DE19962893A1

DE19962893A1 - Verfahren zur parallelen Sequenzierung eines Nukleinsäuregemisches an einer Oberfläche

Info

Publication number: DE19962893A1
Application number: DE19962893A
Authority: DE
Inventors: Achim Fischer
Original assignee: BASF Lynx Bioscience AG
Current assignee: Sygnis Pharma AG
Priority date: 1999-12-23
Filing date: 1999-12-23
Publication date: 2001-07-12

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur parallelen Sequenzierung von mindestens zwei verschiedenen in einem Nukleinsäuregemisch enthaltenen Nukleinsäuren, wobei DOLLAR A (a) Primermoleküle, die mindestens ein Primerpaar bilden, an eine Oberfläche irreversibel immobilisiert werden; DOLLAR A (b) Nukleinsäuremoleküle mit einem oder mit beiden Primern desselben Primerpaares hybridisiert werden; DOLLAR A (c) die irreversibel immobilisierten Primermoleküle komplementär zum Gegenstrang unter Bildung von sekundären Nukleinsäuren verlängert werden; DOLLAR A (d) die nicht durch irreversible Immobilisierung an die Oberfläche gebundenen Nukleinsäuremoleküle von der Oberfläche entfernt werden; DOLLAR A (e) sie sekundären Nukleinsäuren unter Bildung von tertiären Nukleinsäuren amplifiziert werden; DOLLAR A (f) Gegenstränge der tertiären Nukleinsäuren, GTN, bereitgestellt werden; DOLLAR A (g) die GTN um ein Nukleotid verlängert werden, wobei DOLLAR A - das Nukleotid an der 2'-OH-Position oder an der 3'-OH-Position eine Schutzgruppe trägt, die eine weitere Verlängerung verhindert, DOLLAR A - das Nukleotid eine Molekülgruppe trägt, die die Identifikation des Nukleotids ermöglicht; DOLLAR A (h) das eingebaute Nukleotid identifiziert wird; DOLLAR A (i) die Schutzgruppe entfernt wird und die zur Identifikation versendete Molekülgruppe des eingebauten Nukleotids entfernt oder verändert wird, und DOLLAR A (j) Schritt (g) und nachfolgende Schritte solange wiederholt werden, bis die gewünschte Sequenzinformation erhalten worden ist.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Festphasen-gestützten parallelen Sequen zierung von mindestens zwei verschiedenen in einem Nukleinsäuregemisch ent haltenen Nukleinsäuren.

Ein wichtiges Verfahren der biologischen Analytik ist die Sequenzanalyse von Nukleinsäuren. Hier wird die genaue Basenfolge der interessierenden DNA- oder RNA-Moleküle bestimmt. Die Kenntnis dieser Basenfolge erlaubt beispielsweise die Identifikation bestimmter Gene oder Transkripte, also der zu diesen Genen gehörigen Boten-RNA-Moleküle, die Aufdeckung von Mutationen bzw. Poly morphismen, oder auch die Identifikation von Organismen oder Viren, die sich anhand bestimmter Nukleinsäuremoleküle eindeutig erkennen lassen. Üblicher weise wird die Sequenzierung von Nukleinsäuren nach dem Kettenabbruchverfah ren durchgeführt (Sanger et al. (1977) PNAS 74, 5463-5467). Hierzu wird eine enzymatische Ergänzung eines Einzelstrangs zum Doppelstrang vorgenommen, indem ein an besagten Einzelstrang hybridisierter "Primer", in der Regel ein syn thetisches Oligonukleotid, mittels Zugabe von DNA-Polymerase und Nukleotid bausteinen verlängert wird. Ein geringer Zusatz von Abbruch- Nukleotidbausteinen, welche nach ihrer Inkorporation in den wachsenden Strang keine weitere Verlängerung mehr zulassen, führt zur Akkumulation von Teilsträngen mit bekanntem, durch das jeweilige Abbruchnukleotid festgelegtem Ende. Das so erhaltene Gemisch unterschiedlich langer Stränge wird mittels Gel ektrophorese der Größe nach aufgetrennt. Aus den entstehenden Bandenmustern läßt sich die Nukleotidfolge des unbekannten Strangs ableiten. Ein großer Nach teil des genannten Verfahrens besteht im erforderlichen instrumentellen Aufwand, der den erreichbaren Durchsatz an Reaktionen begrenzt. Für jede Sequenzierungs reaktion ist, den Einsatz von mit vier unterschiedlichen Fluorophoren markierten Abbruchnukleotiden vorausgesetzt, mindestens eine Spur auf einem Flachgel oder, beim Einsatz von Kapillarelektrophorese, mindestens eine Kapillare erfor derlich. Der hierdurch entstehende Aufwand begrenzt auf den derzeit modernsten kommerziell erhältlichen Sequenzierautomaten die Zahl an parallel prozessierba ren Sequenzierungen auf maximal 96. Ein weiterer Nachteil besteht in der Be grenzung der Leselänge", also der Zahl der richtig identifizierbaren Basen pro Sequenzierung, durch die Auflösung des Gelsystems. Ein alternatives Verfahren zur Sequenzierung, die Sequenzbestimmung über Massenspektrometrie, ist schneller und erlaubt daher die Prozessierung von mehr Proben in der gleichen Zeit, ist andererseits aber auf verhältnismäßig kleine DNA-Moleküle (beispiels weise 40-50 Basen) beschränkt. Bei noch einer anderen Sequenzierungstechnik, Sequenzierung durch Hybridisierung (SBH, Sequencing By Hybridization; vgl. Drmanac et al., Science 260 (1993), 1649-1652), werden Basenfolgen durch die spezifische Hybridisierung unbekannter Proben mit bekannten Oligonukleotiden identifiziert. Besagte bekannte Oligonukleotide werden hierzu in einer komplexen Anordnung auf einem Träger fixiert, eine Hybridisierung mit der markierten, zu sequenzierenden Nukleinsäure wird vorgenommen, und die hybridisierenden Oli gonukleotide werden ermittelt. Aus der Information darüber, welche Oligonu kleotide mit der unbekannten Nukleinsäure hybridisiert haben, und aus ihrer Se quenz läßt sich dann die Sequenz der unbekannten Nukleinsäure ermitteln. Ein Nachteil des SBH-Verfahrens ist die Tatsache, daß sich die optimalen Hybridisie rungsbedingungen für Oligonukleotide nicht exakt vorhersagen lassen und sich dementsprechend kein großer Satz an Oligonukleotiden entwerfen läßt, die einer seits alle bei ihrer gegebenen Länge möglichen Sequenzvariationen enthalten und andererseits exakt die gleichen Hybridisierungsbedingungen benötigen. Somit kommt es durch unspezifische Hybridisierung zu Fehlern in der Sequenz- Bestimmung. Außerdem kann das SBH-Verfahren nicht für repetitive Regionen zu sequenzierender Nukleinsäuren eingesetzt werden.

Neben der Analyse der Expressionsstärke bekannter Gene, wie sie durch Dot Blot-Hybridisierung, Northern-Hybridisierung und quantitative PCR möglich ist, sind auch Verfahren bekannt, welche die de novo-Identifikation unbekannter zwi schen verschiedenen biologischen Proben differentiell exprimierter Gene ermögli chen.

Eine solche Strategie zur Expressionsanalyse besteht in der Quantifizierung dis kreter Sequenzeinheiten. Diese Sequenzeinheiten können in sog. ESTs (Expressed Sequence Tags) bestehen. Werden hinreichende Zahlen von Klonen aus cDNA- Banken, die von miteinander zu vergleichenden Proben stammen, sequenziert, können jeweils identische Sequenzen erkannt und gezählt werden und die erhalte nen relativen Häufigkeiten dieser Sequenzen in den verschiedenen Proben mitein ander verglichen werden (vgl. Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92 (1995), 8303-8307). Unterschiedliche relative Häufigkeiten einer bestimmten Sequenz zeigen differentielle Expression des entsprechenden Transkripts an. Allerdings ist das beschriebene Verfahren sehr aufwendig, da bereits für die Quantifizierung der häufigeren Transkripte die Sequenzierung vieler tausend Klone erforderlich ist. Andererseits ist für die eindeutige Identifikation eines Transkripts in der Regel lediglich ein kurzer Sequenzabschnitt von ca. 13-20 Basenpaaren Länge erforder lich. Diese Tatsache wird vom Verfahren des "Serial Analysis of Gene Expressi on" (SAGE) ausgenutzt (Velculescu et al. Science 270 (1995), 484-487). Hier werden kurze Sequenzabschnitte ("Tags") konkateniert, kloniert, und die resultie renden Klone werden sequenziert. Mit einer einzelnen Sequenzreaktion lassen sich auf diese Weise etwa 20 Tags bestimmen. Dennoch ist diese Technik noch nicht sehr leistungsfähig, da bereits für die Quantifizierung der häufigeren Tran skripte sehr viele konventionelle Sequenzreaktionen durchgeführt und analysiert werden müssen. Aufgrund des hohen Aufwands ist eine verläßliche Quantifizie rung seltener Transkripte mittels SAGE nur sehr schwer möglich.

