジイミダゾール及びピロリン酸、テトラ−トリ−ｎ−ブチルアンモニウム塩（Ｙ．Ｔｏｒ及びＰ．Ｄ．Ｄｅｒｖａｎ，Ｊ．Ａ．Ｃ．Ｓ．，１９９３，１１５：４４６１−４４６７；Ｒ．Ｔｉｐｓｏｎ及びＢ．Ｔｏｗｎｓｅｄ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐａｒｔ４（Ｗｉｌｅｙ−ＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ）１９９１，３３７−３４０）で順次処理することにより三リン酸塩を調製した。こうして得られた化合物（２２）をクロマトグラフィー精製し、リンの核磁気共鳴により特徴付けた。これらの結果が良好であったので、同様に化合物（２０）をローダミンでラベルした（ＩＮＴＥＲＢＩＯｔｅｃｈ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ；“１９９２−１９９４Ｈａｎｄｂｏｏｋｏｆｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｂｅｓａｎｄｒｅｓｅａｒｃｈｃｈｅｍｉｃａｌｓ”．１９９２，２０− ４１）。実際に、ローダミンはフルオレセインと常に異なる発光波長λ_max＝５９６ｎｍでＮ−メチルイサト酸よりも著しく強く蛍光発光する。化合物（２３）は溶解度が低いので、フラクションをＨＰＬＣにより精製して特徴付けた。ｃ）５−アミノ−２，５−ジデオキシ−Ｄ−リボン酸のエステル：図３の図式は、ヒドロキシル基の遊離及び復元がどのように行われるかを示し、ビシナルジオールは過ヨウ素酸酸化され、この酸化の結果として一方ではアルデヒドは上記方法により測定可能な蛍光吸収及び発光を有する発蛍光団により置換され、他方ではオリゴヌクレオチドはエノール化後にβ脱離により除去されるアルデヒドにより置換され、こうして３’ヒドロキシルを遊離する。これらの条件は配列決定すべき鋳型にハイブリダイズしたプライマー等の２本鎖ＤＮＡを変性しないので、過ヨウ素酸酸化の使用はプライマーをリハイブリダイズせずに新しい伸長と適合可能である。工程全体は該当配列が完全に配列決定されるまでこうして反復され得る。図９の図式はこの型の化合物の利点を明示するものであり、実際にオリゴヌクレオチド合成では、糖はレブリン酸のエステル形態であるレブリネートで一時的に保護される場合が多い（Ｊ．Ｈ．ＶａｎＢｏｏｍら，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．４８７５（１９７６））。これらのエステルの別の利点として、アルコールの脱保護が中性ｐＨ及び室温で１分間に定量的である。これらの条件下でオリゴヌクレオチドは安定である。過ヨウ素酸酸化された６−アミノ−２，３，６−トリデオキシ−Ｄ−グルコン酸により３’アシル化されたヌクレオチドは、メチルを水素（ケトンをアルデヒド）で置換した以外はレブリン酸エステルと同一のエステル及び蛍光色素を定量的に遊離する。アルコールは以下の機序で再生される。中性ｐＨでヒドラジン−ピリジン−酢酸−水混合物中でケトン基はヒドラゾンに変換され、窒素上の遊離ダブレットはカルボニルを攻撃し、アルコールが遊離される。ヒドラゾンはケトンからよりもアルデヒドからのほうが形成し易いので、３’ −ＯＨの復元はアルデヒドからのほうが迅速であると思われる。従って、この型の化合物には多数の利点があり、室温で中性ｐＨで特に定量的に迅速に脱保護可能である。 −Ｍｉｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｅｐｒａｅのリファンピシン耐性株のｒｐｏＢ遺伝子のヌクレオチド配列決定例：下記実施例は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動段階を必要とせずに管内又はカラム内で１本鎖核酸の複合混合物中のヌクレオチド配列を同定するために上記方法を使用できることを立証するものである。