JPH11505127A - 切断可能なプライマーを用いるオリゴヌクレオチドサイズ計測 - Google Patents

切断可能なプライマーを用いるオリゴヌクレオチドサイズ計測

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、プライマーの(3')部分（伸長産物に結合される）がプライマーの上流(5')部分から放出され得るように切断可能部分を組み込むために設計された、修飾されたオリゴヌクレオチドプライマーを提供する。切断可能部位の選択的切断の際に、プライマー配列の約５またはそれより少ない塩基対を含むプライマー伸長産物が放出されて、プライマー全体を含む伸長産物よりもフラグメントについて、より有用なサイズ計測および配列情報を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 切断可能なプライマーを用いるオリゴヌクレオチドサイズ計測発明の分野 本発明は、切断可能なプライマーを含むオリゴヌクレオチド組成物、ならびに このようなプライマーを用いる診断方法および分析方法に関する。参考文献 発明の背景 一次遺伝物質であるDNAは、２つのからみ合ったポリヌクレオチド鎖からなる 複合分子であり、各ヌクレオチドはデオキシリボース単位、リン酸基、および窒 素含有ヘテロ環塩基を含む。２つのポリヌクレオチド鎖は、相補的塩基対間の水 素結合相互作用によってともに保持される。 正常なヒトは、合計約100,000遺伝子を含む23対の染色体を有する。ヒト染色 体内に含まれるDNAの長さは、合計で約33億塩基対であり、代表的な遺伝子は約3 0,000塩基対を含む。 ヒトおよび非ヒトゲノムの両方で今なお集められるべき遺伝情報が莫大な量で あるため、DNAの検出、サイズ計測、定量、配列決定、およびヒトの疾患遺伝子 のマッピングを包含する遺伝子同定の新しくかつより迅速な方法の開発のために 、熱烈な努力が進行中である。これらのプロセスの効率は自動化によって改良さ れているが、より迅速かつ安価な方法が、ゲノム規模のDNA分析を効率的に行う た めにやはり開発されなければならない。 オリゴヌクレオチドサイズ計測および配列分析は、代表的には、まず、Sanger およびCoulsonにより開発された酵素的方法を利用することによって、またはMax amおよびGilbertにより開発された化学的分解によってのいずれかにより行われ る。Sanger法は、鎖終結ジデオキシ前駆体とカップリングした酵素的鎖伸長を用 いてランダムに終結したDNAフラグメントを生成する。MaxamおよびGilbert技法 は、DNA標的の部分で行われる４つの異なる塩基特異的反応を包含し、４セット の放射標識したフラグメントを生成する。両方の技法はゲル電気泳動を利用して 、結果として生じる種々の長さのDNAフラグメントを分離する。 従来のDNA分析では、DNAフラグメントは放射性同位体で標識される。シークエ ンシングゲルでの分離後、フラグメントは、ゲル上においた１片のフィルム上に それらが生じる画像により可視化される。 放射性同位体の使用を排除するDNA分析の他の方法が記載されている。このよ うな方法の一例は、蛍光体または蛍光タグを使用する。一般的に、４つの異なる 蛍光体は、各々異なる吸収スペクトルおよび発光スペクトルを有し、これらは化 学的DNA合成技法を用いてDNAプライマーに付着される。異なる蛍光標識を有する プライマーは、４つの酵素的配列決定反応の各々に使用される。 ４つの色素の蛍光に基づく検出の別のアプローチでは、色素は、酵素的伸長後 に鎖終結塩基アナログに化学的に付着される。このアプローチでは、異なる色素 プライマーの合成が避けられる。 単機能および多機能のインターカレーター化合物もまた、高感度蛍光検出用の 試薬として開発されている（Glazerら、1992）。これらの平面の芳香族蛍光体（ 例えば、エチジウムホモダイマー、チアゾールオレンジホモダイマー、オキサゾ ールイエローホモダイマー）は、二本鎖DNAの隣接する塩基対間に挿入する。 DNAを分析するための努力は、DNAのインビトロ増幅、すなわちポリメラーゼ連 鎖反応（PCR）のためのプロセスの開発により非常に助けられている。PCRは、標 的DNA配列のたった１コピーから直接配列情報を増幅し、そして得るための能力 を提供する。 代表的には、PCR増幅は、標的二本鎖DNAの混合物、デオキシヌクレオチド三リ ン酸の混合物、緩衝液、２つのプライマー（１つはリン酸標識されている）、お よびDNAポリメラーゼ（例えば、熱安定性Taqポリメラーゼ）を、変性、アニーリ ング、および合成のための温度間で循環するサーモサイクラー中に入れることに より行われる。プライマーの選択は、増幅されるべき領域を規定する。サイクル の最初の段階では、温度を、二本鎖のDNAストランドを分離するために上昇させ て、増幅のための一本鎖テンプレートを形成する。次いで、温度を下げて、DNA ポリメラーゼのためのプライムされたテンプレートを生成する。第３段階では、 温度を上昇させて、Taqにより促進されるDNA合成を促進し、そしてストランドの 分離、プライマーのアニーリング、および合成のサイクルを約30〜60サイクルも 繰り返す。上記のような標準的検出、サイズ計測、および配列決定方法は、有用 な情報を提供するが、しばしば退屈かつ高価である。通常用いられる技法の多く は、複数の取扱い工程を包含する。さらに、フラグメント分析であるゲル電気泳 動のほとんどの通常の方法は、比較的時間を費やすプロセスである。発明の要旨 本発明は、5'末端および3'末端を有する修飾されたプライマーを含み、そして 少なくとも１つの選択的に切断可能な部位を含むオリゴヌクレオチド組成物を提 供する。好ましくは、この切断可能部位は、プライマーの3'末端から約５ヌクレ オチドにまたは約５ヌクレオチド以内に位置する。 修飾されたオリゴヌクレオチドプライマーは、5'末端および3'末端を有し、２ つの別々のヌクレオチド領域から構成される。第１の領域は5'末端を含み、一方 第２の領域はプライマーの3'末端を含み、ここで3'末端は、代表的にはポリメラ ーゼまたはリガーゼによる、酵素的伸長のためのプライミング部位として作用し 得る。第２の領域はまた、第１および第２のプライマー領域をつなぐ切断可能部 位を含む。好ましい実施態様では、プライマーの第１の領域は、少なくとも３つ のヌクレオチドを含む。第１のプライマー領域は、必要に応じて、プライマーの 5'末端と第２領域の切断可能部位との間に位置する、１つ以上の第２の切断可能 部位を含み得る（例えば、第１の領域をより小さなフラグメントに分解するため に）。第２の切断可能部位を含む修飾されたプライマーについて、最も遠くの下 流の切断可能部位は、追加の塩基を有する第２のまたは微量の産物の形成を避け るために、理想的には、ほぼ100％の効率で切断されるべきである。 本発明の１つの実施態様では、切断可能部位は、プライマーの3'末端から約５ ヌクレオチドに、または約５ヌクレオチド以内に位置する。別の実施態様では、 第２のプライマー領域は、リボヌクレオチドのような切断可能部位も含む単一の ヌクレオチドからなる。あるいは、第２の領域は、切断可能部位のみから構成さ れ得る。 修飾されたプライマー組成物内に含まれる切断可能部位は、ジアルコキシシラ ン、3'-(S)-ホスホロチオエート、5'-(S)-ホスホロチオエート、3'-(N)-ホスホ ルアミデート、5'-(N)-ホスホルアミデート、およびリボースのような化学的に 切断可能な基を包含する。 さらなる切断可能部位には、ヌクレアーゼのような酵素により切断可能なヌク レオチドが含まれる。１つの実施態様では、修飾されたプライマー組成物内の切 断可能部位は、チミジンを置き換えるために組み込まれた単一のウラシルであり 、ここでウラシルはウラシルDNAグリコシラーゼでの処理、次いでアルカリ処理 により部位特異的に切断される。別の実施態様では、切断可能部位は、制限エン ドヌクレアーゼ切断可能部位であり、ここで認識配列は第１のプライマー領域に 位置する（すなわち、切断部位の上流）。好ましい実施態様では、制限エンドヌ クレアーゼ切断可能部位は、プライマーの3'末端から約５ヌクレオチドに、また は約５ヌクレオチド以内に位置する。例えばクラスIIs制限酵素で、伸長産物内 の切断可能部位または切断部位の位置を定めることもまた可能である。本発明の 修飾されたプライマーを切断するのに使用するための制限エンドヌクレアーゼに は、BpmI、BsgI、BseRI、BsmFI、およびFokIのようなクラスIIs制限エンドヌク レアーゼが含まれる。BpmIまたはBsgI認識部位を含む修飾されたプライマーは、 (i)各々、認識部位、5'-CTGGAG-3'または5'-GTGCAG-3'を含む第１の領域を含み 、そして(ii)第２のプライマー領域中の認識配列の最後のヌクレオチドから16塩 基下流に位置し、これは切断可能部位である。BseRIまたはBsmFI認識部位（例え ば、各々5'-GAGGAG-3'または5'-GGGAC-3'）を含む修飾されたプライマーは、認 識配列の最後のヌクレオチドから10塩基下流に位置する切断可能部位を含むが、 一方、 FokI認識配列（例えば、5'-GGATG-3'）を含むプライマーは、認識配列の最後の ヌクレオチドから９塩基下流の切断可能部位を有する。 さらに別の実施態様では、切断可能部位は、制限エンドヌクレアーゼ切断可能 部位であり、ここで、認識配列は第１のプライマー領域（すなわち、切断部位の 上流）に位置し、そして第１のプライマー領域は、5'ヘアピン型（自己相補的二 本鎖）ドメインを含む。5'ヘアピンドメインは、制限酵素のための二本鎖認識部 位を含む。第２の（一本鎖）プライマー領域は、(i)切断可能部位（すなわち、 制限エンドヌクレアーゼ切断部位）を含み、そして(ii)一本鎖標的に相補的なヌ クレオチドから構成され、したがって酵素的伸長のためのプライミング部位とし て作用する。プライマーの酵素的伸長の後、産物は、適切なクラスIIS制限エン ドヌクレアーゼでの処理により切断され、次いで変性により一本鎖伸長セグメン トを放出する。 別の実施態様では、切断可能部位は、T7遺伝子6エキソヌクレアーゼのような 、5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素によって、5'→3'酵素により促進 される消化をブロックまたは終結し得る、１つのヌクレオチドまたは連続のヌク レオチドである。ブロッキングヌクレオチドは、ホスホロチオエート基またはボ ラノホスフェート基を含む、ペプチド核酸およびヌクレオチドを含む。切断可能 部位としてブロッキングヌクレオチドを含む修飾されたプライマーを利用するプ ライマー伸長反応において、プライマー伸長反応後、得られる産物は、(i)ブロ ッキングヌクレオチドを含む修飾されたプライマーおよび(ii)伸長セグメントか ら構成され、これは5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を有するエキソヌクレアーゼ のようなヌクレアーゼで処理される。ヌクレアーゼ処理は、代表的には、プライ マーの第１領域の消化を生じて、切断可能部位の下流（すなわち3'）のヌクレオ チドから構成される伸長セグメントを生成する。好ましくは、ブロッキング基は 、プライマーの酵素的伸長を阻害しない。 修飾されたプライマーは、固体支持体への結合のための固定化付着部位をさら に含み得る。固定化付着部位は、切断可能部位の上流（すなわち5'）または下流 （すなわち3'）のいずれかに位置し得る。１つの実施態様では、固定化付着部位 は、修飾されたプライマーの5'末端または切断可能部位に対して5'（すなわち、 切断可能部位の上流）に位置する。別の実施態様では、固定化付着部位は、3'末 端または切断可能部位に対して3'（すなわち、切断可能部位の下流）に位置する 。あるいは、固定化付着部位は、酵素的伸長反応から得られる伸長セグメント内 に含まれ得るか、または標的核酸内に含まれ得る。 固定化付着部位を含む修飾されたプライマーについて、プライマーは、固体支 持体とプライマー固定化付着部位との間の共有結合または非共有結合のいずれか により固体支持体に付着可能であり、固定化され修飾されたオリゴヌクレオチド 組成物を提供する。本発明での使用のための固体支持体には、ガラス、シリコン 、ポリスチレン、セルロース、テフロン、ポリスチレンジビニルベンゼン、アル ミニウム、スチール、鉄、銅、ニッケル、銀、および金が含まれる。 １つの実施態様では、プライマーは、介在スペーサーアームにより固体支持体 に付着可能であり、代表的なスペーサーは６以上の原子の長さである。 別の実施態様では、修飾されたプライマーは、媒介オリゴヌクレオチドに相補 的な一連の塩基から構成される第１のプライマー領域に、固定化付着部位を含む 。修飾されたプライマーは、固定化付着部位の媒介オリゴヌクレオチドへの特異 的ハイブリダイゼーションにより固定化され得、これは固体支持体に結合される 。媒介オリゴヌクレオチドは、修飾されたプライマーの配列の全体または一部に 相補的であり得る。媒介ヌクレオチドは、代表的には、６以上の塩基、および好 ましくは８より多い塩基から構成される。さらに、媒介オリゴヌクレオチドはま た、標的核酸（テンプレート）分子内の領域に相同であり得る。 １つの実施態様では、本発明の修飾されたプライマーは、ホスホジエステルヌ クレオチド間結合を有する、DNAまたはRNAのようなオリゴヌクレオチドである。 別の実施態様では、修飾されたプライマーは、メチルホスホネート、ホスホトリ エステル、ホスホロチオエート、ペプチドなどのようなヌクレオチド間結合を含 む別の骨格構造から構成されるオリゴヌクレオチドアナログである。本発明での 使用のためのプライマーは、標的配列へ配列特異的な様式で水素結合し得るべき である。 本発明はまた、本発明の修飾されたプライマーを用いてプライマー伸長産物の サイズを決定する方法を提供する。この方法を用いる場合、オリゴヌクレオチド サイズ分析は、最初に本発明の修飾されたプライマーを標的核酸分子（例えば、 DNAまたはRNA）に接触させて、プライマーと一本鎖標的とのハイブリダイゼーシ ョンをもたらすことにより行われる。修飾されたプライマーは、標的に相補的で あり、そしてプライマーの5'末端を含む第１の領域およびプライマーの3'末端を 含む第２の領域を含み、ここで、3'末端は酵素的伸長のためのプライミング部位 として作用し得る。プライマーの第２の領域はまた、切断可能部位を含む。 プライマー伸長産物のサイズを決定する場合、プライマーは酵素的手段によっ て、代表的にはポリメラーゼまたはリガーゼの作用によって伸長されて、プライ マーおよび１つ以上の伸長セグメントから構成される産物を含む混合物を生成す る。得られる産物は、切断可能部位で切断され、次いで得られる伸長セグメント は多くの適切な分析技法のいずれか、好ましくは質量分析法によりサイズ計測さ れる。本発明によれば、伸長セグメントの質量は減少し、そして伸長セグメント の読みの長さ（read length）は、修飾されたプライマーおよび伸長セグメント から構成される産物の読みの長さに比例して増加する。 伸長産物のサイズを決定するための好ましい実施態様では、修飾されたプライ マー（第１または第２の領域）またはテンプレートは、固体支持体への付着によ り固定化される。固定化は、共有結合または非共有結合を介してであり得る。非 共有結合の例には、リガンド−タンパク質相互作用および塩基特異的水素結合が 含まれる。酵素的伸長反応からの伸長セグメントはまた、固体支持体への付着に より固定化され得、そしてサイズ計測または配列決定の前に固体支持体から放出 される。後者の実施態様では、酵素的伸長は、代表的には、(i)固定化付着部位 および(ii)放出可能部位を含むヌクレオチド、例えば、ビオチン化ジスルフィド ジデオキシヌクレオチドのような例示的なヌクレオチドの存在下で行われる。酵 素的伸長後、伸長産物は固定化され、変性され、そして切断可能部位で切断され て、固体支持体に付着した伸長セグメントを残す。放出されたプライマー（切断 可能部位の上流部分）、テンプレート、および追加の混合物成分は、代表的には 、洗浄により除去され、次いで固定化された伸長セグメントは放出可能部位で切 断されてサイズ計測のための伸長セグメントを放出する。 この方法の１つの実施態様では、修飾されたプライマーは、固体支持体に結合 される媒介オリゴヌクレオチド（固相結合媒介オリゴヌクレオチド、SPBIO）へ の固定化付着部位の特異的ハイブリダイゼーションを介して固定化される。１つ の特定の実施態様では、固定化付着部位は第１のプライマー領域に位置し、そし て媒介オリゴヌクレオチドに相補的な一連の塩基から構成される。あるいは、伸 長産物の配列の一部が公知である場合、固定化付着部位は伸長セグメントの領域 内に含まれ得る。 さらに別の実施態様では、SPBIOは、SPBIOと修飾されたプライマーにハイブリ ダイズするための標的との間の競合を生じる、標的核酸分子に相同である。酵素 的伸長後、産物（プライマーおよび伸長セグメントから構成される）は、SPBIO へのハイブリダイゼーションを介して固体支持体に付着される。産物へのSPBIO のハイブリダイゼーションを促進するために、標的分子の量は、(i)プライマー および伸長産物をそのまま残す標的選択的消化を行うこと、または(ii)標的分子 の量を減少させることのいずれかによって、減少され得る。テンプレート特異的 消化は、化学的または酵素的であり得る。 この方法の関連する実施態様では、修飾されたプライマーは、SPBIOへのハイ ブリダイゼーションを介して固定化され、ここで、第１のプライマー領域はSPBI Oに相補的である第１の部分を含み、そして第１の領域のこの部分の下流または3 'は、標的分子に相補的であるがSPBIOに相補的でない、第１のプライマー領域の 第２の部分である。修飾されたプライマーの第１の領域の第１の部分は、代表的 には、SPBIOに相補的である少なくとも６以上のヌクレオチドから構成される。 あるいは、修飾されたプライマーの間接的固定化は、固体支持体に付着される 標的核酸を用いて酵素的伸長反応を行うことにより達成され得る。標的分子は、 プライマー伸長の前または後のいずれかに固定化され得る。 必要に応じて、固定化種または非固定化種を含む反応混合物は、切断可能部位 での切断の前に洗浄されて、伸長セグメントのサイズ計測の前に固定化種と非固 定化種との容易な分離を可能にする。 プライマーは、固定化の性質に依存して、酵素的伸長の前または後のいずれか に固定化付着部位で固定化され得る。一般的に、固定化付着部位が第１のプライ マー領域内に含まれる場合、固定化付着は、選択された切断条件下でそのまま残 り、固定化された形態において修飾されたプライマーからのヌクレオチドのかな りの部分（例えば、第１のプライマー領域を含む部分）を保持する。本発明の方 法によれば、切断可能部位での切断から生じる伸長セグメントの読みの長さは、 プライマーおよび伸長セグメントから構成される産物の読みの長さに比例して増 加する。 本発明の１つの実施態様では、伸長セグメントは、代表的には、修飾されたオ リゴヌクレオチドプライマーに由来するほんの約５ヌクレオチドを含み、これは 質量分析法を用いてサイズ計測される。このようなサイズ計測は、マトリクス援 助レーザー脱着イオン化（matrix assisted laser desorption ionization）質 量分析法を利用し得、そしてより特定には、飛行時間型（time-of-flight）質量 分析法を用いて達成され得る。 サイズ計測方法はまた、標的核酸の増幅とカップリングされ得る。 本発明のこの局面の１つの実施態様では、第１および第２のプライマーは、核 酸へのプライマーのハイブリダイゼーションを促進するために効果的な条件下で 標的核酸と組み合わせられて、プライマー／核酸複合体を生成する。プライマー の１つ（例えば、第１のプライマー）は、標的核酸に相補的であり、そしてプラ イマーの5'末端および固定化付着部位を含む第１の領域を有する。第１のプライ マーは、プライマーの3'末端を含む第２の領域をさらに含み、ここで、3'末端は 酵素的伸長のためのプライミング部位として作用し得る。第１のプライマーの第 ２の領域は、切断可能部位をさらに含む。第２のプライマーは標的核酸に相同で ある。 プライマー／核酸複合体は、適切なポリメラーゼ、およびすべての４つのデオ キシヌクレオチド三リン酸（dNTP）またはその修飾された型の存在下で、二本鎖 フラグメントに変換される。プライマー含有フラグメントの数は、(i)二本鎖フ ラグメントを変性して一本鎖フラグメントを生成する工程、(ii)一本鎖をプライ マーとハイブリダイズしてストランド／プライマー複合体を形成する工程、(iii )ポリメラーゼおよびすべての４つのdNTPの存在下でストランド／プライマー複 合体から二本鎖フラグメントを生成する工程、および(iv)所望の程度の増幅が達 成されるまで(i)から(iii)の工程を繰り返す工程を連続して繰り返すことにより 増幅される。 次いで、増幅されたフラグメントは変性されて、第１のプライマーおよび伸長 セグメントから構成される産物を含む混合物を生成する。本発明のこの局面の１ つの実施態様では、第１のプライマーを含む増幅されたフラグメントは、固定化 付着部位で固定化され、そして固定化されない増幅されたフラグメントは、代表 的には洗浄により除去される。次いで、第１のプライマーは、切断可能部位で固 定化産物から切断され、支持体からの伸長セグメントの放出を生じる。 別の実施態様では、増幅されたフラグメントは変性の前に固定化され得る。