Ein weiteres Verfahren zur Sequenzierung von Tags nach der US-A 5 695 934 besteht darin, kleine Kugeln mit zu sequenzierender Nukleinsäure auf eine solche Weise zu beschichten, daß jede Kugel zahlreiche Moleküle lediglich einer Nu kleinsäurespezies erhält. Zur Sequenzierung wird dann das Verfahren des "stepwise ligation and cleavage" eingesetzt, bei dem von einem artifiziellen Lin ker aus die zu sequenzierende Nukleinsäure durch Einsatz eines Typ IIS- Restriktionsenzyms basenweise abgebaut und dabei ihre Sequenz bestimmt wird. Damit eine Beobachtung und Aufzeichnung des Sequenziervorgangs möglich ist, werden die verwendeten Kugeln in eine flachen Küvette eingebracht, die nur we nig höher ist als dem Kugeldurchmesser entspricht, um die Bildung einer einzel nen Lage zu erlauben. Weiterhin müssen die Kugeln in dichtester Packung in der Küvette vorliegen, damit es während des Sequenziervorgangs weder durch den erforderlichen Austausch der Reaktionslösungen noch durch Erschütterungen des Geräts zu einer Veränderung der Kugelanordnung kommt. Obschon sich auf diese Weise viele Sequenzierreaktionen auf kleinem Raum durchführen lassen, hat die Anordnung in einer sehr engen Küvette (wenige Mikrometer Höhe) erhebliche Nachteile, da eine gleichmäßige Befüllung der Küvette schwer zu erreichen ist. Ein weiterer Nachteil besteht im hohen apparativen Aufwand des Verfahrens. So muß beispielsweise mit hohen Drücken gearbeitet werden, damit trotz der kleinen Küvettengröße ein effizienter Austausch der notwendigen Reaktionslösungen möglich ist. Noch ein weiterer Nachteil besteht im leichten Verstopfen der Kü vette, welches ebenfalls durch die notwendigerweise geringen Maße der Küvette begünstigt wird.

Die bekannten Verfahren zur Nukleinsäureseanalytik weisen einen oder mehrere der folgenden Nachteile auf:

- Sie ermöglichen nur in stark eingeschränkten Umfang die parallelisierte Durchführung von einzelnen Sequenzierungsreaktionen.
- Sie benötigen relativ große Mengen der Nukleinsäure, deren Sequenz be stimmt werden soll.
- Sie sind nur zur Sequenzbestimmung kurzen Sequenzabschnitten geeignet und apparativ aufwendig.

Es ist Aufgabe der Erfindung ein Verfahren bereit zu stellen, das die Nachteile des Standes der Technik überwindet.

Die erfindungsgemäße Aufgabe wird durch ein Verfahren zur parallelen Sequen zierung von mindestens zwei verschiedenen in einem Nukleinsäuregemisch ent haltenen Nukleinsäuren gelöst, wobei

a) Primermoleküle, die mindestens ein Primerpaar bilden, an eine Oberfläche irreversibel immobilisiert werden;
b) Nukleinsäuremoleküle mit einem oder mit beiden Primern desselben Pri merpaares hybridisiert werden, indem man das Nukleinsäuregemisch mit der Oberfläche in Kontakt bringt;
c) die irreversibel immobilisierten Primermoleküle komplementär zum Ge genstrang unter Bildung von sekundären Nukleinsäuren verlängert werden;
d) die nicht durch irreversibele Immobilisierung an die Oberfläche gebunde nen Nukleinäuremoleküle von der Oberfläche entfernt werden;
e) die sekundären Nukleinsäuren unter Bildung von tertiären Nukleinsäuren amplifiziert werden;
f) Gegenstränge der tertiären Nukleinsäuren, GTN, bereitgestellt werden;
g) die GTN um ein Nukleotid verlängert werden, wobei
- - das Nukleotid an der 2'-OH-Position oder an der 3'-OH-Position eine Schutzgruppe trägt, die eine weitere Verlängerung verhindert,
- - das Nukleotid eine Molekülgruppe trägt, die die Identifikation des Nu kleotids ermöglicht;
h) das eingebaute Nukleotid identifiziert wird;
i) die Schutzgruppe entfernt wird und die zur Identifikation verwendete Mo lekülgruppe des eingebauten Nukleotids entfernt oder verändert wird,
j) Schritt (g) und nachfolgende Schritte solange wiederholt werden, bis die gewünschte Sequenzinformation erhalten worden ist.

Bei dem Nukleinsäuregemisch des Schritts (b) kann es sich zum Beispiel um eine Bibliothek handeln, also um Nukleinsäuremoleküle, die über weite Strecken eine identische Sequenz aufweisen, sich aber in einem Teilbereich inmitten der identi schen Bereiche stark unterscheiden. Häufig bestehen die Bibliotheken aus gege benenfalls linearisierten Plasmiden, in welche verschiedene Nukleinsäurefrag mente einkloniert wurden, die später sequenziert werden sollen. Ferner kann es sich bei dem Nukleinsäuregemisch um Restriktionsfragmente handelt, an deren Schnittenden Linkermoleküle gleicher Sequenz ligiert wurden. Hierbei unter scheiden sich in der Regel die Linker, die an das 5'-Ende der Fragmente gebunden werden von den Linkern, die an das 3'-Ende der Fragmente gebunden werden. Jedenfalls ist in der Regel der interessierende Sequenzabschnitt in den Nuklein säuremolekülen des Nukleinsäuregemischs von zwei flankierenden im wesentli chen bei allen Nukleinsäuremolekülen jeweils identischen Sequenzabschnitten umgeben, von denen einer der beiden Seuenzabschnitte bevorzugt eine selbst komplementäre Sequenz aufweist. Der betreffende Sequenzabschnitt besitzt in einzelsträngiger Form eine ausgeprägte Neigung zur Ausbildung einer sogenann ten Hairpinstruktur.

Die Primer in Schritt (b) oder die Primermoleküle in Schritt (a) sind einzelsträngi ge Nukleinsäuremoleküle einer Länge von etwa 12 bis etwa 60 Nukleotidbaustei nen und mehr. Es handelt sich um RNA-Moleküle, DNA-Moleküle oder deren Analoga, die zur Hybridisierung mit einer zumindest über einen Teilbereich kom plementären Nukleinsäure bestimmt sind und als Hybrid mit der Nukleinsäure ein Substrat für eine Dopplestrang-spezifische Polymerase darstellen. Bei der Poly merase handelt es sich vorzugsweise um DNA Polymerase I, T7-DNA- Polymerase, das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I, um Polymerasen die bei der PCR Anwendung finden, oder auch um eine Reverse Transkriptase.

Das Primerpaar in Schritt (b) stellt einen Satz von zwei Primern dar, die an Berei che einer Nukleinsäure binden, die die zu amplifizierende Zielsequenz der Nu kleinsäure flankieren. Bei diesen Bereichen handelt es sich bevorzugt um Se quenzabschnitte, die bei den Nukleinsäuremolekülen des Nukleinsäuregemisches identisch sind. Zum Beispiel kann es sich bei dem Nukleinsäuregemisch um eine Plasmid-Bibliothek handeln. Die Primer würden dann bevorzugt in dem Bereich der sogenannten Multiple Cloning Site (MCS) binden, und zwar einmal oberhalb und einmal unterhalb der Klonierungsstelle. Ferner könnten die Primer an die Se quenzabschnitte binden, die den Linkern entsprechen, die, wie oben beschrieben, an Restriktionsfragmente beidseitig ligiert wurden. Das erfindungsgemäße Ver fahren wird bevorzugt mit nur einem Primerpaar durchgeführt etwa wie das in der US-A 5 641 658 beschriebene Verfahren, in dem auch nur ein Primerpaar einge setzt wird. Erfindungsgemäß bevorzugt binden die Primer des Primerpaars oder oder der Primerpaare an Sequenzbereiche, die bei allen oder bei fast allen Nu kleinsäuren des Nukleinsäuregemischs im wesentlichen identisch sind.