１）ＤＮＡサンプル及び配列決定標的：本実施例では、分析しようとするヌクレオチド配列はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｅｐｒａｅのＲＮＡポリメラーゼのサブユニットβの遺伝子の一部（ｒｐｏＢ）である。遺伝子中のコドン４２５におけるアミノ酸を改変すると、細菌にリファンピシン耐性が付与される。野生コドン中の１、２又は３位については、セリンをロイシン、フェニルアラニン又はメチオニンに置換する突然変異が既に報告さ（１９９３），Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ＡｇｅｎｃｅａｎｄＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ３７，ｎ°３，ｐｐ．４１４−４１８］。出発生物材料は上記文献に記載されているように取得し、要約すると、マウスの足の裏からリファンピシン耐性Ｍ．ｌｅｐｒａｅ細胞を抽出し、凝固／沸騰法により溶解させ、ｒｐｏＢ遺伝子の特異的プライマー１及び２を使用することによりサンプルをＰＣＲ増幅する。次に増幅産物をアガロースゲル電気泳動により分析し、本実施例の出発ＤＮＡサンプルとして使用する。２）オリゴヌクレオチドプライマー：プライマー１は上記文献のＢｒｐｏＢ２２である。即ち配列：５’−ＣＡＧＧＡＣＧＴＣＧＡＧＧＣＧＡＴＣＡＣ−３’を有するビオチン化５’プライマーである。プライマー２は遺伝子ｒｐｏＢのコドン４２５中の分析すべきヌクレオチドに隣接する配列から選択する。プライマー２はコドン４２５の下流のＭ．ｌｅｐｒａｅの遺伝子ｒｐｏＢの野生型に対応する配列：５’−ＣＡＡＡＣＣＡＣＣＣＧＧＧＣＣＣＡＧＣＧＣ−３ ’を有する２１ヌクレオチドから構成される。プライマー３は本明細書中に上述し、図７に示す「ヘアピン」型プライマーである。その５’末端はリン酸化され、ヌクレオチド配列：５’−ＧＧＧＣＧＧＣＧＧＧＧＣＴＴＴＡＴＴＴＧＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＡＡＡＣＣＡＣＣＣＧＧＧＣＣＣＡＧＣＧＣ−３’を有する。これらのプライマーはＧＥＮＳＥＴ社（フランス、パリ）から精製形態で入手した。３）配列決定用鋳型の調製：載されている通りに使用し、最終反応容量１００μｌ中でＭ．ｌｅｐｒａｅの未知サンプルのコドン４２５の配列決定に使用可能なＰＣＲ増幅フラグメントを生成する。アリコート（１０μｌ）をアガロースゲル電気泳動により分析し、ＰＣＲ増幅が適正であることを確認する。次にストレプトアビジンで被覆して予め洗浄した磁気ビーズ（Ｍ２８０Ｄｙｎａｂｅａｄｓ，ストレプトアビジン、Ｄｙｎａｌ社、ノルウェー）にＰＣＲ増幅産物１００μｌを吸着させ、製造業者により記載されているように０．１ＭＮａＯＨを使用することにより、ビーズに結合し続けている相補鎖から非ビオチン化変性ＤＮＡ鎖を除去する。数回洗浄後、支持体に結合した１本鎖ＤＮＡ鋳型は精製形態であり、プライマー又はヌクレオチドを妨げない。４）「ヘアピン」型プライマー３の連結：支持体に結合した鋳型を連結用緩衝液（４０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．５、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭＤＴＴ、０．５ｍＭＡＴＰ）に再懸濁し、「ヘアピン」型プライマー３５ｎＭを混合物に加え、管を６９℃で２分間、３７ ℃で３０分間加熱する。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社、ドイツ）４０単位の添加後、混合物を時々撹拌しながら室温で３時間インキュベートする。こうして連結した生成物をビーズに結合させ、製造業者に記載されているようにＴＥ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８、１ｍＭＥＤＴＡ）で数回洗浄し、最後に滅菌蒸留水１２０μｌに再懸濁する。５）配列決定反応：ａ）連結した「ヘアピン」型プライマー３の３’ＯＨ末端への３’ＲＴ−ｄＮＭＰの取り込み（配列決定用鋳型）：次に配列決定用鋳型を「ヘアピン」型プライマーにより伸長させ、３’ＯＨ末端をブロックする（図７参照）。