一 般的に、増幅されたフラグメントは、切断可能部位での切断の前に固定化され、 他の種（例えば、プライマー、反応物、過剰のdNTP）の非存在下で、このような 切断から生じる伸長セグメントの放出およびそれに続く分析を可能にする。 次いで、伸長セグメントは質量分析法によりサイズ計測される。伸長セグメン トの読みの長さは、第１のプライマーおよび伸長セグメントから構成される産物 の読みの長さに比例して増加する。 サイズ計測方法の別の実施態様は、第１および第２のプライマーを提供し、こ こで、一方のプライマー（すなわち第１のプライマー）は切断可能部位を含み、 そして他方のプライマー（すなわち第２のプライマー）は固体支持体への結合の ための固定化付着部位を含む。第２のプライマーは5'末端および3'末端から構成 され、標的核酸に相同であり、そして第２のプライマーの3'末端を含む第１のセ グメント、ならびにプライマーの5'末端および固定化付着部位を含む第２のセグ メントを含む。 これらの第１および第２のプライマーは、標的核酸と組み合わされてプライマ ー／核酸複合体を生成し、そしてポリメラーゼおよびデオキシヌクレオシド-三 リン酸の存在下で二本鎖フラグメントに変換される。サイズ計測方法は、高濃度 の標的核酸を用いて行われて実質的な量のプライマー伸長産物を生成し得るか、 あるいは、異なる回の増幅とカップリングされ得る。所望の量の産物が達成され たら、第２のプライマーを含む伸長産物は、固定化付着部位での付着により固定 化される。次いで、伸長産物は、切断可能部位で切断されて二本鎖産物を含む混 合物を生成する。固定化されていない切断されたフラグメントは、好ましくは洗 浄により除去され、そして二本鎖産物は変性されて伸長セグメントを放出し、こ れは質量分析法によりサイズ計測され、ここで、伸長セグメントの質量は減少し 、そして伸長セグメントの読みの長さは、プライマー／核二本鎖フラグメントの 読みの長さに比例して増加する。伸長産物の固定化は、切断可能部位での切断の 前または後のいずれかで生じ得る。 認識されるように、第１のプライマーの切断可能部位および第２のプライマー の固定化付着部位は、上記のタイプのものを含む。 １つの実施態様では、第１のプライマーは、第１のプライマー領域にクラスII s制限酵素認識部位を含み、そして第２のプライマー領域に切断可能部位を含み 、そして第２のプライマーは、固体支持体への付着のための固定化付着部位を含 む。切断可能部位での切断は、第１のプライマー領域に含まれる認識部位に対し て選択的な制限エンドヌクレアーゼの添加により行われて、(i)第１のプライマ ーの第１の領域を含む放出されたフラグメントおよび(ii)所望の伸長セグメント を放出するために変性の前に固定化される二本鎖産物を提供する。 関連する局面では、配列決定の方法が提供されて、これは質量分析法により標 的分子の配列を決定するために本発明の修飾されたプライマーを利用する。本発 明のこの局面の１つの実施態様では、標的核酸の配列は、本発明の修飾された固 定化可能なプライマーをDNAまたはRNAのような標的核酸とハイブリダイズするこ と、次いで４つの異なるジデオキシヌクレオチド（チェーンターミネーター）の 第１番目の存在下でプライマーを酵素的に伸長してプライマー伸長産物の混合物 を生成することにより決定される。プライマー伸長産物は、各々プライマーおよ び伸長セグメントを含む。伸長産物は変性され、固定化され、そして洗浄されて 、反応物中に存在する固定化されない種を除去する。上記の実施態様のように、 固定化は、酵素的伸長の前または後に生じ得、そして代表的には切断可能部位で の切断前に行われる。固定化および固定化されない種の除去に続いて、プライマ ー伸長産物は切断されて、伸長セグメントを放出する。伸長セグメントは質量分 析法によりサイズ計測され、そして上記の工程は、３つの残りの異なるジデオキ シヌクレオチドの各々について繰り返される。次いで、標的の配列は、４つの伸 長反応の各々から得られた伸長セグメントのサイズを比較することにより決定さ れ る。上記の変法において、単一のプライマー伸長反応は、最大４つ全てまでの１ つより多い鎖終結ヌクレオチド（例えば、dTTP、ddTTP、dATP、ddATP、dCTP，dd CTP、dGTP、およびddGTP）から構成される混合物を用いて行われる。得られる反 応混合物は、最大４つ全ての塩基で特異的に終結された産物を含み、次いで、質 量データおよび４つの塩基について公知の質量値を用いて分析される。必要に応 じて、質量が変化したヌクレオチドは、産物混合物の分解能を増強するために利 用され得る。配列決定はまた、ジデオキシヌクレオシドを用いない代わりの配列 決定方法論とカップリングした、本発明の修飾されたプライマーを用いて行われ 得る。 このような実施態様の１つでは、DNAまたはRNAのような標的核酸の配列は、最 初にプライマーを標的DNAとハイブリダイズすることにより決定され、ここで、 プライマーは、(i)標的DNAに相補的であり；(ii)プライマーの5'末端を含む第１ の領域および固定化付着部位を有し；そして(iii)プライマーの3'末端を含む第 ２の領域および切断可能部位を有する。プライマーの3'末端はまた、酵素的伸長 のためのプライミング部位として作用し得る。 次いで、プライマーは、４つの異なるデオキシヌクレオチドα-チオ三リン酸 アナログ（dNTPαS）の第１番目の存在下で酵素を用いて伸長されて、ホスホロ チオエート結合を含むプライマー伸長産物の混合物を生成する。次いで、ホスホ ロチオエート含有伸長産物は、ホスホロチオエート位置で特異的に切断する試薬 で処理される。ホスホロチオエート特異的切断を促進するために適切な試薬は、 3'→5'エキソヌクレアーゼ、2-ヨードエタノール、および2,3-エポキシ-1-プロ パノールを含む。伸長産物の処理は、代表的には、ホスホロチオエート結合の限 定された切断を生じる条件下で行われ、その結果、プライマー伸長分解産物の群 が産生する。あるいは、プライマー伸長反応は、対応する従来のデオキシヌクレ オシド三リン酸（dNTP）とともに、限定された量のα-チオデオキシヌクレオシ ド三リン酸アナログを用いて行われ得る。次いで、得られる伸長産物は、伸長産 物中に組み込まれたホスホロチオエート基のすべてを切断する（完全な切断）た めに効果的な条件下で、上記のようなホスホロチオエート選択的試薬で処理され る。 プライマー伸長分解産物は、固定化付着部位で固定化されて、固定化されたプ ライマー伸長分解産物（すなわち、5'末端含有プライマーに特異的なフラグメン トのネスティッドセット）を生成し、各々プライマーおよび伸長セグメントを含 む。本発明のこの局面の別の実施態様では、固定化は、i)酵素的伸長の前、ii) 酵素的伸長の後、iii)ホスホロチオエート含有プライマー伸長産物をホスホロチ オエート特異的切断試薬で処理する前、またはiv)このような処理の後のいずれ かに行われ得る。 固定化に続いて、プライマー伸長分解産物は、洗浄されて、固定化されていな い種が取り除かれる。切断可能部位での切断は、伸長セグメントの放出を生じ、 次いで質量分析法によりサイズ計測される。本発明のこの局面の配列決定方法を 用いて、あらゆる所定の伸長セグメントの読みの長さは、その対応するプライマ ー伸長分解産物の読みの長さに比例して増加する。 次いで、ハイブリダイゼーション、酵素的伸長、ホスホロチオエート切断試薬 での処理、固定化、洗浄、切断、およびサイズ計測の工程は、４つの異なるdNTP αSアナログの第２番目、第３番目、および第４番目を用いて繰り返されて、４ つの伸長反応の各々から得られた伸長セグメントのサイズの比較によって、標的 DNAの配列が決定される。必要に応じて、ハイブリダイゼーション、酵素的伸長 、ホスホロチオエート切断試薬での処理、固定化、洗浄、および切断の工程は、 ２〜４の異なるdNTPαSアナログの存在下で行われ、その後、質量分析法により 得られる伸長セグメントのサイズ計測が行われ得る。 さらに別の局面によれば、標的オリゴヌクレオチドのフィンガープリントを得 るために本発明の修飾されたプライマーを利用する、フィンガープリンティング の方法が提供される。 本発明のこれらのおよび他の目的および特徴は、以下の詳細な説明が添付の図 面および実施例とともに読まれる場合、より十分に明らかになる。図面の簡単な説明 図１Ａ〜１Ｗは、もとのままのホスホジエステルヌクレオチド間結合および本 発明のオリゴヌクレオチド組成物における使用のための例示的なヌクレオシド間 切断可能部位を示す； 図２Ａ〜２Ｍは、修飾されたオリゴヌクレオチドプライマーの第１の領域を固 定化することにおける使用のための多くの例示的な固定化付着結合を含む； 図３Ａおよび３Ｂは、選択的切断の前後両方の3-ヒドロキシピコリン酸の固体 マトリクスから脱着した切断可能なリボースを含む、修飾されたオリゴヌクレオ チドプライマーの試料についての飛行時間型質量スペクトルを示す； 図４は、10位に切断可能なリボースを含む固定化された18マーの切断産物の飛 行時間型質量スペクトルである； 図５Ａ〜５Ｅは、本発明により固定化された切断可能なプライマーの４つの別 の実施態様を示す； 図６Ａおよび６Ｂは、本発明の固定化可能な切断可能なプライマーを用いて標 的DNA分子の配列を決定する例示的な方法を示す； 図７Ａおよび７Ｂは、本発明の修飾されたプライマーを用いる検出に適切な２ つの異なる遺伝子障害について同定された、それぞれの単一遺伝子変異部位を示 す； 図８は、標的分子および固相結合媒介オリゴヌクレオチドSPBIOの両方への第 １のプライマー領域の競合的ハイブリダイゼーションを介して修飾されたプライ マーの固定化を示す； 図９は、SPBIOへのハイブリダイゼーションを介する修飾されたプライマーの 固定化を示し、ここで、修飾されたプライマーは、SPBIOに相補的な第１の部分 および標的分子に相補的であるがSPBIOに相補的でない下流の第２の部分から構 成される第１のプライマー領域を含む； 図１０は、固体支持体に結合した標的分子への塩基対合相互作用を介する酵素 的伸長産物（修飾されたプライマーおよび伸長セグメントから構成される）の固 定化を示す； 図１１は、酵素的伸長産物の配列特異的切断を示し、ここで、修飾されたプラ イマーは、第１のプライマー領域中の制限認識部位および第２のプライマー領域 中の切断可能部位を含む； 図１２は、第１および第２の修飾されたプライマーを用いる例示的な本発明の サイズ計測方法を示し、ここで、第１のプライマーは酵素切断可能部位を含み、 そして第２のプライマーは固定化付着部位を含む； 図１３は、5-チオールチミジン切断可能部位を含むプライマーおよび10倍過剰 のプライマーを用いる伸長反応から得られたプライマー伸長産物のMALDI飛行時 間型質量スペクトルである。プライマー伸長産物は、ストレプトアビジンでコー トされたビーズに結合した相補的ビオチン化媒介オリゴヌクレオチドへのハイブ リダイゼーションを介して固定化され、そしてその後のサイズ分析のための化学 的切断により放出された； 図１４Ａおよび１４Ｂは、塩基特異的消化を用いてオリゴヌクレオチド間の単 一塩基置換（点変異）を検出することにおける本発明の方法の有用性を示す、MA LDI飛行時間型質量スペクトルである；そして 図１５Ａおよび１５Ｂは、(i)本発明による切断可能プライマー（図１５Ｂ） 対(ii)全長プライマー（図１５Ａ）を用いて得られるプライマー伸長産物のMALD I飛行時間型質量スペクトルであり、得られるスペクトルの分解能および読みの 長さの両方に相違を示す。 図１６は、酵素的伸長産物の配列特異的切断を示し、ここで、修飾されたプラ イマーは、第１のプライマー領域中のクラスIIs制限酵素認識部位を含み、5'ヘ アピン型（自己相補的二本鎖）ドメインおよび第２のプライマー領域中の切断可 能部位から構成される。発明の詳細な説明 Ｉ．定義 本明細書で用いられる場合、以下の用語は示されるような意味を有する： 一本鎖オリゴヌクレオチド内の位置をいう場合、特定の位置から「上流」であ る位置は、この位置に対して5'に位置するが、「下流」である位置は、参照点に 対して3'に位置する。 「固定化付着部位」すなわちIASは、直接、介在スペーサーアームを介して、 または固体支持体に結合した媒介オリゴヌクレオチドへの特異的ハイブリダイゼ ーションによるかのいずれかによる、固体支持体物質への結合のためのオリゴヌ クレオチドプライマー内に存在し得る部位である。固定化付着部位は、切断可能 部位の上流（すなわち、5'に）または下流（すなわち、3'に）のいずれかに位置 し得、そして固体支持体への結合前に化学的修飾を必要とし得る。あるいは、固 定化付着部位は、酵素的伸長反応から得られる伸長セグメント内に含まれ得、ま たは標的核酸内に含まれ得る。固定化付着部位は、図２Ａ〜２Ｋおよび図２Ｍに 示す代表的な官能基のような、固体支持体への共有結合のための選択官能基であ り得る。固定化付着部位はまた、固体支持体との高アフィニティー非共有相互作 用による付着のための、ビオチンのようなリガンドであり得る。さらに、固定化 付着部位はまた、媒介オリゴヌクレオチドに相補的な一連の塩基から構成され得 る。修飾されたプライマーの固定化は、例えば、媒介オリゴヌクレオチドへの固 定化付着部位の特異的ハイブリダイゼーションによりもたらされ、これは、固体 支持体に結合される。媒介オリゴヌクレオチドはまた、テンプレートとして作用 し得る。固定化付着部位は、化学的または酵素的な手段のいずれかによって固体 支持体に付着され得る。固体支持体への固定化付着部位の付着の際に、得られる 固定化結合は、切断可能部位を切断するために用いられる条件下で安定なままで あり、そして塩基対ハイブリダイゼーションを阻害せず、その3'末端からプライ マーを伸長するための能力をブロックしない結合である。 ２つの核酸フラグメントは、例えば、Maniatisら、320-328頁および382-389頁 に記載のような、代表的なハイブリダイゼーション条件下および洗浄条件下で、 お互いに特異的にハイブリダイズし得るが、他のポリヌクレオチドにハイブリダ イズし得ない場合、「選択的にハイブリダイズし得る」と考えられる。 ２つの核酸フラグメントは、(i)例えば、Maniatisら、320-328頁および382-38 9頁に記載のような、代表的なハイブリダイゼーション条件下および洗浄条件下 で、または(ii)例えば、２×SSC、0.1％SDS、室温で２回、各々30分間；次いで 、２×SSC、0.1％SDS、37℃で１回、30分間；次いで、２×SSC、室温で２回、各 々10分間で、多くとも約25〜30％塩基対のミスマッチを可能にする減少したスト リンジェントの洗浄条件を用いて、お互いに特異的にハイブリダイズし得る場合 、「相補的」であると考えられる。 本明細書で用いられる「切断可能部位」は、代表的には、(i)プライマーの3' 末端から約５ヌクレオチドにまたは約５ヌクレオチド内に位置する、および(ii) 化学的、熱的、または光分解的手段を包含する適切な非酵素的または酵素的手段 により選択的に切断可能である反応性部分であり、代表的には修飾されたプライ マーの塩基対を全く含まないかまたは比較的少数を含むプライマー伸長産物の放 出を可能にする。切断可能部位は、上記のような選択的に切断可能な官能基につ いて、およびまたその保護された形態についての両方をいう。切断可能部位は、 例えば、(i)ポリマー骨格（すなわち、ホスホジエステル基の１つの代わりに修 飾された3'-5'ヌクレオチド間結合）に沿って位置し得、(ii)オリゴヌクレオチ ドプライマーの塩基または糖の１つの置換基または置換として、または(iii)3' 末端残基（例えば、オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーの3'末端でのリ ボヌクレオチド）としてであり得る。切断可能部位は、プライマー固定化、ハイ ブリダイゼーション、プライマー伸長、および洗浄条件の間、標準的な固相DNA 合成条件下で安定である。 本明細書で用いられる場合、切断可能部位はまた、ヌクレアーゼのような酵素 により切断可能なヌクレオチドであり得る。例えば、切断可能部位は、制限エン ドヌクレアーゼ切断可能部位であり得、ここで、認識配列は第１のプライマー領 域（すなわち、切断部位の上流）に位置する。切断可能部位での切断に使用する ための例示的な制限エンドヌクレアーゼは、BpmI、BsgI、BseRI、BsmFI、および FokIを含む。 切断可能部位はまた、T7遺伝子6エキソヌクレアーゼ（Amersham Life Science s，Arlington Heights，IL）のような、5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を有する 酵素による5'→3'酵素により促進される消化をブロックまたは終結し得る、１つ のヌクレオチドまたは連続のヌクレオチドであり得る。代表的なブロッキングヌ クレオチドは、ホスホロチオエート、ボラノホスフェート、またはペプチド基を 含むヌクレオチドである。ブロッキングヌクレオチド／切断可能部位は、プライ マーの酵素的伸長を阻害しない部位であるべきである。 本明細書に記載される場合、「フィンガープリンティング」とは、標的オリゴ ヌクレオチド鎖中のほんの２つの異なる塩基の位置を決定する方法をいい、「配 列決定」に対立するものであって、配列決定は、標的ストランドまたはその相補 物に存在する各ヌクレオチドの同定および位置を含む、標的オリゴヌクレオチド の完全なヌクレオチド配列（およびまた標的オリゴヌクレオチドによりコードさ れる対応するアミノ酸配列）の決定をいう。 「非共有結合」とは、あらゆるタイプの非共有結合相互作用をいい、そして本 明細書では主として種々のタイプの固定化付着部位を記載するために用いられる 。非共有結合は、相補的ヌクレオチド塩基対間で生じるもののような、塩基特異 的水素結合相互作用を含み、またはビオチン／アビジンもしくはビオチン／スト レプトアビジン相互作用（Ｋa＝1015Ｍ-1）のような高アフィニティーリガンド −タンパク質相互作用を指し得る。 「伸長セグメント」は、プライマーの3'末端でのインビトロの酵素的伸長から 得られる産物をいい、伸長前にプライマーに元来存在するヌクレオチドの部分を 除外する。 本明細書で使用される場合、「読みの長さ」は、新しい分析データ（例えば、 サイズ計測、定量、配列決定）が得られ得る所定の標的配列のヌクレオチドの数 をいう。新しいデータは、用いられる１つまたは複数のプライマーに相補的な標 的DNAの部分（例えば、配列情報が既に公知である領域）に由来するデータを除 外するプライマー伸長産物についてのフラグメント情報をいう。 読みの長さは、代表的には、方法依存的である（すなわち、用いられる検出方 法の関数）。いくつかの分析方法では、サイズ分解能は、本質的に限定される上 限、例えば、100ヌクレオチドまでを有し得る。本発明のある利点は、産物がこ のような方法を用いて分析される場合、プライマー伸長産物から得られ得る標的 DNA配列についての新しいまたは有用な情報の量を向上させるための能力である 。 例えば、本発明の修飾されたプライマーを用いて、例示的な伸長セグメントの 読みの長さは以下のように決定される。DNA標的に相補的な18ヌクレオチドから 構成され、そしてヌクレオチド17と18との間に切断可能結合を有する（例えば、 切断可能部位はプライマーの3'末端から１つのヌクレオチド以内である）修飾さ れたプライマーは、最初に標的ストランドにアニールされ、（例えば、ポリメラ ーゼまたはリガーゼで）酵素的に伸長され、そして（固定化に続く）得られるプ ライマー伸長産物は、切断可能部位で切断されて、プライマーに由来する１つの みのヌクレオチドを含む伸長セグメントを生じる。伸長産物のサイズ計測を行う 際に、読みの長さは、検出されたヌクレオチドの総数(Ｘ)−プライマーの第２の 領域に由来する１つのヌクレオチド、すなわちＸ−１に等しい。 対照的に、切断可能部位での切断前に、プライマーおよび同様のセットの伸長 セグメントから構成される産物は、Ｘ−18の読みの長さを有し、ここで、18はプ ライマー中の塩基の数に等しい。したがって、本発明の修飾されたプライマーを 用いて得られたプライマー伸長産物についての新しいまたは有用な配列決定また はサイズの情報の量は、向上する。 II．オリゴヌクレオチド組成物：修飾プライマーの合成 Ａ．修飾プライマーの特徴 本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、(i)3'末端からプライマーを伸長 する能力をブロックしないように固体支持体への任意の結合のために設計され、 そして(ii)伸長セグメントに連結されたプライマーの3'部分がプライマーの上流 部分（切断可能部位の5'）から放出され得るように、切断可能部分を組み込む。 プライマーの上流部分は、本明細書では第１のプライマー領域というが、代表的 には、プライマーに存在するヌクレオチドの総数のうちの有意な数を含み、その ため切断可能部位での切断時に、プライマー伸長産物についての新しいフラグメ ント情報量が最大になる。 本発明の修飾プライマーは、好ましくは、プライマーを固体支持体に結合する ための固定化付着部位を含む。内部固定化付着部位（すなわち、プライマー自身 の中に含まれる部位）を含む修飾プライマーについて、固定化付着部位またはIA Sは、一般に、少なくとも３つのヌクレオチドにより切断可能部位から分離され る。切断可能部位の選択的切断において、プライマーフラグメントの大部分は、 固体支持体に固着されたままである。これは、プライマー配列の約５つまたはそ れより少ない塩基対を含むプライマー伸長産物の放出を可能にして、図１５Ａお よび１５Ｂに示すような有用なサイズ分析の範囲（例えば、増加した読みの長さ ）を広げる。 