Bevorzugt besitzt einer der Primer eines Primerpaars eine Sequenz, die die Aus bildung einer intramolekularen Nukleinsäuredoppelhelix (einer sogenannten Hair pinstruktur) ermöglicht, wobei allerdings ein aus mindestens 13 Nukleotidbau steinen bestehender Bereich des 3'-Terminus ungepaart bleibt.

Bei der Oberfläche in Schritt (b) handelt es sich um die zugängliche Fläche eines Körpers aus Kunststoff, Metall, Glas, Silicium oder ähnlich geeigneten Werkstof fen. Vorzugsweise ist diese flach, insbesondere plan ausgestaltet. Die Oberfläche kann eine quellbare Schicht aufweisen, zum Beispiel aus Polysacchariden, Poly zuckeralkoholen oder quellbaren Silikaten.

Irreversibele Immobilisierung meint das Ausbilden von Wechselwirkungen mit der oben beschriebenen Oberfläche, die bei 95°C und der üblichen Ionenstärke bei den PCR-Amplifikationen des Schritts (e) im Stundenmaßstab stabil sind. Bevor zugterweise handelt es sich dabei um kovalente Bindungen, die auch spaltbar sein können. Bevorzugt werden die Primermoleküle in Schritt (a) über die 5'-Termini irreversibel an der Oberfläche immobilisiert. Alternativ kann eine Immobilisie rung auch über ein oder mehrere Nukleotidbausteine, die zwischen den Termini des betreffenden Primermoleküls liegen, immobilisiert werden, wobei allerdings ein Sequenzabschnitt von mindestens 13 Nukleotidbausteinen gerechnet von dem 3'-Terminus ungebunden bleiben muß. Bevorzugt erfolgt die Immobilisierung durch Ausbildung kovalenter Bindungen.

Aus dem Stand der Technik sind Verfahren bekannt, chemisch geeignet derivati sierte Oligonukleotide an Glasoberflächen zu binden. Besonders geeignet sind hierzu beispielsweise endständige, über einen mehratomigen Spacer an das 5'- Ende des Oligonukleotids gebundene primäre Aminogruppen ("Aminolink"), welche leicht im Zuge der Oligonukleotidsynthese inkorporiert werden können und gut mit Isothiocyanat-modifizierten Oberflächen reagieren können. Bei spielsweise beschreiben Guo et al. (Nucleic Acids Res. 22 (1994), 5456-5465) ein Verfahren, Glasoberflächen mit Aminosilan und Phenylendiisothiocyanat zu akti vieren und anschließend 5'-aminomodifizierte Oligonukleotide hieran zu binden. Besonders bevorzugt ist die Verwendung kommerziell erhältlicher Glasträger, welche einerseits zur Bindung von Aminolink-modifizierten Oligonukleotiden aktiviert sind und andererseits eine strukturierte Oberfläche aufweisen, welche gegenüber einer planen Oberfläche eine größere Bindungskapazität besitzt (Fa. Surmodics, Eden Prairie, Minnesota, USA). Ebenfalls geeignet ist die Carbodii mid-vermittelte Bindung 5'-phosphorylierter Oligonukleotide an aktivierte Po lystyrolträger (Rasmussen et al., Anal. Biochem 198 (1991), 138-142). Ein ande res bekanntes Verfahren nutzt die hohe Affmität von Gold für Thiolgruppen zur Bindung von Thiol-modifizierten Oligonukleotiden an Goldoberflächen aus (Hegner et al. FEBS Lett 336 (1993), 452-456).

Der Begriff sekundäre Nukleinsäure in Schritt (c) bezeichnet diejenigen Nuklein säuremoleküle, die durch komplementäre Verlängerung von Primermolekülen entstehen, wobei die Verlängerung komplementär zu den Nukleinsäuremolekülen des Schritts (b) erfolgt, die mit den Primern hybridisiert wurden.

Nicht durch irreversibele Immobilisierung an die Oberfläche gebundene Nuklein säuremoleküle werden in Schritt (d) im wesentlichen von der Oberfläche entfernt. Hierbei ist es möglich, jedoch nicht bevorzugt, die Entfernung der vorgenannten Nukleinsäuremoleküle erst nach Durchlaufen eines oder mehrerer Amplifikations zyklen des Schritts (e) vorzunehmen.

Der Begriff tertiäre Nukleinsäuren bezeichnet sekundäre Nukleinsäuren sowie diejenigen Nukleinsäuremoleküle, die aus den sekundären Nukleinsäuren nach derri Verfahren der Polymerasekettenreaktion im Schritt (e) gebildet werden. Hierbei ist es wichtig, daß die in Schritt (d) von der Oberfläche entfernten Nu kleinsäuren auch aus dem die Oberfläche umgebenden flüssigen Reaktionsraum entfernt werden. Hierbei entstehen in der Regel regelrechte Inseln, das heißt dis krete Bereiche auf der Oberfläche, die tertiäre Nukleinsäuren der gleichen Sorte, das heißt identische oder komplementäre Nukleinsäuremoleküle, tragen.

In Schritt (f) werden Gegenstränge der tertiären Nukleinsäuren (GTN') bereitge stellt. Dies kann zum Beispiel durch eine von vier Maßnahmen geschehen, die im folgenden aufgeführt werden:

Zum einen können in Schritt (a) Primermoleküle oder gegebenenfalls in Schritt (b) Nukleinsäuremoleküle mit flankierenden Sequenzabschnitten verwendet werden, die selbstkomplementäre Bereiche aufweisen und so mit zur intramolekularen Basenparung in der Lage sind, was sich in der sogenannten Hairpinstruktur äußert (siehe oben). Hierbei ist bevorzugt nur ein Primer eines Primerpaars oder nur ein flankierender Sequenzabschnitt von zweien zur Ausbildung einer Hairpinstruktur in der Lage, um sicher zustellen, das der in den Schritten (g) bis (j) beschriebene Einbau von Nu kleotiden nur an einem von zwei komplementären Nukleinsäuremolekülen erfolgt, so daß eine Interferenz der Sequenzsignale beider Nukleinsäure moleküle ausgeschlossen ist. Die in Schritt (e) gebildeten tertiären Nu kleinsäuren weisen im einzelsträngigen Zustand, der durch Schmelzen der Doppelstränge, also durch Denaturierung, erreicht wurde, in Nähe ihres 3'- Terminus' eine Hairpinstruktur auf und in der Regel einen Sequenzbereich ungepaarter Basen unmittelbar am 3'-Teminus. Dieser ungepaarte Se quenzabschnitt muß entfernt werden, bevor mit der Sequenzanalyse in Schritt (g) begonnen werden kann. Dies kann enzymatisch, zum Beispiel durch DNA-Polymerase I geschehen. Aufgrund ihrer einfachen Durch führbarkeit ist diese Alternative bevorzugt.

Zweitens kann ein am 5'-Terminus phosphoryiertes Oligonukleotid mit den denaturierten, das heißt einzelsträngigen, tertiären Nukleinsäuren hy bridisiert werden, welches zur Ausbildung einer Hairpinstruktur in der La ge ist. Hierbei ist zu beachten, daß das Oligonukleotid nur an eines von zwei komplementären Nukleinsäuremolekülen hybridisiert und ligiert wird, was durch entsprechende Wahl der Sequenz aber mühelos zu ge währleisten ist. Anschließend erfolgt Ligation des Oligonukleotids an die betreffende tertiäre Nukleinsäure. Ein ähnliches Verfahren zur Anheftung einer Hairpinstruktur an eine einzelsträngige Nukleinsäure ist in der US-A 5 798 210 beschrieben, die ein Sequenzierverfahren betrifft und auf die vollinhaltlich Bezug genommen wird (insbesondere auf Spalte 4, Zeile 54 ff. und Fig. 7).