ビーズに結合した鋳型に以下の溶液（伸長用溶液）： −１０倍濃縮緩衝液１０μｌ（製造業者により提供）、 −グリセロール１０μｌ、 −３’−アントラニロイルｄＡＴＰ、３’−Ｎ−メチルアントラニロイルｄＧＴＰ、３’−５−メチルアントラニロイルｄＣＴＰ、３’−６−メチルアントラニロイルｄＴＴＰ各２ｍＭ濃度の３’ＲＴ−ｄＮＴＰ５０μｌ、 −Ｔａｑポリメラーゼ１０μｌ（５単位／μｌ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社、ドイツ）を加える。管を時々静かに撹拌しながら５０℃で３０分間インキュベートした後、磁気分離器に移し、取り込まれなかったヌクレオチドを除去し、１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．５、１ｍＭＥＤＴＡ、２ＭＮａＣｌ、０．０２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で３回洗浄した後、０．０２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で２回洗浄し、滅菌蒸留水で１回洗浄する。ｂ）３’保護の除去：滅菌蒸留水を除去し、０．１ＭＮａＯＨ３０μｌをビーズに直接加える。次に５０℃で１０分間インキュベーションを行う。次にサンプルを磁気撹拌し、上清を集め、再び０．１ＭＮａＯＨ３０μｌをビーズに加え、５０℃で１０分間インキュベートした後、磁気分離後に第２の上清を第１の上清と混合し、蛍光スペクトル分析する。取り込み段階後にすぐにビーズを上記と全く同様に洗浄し、ビーズ懸濁液１２０μｌを新たな伸長反応に備える。ｃ）取り込んだヌクレオチドに対応する３’標識の同定：集めた上清に０．５ＭＴｒｉｓ（ｐＨ８）６．６μｌを加え、Ｐｅｒｋｉｎ −ＥｌｍｅｒＬ５０Ｂスペクトロフルオロメーター及び対応するＨＰＬＣ蛍光分析検出セルを使用することにより、先述のように蛍光スペクトル分析する。０．１ＭＮａＯＨ及び５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８）を含有する対照溶液を使用することにより較正を行う。アントラニレートを含まない４種の誘導体に対応する個々のスペクトルを同一緩衝液中で測定し、その最大発光を決定する。次に、その励起スペクトルを上述のように決定する。こうして２つの特定波長、即ち励起及び発光最大値（ｎｍ）で各マーカーを定義する。検出セルにサンプルを加えた後、３１０ｎｍで励起させ、３４０〜５００ｎｍで発光スペクトルを測定する。対照のスペクトルを差し引くことにより、緩衝液に起因するスペクトルへの影響を修正し、曲線をならし、製造業者により提供されるコンピュータープログラムを使用することにより、上記最大値に対応する波長を決定する。上清の蛍光スペクトル分析の結果、夫々励起及び発光最大値は３１７ｎｍ及び４０９ｎｍである。こうして、配列決定鋳型の３’末端にｄＣ残基が取り込まれたことが明らかに確認される。６）方法の反復：リファンピシン耐性単離株のＭ．ｌｅｐｒａｅ遺伝子ｒｐｏＢのコドン４２５の配列決定：次にビーズ懸濁液１２０μｌで再び配列決定反応の段階５ａ），ｂ），ｃ）を実施し、Ｍ．ｌｅｐｒａｅのリファンピシン耐性単離株のコドン４２５の後続ヌクレオチドを同定する。この場合には、励起及び発光最大値は夫々３１５ｎｍ及び３９７ｎｍであり、従って、前の反応のｄＣの後にｄＡ残基が取り込まれたことが確認される。更に最終配列決定サイクル（段階５ａ），ｂ），ｃ））により、配列決定用鋳型の３’末端に取り込まれたｄＴ残基に特徴的な夫々２８９ｎｍ及び４０３ｎｍの励起及び発光波長が確認される。以上の実験に基づき、発明者らは分析したサンプルの遺伝子ｒｐｏＢのコドン４２５のヌクレオチド配列が、野生表現型の特徴を表すセリンの代わりにメチオニンをコードするＡＴＧであると結論する。この種の突然変異はｒｐｏＢ３型単離株で報告されていｅｐｒａｅの単離株の遺伝子におけるリファンピシン耐性の分子的基礎を与える。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＧ０１Ｎ 33/58 8310−2ＪＧ０１Ｎ 33/58 Ａ // Ｃ１２Ｎ 15/09 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 Ａ