図１５Ａおよび１５Ｂは、プライマー伸長反応からの産物の質量スペクトルで あり、本発明による切断されたプライマー伸長セグメント（図１５Ｂ）対切断さ れていない全プライマー伸長セグメント（図１５Ａ）について得られたフラグメ ント情報の差を示す。プライマー伸長反応およびプライマー切断の詳細が実施例 ８に記載されている。配列決定の適用について、修飾プライマーはまた、全体の プライマーを含む伸長産物よりもフラグメントごとのより有用な配列情報を提供 し得る。 本発明のオリゴヌクレオチド組成物におけるプライマーまたはプローブとして の使用のためのオリゴヌクレオチド配列の例は、代表的には、約８〜30ヌクレオ チド、好ましくは約10〜25ヌクレオチドの範囲の長さを有する。代表的には、オ リゴヌクレオチド配列は、標的分子についての公知の配列情報に基づいて、目的 の標的配列の、5'末端に関して上流部位に相補的である。オリゴヌクレオチド配 列は、さらに、用いられる配列分析方法に依存して、放出可能なプライマーフラ グメント（例えば、第２の領域）に、放射活性または蛍光タグのような標識を含 み得る。 5'末端および3'末端を有する本発明の修飾プライマーは、一般に、２つの別々 のヌクレオチド領域から構成される。図５Ａに示すように、本発明の１つの実施 態様では、２つの領域は、「Ｘ」で示されるように、切断可能部位により連結さ れる。ヘテロ環塩基、アデニン、チミン、グアニン、およびシトシンは、通常、 記号「Ｂ」により図面中に示される。プライマーの5'末端を含む第１の領域は、 固体支持体への結合のための固定化付着部位「Ｉ」を含む。図５Ａに示される実 施態様では、修飾プライマーは固定化された形態である。固定化部位は、必要に 応じて、指示されるように、スペーサーアームによりプライマーの5'末端から分 離され得る。本発明での使用のためのスペーサーアームは、一般に、６以上の原 子長である。 第１の領域中のヌクレオチドの数は変化するが、代表的には少なくとも約３ヌ クレオチドである。好ましい実施態様では、第１のプライマー領域は、修飾プラ イマーを構成するヌクレオチドのかなりの部分（例えば、代表的には、約３〜20 ヌクレオチド）を含む。示されるように、切断可能領域である「Ｘ」は第２の領 域に第１位の領域を連結する3'−5'ヌクレオチド間切断可能部位である。第２の 領域は、プライマーの3'末端を含み、実行可能な少数のヌクレオチドから構成さ れるが、その数は用いられるプライマーに依存して変化する。好ましくは、第２ の領域は、０〜５ヌクレオチドを含み、そして修飾プライマー中のヌクレオチド の総数は約８〜30の間であり、好ましくは10〜25の間である。修飾プライマーの 3'末端は、酵素的伸長のためのプライミング部位として作用する。 図５Ｂは、ビオチン分子が修飾プライマーの5'末端に連結される、本発明の他 の実施態様を示す。ビオチンは、立体障害を減少するように作用する伸長された スペーサーを介してプライマーの5'末端に結合される。ビオチンは、アビジンお よびストレプトアビジンの両方に高アフィニティーで結合する比較的小さいビタ ミン分子であり、本発明での使用のための固定化付着部位の一例である。ビオチ ン化プライマーは、市販のソースから入手可能であるか、または、当該分野で通 常用いられる方法により、代表的にはカップリングに適切な反応性基を含む機能 化ビオチン試薬を利用して、合成され得る。上記の図５Ａのように、ヌクレオチ ド間切断可能結合は、修飾プライマーの２つの領域を分離する。第２の領域は、 酵素的伸長に適切な3'末端を含み、これは固体支持体への固定化の前または後の いずれかに起こり得る。 図５Ｃは、アビジン機能化固体支持体上での酵素的伸長の前の図５Ｂの修飾プ ライマーの捕獲を示す。本発明の実施態様では、修飾プライマーは、「Ｉ」によ り示されるように、アビジンとビオチンとの間の高アフィニティー相互作用によ り固定化される。 図５Ｄは、本発明の他の実施態様を示し、ここで、修飾プライマーは、ヘテロ 環塩基の１つの置換基として存在する固定化付着部位を介して固体支持体に結合 される。図５Ｄに示されるように、固定化のための部位は、ウラシルの第５位で 置換されたアミノ残基（Dattagupta、1989）であり、そしてより詳細には、5-ア リルアミノ置換基である。アミノ基は、固体支持体への結合前に保護された形態 （例えば、トリフルオロアセタミド）であり得る。示されるように、固体支持体 への固定化は、アミド結合を介してであるが、任意の多くの固定化結合結合が用 いられ得、以下により詳細に記載される。固体支持体へのアミノ残基のカップリ ングは、一般に、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）エステル機能化支持体の ような、活性化された支持体物質を用いることにより行われる。 図５Ｄに示される実施態様では、固定化されたプライマーは分枝または「Ｔ」 型である。上記の実施態様におけるように、修飾プライマーは「Ｘ」により示さ れる切断可能結合によって分離された２つの領域を含む。第１の領域は、上記の ように、プライマーの5'末端および固定化付着部位を含む。図５Ｄに示されるよ うな「Ｔ」型のプライマーの設計を参照すると、一般に、修飾プライマーを構成 しそして配列特異的標的結合を必要とするヌクレオチドの大部分は、矢印により 示される「中心」デオキシリボースの5'に位置する。第２の領域は、酵素的伸長 のためのプライミング部位として作用するプライマーの3'末端を含む。示される 修飾プライマーの例では、標的DNAへのハイブリダイゼーション、および酵素的 伸長、次いで変性および洗浄の後、切断可能部位「Ｘ」の選択的切断は、伸長産 物を伴う修飾プライマーの第２の領域（例えば、伸長セグメント）を放出するが 、配列特異的標的結合に必要とされるヌクレオチドの大部分を含む第１の領域は 固定化されたままである。 図５Ｅは、(Ｘ)により示されるような、末端切断部位を含む修飾プライマーの 例を示す。本発明のこの実施態様では、切断可能結合はリボース部分により示さ れるが、任意の多くの末端切断可能部位が用いられ得る。示されるように、修飾 プライマーは固定化された形態であり、そして切断可能部位の5'に固定化付着部 位を含む。第１の領域は、固定化付着部位およびリボースまでであるがリボース を含まないプライマーの一部を含む。リボース、あるいは切断可能部位は、第２ のプライマー領域を示し、また酵素的伸長のためのプライミング部位としても作 用する。 本発明によるさらなる切断可能部位は、ヌクレアーゼまたはグリコシラーゼの ような酵素により切断可能なヌクレオチドを含む。図11は、第１のプライマー領 域中の制限認識部位および第２のプライマー領域中の切断可能部位を含む切断可 能プライマーの例を示す。図11に見られ得たように、プライマー75は、２つの領 域、制限エンドヌクレアーゼ認識配列73を含む第１の5'領域、および認識配列の 下流または3'に切断可能部位77を含む第２の領域76を含む。好ましくは、制限エ ンドヌクレアーゼ切断可能部位は、プライマーの3'末端から約５ヌクレオチドに または約５ヌクレオチド内に位置する。 本発明の修飾プライマーを切断することにおける使用のための代表的な制限エ ンドヌクレアーゼには、BpmI、BsgI、BseRI、BsmFI、およびFokIが挙げられ、こ れらはすべてスタッガーカットを作成する。BpmIまたはBsgI認識部位を含む修飾 プライマーは、(i)認識配列（それぞれ5'-CTGGAG-3'または5'-GTGCAG-3'）を含 む第１の領域を含み、そして(ii)第２のプライマー領域中に認識配列の最後のヌ クレオチドから16塩基下流に位置する切断可能部位である。BseRIまたはBsmFI認 識部位（それぞれ5'-GAGGAG-3'または5'-GGGAC-3'）を含む修飾プライマーは、 認識配列の最後のヌクレオチドから10塩基下流に位置する切断可能部位を含み、 一方、FokI認識配列（5'-GGATG-3'）を含むプライマーは、認識配列の最後のヌ クレオチドから９塩基下流の切断可能部位を有する。 ここで図11に戻ると、プライマーの第１の領域は２つの別々のドメインを含む 。第１のドメイン73は、上記のように制限エンドヌクレアーゼにより認識可能な 一連の塩基から構成される。第１のプライマー領域の第２のドメイン76は、制限 エンドヌクレアーゼ認識配列の3'にあり、そしてプライマーの酵素的伸長のため のテンプレートとして作用する標的DNA分子81に相補的なヌクレオチドを含む。 第１のプライマー領域の第１のドメイン73は、必要に応じて、標的分子にハイブ リダイズし得る。 プライマー伸長産物79を形成するためにプライマー伸長反応を行った後、以下 により詳細に記載されるように、二本鎖産物は変性され85、そして第１のプライ マー領域内の第１の73および第２の76のドメインの両方に相補的なオリゴヌクレ オチド83を、好ましくは過剰量で、反応混合物に添加する。代表的には、相補的 オリゴヌクレオチド83は、制限酵素認識および切断可能部位での切断をさせるに 十分な、約15〜25ヌクレオチドを含む。好ましくは、制限エンドヌクレアーゼ切 断可能部位は、プライマーの3'末端にまたはその近くにある。 次いで、反応混合物を冷却しそして再アニールする86。相補的オリゴヌクレオ チド83の過剰量が存在するため、プライマー伸長産物のオリゴヌクレオチド相補 物へのハイブリダイゼーションは、87に示すように、好都合である。次いで、制 限エンドヌクレアーゼを89で示されるように混合物に添加し、切断可能部位での 切断を促進して伸長セグメント91，切断可能部位の3'の相補的オリゴヌクレオチ ドの小さなフラグメント93、および切断可能部位の5'のより大きなプライマー／ 相補的オリゴヌクレオチドフラグメント95を放出する。 上記のタイプのプライマーはまた、切断可能部位の下流の固定化付着部位（IA S）を含み、伸長セグメントの固定化を可能にし得る。IASの導入は、(i)修飾プ ライマーへのテンプレートの配列特異的結合、(ii)相補的オリゴヌクレオチド83 へのプライマーの配列特異的結合、(iii)プライマーの酵素的伸長、または(iv) 制限酵素の切断能力に悪い影響を与えるべきではない。一般に、伸長産物を固定 化し洗浄して、放出およびそれに続くサイズ計測およびまたは配列分析の前に、 反応産物（塩、酵素、ヌクレオチドフラグメント、試薬）を除去する。他のアプ ローチは、(i)固定化付着部位を含むプライマーまたは伸長セグメントの使用（ ここで、プライマーを酵素的に伸長しそして二本鎖産物を変性した後、一本鎖プ ライマー伸長産物は、上記のように、固定化付着部位での結合により捕獲され、 次いでテンプレートが除去されそして相補的オリゴヌクレオチド83が添加される ）、あるいは(ii)オリゴヌクレオチド83の添加前で、酵素的伸長の前または後の いずれかに、テンプレートを捕獲するために、固定化付着部位を含むように修飾 テンプレートの使用を包含する。 図11に示されるタイプの種々の切断可能なプライマーは図16に示され、ここで 第１のプライマーは、ヘアピン内に普遍的制限認識部位を含む（Szybalski）。 ここで図16を参照すると、切断可能部位127はクラスIIs制限エンドヌクレアーゼ 切断可能部位であり、ここで二本鎖酵素認識配列129は第１のプライマー領域（ すなわち、切断部位の上流）に位置し、そして第１のプライマー領域は5'ヘアピ ン型（自己相補的二本鎖）ドメインを含む。5'ヘアピンドメイン131は、制限酵 素のための二本鎖認識部位129を含む。第２の（一本鎖）プライマー領域は、(i) 切断可能部位（すなわち、制限エンドヌクレアーゼ切断部位）を含み、そして(i i)一本鎖標的133に相補的なヌクレオチドから構成され、したがって酵素的伸長 のためのプライミング部位として作用する。プライマー（135に示す）の酵素的 伸長の後、産物137は適切なクラスIIS制限エンドヌクレアーゼでの処理により切 断されて139、フラグメント141および143を放出し、その後変性して続く分析（ すなわち質量分析法）のための一本鎖伸長セグメントを放出する。図面に 145で示されるように、テンプレートは、必要に応じて、プロセス中の任意の段 階で固相支持体に結合され得る。 いくつかの例において、切断可能部位は、T7遺伝子6エキソヌクレアーゼ、Exo VIII，RecJ、および脾臓ホスホジエステラーゼIIのような、5'→3'エキソヌクレ アーゼ活性を有する酵素による5'→3'酵素が促進する消化をブロックまたは終結 し得るヌクレオチドである。このような「ブロッキング」ヌクレオチドは、ホス ホロチオエート、ボラノホスフェート、または以下に記載されるようなペプチド 基を含むヌクレオチドを含む。切断可能部位としてブロッキングヌクレオチドを 含む修飾プライマーを利用するプライマー伸長反応において、プライマー伸長反 応後、得られた産物は、(i)ブロッキングヌクレオチドを含む修飾プライマー、 および(ii)5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を有するエキソヌクレアーゼのような ヌクレアーゼで処理される伸長セグメントから成る。ヌクレアーゼ処理は、代表 的には、プライマーの第１の領域の切断を生じて、切断可能部位の下流（すなわ ち3'）のヌクレオチドから構成される伸長セグメントを生成する。 上記の実施態様の例のすべてにおいて、切断可能部位での切断は、修飾プライ マーに元来存在するヌクレオチド塩基がほとんどまたは全く含まれない新しく合 成されたプライマー伸長産物の放出を生じる。 Ｂ．切断可能部位の導入 切断可能部位（修飾ヌクレオチドから構成される）は、代表的には、以下の合 成アプローチの１つを用いることによりオリゴヌクレオチドプローブに導入され る。導入される切断可能部位の選択に依存して、機能化ヌクレオチドまたは修飾 ヌクレオチドダイマーのいずれかが最初に調製され、次いでプライマー合成の経 過中、成長するオリゴヌクレオチドフラグメント中に選択的に導入される。切断 可能部位を含むプライマーは、溶液合成を用いて、または好ましくはDNA合成機 を用いる自動化固相合成条件を用いて調製され得る。 修飾ダイマーの形成において、２つの適切に保護されたヌクレオチドは、互い にカップリングされ、修飾された3'−5'ヌクレオチド間結合を形成する。次いで 、切断可能部位を含むダイマー（またはその保護された形態）は、合成中にオリ ゴ ヌクレオチドプライマーに導入されて、切断可能部位を含む修飾オリゴヌクレオ チドを形成する。切断可能部位は、選択条件下で化学的に切断可能であるが、標 準的な固相DNA合成、固体支持体結合、プライマー伸長、およびハイブリダイゼ ーション条件下で安定である。 あるいは、機能化は単一のヌクレオチド上で行われ、第２のヌクレオチド分子 との反応の際またはプライマー合成中に切断可能部位を形成するために適切な反 応性基を導入する。 機能化はヌクレオチドの塩基または糖内の部位で起こり得るが、代表的には、 修飾は、得られるポリマーのホスホジエステル結合の１つの代わりに特異的切断 可能部位を含むオリゴヌクレオチドプライマーを生じるために行われる。切断可 能部位の修飾または導入に好ましい非ヌクレオチド間位置としては、チミジンの Ｃ(5)およびシトシンのＮ(4)が挙げられる。なぜならこれらの２つの塩基部位は 塩基対合を妨げることなく容易に化学的に操作されるからである。 本発明のオリゴヌクレオチド組成物における使用のためのヌクレオチド間切断 可能部位の多くの例は、図１Ｂ〜１Ｗに示される。図１Ａは、修飾されていない 、もとのままの3,-5-ホスホジエステル結合の実例である。本発明での使用のた めの切断可能部位または結合は、オリゴヌクレオチド配列内の特定の位置に、好 ましくはプライマーの3'末端から約５ヌクレオチドにまたは約５ヌクレオチド以 内に導入され得るものであり、そして固定化付着部位の切断を可能にしない条件 下で選択的に切断される。１つの好ましい実施態様では、切断可能部位はプライ マーの3'末端に位置する。切断可能結合はまた化学的に接近可能である結合であ るべきである。 本発明での使用のための化学的に切断可能なヌクレオチド間結合としては、そ れぞれ図１Ｂ〜１Ｗに示されるような、以下のものが挙げられるが、これらに限 定されない：ジアルコキシシラン、図１Ｂ；β-シアノエーテル、図１Ｃ；5'-デ オキシ-5'-アミノカルバメート、図１Ｄ；3'デオキシ-3'-アミノカルバメート、 図１Ｅ；尿素、図１Ｆ；2'シアノ-3',5'-ホスホジエステル、図１Ｇ；3'-(S)-ホ スホロチオエート、図１Ｈ；5'-(S)-ホスホロチオエート、図１Ｉ；3'-(N)-ホス ホルアミデート、図１Ｊ；5'-(N)-ホスホルアミデート、図１Ｋ；α-アミノアミ ド、図１Ｌ；ビシナルジオール、図１Ｍ；リボヌクレオシド挿入、図１Ｎ；2'- アミノ-3',5'-ホスホジエステル、図１Ｏ；アリル性スルホキシド（allylic sul foxide）、図１Ｐ；エステル、図１Ｑ；シリルエーテル、図１Ｒ；ジチオアセタ ール、図１Ｓ；5'-チオホルマール、図１Ｔ；α-ヒドロキシメチルホスホニック ビスアミド（α-hydroxy-methyl-phosphonic bisamide）、図１Ｕ；アセタール 、図１Ｖ；および3'-チオホルマール、図１Ｗ。他の化学的切断可能結合として は、メチルホスホネートおよびホスホトリエステルが挙げられる。光分解または 熱分解のような非化学的切断方法に適切な切断可能結合としては、ニトロベンジ ルエステル（NBE）、シス-syn チミジンダイマー（Nadjiら、1992）、およびシ クロヘキセンが挙げられる。 図１Ｂ〜１Ｗに示される切断可能結合を含むヌクレオシドダイマーは、当業者 に公知の標準的核酸化学を用いて合成される（Hobbs、1990；Townsendら、1986 ）。あるいは、標準的固相合成における使用のための5'-または3'-反応性基（ま たはその保護された形態）のいずれかを含む修飾ヌクレオシドを直接合成して、 所望の切断可能結合を導入し得る。2'-機能化ヌクレオシドは、代表的には、対 応するリボヌクレオシド開始物質から調製される。図１Ｃに示されるようなヌク レオチド間β-シアノエーテル結合は、適切に保護されたヌクレオシドの5'-(2- シアノアリル)機能化3'-ホスホルアミダイトとの反応により形成され得る。選択 的切断は、β-シアノ置換基の存在により促進される、塩基での処理におけるβ- 脱離反応により行われる。3'-(O)-カルバメートヌクレオシド間結合を含むヌク レオシドダイマーは、対応する3'-アシルクロリドと5'-アミノ-修飾ヌクレオシ ドとの間の反応を包含する任意の多くの合成アプローチにより調製される。ある いは、3'-修飾イソシアネートヌクレオシドが調製され、そして続いて適切に保 護されたヌクレオシドの5'-ヒドロキシルと反応される。5'-(O)-カルバメート切 断可能結合を含むヌクレオシドダイマーは、イミダゾールカルバメート前駆体か ら調製される。 メチルホスホネート結合を含むオリゴヌクレオシドは、標準的ホスホルアミダ イトの代わりに用いられるホスホンアミダイト試薬を用いる固体支持体ベースの 合成を用いて調製される（AgrawalおよびGoodchild、1987）。ホスホトリエステ ルは、塩基性脱ブロッキング条件下では幾分不安定であるが、この切断可能基は 、穏やかな反応条件またはより不安定なアミン保護基を用いることによりオリゴ ヌクレオチド骨格中に導入され得る（Millerら、1971）。トシルクロリドの存在 下でのメタノールまたはエタノールは、ヌクレオシド間ホスフェート基をエステ ル化するために用いられ（Moodyら、1989）；メチルメタンスルホネートはまた メチル化剤として使用され得る（Kooleら、1987）。 修飾オリゴヌクレオチド組成物における使用に好ましい切断可能部位には、ジ アルコキシシラン、リボース、3'-および5'-ホスホルアミデート、ならびに3'- および5'-ホスホロチオエートが挙げられる。 本発明の１つの実施態様では、修飾オリゴヌクレオチドプライマーに含まれる 切断可能部位はジアルコキシシランである（Ogilvieら、1986；Seligerら、1987 ；Cormierら、1988）。ジアルコキシシランヌクレオチド間結合を含むプライマ ーの合成は、実施例１Ａに記載される。ジイソプロピルシリル結合したジヌクレ オシドの調製は実施例１Ａに記載されるが、シリコン上の置換基としての使用の ためのアルキル基は、イソプロピルに限定されず、そして直鎖または分枝アルキ ル基のいずれかであり得る。さらに、シリコン上の２つのアルキル置換基は、ジ イソプロピルシリルの場合のように同一であり得、または異なり得る。種々のジ アルキルシリル化試薬がPetrarch Systems，Bertram，PAから入手可能である。 実施例１Ａに概説された合成アプローチにおいて、反応性3'-0-シリルエーテ ル中間体が最初に調製され、次いで3'-5'-ジイソプロピルシリルヌクレオシド間 架橋基を含むヌクレオシドダイマーを形成する。3'-シリルトリフレート中間体 の形成は、5'-(O)-ジメトキシトリチル(DMT)保護したヌクレオシド（例えば、5' -(O)-DMT-チミジンあるいはN-保護したヌクレオシドN6-ベンゾイル-2'-デオキシ -5'-(O)-DMT-アデノシン、N4-ベンゾイル-2'-デオキシ-5'-(O)-DMT-シチジン、 またはN2-イソブトリル-2'-デオキシ-5'-(O)-DMT-グアノシン）をO-保護したシ ラン試薬と反応させることにより行われる。 実施例１Ａにおいて、保護されたヌクレオシドを、立体障害塩基（sterically hindered base）である2,6-ジ-tert-ブチル-4-メチルピリジンの存在下で、反 応性シランであるビス（トリフルオロメタンスルホニル）ジイソプロピルシラン で処理して、所望の3'-(O)-ジイソピルシリルトリフレート中間体の形成を促進 する。