Drittens kann eine Hairpinstruktur auch durch Restriktion der nicht dena turierten, das heißt doppelsträngigen, tertiären Nukleinsäuren inmitten ei nes Sequenzabschnitts, der der Sequenz eines Primers aus Schritt (a) oder (b) entspricht, und anschließender Ligation von zur Restriktionsschnitt stelle kompatiblen, zur Ausbildung einer Hairpinstruktur fähigen, einzel strängigen Oligonukleotiden an die freistehenden Enden der doppelsträn gigen tertiären Nukleinsäuren in die tertiären Nukleinsäuren eingebracht werden. Aufgrund ihrer Zuverlässigkeit ist diese Alternative ebenfalls be vorzugt.

Denkbar wäre im übrigen auch der Ersatz der Restriktionsspaltung durch eine bekannte chemische Spaltmethode.

Viertens führt auch die Hybridisierung von Oligonukleotiden, die nicht zur Ausbildung einer Hairpinstruktur in der Lage sind, mit den tertiären Nu kleinsäuren zu Ausbildung von GTN (vgl. US-A 5 798 210, Fig. 8). Diese Alternative kommt allerdings nur dann in Frage, wenn in Schritt (i) Bedin gungen, gewählt werden, die nicht zur Denaturierung, das heißt nicht zur Aufschmelzung der Doppelstränge, bestehend aus ggf. verlängerten Oli gonukleotiden und tertiären Nukleinsäuren, führen. Wird in Schritt (i) unter denaturierenden Bedingungen gearbeitet (z. B. durch Einsatz starker Ba sen), dann können nur die ersten drei Alternativen gewählt werden.

Alle vier Maßnahmen haben zur Folge, daß die tertiären Nukleinsäuren einen doppelsträngigen Teilbereich aufweisen, der eine Strangverlängerung an den Ge gensträngen der tertiären Nukleinsäuren (GTN) durch eine DNA-Polymerase oder Reverse Transkriptase ermöglicht.

Bei dem Nukleotid, das in Schritt (g) komplementär zum Gegenstrang eingebaut wird, handelt es sich um ein entschützbares Abbruchnukleotid. Geeignete Ab bruchnukleotide sind zum Beispiel aus US-A 5 798 210 bekannt. Canard und Sar fati (Gene 148 (1994) 1-6) beschreiben 3'-veresterte Nukleotide, welche ein zu sammen mit der Schutzgruppe abspaltbares Fluorophor enthalten. Diese Nukleo tidbausteine können mit allerdings niedriger Effizienz von verschiedenen Polyme rasen in einen wachsenden Strang inkorporiert werden und wirken dann als Ab bruchnukleotide, lassen also keine weitere Strangverlängerung zu. Die beschrie benen Ester lassen sich alkalisch oder enzymatisch abspalten, so daß freie, weitere Nukleotidinkorporation erlaubende 3'-OH-Gruppen entstehen. Die Esterspaltung erfolgt allerdings sehr langsam (innerhalb von 2 Stunden), so daß die beschriebe nen Verbindungen für eine Sequenzierung längerer DNA-Abschnitte (z. B. mehr als 20 Basen) ungeeignet sind. Solange die Schutzgruppe in 3'-OH oder gegebe nenfalls 2'-OH-Position gebunden ist, stellt die um dieses Nukleotid verlängerte quartäre Nukleinsäure kein Substrat mehr für eine Nukleinsäurepolymerase dar. Erst die Entfernung der Schutzgruppe in Schritt (i) macht eine weitere Verlänge rung der quartären Nukleinsäure möglich. Die Schutzgruppe trägt außerdem in der Regel eine Molekülgruppe, die die Identifikation des eingebauten Nukleotids und so die Sequenzierung des wachsenden Nukleinsäurestranges ermöglicht und das Nukleotid mit der Abspaltung der Schutzgruppe verläßt. Allerdings kann die identifizierende Molekülgruppe auch an einer anderen Stelle des Nukleotids, zum Beipiel an der Base, gebunden sein. In diesem Fall ist es notwendig, zwischen Schritt (h) und (j) das Signal der identifizierenden Molekülgruppe zu löschen. Dies kann in der Regel auf zwei Arten erfolgen. Zum Beispiel im Falle eines Flu orophors kann die Molekülgruppe durch Ausbleichen verändern werden. Daneben kann die identifizierende Molekülgruppe auch entfernt werden, zum Beispiel durch photochemische Spaltung einer photolabilen Bindung. Bevorzugt trägt je der, der für den Einbau in Frage kommenden vier Nukleotidbausteine (G, A, T, C) eine andere identifizierende Molekülgruppe. In diesem Fall können die vier Sorten Nukleotide in Schritt (g) gleichzeitig angeboten werden. Tragen verschiedene oder sogar alle Nukleotide dieselbe identifizierende Gruppe, so ist Schritt (g) in in der Regel vier Teilschritte zu zerlegen, in welchen die Nukleotide einer Sorte (G, A, T, C) getrennt angeboten werden.

Bei der Molekülgruppe handelt es sich zum Beispiel um einen Fluorophor oder um einen Chromophor. Letzterer könnte sein Absorptionsmaximum im sichtbaren oder im Infraroten Frequenzbereich haben. Die in Schritt (h) erfolgende Detektion erfolgt sowohl orts- als auch zeitaufgelöst, so daß die auf der Oberfläche befindli chen Inseln quartärer Nukleinsären parallel sequenziert werden können.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wer den in Schritt (a) die Primermoleküle durch Ausbildung einer kovalenten Bindung an eine Oberfläche irreversibel immobilisiert.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ein Primer von beiden Primern desselben Primerpaars in der Lage, eine Hairpin struktur auszubilden.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in Schritt (f) die tertiären Nukleinsäuren durch eine Restriktionsendonuklase restrin giert werden bevor an die auf diese Weise generierten Enden Nukleinsäuremole küle, die zur Ausbildung einer Hairpinstruktur fähig sind, ligiert werden.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in Schritt (t) an tertiäre Nukleinsäuren einzelsträngige Nukleinsäuremoleküle hybri disiert, die zur Ausbildung einer Hairpinstruktur fähig sind, bevor teriäre Nuklein säuren und vorgenannte einzelstängige Nukleinsäuremoleküle ligiert werden.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens trägt in Schritt (g) die Base die Molekülgruppe, die die Identifikation des Nukleotids er möglicht.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens trägt in Schritt (g) das Nukleotid an der 3'-OH-Position die Schutzgruppe.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens weist in Schritt (g) die Schutzgruppe eine spaltbare Ester-, Ether-, Anhydrid- oder Pero xid-Gruppe auf.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist in Schritt (g) die Schutzgruppe über eine Sauerstoff-Metall-Bindung mit dem Nu kleotid verbunden.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt in Schritt (i) die Entfernung der Schutzgruppe durch ein komplexbildendes Ion, vor zugsweise durch Cyanid, Thiocyant oder Fluorid oder Ethylendiamintetraacetat.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens weist in Schritt (g) die Schutzgruppe einen Fluorophor auf. Das Nukleotid wird in Schritt (h) dann fluorometrisch identifiziert.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in Schritt (i) die Schutzgruppe photochemisch abgespalten. Die Schutzgruppe ist also mit dem Nukleotid über eine photolabile Bindung verbunden, die photoche misch gespalten werden kann.

Die Erfindung wird durch die Zeichnung näher beschrieben.