Claims

【特許請求の範囲】１．下記一般式：［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３又はＲ４は水素（Ｈ）原子、メチル（ＣＨ₃）基、又は残基の特性が保存されるという条件下で別の基であり、３’ヒドロキシルは塩基性媒体へのアントラニル酸誘導体の遊離又は酵素、例えばリパーゼもしくはヒドロラーゼの作用により復元され得る］を有するアントラニレートであることを特徴とするデオキシリボヌクレオチド５’−三リン酸（ｄＮＴＰ）又はリボヌクレオチド５’−三リン酸（ＮＴＰ）のエステル。２．置換基が３’−アントラニル酸ｄＡＴＰではＲ１＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｒ４＝Ｈであり、Ｎ−メチル−３’−アントラニル酸ｄＧＴＰではＲ１＝ＣＨ₃、Ｒ２＝Ｒ３＝Ｒ４＝Ｈであり、３−メチル−３’−アントラニル酸ｄＴＴＰではＲ２＝ＣＨ₃、Ｒ１＝Ｒ３＝Ｒ４＝Ｈであり、５−メチル−３’− アントラニル酸ｄＣＴＰではＲ４＝ＣＨ₃、Ｒ１＝Ｒ２＝Ｒ４＝Ｈであることを特徴とする請求項１に記載のエステル。３．下式：（式中、３’ヒドロキシルは任意の発蛍光団により置換されたカプロン酸を塩基性媒体中に遊離させるか又は酵素、例えばリパーゼもしくはヒドロラーゼの作用により復元され得る）を有することを特徴とするデオキシリボヌクレオチド５’−三リン酸（ｄＮＴＰ）又はリボヌクレオチド５’−三リン酸（ＮＴＰ）のエステル。４．下式：（式中、Ｘはシグナルを与えることが可能な物質、特に発蛍光団、又は水素を表し、３’ヒドロキシルはビシナルジオールの過ヨウ素酸酸化段階と、３’アルデヒドのエノール化及びβ脱離段階との２段階で遊離され得る）の一方に対応することを特徴とするデオキシリボヌクレオチド５’−三リン酸（ｄＮＴＰ）又はリボヌクレオチド５’−三リン酸（ＮＴＰ）のエステル。５．ａ）プライマーを構築及び使用する段階と、ｂ）その組み込みによってその後の伸長を阻止し且つエステルがこれらの修正ヌクレオチドを構成する４種の塩基の各々の特異的標識を有するように３’ＯＨをエステル化されたヌクレオチド三リン酸を前記プライマー又は他の任意のプライマーから核酸ポリメラーゼにより付加する段階と、ｃ）形成されたエステルの化学的又は酵素的加水分解により３’ＯＨ基を復元する段階と、ｄ）形成された加水分解物を所与のヌクレオチドで特徴付ける段階と、ｅ）段階ａ）、ｂ）、ｃ）及びｄ）を反復し、後続ヌクレオチドを特徴付ける段階とを含むポリヌクレオチド鎖の配列決定方法における請求項１から４のいずれか一項に記載のエステルの使用。６．プライマーが５’リン酸化「ヘアピン」型プライマーであり、配列決定すべきＤＮＡ鋳型を生成するためにＰＣＲで使用するプライマーと同一の３’配列の一部を有しており、配列決定すべきＤＮＡ鋳型の連結後にプライマーが塩基性媒体中の脱保護に適合可能であることを特徴とする請求項５に記載の使用。７．エステルが蛍光検出可能な化合物を担持しており、該化合物の励起及び発光特性が４種のヌクレオチドの各々の特徴であることを特徴とする請求項５に記載の使用。８．核酸配列中の点突然変異の検出又は２〜２０ヌクレオチドを含む変異体の検出における請求項１から４のいずれか一項に記載のエステルの使用。９．核酸の複合混合物中の特定配列の調査における請求項１から４のいずれか一項に記載のエステルの使用。１０．分析を所望される核酸配列の存在をサンプル中で診断するツールであって、配列決定プライマーと、可逆的に３’エステル化された４種のデオキシリボヌクレオチドと、任意要素として被分析核酸又はプライマーを固定化するための固相と、プライマーに応じて選択され、好ましくは３’→５’エキソヌクレアーゼ活性をもたない核酸ポリメラーゼ、好ましくはＴａｑＤＮＡポリメラーゼとを含む診断用ツール。