３置換したピリジン試薬のようなかさのある塩基（bulky base）の使用は 、未反応のヌクレオシドのトリフレート中間体との縮合により形成される望まし くない対称ヌクレオシドダイマーの形成を防ぐことを助ける（Sahaら、1993）。 所望の3'-O-シリルエーテル基の導入後、3'-O-ジイソプロピルシリルトリフレ ート中間体は、保護されていないヌクレオシドと反応して、3'(O),5'(O)-ジアル コキシシラン切断可能部位を含む所望のヌクレオシドダイマーを形成する。次い で、保護されたダイマーは、標準的ホスホルアミダイト化学を利用する自動化固 相合成における使用のために、例えば、3'-ヒドロキシルの対応する2-シアノエ チル-N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイトへの変換によりさらに機能化され て、所望のプライマー配列を提供し得る。ジアルコキシシラン部位の選択的切断 は、フッ素イオンでの処理により行われる（CoreyおよびSnider、1972）。 本発明における使用のための別の好ましい選択的切断可能機能性は、ホスホロ チオエートである。3'(S)-ホスホロチオエートまたは5'(S)-ホスホロチオエート ヌクレオチド間結合を含むプライマーの調製は、実施例１Ｂおよび１Ｃにそれぞ れ記載される。本発明の修飾オリゴヌクレオチド組成物によれば、ホスホロチオ エートヌクレオチド間結合は、穏やかな酸化条件下で選択的に切断される（Coss tickら、1989）。 実施例１Ｂに記載されるような3'(S)-ホスホロチオエート切断可能部位を含む プライマーの調製についての１つの合成アプローチでは、保護された3'-チオ置 換ヌクレオシド開始物質（例えば5-O-MMT-3'-S-ベンゾイル-3'-チミジン（Cosst ickら、1988））は、塩基での処理により最初に脱保護されて、脱ベンゾイル化 したチオールである5'-(O)-MMT-3'-チオチミジンを形成し、次いで2-シアノエチ ル-N,N-ジイソプロピルアミノホスホルモノクロリダイトとの反応により対応す る反応性チオホスホルアミダイトに変換される。反応性チオホスホルアミダイト は、第２のヌクレオシド分子にカップリングして、対応するチオホスファイトダ イマーを形成し、次いでリン中心（phosphorus center）の酸化により完全に保 護された3'-(S)-ホスホロチオエート結合したダイマーを形成する。 3'-O-アセチルチミジンのような第２のヌクレオシド分子へのチオホスホルア ミダイトのカップリングを促進しそして望ましくない自己縮合副反応を防ぐため に、酸性活性化試薬である5-(パラニトロフェニル)テトラゾールが用いられる。 チオホスファイトダイマーは、テトラブチルアンモニウムオキソンまたは過ヨウ 素酸テトラブチルアンモニウムのような適切な酸化剤で酸化されて、所望のヌク レオシド間結合の保護された形態を含む完全に保護された（P-(O)-2-シアノエチ ル-3'-アセチル）ダイマーを形成する。脱保護は、実施例１Ｂに記載の標準的条 件下で容易に行われる。上述のように、3'-(S)ホスホロチオエート切断可能結合 を含むヌクレオシドダイマーは、標準的固相ホスホルアミダイト化学を用いてオ リゴヌクレオチドプライマー中に容易に組み込まれ得る。 あるいは、反応性チオホスホルアミダイトを直接使用して、固相合成の間のオ リゴヌクレオチドプライマーに所望の3'-(S)-ホスホロチオエート結合を導入し 得る。制御された細孔ガラス上での固相合成の間の3'-(S)-チオホスホロアミダ イトを含む機能化ヌクレオシドの導入のために、チオ修飾ヌクレオシドを導入す るためのカップリングサイクルの間、5-(パラニトロフェニル)テトラゾールで飽 和されたアセトニトリルに溶解された、チオ修飾ヌクレオシドは、固体支持体を 含むカラム中に注入され、そしてカップリング効率はトリチルカチオンの放出に よりモニターされる。 本発明による所望の固定化された切断可能なプライマーを調製し、そして所望 のハイブリダイゼーションおよびプライマー伸長反応を行った後、ホスホロチオ エートヌクレオチド間部位は、水性硝酸銀のような穏やかな酸化剤での処理によ り切断される。 対応する5'-(S)ホスホロチオエート修飾オリゴヌクレオチドの調製は、3'-(S) -ホスホロチオエートについての上記の調製とは幾分異なる様式で行われ、実施 例１(Ｃ)に詳細に記載される。このアプローチは、固相オリゴヌクレオチド合成 の間の所望の5'-(S)-ホスホロチオエート切断可能結合の導入のために、重要な5 -チオ修飾ヌクレオシド中間体を使用する（Magら、1991；Sproatら、1987）。 保護された5'-チオ基を含むヌクレオシドビルディングブロックの合成は、ト シルクロリドでの処理によりチミジンの5'-トシレートを最初に調製し、次いで5 '-トシレートの5'-(S-トリチル)-メルカプト-5'-デオキシチミジンへ転換するこ とにより行われる。5'-トシルチミジンは、５倍過剰のトリチオレートナトリウ ムでの処理により5'-(S-トリチル)-メルカプト-5'-デオキシチミジンへ変換され 、これはトリチルメルカプタンの水酸化ナトリウムでの脱プロトン化によりイン サイチュで調製される。上記の合成工程において、硫黄原子はヌクレオシドの5' 位に導入されて、所望の重要な中間体のS-トリチル前駆体を形成する。テトラゾ ールの存在下の2-シアノエトキシ-ビス-(N,N-ジイソプロピルアミノ)ホスフィン での3'位の続いての亜リン酸化（phosphitylation）により、所望の機能化ヌク レオシドである5'-(S-トリチル)-メルカプト-5'-デオキシチミジン-3'-O-(2-シ アノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノ)ホスファイトを生じる。 5'-(S)-保護されたヌクレオシド中間体は、脱保護されたポリマー結合オリゴ ヌクレオチドに最初にカップリングすることにより、標準的固相ホスホルアミダ イト化学を用いて、オリゴヌクレオチドプライマー中に導入される。次いで、ホ スファイト結合は水性Ｉ2で酸化され、そしてS-トリチル基は硝酸銀で切断され そしてジチオスレイトールで還元されて反応性チオールを形成する。次いで、チ オールは、2'-デオキシヌクレオシド-3'-ホスホルアミダイトにカップリングさ れ、次いでチオホスファイト結合を酸化して所望の5'-ホスホロチオエート切断 可能部位を生じる。 ホスホロチオエート部位の選択切断はまた、硝酸銀（AgNO3）または塩化水銀( HgCl2)のいずれかの水溶液での処理により行われ得る。 本発明の修飾オリゴヌクレオチド組成物における切断可能部位としての使用の ための他の機能はホスホルアミデートである。ホスホルアミデートヌクレオチド 間結合を有するオリゴヌクレオチドは、標準的な固相DNA合成により化学的に調 製され得る（Bannwarth、1988）。5'(N)-ホスホルアミデートヌクレオチド間結 合を含むプライマーの調製は実施例１Ｄに記載される。実施例１Ｄに記載の合成 アプローチにおいて、5'-アミノ修飾ヌクレオシドは、市販で購入されるかまた は5'-ヒドロキシ基の対応するアジドへの変換、次いでパラジウム／炭素触媒上 での還元により合成される（Yamamotoら、1980）かのいずれかである。 次いで、5'-アミノ基は、4-メトキシトリチルクロリドでの処理、次いでビス( ジイソプロピルアンモニウム)テトラゾリドおよび(2-シアノエトキシ)ビス(ジ イソプロピルアミノ)ホスフィンとの反応により保護されて、対応する3'-(2-シ アノエチル)-N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト機能化ヌクレオシドを形成 する。5'-保護されたアミノ機能を含むこの反応性ヌクレオシドは、次いで、ホ スホルアミダイト化学を利用する標準的固相DNA合成の間にオリゴヌクレオチド フラグメントヘ選択的に導入されて、所望の5'-ホスホルアミデート結合を形成 する。ホスホルアミデート結合の選択切断は、80％酢酸での処理のような穏やか な酸性条件下で行われる。ホスホルアミデート結合は、デオキシリボ族よりもリ ボ族においてより不安定である（Tomaszら、1981）。 本発明のオリゴヌクレオチド組成物における切断可能部位としての使用のため の別の機能は、リボースである。切断可能なリボースを含む修飾プライマーは、 実施例３〜５に記載される。適切なO-保護基を含むリボースは、標準的ホスホル アミダイト化学を用いて自動化固相合成の間に成長するオリゴマーフラグメント 中に選択的に導入される。選択的切断は、実施例３および５に記載のように、希 水酸化アンモニウムでの処理により行われる。 Ｃ．固体支持体への付着 本発明の１つの局面によれば、オリゴヌクレオチドプライマーは、(i)プライ マーをその3'末端から伸長する能力をブロックしない様式で、固体支持体への付 着のために設計され得、そして(ii)（伸長産物へ連結された）プライマーの3'部 分が必要に応じて固定化された5'部分から放出され得るように切断可能部分に組 み込まれる。 本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、好ましくは、介在スペーサーアー ムを介して直接、または固体支持体に結合される媒介オリゴヌクレオチド（SPBI O）への特異的ハイブリダイゼーションによるかのいずれかで、固体支持物質へ の結合のために設計される。固定化は、切断可能部位の上流（すなわち、5'）ま たは下流（すなわち、3'）の位置で生じ得る。 固相への付着はまた、(i)酵素的伸長反応から生じる核酸伸長セグメント内に 含まれるか、または(ii)標的核酸内に含まれる付着部位を介して行われ得る。 固定化付着部位は、図２Ａ〜２Ｋおよび図２Ｍに示す代表的な官能基のような 、固体支持体への共有結合のための選択官能基であり得る。固定化付着部位はま た、 固体支持体との高アフィニティー非共有相互作用を介する付着のための、ビオチ ンのようなリガンドであり得る。 さらに、固定化付着部位はまた、図８および９に示されるように、固体支持体 に結合される媒介オリゴヌクレオチドに相補的な一連の塩基から構成され得る。 ここで図８を参照すれば、上記のような切断可能部位17を有するプライマー15 は、(i)標的がプライマーに安定にアニールする条件を利用して、一本鎖の標的D NA配列21にハイブリダイズされ、そして(ii)酵素的に伸長されて伸長セグメント 19を形成する。次いで、伸長産物は、固体支持体23に結合される媒介オリゴヌク レオチドに曝される。媒介オリゴヌクレオチドは、プライマーの全部または少な くとも第１の領域に相補的である。 図８に示される実施態様においては、媒介オリゴヌクレオチドの配列は、標的 分子21の少なくとも一部と相同であり、そのため、媒介オリゴヌクレオチドおよ び標的の両方とも、プライマーのオーバーラップ領域へのハイブリダイズに競合 している。伸長産物の配列が公知である例において、媒介オリゴヌクレオチドの 配列は、プライマーよりもむしろ伸長セグメントの一部に、またはプライマーお よび伸長セグメントの両方の部分を含む領域に相補的であるように設計され得る 。 固定化のためのこのアプローチの使用において、媒介オリゴヌクレオチドに比 較して標的分子の濃度は、プライマー伸長産物の媒介オリゴヌクレオチドへのハ イブリダイゼーションを好都合にするために、好ましくは低下される。テンプレ ートは伸長産物の全長にハイブリダイズし得るので、テンプレートへの伸長産物 のハイブリダイゼーションは、熱動力学的に好都合である。標的核酸の濃度は、 プライマー伸長産物をインタクトなままにしておく特異的な化学的または酵素的 消化を含む多くの方法により低下され得る。 テンプレートの選択的消化は、以下を含む多くの方法のいずれかによって行わ れ得る：(i)デオキシウリジン含有テンプレートの使用；(ii)DNA伸長産物を提供 するためのRNAテンプレートの使用；(iii)修飾ヌクレオシド間結合を含むテンプ レートの使用；または(iv)テンプレートのエキソヌクレアーゼで促進された消化 。それぞれは、以下にさらに詳細に記載される。 第１のアプローチの利用において、デオキシチミジンの代わりにデオキシウリ ジンを含むように部位選択的に修飾されている核酸フラグメント（Longoら、199 0）が、プライマー伸長反応のためのテンプレートとして使用される。酵素的伸 長の後、テンプレート含有反応混合物は、デオキシウリジンを含むように修飾さ れた位置でテンプレート分子をフラグメントにするために、ウラシルDNAグリコ シラーゼ（Amersham Life Sciences，Arlington Heights，IL）で処理される。 ウラシルDNAグリコシラーゼは、ウラシル塩基と糖リン酸塩骨格との間のN-グリ コシド結合を切断することにより、dU含有DNAからデオキシウラシルを切除する 。 第２のアプローチでは、RNAテンプレートは、DNA伸長産物を提供するために使 用される。次いで、テンプレートはRNaseAのようなRNaseを用いる消化により選 択的に除去される。 あるいは、上記の(iii)に示すように、ホスホルアミデートまたはホスホロチ オエートのような修飾されたヌクレオシド間結合を含むテンプレート分子が使用 される。プライマーの伸長後、テンプレートは、修飾された結合位置での化学的 に促進された切断により消化される。テンプレートを修飾したヌクレオシド間結 合およびテンプレート消化試薬の選択は、プライマー中に存在する切断可能部位 の型に依存する。テンプレートの消化は、代表的には、プライマー切断可能部位 をインタクトなままにしておく条件下で行われる。ホスホロチオエート結合（5' -(O)-P(S)O2）の切断は、グリシドールまたはヨードエタノール（Olsen）での処 理により行われ得るが、一方、ホスホルアミデート結合の選択的切断は、代表的 には、80％酢酸での処理によるような、穏やかな酸性条件下で行われる。 （上記の(iv)により示されるように）テンプレートのエキソヌクレアーゼで促 進された消化を利用することにおいて、プライマー伸長産物は、既に述べたよう に、適切なエキソヌクレアーゼ耐性ブロッキング基を含むように修飾される。次 いで、3'→5'特異的または5'→3'特異的エキソヌクレアーゼのいずれかでのエキ ソヌクレアーゼ処理の際、「保護された」プライマー伸長産物は、ブロッキング 基の存在のためにインタクトなままである。3'→5'エキソヌクレアーゼ（例えば 、ヘビ毒液のホスホジエステラーゼまたはエキソヌクレアーゼIII）の利用にお いて、適切なブロッキング基が伸長産物の3'末端に配置されて酵素で促進される 分解を防ぐ。 固体に結合した媒介オリゴヌクレオチドに対するテンプレートの相対濃度はま た、例えば、(i)限定された量のテンプレートを用いてサイクル合成手順（例え ば、サイクル配列決定または鎖置換増幅）を行うことによって、または(ii)大過 剰量（例えば、10〜100倍）の媒介オリゴヌクレオチドを反応混合物に添加する ことによって最小にされ得る。 ここで図８に戻ると、固相に結合した媒介オリゴヌクレオチドへのプライマー 伸長産物のハイブリダイゼーションを好都合にする条件下で、プライマー伸長産 物は、固相に結合した媒介オリゴヌクレオチド23へのハイブリダイゼーションに より固定化されて25、捕獲された産物27および遊離物（すなわち、一本鎖テンプ レート）を形成する。固相結合媒介オリゴヌクレオチドの5'末端は、修飾プライ マーの切断可能部位の前または後で終結し得る。上記のような固定化の後、過剰 の反応産物は、洗浄29により除去されて、精製された固定化産物31を提供する。 固定化産物は切断されて33、続く分析のために伸長セグメント35を放出する。 本発明によれば、媒介固相結合オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーショ ンによる切断可能な伸長プライマーの固定化は、実施例６に記載される。 簡単にいえば、5'-(S)-チミジン切断可能基を含む修飾M13逆方向プライマー（ 配列番号12）を、(i)一本鎖標的にハイブリダイズし、そして(ii)ジデオキシチ ミジンの存在下で酵素的に伸長して、プライマー対テンプレートの8:1の比で１ セットのジデオキシチミジンで終結した伸長フラグメントを生成した。次いで、 一本鎖伸長産物を、M13逆方向プライマーに相補的な媒介オリゴヌクレオチド（ 配列番号13）にアニールさせ、そして3'末端でビオチン化した。次いで、伸長産 物-媒介オリゴヌクレオチドハイブリッドを、ストレプトアビジンでコートした 磁性ビーズの添加により固定化し、洗浄し、そして伸長産物を、5'-(S)-チミジ ン切断可能基の硝酸銀で促進された切断により放出した。伸長セグメントを、図 13に示すように、MALDI飛行時間型質量分析法により分析した。見られ得るよう に、少なくとも約33塩基対までの読みの長さを有する伸長セグメントは、良好な 分解能で検出され得る。 上記のアプローチの変形において、図９に示すように、プライマー39は、固体 支持体に結合した媒介オリゴヌクレオチドに相補的な一連の塩基から構成される 第１のプライマー領域に含まれる固定化付着部位38を含むように設計される。し かし、この実施態様において、媒介オリゴヌクレオチドは、テンプレート分子45 と相同性を共有せず、そのため、媒介オリゴヌクレオチドおよびテンプレートは 、プライマーへのハイブリダイゼーションについて互いに競合しない。図９に示 すように、伸長セグメント43を形成するための酵素的伸長の後、プライマーは、 固相に結合した媒介オリゴヌクレオチド37への特異的なハイブリダイゼーション により固定化される。プライマー、テンプレート、および媒介オリゴヌクレオチ ドのこの設計は、テンプレートおよび媒介オリゴヌクレオチドの両方へのプライ マーの同時の非競合ハイブリダイゼーションを可能にする。固相結合伸長産物を 洗浄し、そしてテンプレートを排除して47、精製された固定化産物49を提供し、 次いで、切断可能部位41で切断して51，先の図８についての記載のように、続く サイズおよび／または配列分析のために伸長セグメント53を放出する。 あるいは、本発明のプライマーは、図10に示すように、固定化される標的核酸 へのハイブリダイゼーションを介して固相に結合され得る。このアプローチの利 用において、標的分子61は、プライマー55の酵素的伸長のためのテンプレート、 およびプライマーの固相結合のための媒介の両方として作用する。テンプレート は、プライマーの酵素的伸長を行う前または後のいずれかに固相に付着されて、 伸長したプライマーセグメント59を形成し得る。記載されているように、プライ マー伸長産物の固定化は、過剰の酵素、塩類などの迅速な除去を可能にして63、 精製された固定化プライマー伸長産物65を提供する。分析の前に、伸長したプラ イマーはテンプレート67から変性され、そして溶液中に放出される。切断可能部 位57での切断は、伸長セグメント71および第１のプライマー領域から構成される フラグメント69の放出を促進する。プライマーの設計および産物の分析の様式に 依存して、プライマーフラグメント69の存在は、続く産物の分析の質に不都合な 影響を与え得る。これらの場合には、上記のようなテンプレートを排除するため に使用される同様の方法が、フラグメント69を排除するために使用され得る。伸 長セグメントが質量分析法によりサイズ計測される場合に、いくつかの場合にお いて、フラグメント69の質量は、得られる質量スペクトルにおける産物ピーク との干渉を避けるように選択され得、そして内部質量標準を提供するようにも使 用され得る。 固体支持体への固定化付着部位の付着の際、得られる固定化結合は、一般的に 、切断可能部位を切断するために用いられる条件下で安定なままであり、そして 塩基対ハイブリダイゼーションを阻害せず、3'末端からプライマーを伸長する能 力もブロックしない結合である。 本発明の修飾プライマーにおいて、固定化付着部位は、代表的には、少なくと も３ヌクレオチドで切断可能部位から隔てられる。好ましい実施態様では、切断 可能部位の選択的切断の際、大部分のプライマーフラグメントは固体支持体に取 り付けられたままである。これは、代表的にはプライマー配列のうちの約５また はそれより少ない塩基対を含むプライマー伸長産物の放出を可能にして、プライ マー全体を含む伸長産物よりもフラグメントについてのより有用な配列情報を提 供する。 本発明の修飾プライマーは、例えば、野生型および変異対立遺伝子の両方のヌ クレオチド配列が公知である遺伝子障害を検出するために使用され得る。この目 的のための修飾プライマーは、5'末端および3'末端を有し、そして公知の変異部 位から上流の遺伝子配列に相補的な約８〜30塩基対を含む。好ましくは、プライ マーの3'末端は、少なくとも約10塩基対による公知の変異領域から上流の部位に 相補的であり、変異領域のいずれかの側について確認されている配列情報を提供 する。 本発明の１つの局面によれば、修飾プライマーはまた、(i)固体支持体への付 着のための固定化部位および(ii)切断可能部位を含む。本発明による１つのプラ イマー設計は、固定化部位が、好ましくはプライマーの3'末端から約５塩基対に または約５塩基対以内に位置する切断可能部位の5'に位置する設計である。 次いで、この修飾プライマーは、目的の変異配列を含むDNAの存在を区別する ためのプローブとして使用される。プライマーは、(i)変異および正常配列の両 方がプライマーに安定にアニールする条件を利用して、未知の一本鎖標的DNA配 列にハイブリダイズし、そして(ii)酵素的に伸長される。