Es zeigt

Fig. 1 die Amplifikation einzelner Nukleinsäuremoleküle mittels Oberflächen gebundener Primer zu Inseln aus jeweils identischen amplifizierten Nu kleinsäuremolekülen;

Fig. 2 die Sequenzierung Oberflächen-gebundener Amplifikationsprodukte;

Fig. 3 die Bereitstellung eines GTN durch Ausbildung einer Hairpinstruktur in Sequenzabschnitten, die Linker entstammen;

Fig. 4 die Parallele Sequenzierung an einer Oberfläche;

Fig. 5 die Assemblierung der Detektions- und Identifikationsergebnisse zu zu sammenhängenden Sequenzen;

Fig. 6 die Bereitstellung primärer Nukleinsäuren zur Anwendung in der Expres sionsanalyse;

Fig. 7 die Bereitstellung primärer Nukleinsäuren zur Sequenzierung genomi scher Klone,

Fig. 8 das Ergebnis der Amplikation einzelner Nukleinsäuremoleküle gemäß Fig. 1

Fig. 1 zeigt die Amplifikation einzelner Nukleinsäuremoleküle mittels Oberflä chengebundener Primer zu Inseln aus jeweils identischen amplifizierten Nuklein säuremolekülen, wobei im einzelnen

1. 1 die irreversible Immobilisierung von ein Primerpaar bildenden Oli gonukleotiden,
2. 2 die Hybridisierung der primären Nukleinsäuren mit den Oberflächen gebundenen Primern,
3. 3 die Bildung sekundärer Nukleinsäuren durch Strangverlängerung der Primer,
4. 4 die Entfernung der nicht irreversibel gebundenen primären Nuklein säuremoleküle und Amplifikation der sekundären Nukleinsäuren,
5. 5 Inseln mit jeweils identischen tertiäreren Nukleinsäuremoleküle be zeichnet.

Fig. 2 veranschaulicht die Sequenzierung Oberflächen-gebundener Amplifika tionsprodukte, wobei

1. 1 das Lösen der Amplifikationsprodukte durch Restriktionsdau der Amplifikationsprodukte (Unterstrichen: die Erkennungsstelle für die Restriktionsendonuklease SphI);
2. 2 die Dephosphorylierung;
3. 3 die Ligation eines Hairpin-Oligonukleotids (fett)
4. 4 die Entfernung des nicht irreversibel immobilisierten Nukleinsäure strangs;
5. 5 den Einbau und Identifikation eines ersten geschützten Nukleotids;
6. 6 die Entfernung von Schutzgruppe und Markierungsgruppe unter Wiederherstellung einer freien 3'-OH-Gruppe;
7. 7 den Einbau und Identifikation eines zweiten geschützten Nukleotids;
8. 8 die Wiederholung der Schritte 5 und 6 zeigt.

Fig. 3 zeigt die Bereitstellung eines GTN durch Ausbildung einer Hairpinstruktur in Sequenzabschnitten die Linker entstammen. Die zu sequenzierende Nuklein säure (Restriktionsfragment mit zwei unterschiedlichen Enden, eines hiervon durch die Restriktionsendonuklease NlaIII erzeugt) ist grau hinterlegt. CATG, durch Restriktionsendonuklease NlaIII generierter Überhang; GCATGC, Erken nungsstelle für Restriktionsendonuklease SphI (enthält die Erkennungsstelle für NlaIII, CATG); NNNNNNNNNN und MMMMMMMMMM, "inverted repeats" (zueinander komplementäre Sequenzen, die intramolekulare Rückfaltung eines Einzelstrangs erlauben); XXXXX und YYYYY, Spacerregion zur Oberfläche. Im einzelnen beschreibt

1. 1 die Ligation eines Linkers mit "inverted repeat" und SphI- Schnittstelle an zu sequenzierendes Fragment;
2. 2 die Denaturierung und Hybridisierung mit an einer Oberfläche im mobilisiertem Primer;
3. 3 die Amplifikation mit zwei an Oberfläche immobilisierten Primern (Gegenprimer nicht gezeigt);
4. 4 das "halbseitige Lösen" der Amplifikationsprodukte von der Oberflä che durch Restriktionsendonuklease SphI (Pfeile);
5. 5 die Denaturierung und Entfernung des nicht an der Oberfläche im mobilisierten Strangs;
6. 6 die Renaturierung unter Ausbildung eines Hairpins, Beginn der Se quenzierung durch Inkorporation entschützbarer Abbruchnukleotide.

Fig. 4 beschreibt die parallele Sequenzierung an einer Oberfläche. "Inseln" iden tischer Nukleinsäuremoleküle sind in dieser Figur vereinfacht durch einen einzi gen Strang symbolisiert. Im einzelnen zeigt

1. 1 die Befestigung eines Sequenzierprimers, Einbau des ersten Ab bruchnukleotids und parallele Detektion und Identifikation des je weils ersten Nukleotidbausteins,
2. 2 die Entfernung von Schutzgruppe und Markierungsgruppe des ersten Nukleotids, Einbau des zweiten Abbruchnukleotids und parallele Detektion und Identifikation des jeweils zweiten Nukleotidbausteins;
3. 3 das Detektions- und Identiflkationsergebnis der ersten Base;
4. 4 das Detektions- und Identifikationsergebnis der zweiten Base.

Fig. 5 beschreibt die Assemblierung der Detektions- und Identifikationsergebnis se zu zusammenhängenden Sequenzen, wobei

1. 1 die Detektions- und Identifikationsergebnis der ersten Base,
2. 2 die Detektions- und Identifikationsergebnis der zweiten Base,
3. 3 die Detektions- und Identifikationsergebnis der n-ted Base,
4. 4 die assemblierten Sequenzen der Nukleinsäuremoleküle in einzelnen Inseln bezeichnet.

Fig. 6 zeigt die Bereitstellung primärer Nukleinsäuren zur Anwendung in der Expressionsanalyse, wobei im einzelnen

1. 1 die cDNA-Synthese mit biotinyliertem Primer, Bindung der doppel strängigen cDNA an Streptavidin-beschichtete Oberfläche;
2. 2 den Restriktionsschnitt mit dem ersten Enzym (RE1), Fortwaschen der freigesetzten Fragmente, und den zweiter Restriktionsschnitt mit dem zweiten Enzym (RE2);
3. 3 die Ligation zweier verschiedener Linker;
4. 4 mRNA;
5. 5 doppelsträngige an Festphase immobilisierte cDNA;
6. 6 ein cDNA-Fragment, das von zwei verschiedenen "überhängenden" Enden flankiert wird,
7. 7 ein von zwei verschiedenen Linkem (L1, L2) flankiertes cDNA- Fragment zeigt.

Fig. 7 zeigt die Bereitstellung primärer Nukleinsäuren zur Sequenzierung genomischer Klone, wobei im einzelnen

1. 1 einen Restriktionsschnitt eines genomischen Klons parallel mit je weils zwei verschiedenen Restriktionsendonukleasen (RE1-4), Liga tion verschiedener Linker (L1-4);
2. 2 einen genomischen Klon;
3. 3 zwei überlappende Sätze mit Linkern ligierter Fragmente bezeichnet.

Symmetrisch von identischen Linkern flankierte Fragmente (durchgestrichen) lassen sich nicht sequenzieren.

Fig. 8 zeigt das Ergebnis der Amplifikation einzelner Nukleinsäuremoleküle mit tels Oberflächen-gebundener Primer zu Inseln aus jeweils identischen amplifi zierten Nukleinsäuremolekülen, visualisiert durch Anfärbung mit SYBR Green I.

Die Erfindung wird im folgenden durch die Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1 Vorbereitung von Nukleinsäuremolekülen

4 µg Gesamt-RNA aus Rattenleber wurde mit Ethanol gefällt und in 15,5 µl Was ser gelöst. Es wurden 0,5 µl 10 µM cDNA-Primer CP28 V (5'- ACCTACGTGCAGATTTTTTTTTTTTTTTTTTV-3') hinzugegeben, 5 Minuten bei 65°C denaturiert und auf Eis gestellt. Die Mischung wurde mit 3 µl 100 mM Dithiothreitol (Life Technologies GmbH, Karlsruhe), 6 µl 5× Superscript-Puffer (Life Technologies GmbH, Karlsruhe), 1,5 µl 10 mM dNTPs, 0,6 µl RNase Inhi bitor (40 U/µl; Roche Molecular Biochemicals) und 1 µl Superscript II (200 U/µl, Life Technologies) versetzt und zur cDNA-Erststrangsynthese 1 Stunde bei 42°C inkubiert. Zur Zweitstrangsynthese wurden 48 µl Zweitstrang-Puffer (vgl. Ausu bel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1999), John Wiley & Sons), 3,6 µl 10 mM dNTPs, 148,8 µl H₂O, 1,2 µl RNaseH (1,5 U/µ1, Promega) und 6 µl DNA Polymerase I (New England Biolabs GmbH Schwalbach, 10 U/µl) hinzuge fügt und die Reaktionen 2 Stunden bei 22°C inkubiert. Es wurde mit 100 µl Phe nol, dann mit 100 µl Chloroform extrahiert und mit 0,1 Vol. Natriumacetat pH 5,2 und 2,5 Vol. Ethanol gefällt. Nach Zentrifugation für 20 Minuten bei 15.000 g und Waschen mit 70% Ethanol wurde das Pellet in einem Restriktionsansatz aus 15 µl 10× Universal buffer, 1 µl MboI und 84 µl H₂O gelöst und die Reaktion 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Es wurde mit Phenol, dann mit Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Das Pellet wurde in einem Ligationsansatz aus 0,6 µl 10× Ligationspuffer (Roche Molecular Biochemicals), 1 µl 10 mM ATP (Roche Mo lecular Biochemicals), 1 µl Linker ML2025 (hergestellt durch Hybridisierung von Oligonukleotiden ML20 (5'-TCACATGCTAAGTCTCGCGA-3') und LM25 (5'- GATCTCGCGAGACTTAGCATGTGAC-3'), ARK), 6,9 µl H₂O und 0,5 µl T4 DNA Ligase (Roche Molecular Biochemicals) gelöst und die Ligation über Nacht bei 16°C durchgeführt. Die Ligationsreaktion wurde mit Wasser auf 50 µl aufge füllt, mit Phenol, dann mit Chloroform extrahiert und nach Zugabe von 1 µl Gly cogen (20 mg/ml, Roche Molecular Biochemicals) mit 50 µl 28% Polyethylengly col 8000 (Promega)/10 mM MgCl₂ gefällt. Das Pellet wurde mit 70% Ethanol gewaschen und in 100 µl Wasser aufgenommen.

Beispiel 2 Beschichtung mit Oligonukleotiden

Lyophilisierte, an ihrem 5'-Ende Aminolink-Gruppen tragende Oligonukleotide Amino-M13rev (5'-Amino-CAGGAAACAGCGATGAC-3') und Amino-T7 (5'- Amino-TAATACGACTCACTATAGG-3') (ARK Scientific GmbH, Darmstadt) wurden zu einer Endkonzentration von 1 mM in 100 mM Natriumcarbonatpuffer pH 9 aufgenommen. Mikroskopie-Objektträger aus Glas ("Slides"; neoLab Migge Laborbedarf-Vertriebs GmbH, Heidelberg) wurden 1 Stunde in Chromschwefel säure gereinigt und danach 4x mit destilliertem Wasser gewaschen. Nach Luft trocknung wurden die Slides 5 Minuten in einer 1%igen Lösung von 3- Aminopropyltrimethoxysilan ("Fluka": Sigma Aldrich Chemie GmbH, Seelze) in 95% Aceton/5% Wasser behandelt. Danach wurde zehnmal für je 5 Minuten in Aceton gewaschen und 1 Stunde auf 110°C erhitzt. Dann wurden die Slides für 2 Stunden in 0,2% 1,4-Phenylendiisothiocyanat ("Fluka": Sigma Aldrich Chemie GmbH, Seelze) in einer Lösung aus 10% Pyridin in trockenem Dimethylformamid (Merck KGaA, Darmstadt) eingelegt. Nach S Waschschritten in Methanol und 3 Waschschritten in Aceton wurden die Slides luftgetrocknet und direkt zur Be schichtung weiterverarbeitet. Selbstklebende "Frame Seal"-Rähmchen für 65µl- Reaktionskammern (MJ Research Inc., Watertown, Minnesota, USA) wurden aufgebracht, 65 µl Oligonukleotid-Lösung wurden in die so gebildeten Reaktions kammern pipettiert, und die Kammern wurden durch Aufkleben eines Polyester- Deckblatts (MJ Research Inc.) unter Ausschluß von Luftblasen versiegelt. Die genaue Position der Reaktionskammer wurde mit einem wasserfesten Filzschrei ber auf der Unterseite der Slides gekennzeichnet. Die Bindung der Oligonukleoti de via Aminolink an die Oberfläche der aktivierten Slides fand über 4 Stunden bei 37°C statt. Anschließend wurden die Kleberahmen entfernt und die Slides mit deionisiertem Wasser abgespült. Um verbliebene reaktive Gruppen zu inaktivie ren, wurden die Slides für 15 Minuten in auf 50°C temperierter Blockierungslö sung (50 mM Ethanolamin ("Fluka": Sigma Aldrich Chemie GmbH, Seelze), 0,1 M Tris pH 9 ("Fluka": Sigma Aldrich Chemie GmbH, Seelze), 0,1% SDS ("Flu ka": Sigma Aldrich Chemie GmbH, Seelze) behandelt. Zur Entfernung nicht kovalent gebundener Oligonukleotide wurden die Slides 5 Minuten in 800 ml 0,1× SSC/0,1% SDS (vgl. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1999), John Wiley & Sons) gekocht. Die Slides wurden mit deionisiertem Was ser gewaschen und luftgetrocknet.

Beispiel 3 Beschichtung mit Oligonukleotiden

Lyophilisierte, an ihrem 5'-Ende Aminolink-Gruppen tragende Oligonukleotide Amino-M13rev (5'-Amino-CAGGAAACAGCGATGAC-3') und Amino-T7 (5'- Amino-TAATACGACTCACTATAGG-3') (ARK Scientific GmbH, Darmstadt) wurden zu einer Endkonzentration von 100 pmol/µl in deionisiertem Wasser auf genommen. Je 1,4 µl dieser Primerlösungen wurden mit 32,2 µl Wasser und 35 µl 2× Bindepuffer (300 mM Natriumphosphat pH 8,5) vermischt. Selbstklebende "Frame Seal"-Rähmchen für 65 µl-Reaktionskammern (MJ Research Inc., Water town, Minnesota, USA) wurden auf "3D-Link activated slides" (zur Bindung Amino-modifizierter Nukleinsäuren aktivierte Objektträger aus Glas; (Surmodics, Eden, Prairie, Minnesota, USA) aufgebracht. 65 µl Oligonukleotid-Lösung wur den in die so gebildeten Reaktionskammern pipettiert, und die Kammern wurden durch Aufideben eines Polyester-Deckblatts (MJ Research Inc., Watertown, Min nesota, USA) unter Ausschluß von Luftblasen versiegelt. Die genaue Position der Reaktionskammer wurde mit einem wasserfesten Filzschreiber auf der Unterseite der Slides gekennzeichnet. Die Bindung der Oligonukleotide via Aminolink an die Oberfläche der aktivierten Slides fand über Nacht bei Raumtemperatur statt. Anschließend wurden die Kleberahmen entfernt und die Slides mit deionisiertem Wasser abgespült. Um verbliebene reaktive Gruppen zu inaktivieren, wurden die Slides für 15 Minuten in auf 50°C temperierter Blockierungslösung (50 mM Et hanolamin ("Fluka": Sigma Aldrich Chemie GmbH, Seelze), 0,1 M Tris pH 9 ("Fluka": Sigma Aldrich Chemie GmbH, Seelze), 0,1% SDS ("Fluka": Sigma Aldrich Chemie GmbH, Seelze) behandelt. Zur Entfernung nicht kovalent gebun dener Oligonukleotide wurden die Slides 5 Minuten in 800 ml 0,1× SSC/0,1% SDS (vg1. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1999), John Wiley & Sons) gekocht. Die Slides wurden mit deionisiertem Wasser gewaschen und luftgetrocknet.