プライマー固定化は、 必要に応じて、鎖伸長の前または後のいずれかで起こり得る。切断可能結合の選 択的切断による固定化されたプライマー伸長産物の鎖伸長および放出の後、プラ イマー伸長産物を分析して、存在するならば、公知の変異領域にわたる配列およ び遺伝子障害の同定を決定する。 20デオキシヌクレオチド残基を含み、そして公知の遺伝的障害を検出する能力 に特異的な修飾プライマーの例が、図６Ａおよび６Ｂに示される。示されるよう に、修飾プライマーは、固定化付着部位「Ｉ」を含む第１の領域を含み、これは 切断可能部位「Ｘ」の5'であり、そして全16ヌクレオチド残基からなる。第２の 領域はプライマーの3'末端を含み、そして４ヌクレオチド（C-T-G-C）を含む。 切断可能結合Ｘは第１および第２の領域を連結する。 本発明のこの局面を説明すると、図６Ａ（上）に示されるようなそして配列番 号２として示される配列を有する修飾プライマーは、最初に、図６Ａに示される ような配列番号３として示される配列を有する一本鎖DNA標的にハイブリダイズ される。代表的には、ハイブリダイゼーション培地は、(i)ヒトまたは他の生物 学的供給源由来の変性された未知の（標的）DNA、(ii)修飾プローブ、および(ii i)5X「SEQUENASE」緩衝液（200mM Tris-HCl，pH7.5、100mM MgCl2、250mM NaCl ）（United States Biochemical Corporation、Cleveland，OH）のようなアニー リング緩衝液を含む。アニーリング反応は、上記の混合物を65℃で２分間加温し 、次いでこの混合物を約30分間かけて室温までゆっくりと冷却させることにより 行われる（Maniatisら、1982；Ausubelら、1989）。 ハイブリダイゼーションの後、修飾プライマーは、デオキシヌクレオチドとと もに一本鎖テンプレート上で伸長され、そしてDNAポリメラーゼ（例えば、「SEQ UENASE」DNAポリメラーゼ、バージョン1.0または2.0）を用いてジデオキシヌク レオシドでランダムに終結されて、DNA合成を行う（Primingsら、1980；Sanger 、1975）。図６Ａに示すように、伸長は修飾プライマーの3'末端から生じる。プ ライマー伸長産物は、代表的には、熱またはホルムアミドのような化学変性剤を 用いて、標的から変性されて、プライマー伸長産物および標的DNAの両方の混合 物を提供する。（例えば、「PROTOCOLS FOR DNA SEQUENCING WITH SEQUENASE T7 DNA POLYMERASE」、バージョン1.0または2.0、第４版、United States Biochem ical、または「CIRCUMVENT Thermal Cycle Dideoxy DNA Sequencing Kit Instru ct ion Manual」、New England Biolabs，Inc.，Beverly MAを参照のこと）。 次いで、図6Bに示すように、プライマー伸長産物は、固定化付着部位で固体支 持体に結合されるが、固定化は、必要に応じて、酵素的伸長および／または変性 の前に行われ得る。伸長されたプライマーを固定化することにより、溶液中で遊 離のままである標的DNA鎖は、一連の洗浄工程において、過剰の試薬、イオン、 酵素などとともに容易に除去される。一般的に、固体基質は大容量の洗浄溶液（ 例えば、10mM TrisHCl、1mM EDTA；または純水）で室温にて洗浄される。 次いで、固定化されたプライマー伸長産物を含みそして不純物を含まない固体 粒子は、図6Bに示される固体支持体に取り付けられた配列番号４として示される 配列を有する第１のプライマー領域を維持しながら切断可能部位を選択的に切断 するために効果的な条件に供される。図6Bに示される特定の実施態様で示される ように、選択的切断は、元来の修飾プライマー由来の４ヌクレオチドのみを含む プライマー伸長産物の放出を生じる。放出された伸長セグメントを含む上清は、 続く分析に適切である。 固定化は、続く分析のためのプライマー伸長産物の精製を単純にする。上述の ように、望ましくない酵素、塩類、試薬、および配列決定標的は、伸長産物の選 択的切断の前に洗い流される。 本発明の修飾プライマーの固定化において、プライマーの第１の領域は、切断 可能部位の導入の前または後のいずれかに固体支持物質に付着され得る。当該分 野で通常用いられる多くの方法のいずれかが利用されて、固体支持体上にオリゴ ヌクレオチドを固定化し得る（Saikiら、1989；Zhangら、1991；Kremskyら、198 7；Van Nessら、1991；Ghoshら、1987；Gingerasら、1987；Khrapkoら、1991） 。本発明における使用のための固体支持物質としては、セルロース、ニトロセル ロース、ナイロン膜、制御された細孔ガラスビーズ、アクリルアミドゲル、ポリ スチレンマトリクス、活性化デキストラン、アビジン／ストレプトアビジンでコ ートしたポリスチレンビーズ、アガロース、ポリエチレン、機能化プラスチック 、ガラス、シリコン、アルミニウム、スチール、鉄、銅、ニッケル、銀、および 金が挙げられる。 いくつかの基質は、オリゴヌクレオチドの付着の前に機能化を必要とし得る。 このような表面修飾を必要とし得る固体基質としては、アルミニウム、スチール 、鉄、銅、ニッケル、金、およびシリコンが挙げられる。１つのアプローチにお いては、固体基質物質は、ジルコアルミネートのようなカップリング剤との反応 により機能化される。 ジルコアルミネートは、一般的に、オキソおよびヒドロキシの両方の架橋を含 み、そして高熱および加水分解安定性により特徴づけられる。このような化合物 は、その非常に金属性の性質のため、上記の金属性固体支持体のような金属表面 と特に反応性である。種々の有機官能基を含む二官能性ジルコアルミネートが市 & Specialty Polymers，Cranbury，NJ）。 固体支持体への付着の際、オリゴヌクレオチド、代表的にはDNAは、固体支持 物質に効率的にカップリングすべきである。さらに、固定化DNAは、固定化に際 して安定であって、そして塩基ハイブリダイゼーションおよび他の潜在的な誘導 体化反応を行い易いDNAの両方であるべきである。固定化付着部位は、本発明の 修飾オリゴヌクレオチド組成物における切断可能部位を選択的に切断するために 用いられる条件下で、安定なままであるべきである。 オリゴヌクレオチドの固体支持体へのカップリングは、種々の固定化付着官能 基を介して行われ得る。本発明における使用のための固定化付着部位には、図2A 〜2Mに示される部位が含まれる。オリゴヌクレオチドへの支持物質の付着は、支 持体上の反応性部位とオリゴヌクレオチド内に含まれる反応性部位との間の反応 によって、あるいは介在リンカーまたはスペーサー分子を介して起こり得る。 上記の所望の基準を満たす何らかの適切な官能基が、支持体にオリゴヌクレオ チドを付着するために使用され得るが、好ましい結合としては、ジスルフィド（ 図2G）、カルバメート（図2B）、ヒドラゾン（図2J）、エステル（図2C、2I、お よび2K、ここでＹは酸素に匹敵する）、(N)-機能化チオ尿素（図2D）、機能化マ レイミド（図2A、ここでＹは硫黄、酸素、または窒素に匹敵する）、ストレプト アビジンまたはアビジン／ビオチン（図2L）、水銀硫化物（図2E）、金硫化物（ 図2M）、アミド（図2C、2I、および2K、ここでＹは窒素に匹敵する）、チオール エーテル（図2C、2I、および2K、ここでＹは硫黄に匹敵する）が挙げられる。 固体支持物質への付着のための他の適切な機能化としては、アゾ、エーテル、お よびアミノが挙げられる。 固定化付着部位は、(i)修飾プライマー骨格に沿った置換基として（例えば、 末端5'-ヒドロキシル位で起こる誘導体化）、(ii)修飾プライマーの塩基または 糖の１つの置換基として、(iii)固相結合媒介オリゴヌクレオチドに相補的な一 連の塩基から構成される、プライマーの第１の領域内に、(iv)酵素的伸長反応か ら得られる核酸伸長セグメント内に、または(v)標的核酸内に含まれて、位置し 得る。 プライマーと固相結合媒介オリゴヌクレオチド（SPBIO）との間の塩基対相互 作用による固定化が、図８および９に示される。固相結合テンプレートへの塩基 対相互作用を介したプライマー伸長産物の間接的固定化が、図10に示される。 オリゴヌクレオチドへのカップリングに使用するための固体支持物質としては 、Pierce（Rockford，IL）から入手可能な1,1'-カルボニルジイミダゾール活性 化支持体のような機能化された支持体、またはChiron Corp．（Emeryville，CA ）から市販されているような機能化された支持体が挙げられる。本発明における 使用のための固体支持体としては、６％架橋されたアガロース、Trisacryl GF-2 000（親水性マトリクス物質）、およびTSK HW-65Fのようなマトリクス物質が挙 げられ、これらはすべて1,1'-カルボニルジイミダゾール（Pierce）で活性化さ れている。固定化は、代表的には、アミノ修飾オリゴヌクレオチドの遊離のアミ ノ基を、固体支持体の反応性イミダゾールカルバメートと反応させることにより 行われる。イミダゾール基の置き換えは、オリゴヌクレオチドと図2Bに示すよう な支持体との間の安定なN-アルキルカルバメート結合の形成を生じる。カップリ ングは、通常、９〜11の範囲のpHで行われるが、9.5〜10の範囲のpHが好ましい 。pH感受性物質へのカップリングは、8.5付近のpHで緩衝液中で行われ得る。 固体支持体への付着に使用するためのアミノ修飾オリゴヌクレオチドは、例え ば、修飾されたヌクレオシドホスホルアミダイトAmino-Modifier-dT（Glen Rese arch，Sterling VA）を用いて標準的固相DNA合成方法論を使用して合成され得る 。 Amino-Modifier-dTは、10原子スペーサーアームのホスホルアミダイト5'-Ami no-Modifier C6（Glen Research，Sterling VA）を介してチミジンに付着した１ 級 アミンを保護する塩基不安定性トリフルオロアセチル基を含み、5'-Amino-Modif ier C6は、酸不安定性モノメトキシトリチル基、またはN-トリフルオロアセチル -6-アミノヘキシル-2-シアノエチルN',N'-イソプロピルホスホルアミダイト（Ap plied Biosystems，Foster City，CA）で保護された１級アミノ基を含む。アミ ノ含有オリゴヌクレオチドは、最も通常にはホスホルアミダイト化学を用いて調 製されるが、１級アミン基を含むオリゴヌクレオチドを導く任意の他の方法もま た使用され得る。 アミノ修飾オリゴヌクレオチドは、アミノ以外の5'-機能化を必要とする固定 化またはスペーサーアーム付着反応における使用のための、対応するチオールま たはカルボキシル終結誘導体に、容易に変化される。アミノ修飾オリゴヌクレオ チドは、無水コハク酸との反応により対応するカルボキシル誘導体に変換され得 る（Bischoffら、1987）。所望であれば、カルボキシル誘導体化プライマーは、 水溶性カルボジイミドのような活性化剤の存在下でカップリング反応を行うこと による固体支持体への付着の前に、1,6-ジアミノヘキサンのような二官能性リン カーにカップリングされ得る。 チオール修飾オリゴヌクレオチドは、ジチオビス（スクシンイミジルプリオピ オネート）で、機能化されたオリゴヌクレオチドの脱保護された5'-アミノ基を 処理することにより、次いでジチオエリスリトールでのスルフヒドリル脱保護に より調製され得る（Bischoffら、1987）。 遊離のアミノ、チオール、およびヒドロキシル機能を含むオリゴヌクレオチド はまた、エポキシド開環反応を利用することにより支持体にカップリングされ得 る（Maskosら、1992）。このようなエポキシ活性化固体支持体の１例は、Pierce （Rockford、IL）から入手可能であり、1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテ ルで活性化したアガロースを含む。カップリング反応は、代表的には、固定化さ れるべき分子の安定性に依存して、7.5〜13のpHで行われる。上記のPierceの支 持体で行われる固定化反応において、得られる固定化オリゴヌクレオチドは、13 原子の親水性スペーサーアームにより固体支持体から分離される。 別の固定化アプローチでは、修飾オリゴヌクレオチドのアルデヒド基は、図2J に示すような固体マトリクス上のヒドラジド基にカップリングされる。オリゴヌ クレオチド上の１級ヒドロキシル基は、最初に、代表的には過ヨウ素酸ナトリウ ムのような穏やかな酸化剤で、対応するアルデヒドに酸化される。次いで、オリ ゴヌクレオチドは、PierceのCarboLinkTM Hydrazideのようなヒドラジド含有マ トリクスにカップリングされる。カップリング反応は中性pHで行われる。 あるいは、固定化反応は、PierceのImmobilized p-Chloromercuribennzoate（ 図2E）のような機能化されたマトリクスにカップリングされるチオール誘導体化 オリゴヌクレオチドを使用して行われる。支持体は、エチレンジアミンスペーサ ーを含む架橋アガロースであり、そしてカップリングは水銀と硫黄原子との間の アフィニティー結合を介して行われる。同様に、図2Mに示すように、固定化は、 5'-チオレート化されたプライマーを金表面に繋ぐことによって行われ得る（Heg nerら、1993a）。このアプローチを用いて、修飾プライマーは、チオレート結合 を介して金表面（例えば、固体支持体）上に化学吸着される。多結晶性金表面の 調製は、既に記載されている（Hegnerら、1993b）。 機能化はまた、PierceのSulfo-SMCCのような、ホモ-またはヘテロ-二官能性架 橋リンカーを使用して行われ得る。本発明における使用のための架橋リンカーは 、代表的には、約３〜20オングストロームの間の長さのスペーサーアームを含む 。オリゴヌクレオチドの固体支持体へのカップリングに使用するための架橋リン カーは、代表的には、反応性の１級アミン、スルフヒドリル、カルボニル、およ びカルボキシルを標的するための官能基を含む。１級アミノ基との反応のための 架橋剤は、代表的には、末端アミドエステル基またはN-ヒドロキシスクシンイミ ジルエステルを含む。PierceのSulfo-SMCCのようなリンカーの例は、ヘキシルア ミンで誘導体化したポリスチレンビーズのようなアミン誘導体化固体支持体への カップリングのために、一方の末端に反応性カルボキシル基を含む。リンカー分 子の他の末端は、ヒドロキシ、チオ、またはアミノのような求核基を含むオリゴ ヌクレオチドと容易に反応する反応性マレイミド分子を含む。スルフヒドリル基 との反応のための架橋リンカーは、代表的には、末端マレイミド基、アルキルあ るいはアリールハライド、α-ハロアシル、またはピリジルジスルフィドを含む 。種々の化学的架橋剤がPierce（Rockford、IL）から入手可能である。 あるいは、Pierceから入手可能のもののようなコートされたプレートが、修飾 オリゴヌクレオチドを固定化するために使用され得る。本発明のオリゴヌクレオ チドの固定化における使用のためのプレートの例として、PierceのReacti-BindT M Maleic Anhydride Activated Polystyrene PlatesおよびReacti-BindTM Strep tavidin Coated Polystyrene Platesのような活性化プレートが挙げられる。１ 級アミノ含有オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの遊離アミノ基と反応 性無水物との間の反応により形成される、安定なアミド結合を介しての共有的な 付着によって、前者のプレート表面上に固定化される（図2H）。後者のプレート はビオチン化オリゴヌクレオチドのアフィニティー結合に効果的である。金でコ ートされたプレートはまた、チオール誘導体化したプライマーへの結合に利用さ れ得る。 ストレプトアビジンまたはアビジンでコートされた固体支持体への固定化にお ける使用のためのビオチン化オリゴヌクレオチドは、実施例2Aに記載され、そし て図2Lに示されるように調製される。種々のビオチン化試薬は市販されており（ 例えば、Pierce）、これは、機能化されて、１級アミノ、スルフヒドリル、また はカルボヒドレート基を含む修飾オリゴヌクレオチドのような分子と反応する。 実施例2Aに戻ると、アミノ修飾プライマーは、ビオチンでまたは介在スペーサ ーアームを含むビオチンの修飾された形態（例えば、NHS-SS-Biotin（Pierce） またはNHS-LC-Biotin(Pierce)）で処理され、ビオチン誘導体は、ビオチンと末 端N-ヒドロキシルスクシンイミドで活性化したカルボキシル基との間の11炭素ス ペーサーアームを含む。次いで、ビオチン化プライマーは、ストレプトアビジン でコートされた支持体への付着によって固定化される。強力な非共有ビオチン／ ストレプトアビジン相互作用のために、固定化されたプライマーは、固体支持体 に本質的に不可逆的に結合されると考えられる。得られる固定化複合体が、pH、 有機溶媒、および他の変性剤の最も極端な状態により影響を受けないので、これ は、本発明における使用のための１つの好ましい固定化付着である（Green、197 5）。アビジン（ストレプトアビジン）-ビオチン固定化の代替は、抗ジゴキシゲ ニン抗体を使用するその後の捕獲での修飾プライマーにおけるジゴキシゲニン分 子（Sigma．St．Louis，Mo）の組込みである。 酵素的方法はまた、オリゴヌクレオチドの固体支持体へのカップリングに利用 され得る（Goldkornら、1986）。１つの実施態様の例では、ポリ(dA)テールを、 3'末端トランスフェラーゼを用いて、二本鎖DNAの3'末端に付加する。次いで、( dA)-テール付加したDNAを、オリゴ(dT)セルロースにハイブリダイズする。DNAを 固体支持体に共有結合するために、ハイブリダイズした試料を、最初に、DNAポ リメラーゼＩのクレノーフラグメントと反応させ、次いでT4 DNAリガーゼで処理 する。DNAの連結されていない鎖を、加熱により、次いで長時間の洗浄により、 固定化された鎖から分離する。この方法により、その5'末端により固体支持体に 共有結合されたssDNAが得られる。 本発明の修飾プライマーはまた、金表面に取り付けられ得る。この固定化アプ ローチの利用において、チオール基で終結するリンカーアームを有する5'末端で 修飾オリゴヌクレオチドを、金表面上に高いアフィニティーで化学吸着させる（ Hegnerら、1993a）。チオレート化したプライマーは、市販の試薬（Pierce、Roc kford、IL）を使用して、固相合成後の修飾により入手可能であり、酵素的伸長 の前または後のいずれかに金の薄層に固定化される。この金層を、内部切断およ びエバポレーションの後、質量分析法による直接分析のための試料ステージ上に 置く。あるいは、得られる伸長セグメントは、分析前に別の表面上に移され得る 。 III．固定化された切断可能なオリゴヌクレオチド組成物を用いる反応 Ａ．ハイブリダイゼーションおよび伸長 標的オリゴヌクレオチドストランドの配列を決定するために用いられる方法は 、しばしば、本発明の修飾された切断可能なプライマーを使用する、Sangerタイ プの配列決定を包含する。修飾されたプライマーの固体支持体への固定化は、酵 素的伸長反応の前または後のいずれかに行われ得る。 Sanger DNA配列決定手順を利用して、４つの塩基のそれぞれのジデオキシヌク レオシドが、反応混合物中への包含のために得られる。ジデオキシヌクレオチド は、正常な5'トリホスフェート基を有するので、例えば、E．coli DNAポリメラ ーゼによってDNAに組み込まれる。一旦成長するDNAストランドへ組み込まれると 、ジデオキシヌクレオシドトリホスフェート（ddNTP）は、次に入ってくるdNTP とのホスホジエステル結合を形成し得ず、そしてDNA鎖の成長が終結する。 Sanger法を使用する代表的なDNA配列決定反応は以下のように進む。この反応 は、配列決定される標的DNAストランド、本発明による切断可能部位を含み、標 的ストランドの末端に相補的である修飾されたプライマー、注意深く制御された 割合の１つの特定のジデオキシヌクレオシドとその正常なデオキシヌクレオチド 相対物、および３つの他のデオキシヌクレオシドトリホスフェートからなる。修 飾されたプライマーは、この点で固体支持体に固定化されてもされなくてもよい 。（固定化は、多くの実験因子に依存して、酵素的伸長反応の前または後のいず れかで生じ得る）。 DNAポリメラーゼを添加して、正常な重合化がプライマーから始まる。ddNTPの 組込みの際、鎖の成長が停止される。一連の異なるストランドを生じ、その長さ は、DNAの末端に対する特定の塩基の位置に依存する。標的ストランドは、通常 、４つのDNAポリメラーゼ反応に配分され、それぞれは４つのddNTPのうちの１つ および本発明の修飾されたプライマーを含む。次いで、伸長反応は上記のように 行われる。 SangerタイプのDNA配列決定は、一般的に、「SEQUENASE」バージョン1.0また はバージョン2.0 T7 DNA Polymerase（United States Biochemical、ClevelandO H）のようなDNA配列決定キットを使用して行われる。「SEQUENASE」バージョン1 .0キットは、バクテリオファージT7 DNAポリメラーゼに由来する化学的に修飾さ れたDNAポリメラーゼを使用し、そこでは天然のT7 DNAポリメラーゼの高い3'→5 'エキソヌクレアーゼ活性が不活性化される。 