Beispiel 4

Plasmide pRNODCAB (enthält Basen 982 bis 1491 des Transkripts von Omithin decarboxylase aus Ratte, AC-Nummer J04791, kloniert in Vektor pCR II (Invitro gen BV, Groningen, Niederlande) und pRNHPRT (enthält Basen 238 bis 720 des Transkripts Hypoxanthinphosphoribosyltransferase aus Ratte, AC-Nummer M63983, kloniert in Vektor pCR II (Invitrogen)) wurden linearisiert, indem je 1 µg Plasmid in einem Volumen von 20 µl 1× Restriktionspuffer H ("Roche Mole cular Biochemicals": Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) mit je 5 U der Re striktionsenzyme BglII und ScaI (Roche Molecular Biochemicals) für 1,5 Stunden bei 37°C inkubiert wurde. Anschließend wurde eine Amplifikation der Vektor- Inserts vorgenommen, indem je 1 µl der Restriktionsansätze in einem Volumen von 100 µl PCR-Puffer II (Perkin-Elmer, Foster City, California, USA) mit 4 µl 10 mM Primer T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGG-3'), 4 µl 10 mM Primer M13 (5'-CAGGAAACAGCGATGAC-3') (ARK), 4 µl 50 mM MgCl₂ ("Fluka": Sigma Aldrich Chemie GmbH, Seelze), 5 µl Dimethylsulfoxid ("Fluka": Sigma Aldrich Chemie GmbH, Seelze), 1 µl 10 mM dNTPs (Roche Molecular Biochemicals), und 1 µl AmpliTaq DNA Polymerase (5u/µl; Perkin-Elmer) versetzt wurde. An schließend wurden die Reaktionen in einem Gene Amp 9700 Thermocycler (Per kin-Elmer) einem Temperaturprogramm bestehend aus 20 Zyklen Denaturierung für 20 Sekunden bei 95°C, Primerannealing für 20 Sekunden bei 55°C und Pri merextension für 2 Minuten bei 72°C unterworfen. Die Amplifikationsprodukte wurden elektrophoretisch auf einem 1,5% Agarosegel auf ihre richtige Größe hin untersucht. Zur Entfernung uninkorporierter Primer wurden die Reaktionen mit tels QiaQuick-Säulen (Qiagen AG, Hilden) gemäß den Angaben des Herstellers gereinigt und in 50 µl deionisierten Wassers eluiert.

Beispiel 5 Amplifikation

Zur Befestigung von in Beispiel 2 vorbereiteten Nukleinsäuren an Glasträgern wurden Annealing-Mischungen aus je 1 µl unverdünnter oder in parallelen Ansät zen 1 : 10, 1 : 100 bzw. 1 : 1000 mit Wasser verdünnter Amplifikationsprodukt- Lösungen, je 4 µl 50 mM MgCl₂-Lösung, je 1 µl Rinderserumalbumin (20 mg/ml; Roche Molecular Biochemicals), je 5 µl Dimethylsulfoxid, je 1 µl 10 mM dNTPs und je 1 µl AmpliTaq in einem Gesamtvolumen von je 100 µl 1× PCR-Puffer II hergestellt. Unter Beachtung der Filzschreiber-Markierungen auf der Slide- Unterseite wurden Frame-Seal-Kammern in den zur Oligonukleotid-Beschichtung verwendeten Positionen auf die in Beispiel 1 vorbereiteten Slides aufgebracht. Dann wurden je 65 µl der Annealing-Mischungen in die Reaktionskammern pi pettiert und die Kammern wie oben versiegelt. Die Slides wurden auf den Heiz block eines UNO II-in situ-Thermocyclers (Biometra biomedizinische Analytik GmbH, Göttingen) gelegt, mit einem Polster aus Papiertüchern abgedeckt und mittels des höhenverstellbaren Heizdeckels an den Heizblock gepreßt. Zum An nealing und der nachfolgenden Primerextension kam folgendes Temperaturpro gramm zur Anwendung: Denaturierung 30 Sekunden bei 94°C, Annealing 10 Mi nuten bei 55°C, Primerextension 1 Minute bei 72°C. Nach erfolgter Reaktion wurden die Reaktionskammern entfernt und die Slides wurden mit deionisiertem Wasser abgespült. Zur Entfernung der nicht ovalent gebundenen Stränge wurde 1 Minute in 800 ml 0,1 × SSC/0,1% SDS gekocht, die Slides mit Wasser abgespült und luftgetrocknet. Um eine kompartimentierte Amplifikation der an den Träger gebundenen Nukleinsäuremoleküle vorzunehmen, wurden erneut an den zuvor gewählten Positionen Reaktionskammern aufgebracht und 65 µl einer Amplifika tionsmischung aufgetragen, zusammengesetzt wie folgt: 4 µl 50 mM MgCl₂, 1 µl Rinderserumalbumin (20 mg/ml), 5 µl Dimethylsulfoxid, 1 µl AmpliTaq (5 U/µl), 1 µl 10 mM dNTPs, in 100 µl 1× PCR-Puffer II. Nach Versiegelung der Kam mern wurde auf dem in situ-Thermocycler folgendes Temperaturprogramm ange wendet: Denaturierung 20 Sekunden bei 93°C, Primerannealing 20 Sekunden bei 55°C, Extension 1 Minute bei 72°C, für 50 Zyklen. Nach beendeter Amplifikation wurden die Kammern entfernt und die Slides mit Wasser abgespült und luftge trocknet. Zur Detektion der durch kompartimentierte Amplifikation entstandenen klonalen Inseln wurden 40 µl SYBR Green I-Lösung (Molecular Probes; Lösung 1 : 10.000 in Wasser) auf die Slides pipettiert und mit Deckgläsern #2 (MJ) abge deckt. Die Detektion erfolgte auf einem konfokalen Mikroskop DMRBE (Leica Microsystems Heidelberg GmbH, Heidelberg) bei einer Anregungswellenlänge von 488 nm und einer Detektionswellenlänge von 530 nm. Es konnten klonale Inseln kompartimentiert amplifizierter Nukleinsäuremoleküle detektiert werden, die sich in einer Zufallsanordnung über die Slideoberfläche im Bereich der Reak tionskammern verteilten (vergl. Abb. 8). Im Bereich von Reaktionskammern, in denen als Negativkontrolle entweder keine Oligonukleotide an den Träger gebun den worden waren oder in denen die Amplifikationsreaktion ohne vorherige Hy bridisierung von Template-Molekülen vorgenommen worden war, wurden hinge gen keine von klonalen Inseln stammende Signale detektiert. Weiterhin zeigte der Vergleich der Slide-Oberflächen im Bereich von Reaktionskammern, in denen unterschiedliche Konzentrationen von Template eingesetzt worden war, eine nä herungsweise lineare Abhängigkeit der Anzahl gebildeter klonaler Inseln von der Menge an eingesetzten Molekülen.

Beispiel 6

Zur Identifikation der Nukleinsäuremoleküle in den detektierten klonalen Inseln wurden die Slides nach der Detektion der mittels SYBR Green angefärbten dop pelsträngigen DNA 10 Minuten in Wasser entfärbt. Dann wurden erneut Reakti onskammern an den gleichen Positionen wie zuvor aufgeklebt und eine Restrikti onsmischung, bestehend aus 12 µl 10× Universal buffer (Stratagene GmbH, Hei delberg), 1 µl Rinderserumalbumin, 3 µl Restriktionsendonuklease MboI (1 U/µl; Stratagene) und 64 µl Wasser, hinzupipettiert. Zur Restriktion der Nukleinsäure moleküle mittels der internen MboI-Schnittstelle wurde 1,5 h bei 37°C inkubiert, dann wurden die Reaktionskammern entfernt und die Slides mit Wasser gewa schen. Die nicht kovalent an den Glasträger gebundenen Strangfragmente wurden duch Denaturierung für 2 Minuten in 800 ml kochendem 0,1× SSC/0,1% SDS entfernt. Nach erneutem Waschen in Wasser und Lufttrocknung wurden neue Re aktionskammern aufgebracht. Pro Hybridisierungsexperiment wurde eine Hybri disierungslösung aus 8 µl 10× PCR-Puffer II, 3,2 µl 50 mM MgCl₂, 2 µl 100 pmol/µl Oligonukleotidsonde Cy5-HPRT (5'-Cy5- TCTACAGTCATAGGAATGGACCTATCACTA-3'; ARK), 2 µl 100 pmol/µl Oligonukleotidsonde Cy3-ODC (5'-Cy3-ACATGTTGGTCCCCAGATGCTGG ATGAGTA-3') und 65 µl Wasser hergestellt. Für jedes Hybridisierungs experiment wurden 65 µl hiervon in die jeweilige Reaktionskammer gegeben und 3 Stunden bei 50°C hybridisiert. Nach Beendigung der Hybridisierung wurden die Reaktionskammern entfernt und die Slides 5 Minuten bei Raumtemperatur in 30 ml 0,1× SSC/0,1% SDS gewaschen. Die Slides wurden kurz mit destilliertem Wasser abgespült, luftgetrocknet und zur Detektion eingesetzt. Die Detektion er folgte wie oben mit Hilfe eines konfokalen Lasermikroskops. Als Anregungswel lenlängen wurden 568 nm und 647 nm verwendet, nachgewiesen wurden Signale bei 600 nm und bei 665 nm. Es konnte gezeigt werden, daß die zuvor mit SYBR Green detektierten klonalen Inseln zum Teil durch die Sonde Cy3-ODC und zum Teil durch die Sonde Cy5-HPRT detektiert wurden.

Beispiel 7 Expressionsanalyse durch hochparallele Sequenzierung von Nukleinsäuremole külen

Die in Beispiel 1 erhaltenen Ligationsprodukte wurden 1 : 1000 mit Wasser ver dünnt und 1 µl dieser Verdünnung wie in Beispiel 5 beschrieben für 50 Zyklen kompartimentiert amplifiziert. Hierfür wurden wie beschrieben mit den Amplifi kationsprimern Amino-CP28 V (5'-Amino-ACCTACGTGCAGATTTTTTT TTTTTTTTV-3') und Amino-ML20 (5'-Amino-TCACATGCTAAGTCTCG CGA-3') beschichtete Glasslides verwendet. Zur einseitigen Ablösung der Ampli fikationsprodukte vom Träger wurde die Amplifikationsmischung durch eine Re striktionsmischung ersetzt, bestehend aus 12 µl 10× Universal buffer (Stratagene), 1 µl Rinderserumalbumin, 4 µl Restriktionsendonuklease MboI, in einem Endvo lumen von 65 µl. Nach Inkubation bei 37°C für 2 h wurde die Restriktionsmi schung ersetzt durch eine Dephosphorylierungsmischung aus 1 U alkalischer Phosphatase aus arktischen Krabben (Amersham) in 65 µl des mitgelieferten Re aktionspuffers. Nach Inkubation für 1 Stunde bei 37°C und Inaktivierung für 15 Minuten bei 65°C wurden Reaktionskammern und die Dephosphorylierungsmi schung entfernt, die Slides gründlich mit destilliertem Wasser gewaschen, erneut Reaktionskammern aufgebracht und mit 65 µl einer Ligationsmischung gefüllt, bestehend aus 3 U T4 DNA-Ligase (Roche Diagnostics) und 500 ng am 5'-Ende phosphoryliertem Hairpin-Sequenzierprimer SLP33 (5'-TCTTCGAATGCACTG AGCGCATTCGAAGAGATC-3') in 65 µl des mitgelieferten Ligationspuffers. Es wurde 14 Stunden bei 16°C ligiert, dann wurden Ligationsmischung und Re aktionskammern entfernt. Zur Entfernung der nicht kovalent an den Glasträger gebundenen Strangfragmente wurde für 2 Minuten in 800 ml kochendem 0,1× SSC/0,1% SDS behandelt und mit destilliertem Wasser nachgewaschen. Zur Her stellung geeigneter entschützbarer Abbruchnukleotide wurden dATP, dCTP, dGTP und dTTP (Roche Molecular Biochemicals) an ihrer 3'-OH-Gruppe mit 4- Aminobuttersäure verestert. Diese Derivate wurden mit den Fluoreszenzgruppen FAM (dATP, dCTP) und ROX (dGTP, dTTP) markiert (Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, USA). Zur parallelen Bestimmung der ersten Base wurden er neut Reaktionskammern auf die Slides aufgebracht und eine Primerextensionsmi schung aus 1 mM FAM-dATP, 1 mM ROX-dGTP und 2 U Sequenase (United States Biochemical Corp., Cleveland, Ohio, USA) in 65 µl Reaktionspuffer (40 mM Tris-HCl pH 7,5, 20 mM MgCl₂, und 25 mM NaCl) eingefüllt. Nach Inkuba tion bei 37°C für 5 Minuten wurde mit Reaktionspuffer gewaschen und auf dem Laserscanningmikroskop detektiert. Anregungswellenlängen waren 488 nm und 568 nm, detektiert wurde bei 530 nm und bei 600 nm. Nach der Detektion wurde erneut Primerextensionsmischung zugegeben, welche nun die übrigen beiden markierten Nukleotide, FAM-dCTP und ROX-dTTP, enthielt. Nach erfolgter In korporation wurde erneut gewaschen und detektiert, und die Schutzgruppen wur den durch enzymatische Spaltung entfernt. Hierzu wurde mit 5 mg/ml Chirazyme L Lipase (Roche Diagnostics) in 100 mM Kaliumphosphatpuffer pH 9 für 1 h bei 35°C behandelt. Anschließend wurde die Sequenzierung wie oben beschrieben für 15 weitere Zyklen durchgeführt.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Verfahren zur parallelen Sequenzierung von mindestens zwei verschiedenen in einem Nukleinsäuregemisch enthaltenen Nukleinsäuren, wobei

a) Primermoleküle, die mindestens ein Primerpaar bilden, an eine Oberfläche irreversibel immobilisiert werden;
b) Nukleinsäuremoleküle mit einem oder mit beiden Primern desselben Pri merpaares hybridisiert werden, indem man das Nukleinsäuregemisch mit der Oberfläche in Kontakt bringt;
c) die irreversibel immobilisierten Primermoleküle komplementär zum Ge genstrang unter Bildung von sekundären Nukleinsäuren verlängert werden;
d) die nicht durch irreversibele Immobilisierung an die Oberfläche gebunde nen Nukleinäuremoleküle von der Oberfläche entfernt werden;
e) die sekundären Nukleinsäuren unter Bildung von tertiären Nukleinsäuren amplifiziert werden;
f) Gegenstränge der tertiären Nukleinsäuren, GTN, bereitgestellt werden;
g) die GTN um ein Nukleotid verlängert werden, wobei
- - das Nukleotid an der 2'-OH-Position oder an der 3'-OH-Position eine Schutzgruppe trägt, die eine weitere Verlängerung verhindert,
- - das Nukleotid eine Molekülgruppe trägt, die die Identifikation des Nu kleotids ermöglicht;
h) das eingebaute Nukleotid identifiziert wird;
i) die Schutzgruppe entfernt wird und die zur Identifikation verwendete Mo lekülgruppe des eingebauten Nukleotids entfernt oder verändert wird, und
j) Schritt (g) und nachfolgende Schritte solange wiederholt werden, bis die gewünschte Sequenzinformation erhalten worden ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (a) die Primermoleküle durch Ausbildung einer kovalenten Bindung an eine Oberflä che irreversibel immobilisiert werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Primer von beiden Primern desselben Primerpaars eine Hairpinstruktur ausbilden kann.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (f) die tertiären Nukleinsäuren durch eine Restriktionsendonuklase restringiert werden bevor an die auf diese Weise generierten Enden Nukleinsäuremolekü le, die zur Ausbildung einer Hairpinstruktur fähig sind, ligiert werden.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (f) an tertiäre Nukleinsäuren einzelsträngige Nukleinsäuremoleküle hybridisiert werden, die zur Ausbildung einer Hairpinstruktur fähig sind, bevor teriäre Nu kleinsäuren und vorgenannte einzelstängige Nukleinsäuremoleküle ligiert werden.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (g) die Base die Molekülgruppe trägt, die die Identifikation des Nu kleotids ermöglicht.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (g) die Schutzgruppe die Molekülgruppe trägt, die die Identifikation des Nukleotids ermöglicht.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (g) das Nukleotid an der 3'-OH-Position die Schutzgruppe trägt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (g) die Schutzgruppe eine spaltbare Ester-, Ether-, Anhydrid- oder Per oxid-Gruppe aufweist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (g) die Schutzgruppe über eine Sauerstoff-Metall-Bindung mit dem Nukleotid verbunden ist.

11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (i) die Entfernung der Schutzgruppe durch ein komplexbildendes Ion, vorzugsweise durch Cyanid, Thiocyant oder Fluorid oder Ethylendiamintetraacetat erfolgt.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (g) die Schutzgruppe einen Fluorophor aufweist und in Schritt (h) das Nukleotid fluorometrisch identifiziert wird.

13. Verfahren einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (i) die Schutzgruppe photochemisch abgespalten wird.