USB「SEQUENASE」キットを使用するにおいて、二本鎖テンプレートを最初に変 性し（二本鎖テンプレートを使用している場合）、そして次いで、プライマーを 、65℃で２分間加熱、続いて約15〜30分かけて35℃より低くまでゆっくり冷却す ることによって、標的にハイブリダイズまたはアニールする。スーパーコイル形 成したプラスミドDNAを、配列決定のためのプライマーをアニールするために、 水酸化ナトリウム処理により変性し、中和し、そしてエタノール沈殿させる。 異なるddNTPを含む終結混合物を、終結反応での使用のために調製する。アニ ールしたDNA混合物を、必要に応じて標識し、そして標識した反応混合物を、４ つの終結チューブのそれぞれに添加する。本発明において、伸長反応を行って、 ほとんど０から数百の塩基対の長さの範囲である産物の分布を生じる。必要に応 じて、停止溶液（ホルムアミド、EDTA、ブロモフェノールブルー、およびキシレ ンシアノールFFを含む）を添加して、得られた試料の分析前に反応を停止する。 修飾されたプライマーが酵素的伸長の前に固体支持体に固定化されていなかっ た反応について、固定化は上記IIB項に記載のように行われる。 固定化された伸長されたプライマーを、次いで洗浄して、過剰の酵素、イオン 、塩類、および他の不純物を除去する。１つの実施態様では、伸長されたプライ マーは、マイクロタイターウェルの表面上に固定化される。固体支持体への固定 化は、切断部位でのプライマーの切断、次いで上清での除去によって、産物の精 製およびその後の単離を容易にする。 あるいは、DNA配列決定は、デオキシヌクレオチドα-チオトリホスフェート、 dNTPαS（United States Biochemical、Cleveland OHから入手可能）を使用して 、次いでExonuclease III（New England BioLabs、Beverly MA）またはヘビ毒ホ スホジエステラーゼ（Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany）のような限定 されたエキソヌクレアーゼで促進された塩基特異的消化により、行われ得る（Ol sen，D.ら、1993）。組み込まれたホスホロチオエート基の位置に特異的なDNAフ ラグメントの切断はまた、2-ヨードエタノールまたは2,3-エポキシ-1-プロパノ ールのような化学試薬を使用して行われ得る（Nakamayeら、1988）。 簡単にいうと、ホスホロチオエートヌクレオシドの組み込みを介する、本発明 の修飾されたプライマーを使用する標的DNA配列の配列決定は以下のように行わ れる。標的DNA配列を、上記のように修飾されたプライマーとハイブリダイズさ せる。次いで、１つのデオキシヌクレオチドα-チオトリホスフェート（dNTPαS ）の存在下で酵素的にプライマーを伸長して、ホスホロチオエート結合を含むプ ライマー伸長産物の混合物を生成する。次いで、プライマー伸長産物を、塩基特 異的プライマー伸長分解産物のネスティッド(nested)セットの生成を生じる条件 下で、(i)2-ヨードエタノールまたは2,3-エポキシ-1-プロパノールのようなホス ホロチオエート結合で特異的に切断する試薬、または(ii)3'→5'エキソヌクレア ーゼのような、ホスホロチオエート結合から下流のDNAを消化する試薬で処理す る。 必要に応じて、プライマー伸長分解産物は、固定化付着部位で固定化されて、 固定化されたプライマー伸長分解産物を生じ、これらはそれぞれプライマーおよ び伸長セグメントを含む。あるいは、固定化は、i)酵素的伸長の前、ii)酵素的 伸長の後、またはiii)ホスホロチオエート含有プライマー伸長産物をホスホロチ オエート特異的切断試薬で処理する前のいずれかに行われ得る。 固定化の後、プライマー伸長分解産物を洗浄して、固定化されていない種を除 去する。切断可能部位での切断は、伸長セグメントの放出を生じ、次いで質量分 析によりサイズ計測する。本発明のこの局面の配列決定方法を用いると、任意の 所定の伸長セグメントの読みの長さは、対応するプライマー伸長分解産物の読み の長さに対して増大する。 次いで、ハイブリダイゼーション、酵素的伸長、ホスホロチオエート切断試薬 による処理、固定化、洗浄、切断、およびサイズ計測の工程を、４つの異なるdN TPαSアナログの第２番目、第３番目、および第４番目について繰り返して、４ つの伸長反応のそれぞれから得られた伸長セグメントのサイズの比較によって、 標的DNAの配列を決定する。 本明細書に記載の方法および修飾されたプライマーはまた、標的オリゴヌクレ オチドのフィンガープリントを得るために使用され得る。本明細書に記載のよう に、フィンガープリンティングとは、標的オリゴヌクレオチドストランド中の２ つ以下の異なる塩基の位置を決定する方法をいい、配列決定とは対照的である。 配列決定は、標的ストランドまたはその相補物に存在する各ヌクレオチドの同定 および配置を包含する標的核酸の完全なヌクレオチド配列の決定（および、また 遺伝子エキソンの場合には、標的核酸よりコードされる対応するアミノ酸配列の 決定）の決定をいう。DNAまたはRNAフィンガープリンティングは、試薬を必要と せず、迅速なおよびコスト効率の良い配列決定の代替を提供し得、そして、多く の種々の適用（例えば、被験体からの遺伝子試料中の１つ以上の感染性因子の同 定、cDNAライブラリーのスクリーニング、変異、多形性を検出するためのヒトま たは非ヒトゲノムからの遺伝子のスクリーニング）に、および法廷の適用のため に使用され得る。本発明の修飾されたプライマーを用いて生成された、オリゴヌ クレオチド伸長セグメントの単一のまたは２塩基のフィンガープリントを決定す るための１つの好ましい方法は、質量分析である。 標的オリゴヌクレオチドのフィンガープリントを決定するにおいて、標的分子 に由来する塩基特異的に終結したフラグメントを含む塩基特異的にネスティッド フラグメントのセットは、後の分析のために生成される。本明細書でいうように 、ネスティッドセットは、生体ポリマー（例えば、DNA、RNA、ペプチド、または 炭水化物）の混合物として定義され、混合物の成分のすべては、通常の末端を有 し、そして単一のポリマー配列から生成される。塩基特異的にネスティッドフラ グメントのセットは、例えば、Sanger法を用いる塩基特異的鎖終結により、また は選択的化学切断により生成され得、以下に記載される。標的分子の増幅が望ま れる場合、増幅は、PCR、SPA（単一プライマー増幅）、NASBA（核酸配列に基づ く増幅）、TMA（転写で媒介される増幅）、およびSDA（ストランド置換増幅）を 含む多くの従来の増幅方法のいずれかを用いて行われる。 質量分析計のような、産物の分析のためのサイズ分画化デバイスを用いるフィ ンガープリンティング方法において、得られる単一塩基のフィンガープリントは 、しばしば、標的配列に存在する他の塩基に関する間接的な情報を提供し得る。 例えば、質量スペクトルにおける２つのピークの位置に対応する質量の差（Δm ）はまた、介在塩基の組成を表し得、以下に記載される。 チミジンフィンガープリントのような、標的オリゴヌクレオチドの単一塩基の フィンガープリントを決定するために、チミジン特異的にネスティッドフラグメ ントのセットは上記のように生成される。多くのチミジンで終結したヌクレオチ ドフラグメントを含む得られるフラグメントファミリーは、代表的には、精製さ れて、質量分析のようなサイズ分画方法により分析される。質量分析の性能を増 大させるために、質量を改変したヌクレオチドが利用され得る。得られる質量ス ペクトルは、多くのピークを含み、それぞれが、産物混合物に存在する特定のチ ミジンで終結したフラグメントの質量に対応する。次いで、種々のチミジンで終 結したフラグメント間の質量の差は、ヌクレオチドの種々の組み合わせの算出さ れた質量に、好ましくは、修飾されたプライマー、切断可能部位のプライマーの 3'の部分、および種々のヌクレオチドのそれぞれの分子量を含むコンピュータプ ログラムの補助に相関されて、公知のチミジンの位置間に介在するヌクレオチド の組み合わせを同定する。 例証として、２つの所定のフラグメントピーク間の質量の差を考慮すると、1, 276質量単位の例示的な質量の差は、以下の塩基組成に唯一対応する：（２つの Ｇ）＋Ａ＋Ｔ。したがって、単一塩基のフィンガープリントは、(i)標的配列内 の特定の塩基の位置を同定するために、および(ii)標的配列の局在する領域内の 塩基組成を決定するために、使用され得る。 より詳細なレベルを必要とする適用については、第２の塩基特異的なネスティ ッドセットを生成し、そして分析して、上記のように第２のフィンガープリント を生成する。種々の塩基特異的なネスティッドセットは、利用される方法および 必要とされる対応する試薬に依存して、単一の反応容器中で、または別々の反応 において生成され得る。異なる塩基特異的にネスティッドセット（例えば、チミ ジンで終結したフラグメントおよびシチジンで終結したフラグメント）は、別々 にまたは混合物として分析され得る。 点変異の検出のための単一塩基フィンガープリントの使用は、実施例７に記載 される。簡単にいうと、3'末端に対して（プライミング領域の後の上流から数え て）16および19位においてのみ異なる配列を有する２つの異なる一本鎖DNA標的 （配列番号14および配列番号15）のシトシンフィンガープリントを、ジデオキシ シトシントリホスフェートを使用して決定して、シトシンで終結したヌクレオチ ドフラグメントのファミリーを生成し、次いで質量分析によって得られた反応産 物混合物を分析した（図14A、14B）。それぞれのスペクトルでの選択ピーク間の 差に対応する正確な質量値を算出して、16および19位で２つの単一のヌクレオチ ド置換（点変異）の存在を確認した。 他のアプローチでは、塩基特異的なネスティッドフラグメントセットは、特定 の塩基に対応する位置に、選択的に切断可能な基（例えば、dUTPまたはアミノ機 能化したヌクレオシドトリホスフェート）を含むように修飾されたDNAまたはRNA 分子を選択的に切断することにより生成される。次いで、得られるウリジンを修 飾したオリゴヌクレオチドをウラシルDNAグリコシラーゼで処理して、フラグメ ントのセットを、好ましくは固相上に捕獲されたネスティッドセットを形成する 。同様に、5'-アミノ修飾した標的分子は、酸での処理によって切断される。 好ましくは、上記のフィンガープリンティング方法は、本発明の切断可能なプ ライマーを用いて、プライマー伸長フラグメントからプライマーの大部分を除去 する。分析フラグメントの質量を減少させることによって、産物の分布は、質量 分析がより高い質量精度および分解能を有する領域中に移される。さらに、異な るヌクレオチド間の質量の差を増強するために、多くの質量改変機能性のいずれ かを導入することにより（例えば、チミジンを5'−ブロモウリジンで置き換える ことにより、または上記のように、固定化付着部位、スペーサーアーム、または 代わりのヌクレオチド間結合を利用することにより）異なるヌクレオチドを質量 改変するするために有用であり得る。 第２のフィンガープリンティングアプローチでは、制限エンドヌクレアーゼを 用いて、例えば変異を検出するために有用な、非ランダムフラグメント化パター ンを生じる。 本発明の他の実施態様では、配列決定またはフィンガープリンティングのため の標的DNAは、ポリメラーゼ連鎖反応すなわちPCRを使用して増幅される（Mullis 、1987；Mullisら、1987；Kusukawaら、1990；Gyllensten、1989）。簡単にいう と、PCR増幅は、代表的には、目的の標的DNA、デオキシヌクレオチドトリホスフ ェート（dNTP）の混合物、反応緩衝液、それぞれの２つのプライマー、およびTa q DNAポリメラーゼ（United States Biochemicals、Cleveland OH）のような伸 長酵素を含む混合物(cocktail)を、熱サイクルすることによって行われる（Erli ch、1989;Innis、1990）。PCR操作プロフィールは、代表的には、94℃にて５分 の変性工程、続いて、94℃にて15秒、アニーリング温度にて15秒、および72℃に て１分の30サイクルからなる。熱サイクルの後、試料は、熱サイクラーから取り 出されるまで、４℃に維持され得る。アニーリング温度は約55℃から65℃の範囲 であるが、ほとんどの標的配列は60℃で十分に増幅する。 増幅に続いて、本発明の修飾されたプライマーとのハイブリダイゼーション、 酵素的伸長、および上記のような産物の配列決定が行われる。 図１２は、本発明の修飾されたプライマーを使用するテンプレート分子のPCR 増幅を示す。 ジデオキシ鎖ターミネーターを使用することの代わりとして、ウラシルDNAグ リコシラーゼでの処理によるdUTPの組み込みの部位で終結されるネスティッドセ ットを生成するために、PCRはdUTPの組み込みと組み合わせられ得る。PCRはまた 、上記のように、ホスホロチオエート法と組み合わせ得る。 本発明によれば、増幅は第１および第２のプライマーを使用して行われ得、こ こで、一方のプライマー、すなわち第１のプライマー95は、切断可能部位99を含 み、そして他方のプライマー、すなわち第２のプライマー105は、固体支持体へ の結合のための固定化付着部位を含む。第２のプライマーは、5'末端および3'末 端から構成され、標的核酸に相同であり、そして第２のプライマーの3'末端を含 む第１のセグメント、ならびにプライマーの5'末端および固定化付着部位を含む 第２のセグメントを含む。 これらの第１および第２のプライマーは、標的核酸103と組み合わされて、プ ライマー／核酸複合体を生成し、そして107に示すように、ポリメラーゼおよび デオキシヌクレオシドトリホスフェートの存在下で二本鎖フラグメント109へ変 換される。サイズ計測方法は、実質的な量のプライマー伸長産物を生成するため に、大過剰の標的核酸を使用して行われ得るか、あるいは、種々の回数の増幅と カップリングされ得る。産物109の所望の量を達成する際、第２のプライマーを 含む伸長産物は、切断可能部位での切断の前または後のいずれかに、固定化付着 部位での付着によって固定化される117。次いで、伸長産物は、切断可能部位で 切断されて111、二本鎖産物115を含む混合物を生成する。固定化されていない切 断されたフラグメントは、好ましくは洗浄によって除去され119、そして精製さ れた二本鎖産物121は変性されて123、伸長セグメント125を放出し、これは質量 分析によってサイズ計測される。ここで伸長セグメントの読みの長さは、プライ マー／核二本鎖フラグメントの読みの長さと比較して増加される。 理解されるように、第１のプライマーの切断可能部位および第２のプライマー の固定化付着部位は、上記のタイプのものを含む。 図１２に示す実施態様の例では、第１のプライマー95は、第１のプライマー領 域101中の制限酵素認識部位97および第２のプライマー領域中の切断可能部位99 を含み、そして第２のプライマーは固体支持体への付着のための固定化付着部位 を含む。切断可能部位での切断は、第１のプライマー領域に含まれる認識部位に 対して選択的な制限エンドヌクレアーゼの添加によって行われて、(i)第１のプ ライマーの第１の領域を含む放出されるフラグメント、および(ii)所望の伸長セ グメントの放出のための変性の前に固定化される二本鎖産物を提供する。図１２ に示すように、制限エンドヌクレアーゼで促進された切断の結果、二本鎖産物11 5、およびプライマーの第１の領域を含む短い二本鎖フラグメント113を放出する 。 Ｂ．切断 選択的に切断可能な部位の切断は、IIA項ならびに実施例１Ａ〜Ｄおよび実施 例３に記載のように行われる。本発明のこの局面に戻ると、トリアルキルシリル エーテルおよびジアルコキシシランのようなヌクレオシド間シリル基は、フッ化 物イオンでの処理により切断される。本発明での使用のための塩基切断可能部位 には、β-シアノエーテル、5'-デオキシ-5'-アミノカルバメート、3'-デオキシ- 3'-アミノカルバメート、尿素、2'-シアノ-3',5'-ホスホジエステル、2'-アミノ -3',5'-ホスホジエステル、エステル、およびリボースが挙げられる。3'-(S)-ホ スホロチオエートおよび5'-(S)-ホスホロチオエートのようなチオ含有ヌクレオ チド間結合は、硝酸銀または塩化水銀での処理によって切断される。本発明での 使用のための酸切断可能部位には、3'-(N)-ホスホルアミダイト、5'-(N)-ホスホ ルアミダイト、ジチオアセタール、アセタール、およびホスホニックビスアミド が挙げられる。α-アミノアミドヌクレオシド間結合は、イソチオシアネートで の処理によって切断可能であり、そしてチタニウムを使用して2'-アミノ-3',5'- ホスホジエステル-O-オルトベンジルヌクレオチド間結合を切断する。ビシナル ジオール結合は、過ヨウ素酸塩での処理によって切断可能である。熱的切断可能 基には、アリル性スルホキシドおよびシクロヘキセンが挙げられるが、光不安定 性結合にはニトロベンジルエーテルおよびチミジンダイマーが挙げられる。 固定化付着部位をもとのままにしておく切断条件が利用され、そのためプライ マーの大部分は固体支持体に取り付けられたままである。好ましくは、切断可能 部位の切断により、プライマー配列から５またはそれより少ない塩基対を含むプ ライマー伸長産物を生じる。これは、続いての分析において提供される配列情報 の量を最大にする。 Ｃ．分析 多くのサイズ分画デバイスのいずれもが、標的オリゴヌクレオチドフラグメン トの配列を決定するために使用され得る。本発明での使用のためのサイズ分画方 法には、ポリアクリルアミドまたはアガロースゲル電気泳動のようなゲル電気泳 動、キャピラリー電気泳動、質量分析、およびHPLCが挙げられる。 ゲル電気泳動サイズ計測および分析を用いる方法において、DNAフラグメント は、代表的には、放射性同位体または付着された発蛍光団のいずれかで標識され 、そしてそれぞれオートラジオグラフィーまたは蛍光検出を使用して可視化され る。 本発明の修飾されたプライマーは、これらを使用してオリゴヌクレオチドフラ グメントを生成し、そのサイズが、１ヌクレオチド長で異なる約100塩基対を越 えるフラグメントを解析することに困難性を現在有している、質量分析のような 技法を使用して解析される場合、特に好都合である。 本発明の修飾されたオリゴヌクレオチド組成物を使用するオリゴヌクレオチド 分析の１つの好ましい方法は、質量分析、そして特にマトリクス援助レーザー脱 着イオン化（MALDI）質量分析であり、好ましくは飛行時間型（TOF）質量分析計 で行われる（Wuら、1993）。MALDI質量分析は、オリゴヌクレオチド配列決定の ための迅速かつ効率的な方法を提供する。 MALDI-TOF質量分析は、100よりも多い塩基対を含む混合された塩基オリゴヌク レオチドのフラグメント化されていない質量スペクトルを提供するために用いら れ得る。さらに、配列の質量スペクトル分解能は、現在、少なくとも約40塩基対 の長さまで達成され得る。 この方法において、パルス化紫外レーザー光は、吸収固体マトリクスからオリ ゴヌクレオチドを脱着するために用いられ、遊離の、フラグメント化されていな い、電荷を有するオリゴマーの生成を引き起こす。質量分析は、飛行時間型質量 分析計で行われる。１つだけ電荷を有する分子イオンは、代表的には、最も豊富 な種であり、そしてフラグメントイオンは最小になる。 分析用の試料を調製するにおいて、分析物は、レーザー波長で共鳴して吸収す る分子のマトリクスに混合される。この使用のための固体マトリクス物質には、 3-ヒドロキシピコリン酸（Wuら、1993）、α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸（Yo ungquistら、1994）、ニコチン酸（Hillenkamp、1988）、および氷（Nelsonら、 1989）が挙げられるが、好ましい物質は3-ヒドロキシピコリン酸である。 実施例４および５には、本発明による修飾されたオリゴヌクレオチド組成物の MALDI-TOF質量スペクトル分析の詳細な記載が含まれる。実施例８は、図１５Ａ および１５Ｂとともに、本発明による切断されたプライマー伸長セグメント（図 １５Ｂ）対切断されていない全長プライマー伸長セグメント（図１５Ａ）につい て得られる、フラグメント情報における差を示す。 実施例３に記載のように、７位に切断可能リボースを含む合成17マーDNAプロ ーブを、水酸化アンモニウム処理によって選択的に切断した。水酸化アンモニウ ム処理の前（図３Ａ）および後（図３Ｂ）のそのままの混合された塩基プライマ ーの質量スペクトルは、リボース結合の選択的切断を表す。図３Ａに示されるよ うに、２つのサイズ計測可能なピークが、ジプロトン化分子イオン[M＋2H]2+お よびプロトン化分子イオン[M+H]+に対応する完全な17マーについて観察された。 水酸化アンモニウム処理の後、予測された切断産物、７マー、10マー、および完 全な17マーに対応するピークは、図３Ｂに示されるように、容易に観察可能であ り、そして同定可能であった。 同様に、質量スペクトル分析を、実施例５に記載のように、10位にリボースを 含むビオチン化した18マーで行い、そしてストレプトアビジンでコートしたビー ズに捕獲した。固定化したプライマーを表面結合後に洗浄し、次いで水酸化アン モニウムで処理して、リボース部位で固定化したプライマーの選択的切断を行っ た。図４は、固定化したプライマー内のリボース部位の選択的切断から得られる ８マーの質量スペクトルを示す。 IV．有用性 Ａ．ゲノム配列決定 本発明の方法は、「ショットガンタイプ(shotgun-type)」配列分析および「方 向性ウォーク」の両方に使用され得る。ショットガンアプローチでは、DNAのラ ンダムな配列が選択されて、未知標的でプライムするために使用される。このア プローチは、未知標的配列とうまくハイブリダイズする可能性を増加させるため に多数のプライマーを使用する。このアプローチの１つの実施態様では、マルチ ウェルアッセイ形式が用いられ、ここで各ウェルは異なるプライマーを有し、そ して同じ基質（すなわち、標的DNA分子）をハイブリダイゼーション条件下で各 ウェルに添加する。ウェル中のプライマーは、本発明の修飾されたプライマーで あり、このウェル表面への固定化はプライマー固定化部位を介する。プライマー 伸長反応が行われる。伸長産物は、相補的配列がプライマーと基質との間に存在 するウェル中で形成されるのみである。各ウェルは伸長産物の存在について検査 される。次いで、伸長産物は配列決定され、そして配列は、伸長産物および塩基 配列重複（すなわち、伸長産物配列のアラインメント）を伸長産物配列から生じ たプライマーの公知の配列に基づいて、任意の所定の標的DNA分子について配列 組み立てられる。本発明の修飾されたプライマーの使用において、伸長セグメン トについての配列情報（例えば、増加した読みの長さ）の量は、フラグメント分 析前の大部分のプライマーの切断および除去のため、従来のプライマーを用いる 同様の技法で得られる以上に最大にされる。さらに、質量分析による分析とカッ プリングされる場合、この方法は迅速であり、そして比較的短い時間で大量のデ ータを提供し得る。 関連のアプローチでは、本発明の方法は、遺伝子マッピングおよび同定の目的 で、cDNAインサートの短い読み（read）を配列決定またはフィンガープリントす るために用いられ得る。これらの短い読みは、各インサートを独自に同定し、そ してExpressed Sequence Tag（EST）またはExpressed Fingerprint Tag（EFT） と呼ばれる。cDNAライブラリーの調製では、mRNAのcDNAコピーは、最初に、pBlu eScriptのような標準的なクローニングベクターに挿入される。本発明による修 飾されたプライマーは、cDNAインサートに直接隣接する3'末端を有するpBlueScr iptベクター配列にハイブリダイズするように設計される。次いで、プライマー 伸長および配列決定またはフィンガープリンティング反応が行われ、これらはイ ンサートを読みとり、そしてその配列またはフィンガープリントを同定する。配 列の独特の長さを同定するために、伸長セグメントについての最小の読みの長さ は、代表的には30塩基であるが、好ましい読みの長さは少なくとも約40塩基であ る。 他の実施態様では、固定化された切断可能なプライマーのアレイは公式化され 得る（Fodorら、1991；Southernら、1992）。本発明のこの局面において、アレ イは本発明の修飾されたプライマーからなり、ここで、切断可能な結合は、例え ば、光切断可能な結合（例えば、骨格ニトロベンジル基）であり、そしてプライ マーは修飾されたプライマーの固定化部位を介して支持体マトリクスに付着され る。この実施態様では、標的DNA分子はプライマーにハイブリダイズされ、プラ イマー伸長反応が行われ、そして異なる配列のプライマーは連続的に切断され、 そして伸長産物の存在または非存在が決定される。伸長産物が検出される場合、 それらの配列は上記のように決定され得る。 方向性ウォークアプローチでは、公知のDNA配列がプライマー配列として使用 され、したがって、公知の領域から離れた両方の方向における配列決定のための 開始点を提供する。次いで、それぞれの新しく同定された配列は、配列ウォーク の進行を可能にするための新しいプライマーの合成を指示するように使用される 。 Ｂ．診断 多くの合成オリゴヌクレオチドは、入手可能であるか、または容易に合成され 得、これらは標的核酸配列（例えば、RNAまたはDNA）に相補的であり、そして一 定の細菌、ウイルス、真菌類、寄生虫などの存在を検出するためのプローブとし て使用され得る。 本発明のオリゴヌクレオチド組成物は、例えば、特定のDNAまたはRNA配列また は以下の標的に対応するフィンガープリントの存在を検出するために使用され得 る：(i)サイトメガロウイルス（CMT）、エプスタイン・バー、およびヘルペス単 純ウイルスのようなヘルペスウイルス；(ii)Ａ、Ｂ、Ｇ、およびＤ型肝炎ウイル スのような肝炎ウイルス；(iii)ヒトパピローマウイルス６、11、16、18、およ び33型のようなパピローマウイルス；(iv)ヒト免疫不全ウイルス１型（HIV I） 、HIV II、ヒトＴ細胞リンパ芽球ウイルスＩ(HTLV I)、HTLV IIのようなレトロ ウイルス；(v)ブタパルボウイルスおよびブタmycoplasma hypneumoniaeのような 動 物ウイルス、パルボウイルスB 19のようなパルボウイルス；(vi)ライノウイルス （エンテロウイルス）およびライノウイルスHRV 2-14のようなピコルナウイルス ；(vii)mycobacterium avium、結核菌、トラコーマ病原体、大腸菌、連鎖球菌、 およびブドウ球菌のような細菌；および(viii)トリパノゾーマ、トキソプラズマ 、およびプラスモジウムのような寄生虫。 プライマー配列を有する本発明の修飾されたプライマーは、目的の微生物由来 の核酸に特異的にハイブリダイズし得る配列であり、試料中の核酸にハイブリダ イズされる。プライマー伸長反応および伸長産物の単離は、上記のように行われ る。伸長産物の存在は、試料中の微生物由来の核酸の存在を示す。本発明の修飾 されたプライマーおよびサイズ計測方法は、質量分析を使用する特定の標的配列 またはフィンガープリントの存在についての、迅速な高い処理能力のスクリーニ ング方法を提供する。 関連の実施態様では、本発明の修飾されたプライマーは、直接的配列決定また はフィンガープリンティングにより病原体を同定するために使用され得る。１つ のこのようなアプローチでは、各病原体についての独特の配列を含む領域（例え ば、可変領域）の隣に位置する、病原体の大きな個体群間で共通であるセグメン ト（例えば、保存領域）を有するゲノムDNAの特定の領域が同定される。このよ うな配列の１つの例は、細菌の16SリボソームRNAまたは16S rRNAに転写されるDN A由来である（Olsen，G.J.ら、1992）。すべての16S様rRNAは同様のコア構造を 含む。入手可能な細菌の16S rRNA配列の90％で保存されるヌクレオチドが同定さ れている（Schmidtら、1994）。 上記のようにrRNAを使用する病原体の同定は以下のように行われる。本発明に よれば、プライマーは、16S rRNAコンセンサス配列（例えば16S rRNA中の配列10 47〜1065）の選択領域にハイブリダイズするように構築され、ここで、i)プライ マーは配列5'-ACGACANCCATGCANCACC-3'（配列番号９）を有し、そしてii)超可変 領域（例えば配列995〜1046）を読みとる。質量分析によるプライマー伸長セグ メントの分析の際、単一の病原体は、存在するならば、少なくとも20塩基、およ び好ましくは少なくとも40の所望の読みの長さで、超可変領域に沿った配列また はフィンガープリントを決定することによって、独特に同定され得る。 あるいは、超可変領域に隣接する保存領域を選択する代わりに、選択された病 原体の超可変または独特の領域にハイブリダイズする一連の独特のプライマーを 生成し得る。これらのプライマーの酵素的伸長は、超可変領域の隣接セグメント についての配列またはフィンガープリント情報を提供する。この方法論は、混合 した個体群に存在する各病原体の特異的同定を可能にする。このアプローチを利 用して、各標的病原体についての種々の超可変領域を標的化し得る。このアプロ ーチは、しばしば他のウイルスまたは細菌間でほとんど保存がないウイルスを同 定するために好ましいかもしれない。 このような微生物由来の試料中で核酸の存在を決定することに加えて、本発明 は、試料中に存在する特定の配列またはフィンガープリントの決定を容易にする 。例えば、HIVまたはトリパノソームの特定の改変体は、フィンガープリンティ ングまたは配列決定により、ならびに抗生物質耐性を担い得る遺伝子の存在また は非存在により同定され得る。 修飾されたプライマーは、診断方法で同様に使用され得、ここで、変異配列は 、欠失、挿入、点変異のような配列変異により野生型配列とは区別される。多く の潜在的な標的部位は、この方法により評価され得、この部位には、長さが変化 するDNA配列（例えば、BCR/ABL）ならびに配列が変化するDNA配列（例えば、鎌 形赤血球貧血）から選択される標的部位が挙げられる。本発明のサイズ計測方法 論は、前者の適用（例えば、長さが変化する標的部位）に特に適切である。標的 核酸への修飾されたプライマーのハイブリダイゼーションは、標的領域への修飾 されたプライマーのハイブリダイゼーションが可能なハイブリダイゼーション条 件を適切に調整して、標準的手順に従って行われる。 本発明の修飾されたプライマーを使用する検出のための遺伝子障害の例には、 鎌形赤血球貧血およびα1-アンチトリプシン欠損が挙げられる（Watsonら、1992 ）。図７Ａに示すように、鎌形赤血球貧血は、ヘモグロビンのβ-グロビン鎖中 の６位で、グルタミン酸残基（トリプレットGAGによりコードされる）をバリン 残基（GTGによりコードされる）に変える変異から生じる。この塩基変化（Ａか らＴ）は、MstIIを含む多くの制限酵素の認識配列を破壊する。この障害を検出 するための修飾されたプライマーは、代表的には、プライマーの末端から約２ヌ クレオチド、そして好ましくは公知の変異部位から約10〜20ヌクレオチド上流に 位置する、図７Ａに示すような切断可能部位を含む。 α1-アンチトリプシン欠損もまた、本発明の修飾されたプライマーを使用して 検出可能であり、この障害は阻害されないエラスターゼの産生により特徴づけら れ、このプロテアーゼは、肺の弾力線維を破壊し、患者を肺気腫にかからせる。 α1-アンチトリプシン遺伝子はクローニングされており、そして図７Ｂに示すよ うに、変異遺伝子は配列番号７によって示されるフラグメントであり、配列番号 ８によって示されるように残基342でのアミノ酸置換（グルタミンからリジン） を導く単一の塩基変化に対応する。図７Ｂ（上）に示すように、野生型α1-アン チトリプシン遺伝子の一部は、配列番号５により示される。野生型α1-アンチト リプシン遺伝子を有する個体で産生されるタンパク質のフラグメントは、配列番 号６により示される。対応する遺伝子変異が同定され、そして本発明の修飾され たプライマーを使用して検出され得る他の疾患には、デュシェーヌ筋肉ジストロ フィー、第Ｘ因子欠損、血友病、およびフェニルケトン尿症が挙げられる。この ような障害を検出するために使用される修飾されたプライマーは、代表的には、 プライマーの末端近くに位置する切断可能部位を含み、ここで、プライマーの末 端は公知の変異部位から上流である（例えば、40マーにおいて検出される変異部 位から約20塩基対以内）。 本明細書に記載される方法を使用する点変異の検出は実施例７で提供され、そ してさらに図１４Ａおよび１４Ｂに示される。 他の診断の例は、BCR-ABL転写物の検出であり、これは慢性骨髄性白血病（CML ）患者の大部分およびPh+急性リンパ球性白血病患者で見いだされ、そして白血 病表現型の維持に必要であると考えられる（Szczylikら、1991；Galeら；Collin sら、1984；Daleyら）。BCR-ABL転写物は、切断点クラスター領域（BCR）（第22 染色体）へのガン原遺伝子ABL（第９染色体）の転座の結果であり、BCR-ABLハイ ブリッド遺伝子の形成を生じる。この実施態様では、本発明の修飾されたプライ マーは、切断点領域の前に3'末端を有する。次いで、プライマー伸長反応は、存 在するならば切断点領域を越えて進行するか、または切断点が存在しないならば 正常な転写領域を通って続く。このようなプライマー伸長産物の配列は、切断 点融合が核酸の任意の所定の試料中に存在するかどうかの診断上の特徴である。 修飾されたプライマーはまた、サイズ計測または配列決定により試料中の特定 の配列の存在を検出するための、あるいは配列決定反応用の多量のDNAを調製す るための、DNA増幅反応（例えば、Mullis；Mullisら）で用いられ得る。本発明 のこの実施態様では、増幅後、固体支持体に付着され得る固定化部位（例えば、 ビオチンおよびジゴキシゲニン）を含む修飾されたプライマーは、特に有用であ る。増幅された産物は捕獲され、修飾されたプライマーは切断され、そして得ら れる増幅産物が単離され得る。 特に、本発明の方法は、PCR産物のサイズ計測により病原体を同定するために 利用され得る。簡単にいうと、プライマーは、最初に、目的の標的病原体（単数 または複数）に独特の配列とハイブリダイズするように選択される。プライマー は、変化するサイズのPCR産物を生成するために、多様なの状況（例えば、いく つかの異なる病原体が存在し得る状況）での使用のために選択されて、各サイズ は特定の病原体に対する独特のPCR産物に相関する。 ３つの異なる病原体（例えば、緑膿菌、大腸菌、および黄色ブドウ球菌）の存 在を決定するためのこのような実験は、DNA分析物に加えて、例えば、それぞれ6 5、70、および75塩基対のサイズを有するPCR増幅産物を生じるように設計された 、上記病原体のそれぞれのための修飾されたプライマーを含む試料に添加するこ とにより行われる。 PCR産物は、（修飾されたプライマー中の）切断可能部位での切断により、20 〜25ほどのヌクレオチドのサイズに縮小される。これにより、質量分析計のより 容易に分解可能な範囲に対応するピークを移し、そしてより多くのPCR産物を増 やすことを可能にする。 本発明の方法に従って、切断された増幅産物は、質量分析を使用して検出され 、そしてサイズ計測される。 以下に実施例を例示するが、これは本発明の範囲を限定することを決して意図 しない。 材料および方法 Bz-DMT-デオキシアデノシンH-ホスホネート、iBu-DMT-デオキシグアノシンH- ホスホネートのような保護されたヌクレオチドH-ホスホネート、完全に保護され たデオキシヌクレオシドホスホルアミダイト、保護されたデオキシヌクレオシド ジエステルおよびトリエステル、ヌクレオチドダイマー、および固相支持体は、 Sigma Chemical Co．(St．Louis，MO)から購入され得る。ビス（トリフルオロメ タンスルホニル）ジイソプロピルシランは、Petrarch Systems Inc．(Bertram,P A)から購入され得る。ホスホルアミダイトは、Applied Biosystems(Foster City ，CA)から購入され得る。標準的化学試薬および溶媒は、Aldrich Chemical Comp any(St．Louis，MO)から購入され得る。 実施例１ 3'-5'- 切断可能な結合を含む修飾オリゴヌクレオチドの調製 以下の3'-5'-ヌクレオシド間切断可能結合を含むヌクレオシドダイマーを以下 のように調製する。 Ａ．3',5'- ジアルコキシシランヌクレオシド間結合 3'-O-機能化ヌクレオシド中間体である3'-O-(ジイソプロピルシリル)-2'-デオ キシヌクレオシドトリフレート(1)を、最初に、不活性雰囲気下で、ビス(トリフ ルオロメタンスルホニル)ジイソプロピルシラン（1mmol）を、乾燥アセトニトリ ルに溶解した当モル量の立体障害塩基である、2,6-ジ-tert-ブチル-4-メチルピ リジンに添加することによって調製する。得られる溶液を、冷却浴中で−40℃ま で冷却し、これに、5'-(O)-保護されたヌクレオシドである5'-(ジメトキシトリ チル)-2'-デオキシヌクレオシド（0.9mmol）および2,6-ジ-tert-ブチル-4-メチ ルピリジン（0.25mmol）のジメチルホルムアミド溶液を、10分の時間をかけて添 加する。得られる反応混合物を、−40℃にて１時間撹拌し、次いで、室温まで加 温する。3'-O-ジイソプロピルシリルトリフレート産物を、水から沈殿により、 代表的には90〜100％の範囲の収率で単離する。単離は必要ではなく、そして好 ましくは、反応中間体を、保護されていないヌクレオシドと直接カップリングし て、所望のダイマーを形成する。 上記の手順を用いて、保護されたヌクレオシドの3'-シリル誘導体である、5'- (O)-ジメトキシトリチルチミジン、N6-ベンゾイル-2'-デオキシ-5'-(O)-DMT-ア デノシン、N4-ベンゾイル-2'-デオキシ-5'-(O)-DMT-シチジン、およびN2-イソブ チル-2'-デオキシ-5'-(O)-ジメトキシトリチルグアノシンを、望ましくない3',3 '対称ダイマーの最少の形成で形成する。 中間体(1)を、(1)とヌクレオシドとの混合物を約１時間室温にて撹拌すること によって、チミジンのようなヌクレオシドと反応させる。反応混合物を、激しく 撹拌した氷／水混合物に１滴ずつ添加することによって、カップリングしたダイ マーを単離する。この混合物を濾過して、白色固体を得て、次いで、乾燥し、そ してシリカゲルでのカラムクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル／ヘキサン グラジエント）により精製する。保護されたダイマーである5'-(O)-DMT-3'-(O)- (5'-(O)-ヌクレオシジルジイソプロピルシリル)チミジン(2)は、代表的には、50 〜75％の範囲の収率で単離される。 次いで、調製したダイマーを、自動化固相合成での使用のために機能化して、 ジアルコキシシラン切断可能部位を含むプライマーを形成する。 上記の(2)のようなダイマーを、5'-DMTダイマーをテトラヒドロフランに溶解 し、そして窒素下で、得られた溶液を、4-DMAP（4-ジメチルアミノピリジン）、 ジイソプロピルエチルアミン、および2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホス ホルアミドクロリダイトを含む撹拌したTHF溶液に１滴ずつ添加することによっ て、対応する3'-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト)に変 換し、そして室温で維持する。反応混合物を２時間撹拌し、酢酸エチルに添加し 、塩水で洗浄し、そして硫酸マグネシウムで乾燥する。次いで、粗産物を、溶離 液として1:1酢酸エチル／ヘキサンを使用するシリカでのカラムクロマトグラフ ィーにより精製する。 次いで、ホスホルアミダイト機能化ダイマーを、プログラム可能なDNA合成機 を使用する自動化固相合成での使用のために用いて、3'-5'-ジイソプロピルシリ ルエーテル切断可能部位を含むオリゴヌクレオチドプライマーを形成する。 切断：上記のようなジアルコキシシランヌクレオチド間結合を含む固定化され たプライマーとの所望のハイブリダイゼーションおよび伸長反応を行った後、 シリルエーテル（Si-O）結合を、フッ化イオンでの処理によって選択的に切断し て（Green，1975）、代表的には、修飾プライマー分子に由来するわずか約５の ヌクレオチドを含む伸長産物を放出する。 Ｂ．3'(S)- ホスホロチオエートヌクレオシド間結合 機能化ヌクレオシドである5'-(O)-モノメトキシトリチル-3'-(S)-チオホスホ ルアミダイトを以下のように調製する。3'-S-機能化開始物質である5'-(O)-モノ メトキシトリチル-3'-(S)-ベンゾイルチミジン(3)を、Cosstickら（Cosstickら 、1988）の方法に従って調製する。アルゴン飽和エタノールに溶解し、そして５ ℃で維持した5'-(O)-モノメトキシトリチル-3'-(S)-ベンゾイルチミジンの溶液 を、10N 水酸化ナトリウムで処理することによって、脱ベンゾイル化を行う。得 られる溶液を約１時間撹拌する。産物である5'-O-MMT-3'-チオチミジン(4)を、 シリカゲルでのカラムクロマトグラフィーにより精製する。次いで、5'-(O)-MMT -3'-(S)-チミジン(4)を、標準的条件下で、2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピル アミノホスホモノクロリダイトとの反応によって、対応するチオホスホルアミダ イトに変換する（McBrideら、1983）。3'-(S)-ホスホルアミダイト(5)は、切断 可能なホスホロチオエート部位を含むダイマーを形成するための第２のヌクレオ シドへのカップリングに、またはホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む オリゴヌクレオチドを調製するための自動化固相合成での使用のために適切であ る。 ホスホロチオエートダイマーの化学合成を以下のように行う。3'-(O)-アセチ ルチミジンのアセトニトリル溶液を、5-(4-ニトロフェニル)テトラゾールで飽和 したアセトニトリル中の3'-(S)-ホスホルアミダイト(5)の撹拌した溶液に、20分 の時間をかけて１滴ずつ添加する。テトラゾール活性化剤の使用は、２つのチオ ホスホルアミダイト分子間で生じる自己縮合反応の確率を減少する。得られるチ オホスファイトダイマー(6)を、2,6-ルチジンとの反応混合物をクエンチングし 、次いで、ジクロロメタン中のTBA過ヨウ素酸塩のような酸化剤を添加すること によって、インサイチュで酸化する。完全に保護されたホスホロチオエートダイ マー(7)を、t-ブチルアミン、80％水性酢酸、次いで濃縮したアンモニア水との 処理によって脱保護し、3-(S)-ホスホロチオエート結合したチミジンダイマ ー(8)を得る。 3'-(S)-ホスホロチオエート切断可能結合を含むオリゴヌクレオチドプローブ の形成は、DNA合成機を使用して制御された細孔ガラス上での固相合成によって 行われる。固相反応サイクルを行うためのプロトコルおよび反応条件は、標準的 固相ホスホルアミダイト手順を使用して、所望されるプライマー産物に従って調 整される。上記のように調製した機能化3'-(S)-ホスホルアミダイトヌクレオシ ド(5)を利用して、機能化テトラゾール試薬である5-(パラニトロフェニル)テト ラゾールの存在下で、3'-(S)-ホスホロチオエート部分をオリゴヌクレオチドプ ライマー中に導入する。 切断：3'-(S)-ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む固定化した修飾 プライマーのハイブリダイゼーション、伸長、および洗浄を行った後、リン−硫 黄結合の選択的切断を、水性硝酸銀での処理によって行う。 Ｃ．5'(S)- ホスホロチオエートヌクレオシド間結合 5'-ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドの合成 を、以下に記載のように、誘導体化されたホスホルアミダイトである5'-(S)-ト リチルデオキシチミジン-3'-(O)-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノ) ホスファイトを最初に合成することによって行う。 5'-(O)-p-トルエンスルホニルチミジン(9)を、ピリジン中で、チミジンを１等 量のp-トルエンスルホニルクロリドと反応させることによって調製する。反応混 合物を室温にて３時間撹拌し、氷中で冷却し、そして水の添加によってクエンチ する。酢酸エチル中への溶解、ならびに重炭酸ナトリウムおよび塩水での連続洗 浄の後、溶液を硫酸ナトリウム上で乾燥し、そして溶媒を真空で除去する。所望 の5'-トシレート産物(9)は、酢酸エチル／メタノールから容易に再結晶され、し たがって、3'-OH位での保護基の必要を回避する。 次いで、5'-トシレートを、対応する5'-(S)-トリチルデオキシチミジン(10)に 変換する。5'-(O)-トシルチミジン(9)のエタノール溶液を、エタノール中に５倍 モル濃度過剰の7.0Ｍ水酸化ナトリウムおよびトリフェニルメルカプタンを含む 反応フラスコに添加する（これは対応する反応性チオレートをインサイチュ で生成する）。反応混合物を、不活性雰囲気下で８時間還流し、濾過して残った 固体を除去し、酢酸エチルに溶解し、そして溶液を洗浄し、乾燥し、そして真空 でエバポレートする。粗産物を、メタノール／塩化メチレングラジエントを使用 するシリカゲルでのクロマトグラフィーによって精製する。 所望の反応性ヌクレオシドホスホルアミダイトである5'-(S)-トリチルデオキ シチミジン-3'-(O)-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノ)ホスファイト( 11)を、乾燥1:1アセトニトリル／塩化メチレン中の保護されたヌクレオシドであ る5'-(S)-トリチルデオキシチミジン(10)の溶液を、当モル量のテトラゾールで 処理し、次いで1.5モル濃度過剰の2-シアノエトキシ（cyanoethyoxy）-ビス-(N, N-ジイソプロピルアミノ)ホスフィンを添加することによって調製する。反応混 合物を室温にて約１時間撹拌し、続いてブタノールの添加によってクエンチする 。この溶液を、酢酸エチルで希釈し、洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、 濾過し、そして乾燥するまでエバポレートする。粗産物を、フラッシュクロマト グラフィーによって精製する。 オリゴヌクレオチドプローブへの所望の5'(S)-ホスホロチオエート切断可能部 位の取り込みを、標準的固相ホスホルアミダイト化学を利用して行う。 Ｄ．5'(N)- ホスホルアミデートヌクレオシド間結合 5'-(N)ホスホルアミデートヌクレオチド間結合を含むオリゴヌクレオチドフラ グメントを以下のように調製する。 Hasaら（Hasaら、1976）の手順に従って、四臭化炭素中のアジ化ナトリウムお よびトリフェニルホスフィンでの処理によって、チミジンを、対応する5'-アジ ド誘導体(12)に変化させる。次いで、5'-アジドデオキシチミジン(12)の還元を 、Pd/C触媒上での水素化によって行って、対応する5'-アミノ誘導体(13)を形成 する。 対応する5'-N-保護したヌクレオシドの形成は、(13)（25mmol）を無水ピリジ ン（150ml）に溶解し、これに4-DMAP（17mmol）、トリエチルアミン（17mmol） 、および4-メトキシトリチルクロリド（60mmol）を添加することによって行われ 、そして得られる反応混合物を室温にて２時間撹拌する。メタノールを反応フラ ス コに添加し、そして得られる混合物を飽和重炭酸ナトリウムの溶液に添加し、ク ロロホルムで抽出し、そして有機抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥する。有機 層を乾燥するまでエバポレートし、そして得られる粗残渣をシリカゲルでのカラ ムクロマトグラフィーによって精製し、5'-アミノ-5'-デオキシ-5'-(N)-(4-メト キシトリチル)チミジン(13)を得る。（N-MeOTr保護基の切断を、1,2-ジクロロエ タン中の３％ジクロロ酢酸での処理によって行う）。 オリゴヌクレオチドフラグメントへの取り込みに適切な反応性ホスホルアミダ イト部分を含む所望の機能化ヌクレオシドである5'-アミノ-5'-デオキシ-5'-(N) -(4-メトキシトリチル)チミジン-3'-(2-シアノエチル)-N,N-ジイソプロピルホス ホルアミダイト(14)は、以下のように合成される。 5'-アミノ保護化チミジン(13)（4mmol）を無水塩化メチレン（60ml）に溶解し 、これに、乾燥ビス(ジイソプロピルアンモニウム)テトラゾリド（３mmol）およ び(2-シアノエトキシ)ビス(ジイソプロピルアミノ)ホスフィン（8mmol）を添加 する。この混合物を室温にて１時間撹拌し、飽和重炭酸ナトリウム溶液中に注ぎ 入れ、そしてクロロホルムで数回抽出する。合わせた有機抽出物を塩水ですすぎ 、乾燥し、そして乾燥するまでエバポレートする。粗残渣を最小量の塩化メチレ ンに溶解し、そしてペンタンの添加によって沈殿してジアステレオマー産物14の 混合物を得る。 次いで、機能化ヌクレオシド14を、オリゴヌクレオチドフラグメント中に選択 的に導入して5'-(N)-ホスホルアミデート切断可能部位を含むオリゴヌクレオチ ドを形成する。チミジン誘導体14の5'-アミノ窒素は、ホスホルアミデート結合 形成が起こる反応中心である。修飾ヌクレオシド14を、標準的サイクルのうちに 、以下のように固体支持体上で合成された伸長する（growing）DNAフラグメント 中に導入する。ホスホルアミデート基の挿入を特定の部位で行って、選択的切断 可能部位を含む所望のヌクレオチドフラグメントを形成する。 以下の修飾された配列の例：d(T-T-C-A-T-G-C-A-A-(ホスホルアミデート)-T-C -C-G-A-T-G)（配列番号１）の形成を以下のように行う。DNAフラグメントを、ヘ キサマー配列d(C-C-G-A-T-G)から始まる段階的様式で合成する（Gromova、1987 ）。ヘキサマーを、標準的手順を使用して固体支持体として制御された細孔ガ ラス上で合成する（Bannwarthら、1986；Bannwarth，1987）。重要な中間体14の 導入を、14のカップリングのためおよび4-メトキシトリチル保護基の脱ブロッキ ングのためにわずかにより長い時間を利用する標準的サイクルの間に行う。14の 5'-MeOTr基の切断の後、構築単位として標準的ホスホルアミダイトを使用して合 成を続けて、所望の16マー配列を形成する。 支持体物質を、56℃で一晩、濃アンモニアで処理して、固体支持体から16マー 産物を切断する。支持体物質の除去後、アンモニアを真空エバポレーションによ って除去し、そして残った残査を水／ジオキサンに溶解し、続いてTHFの添加に よって沈殿させる。次いで、得られる16マーをゲル電気泳動またはHPLCのいずれ かによって精製する。 ホスホルアミデートヌクレオチド間結合の選択的化学的切断を穏やかな酸性条 件下で行って、対応するホスフェートおよびアミノ機能化フラグメントを形成す る。２〜６時間の室温における80％酢酸での処理により、DNAフラグメントの修 飾されていない部分はインタクトなまま、ヌクレオチド間ホスホルアミデート結 合の選択的切断を生じる。 実施例２ 固体支持体への付着 Ａ．ストレプトアビジンアフィニティー固定化 切断可能部位を含む上記実施例１からの修飾プライマーを、機能化固体支持体 物質への付着によって固定化する。いくつかの場合には、切断可能部位含有プラ イマーは以下に記載のように修飾される。 ストレプトアビジンでコートした支持体ヘオリゴヌクレオチドプライマーを付 着するために、代表的には、ビオチン化プライマーが使用される。ビオチン化は 以下のように行われる。 切断可能部位を含むプライマーを、実施例１のように（わずかな改変を含む） 調製する：プライマーを、ビオチン化のための反応性アミノ部位を含むように合 成する。アミノ基を、Applied Biosystems 393 DNA/RNA Synthesizerのような標 準的DNA合成機を使用する固相合成の間に導入する。 内部アミノ機能を選択的に導入するために、10原子スペーサーアームでチミン に付着された１級アミンを保護する塩基の不安定なトリフルオロアセチル基を含 む修飾ヌクレオシドホスホルアミダイトAmino-Modifier dTを、DNA合成サイクル の適切な相に添加する。オリゴヌクレオチド合成の完了の際、プライマーを標準 的方法によって支持体から切断する。残っている塩基保護基ならびにトリフルオ ロアセチルアミノ保護基を、40℃にて15〜17時間、新鮮な濃水酸化アンモニウム での処理によって除去する。溶液をロータリーエバポレーションによって乾燥し 、そして残渣を200μlの水に再溶解する。 アミノ修飾プライマー（約0.25μmol）を、NHS-LC-Biotin（Pierce，Rockford IL）と反応させる。これは、ビオチン基とN-ヒドロキシスクシンイミド活性化 カルボキシル基との間に11炭素スペーサーを有する。50mM NHS-LC-ビオチンのDM F溶液のアリコートを、1.5時間かけてpH９で0.1Ｍ重炭酸ナトリウム／炭酸ナト リウム緩衝液を含むプライマー溶液に添加する。この溶液を室温に一晩維持し、 次いでビオチン化プライマーを逆相HPLCによって精製する。 次いで、ビオチン化プライマーを、Dynabeads M-280 Technical Handbook: Ma gnetic DNA Technology 6，Dynal Inc.に記載されるように、ストレプトアビジ ンでカップリングした磁性ビーズ（Dynabeads M-280，Dynal，Inc.，Great Neck , NY）への付着によって固定化する。ネオジム-鉄-ホウ素磁石を使用して、上清 除去および洗浄工程の間、ビーズを固定化する。 Ｂ．チオ尿素結合による固定化 切断可能結合を含む5'-アミノ修飾オリゴヌクレオチドプライマーを、上記の 実施例１および２Ａに記載のように調製する。 ガラススライドを、アミノ機能化オリゴヌクレオチドへのカップリングのため の２段階プロセスで活性化する。最初に、ガラスの表面を、アミノプロピルトリ メトキシシランとの反応によって機能化して、アミノ誘導体化表面を形成する。 アミノ機能化を行うために、きれいな顕微鏡スライドを、95％アセトン／水中の 3-アミノプロピルトリメトキシシラン溶液の１％溶液に２分間浸す。次いで、こ のスライドをアセトンで数回洗浄し（１洗浄につき５分）、そして110℃にて45 分間乾燥する。 アミノ誘導体化後、ガラススライドを過剰のp-フェニレンジイソチオシアネー トで処理して、アミノ基を、アミノ機能化オリゴヌクレオチドへのカップリング に適切なアミノ反応性フェニルイソチオシアネート基に変換する。アミノ誘導体 化ガラスプレートを、10％ピリジン／DMF中の0.2％1,4-フェニレンジイソチオシ アネート溶液の溶液で２時間処理し、次いでメタノールおよびアセトンで洗浄す る。 炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム緩衝液（２μL）中のアミノ修飾プライマ ーの２mM溶液を、活性化ガラスプレート表面に直接塗布し、次いで、得られるス ライドを最小量の水を含むカバーしたペトリ皿中で37℃にて約２時間インキュベ ートする。次いで、チオ尿素結合したプライマーを含むプレートを、１％水酸化 アンモニウム、および水で連続して洗浄し、次いで室温にて空気乾燥する。 Ｃ．Hg-S アフィニティー結合による固定化 アミノ修飾オリゴヌクレオチドプライマーを上記のように調製する。5'-アミ ノ基のチオールへの変換を、1.0mlの0.2モル濃度4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピ ペラジンエタンスルホン酸(pH7.7)中に溶解した5.0Ａ260単位のアミン含有プラ イマーを、乾燥アセトニトリル中の1.6mlの10mMジチオビス(スクシンイミジルプ ロピオネート)と、20℃にて１時間反応させることによって行う。次いで、アセ トニトリル中の10mMジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)のさらなる1. 0mlを反応容器に添加し、そして得られる混合物をさらに１時間撹拌する。ジチ オエリスリトール（0.2M Tris緩衝液中の20mM溶液の3.5ml）の添加に続いて、37 ℃にて１時間撹拌する。チオール誘導体化プライマー溶液を真空下で濃縮して濃 縮物を形成し、これを逆相HPLCを使用してさらに精製し、続いて凍結乾燥する。 チオール修飾オリゴヌクレオチドプライマーを合成するための別のアプローチ では、オリゴヌクレオチドプライマーの5'-リン酸を、β-シアノエチルホスホル アミダイトC6-Thiol-Modifier（Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA ）を使用して6-メルカプトヘキサノールでエステル化する。 次いで、140μlの1.0M塩化ナトリウム、1.0mMエチレンジアミン四酢酸２ナト リウム塩（EDTA）、および50mM Tris・HCl（pH８）に溶解したチオール誘導体化 プライマー（0.25Ａ260単位）の溶液を、50μlのp-クロロメルクリ安息香酸誘導 体化アガロースと、20℃にて３分間混合することによって、チオール誘導体化プ ライマーを、p-クロロメルクリ安息香酸誘導体化アガロースに固定化する。 実施例３ 切断可能なリボースを含む合成DNAプローブの選択的切断 切断可能なリボース部位を含む合成DNAプローブを、水酸化アンモニウム処理 によって選択的に切断した。配列：5'-AAA TAC ATC リボGCT TGA AC-3'（配列番 号10）を有する17マーを、７位に切断可能なリボースを含むように調製した。修 飾プローブを、水性３％水酸化アンモニウムで室温にて（pH10）15分間処理して 、リボース部分の選択的切断をもたらした。 実施例４ リボース含有DNAプローブの選択的切断産物の質量スペクトル分析 実施例３からの切断産物を、イオン化を付随するマトリクス援助レーザー脱着 （MALDI）を飛行時間型（TOF）質量分析法とともに使用して分析した。 試料フラグメントを分析するために使用される実験装置は、励起ソース、試料 マニピュレーター、およびTOF質量分析計を含んだ。脱着に使用される励起ソー スは、周波数的に３倍にされて355nmになるかまたは４倍にされて266nmになる、 空間的にフィルターを通した5 nsパルスを有するNd:YAGレーザー（モデルDCR-1 、Spectra-Physics、Mountain View、CA）、および355nmで操作する35-psパルス Nd:YAGレーザー（モデルPY610C-10、Continuum、Santa Clara、CA）であった。 両方のレーザーを、5nmパルス幅で、10Hz反復速度にて操作した。入射角45°で 維持される脱着レーザービームを、試料上に約100×150μmの長円スポットサイ ズに、250mm焦点長石英レンズで集束した。Glanレーザー偏光子（Newport Corpo ration、Fountain Valley．CA）を、連続的な可変減衰のためにビーム経路中の 回転ステージに配置し、１mJ/cm2より下から100mJ/cm2までの偏光Nd:YAGレーザ ーエネルギー密度の調整を可能にした。脱着の最適エネルギー密度が、２〜20mJ /c m2の範囲にあることを見いだした。 試料の調製を以下のように行った。オリゴヌクレオチドフラグメントを、室温 にて脱イオン水に約50μmol/リットルの濃度になるように溶解した。50％水／ア セトニトリル中の3-ヒドロキシピコリン酸（3-HPA）の別の飽和した溶液を新た に調製し、そして２つの溶液を混合して、10,000:1のモル濃度比で3HPAおよび分 析物を含む試料溶液を提供した。試料溶液の２μLアリコートを試料ステージ上 にピペットで移し、そして2mm直径の面積に広げた。試料を、真空系への挿入前 に穏やかな窒素流下で乾燥させた。 平滑な銀ホイルまたは研磨されたシリコンウェファーのいずれかからなる試料 ステージを、３つの並進移動および１つの回転の自由度を可能にするマニピュレ ーター上に載せた。実験を室温にて行った。試料領域を、１秒当たり300リット ルのターボ分子ポンプにより真空にした。ドリフト（drift）および検出領域を 、公称１秒当たり1500リットルのポンプスピードの低温ポンプを使用して真空に した。チャンバーの基本圧力は３×10-9Torrであり、そして試料導入の約５分以 内の正常作動圧力は５×10-8Torrであった。 脱着の間に生じたイオンを、基底（ground）でのドリフトおよび抽出電位とと もに、28kVの電圧で試料を片寄らせることによって、飛行時間型質量分析計中の 試料表面に対して垂直に抽出した。試料−抽出器の距離は5mmであり、そして試 料から約5cmのエインゼル（einzel）レンズをイオンを集束させるために使用し た。直線および反射TOF質量分析法幾何学の両方を調べた。反射TOF-MSについて 、２つのステージの静電反射器を使用し、そして効果的なドリフト経路は2.0mで あった。二重マイクロチャンネルプレート検出器を使用した。真空チャンバーの 空間的制限のため、検出器を静電偏向器のそばに配置した。偏向電圧を水平偏向 プレートに印加し、そしてイオンを直線幾何学についての検出器に向けさせるた めにビーム経路を曲げた。合計の飛程距離は直線幾何学では１ｍであった。イオ ン化領域で生成されるあらゆる強力な中性の流れが検出器に到達するのを防ぐた めに、４度の屈曲は、イオン生成領域と検出器との間の照準線をブロックするた めに十分であった。反射TOF測定については、ビーム経路を反対の方向に曲げた 。より高いレーザー力で行われる実験において高発生量のイオン化マトリクス分 子 によって引き起こされる検出器の飽和を避けるために、200V/cmのパルス電界に よって低質量マトリクスイオンを偏向させて検出器から離した。 マイクロチャンネルプレートのシグナル出力を増幅し、次いで10〜50ns／チャ ンネルの時間分解能でデジタル化し、そして代表的には100を越えるレーザーパ ルスを合計した。質量キャリブレーションを、低質量でのアルカリ類、同位体で 分析される（isotopically resolved）フラーレン類、グラミシジンＳ、ウシイ ンスリン、ウマ心臓チロクロムＣ，およびウマ心臓ミオグロビンの混合物のよう な、種々の公知の質量を分析することによって行った。 得られる飛行時間型質量スペクトルを図３Ａおよび３Ｂに示す。図３Ａは、水 酸化アンモニウム処理前の切断可能なリボース結合を含む17マー合成混合塩基プ ライマーの質量スペクトルである。２つのかなり大きなピークが、２プロトン化 分子イオン[M+2H]2+およびプロトン化分子イオン[M+H]+に対応する完全な17マー について観察された。 次いで、水酸化アンモニウム処理後に得られる生じたオリゴマーフラグメント を図３Ｂに示すように分析した。質量スペクトルに示すように、予測された切断 産物である、７マー、10マー、および完全な17マーに対応するピークが、容易に 観察可能（および同定可能）であった。 実施例５ 10 位に切断可能なリボースを有するビオチン化プライマーの 捕獲および選択的切断 10位にリボースを含むビオチン化18マーである5'-ビオチン-ATCTTCCTG-リボ-G CAAACTCA-3'、配列番号11（Keystone Laboratories，Inc.、Menlo Park．CA）を 、ストレプトアビジンでコートしたビーズ（DynaBeads M-280、Dynal，Inc.、Gr eat Neck，NY）上に捕獲した。次いで、固定化プライマーを表面結合後に洗浄し 、次いで上記の実施例３に記載のように水酸化アンモニウムで処理して、リボー ス部位の固定化プライマーの選択的切断をもたらした。 ビオチン固定化付着部位および切断可能なリボース部位を含む修飾プライマー を、捕獲前および選択的切断後の両方で分析した。上記実施例４に記載のように 、 MALDIをTOF質量分析法と組み合わせて使用して、試料を分析した。図４は、固定 化プライマー内のリボース部位の選択的切断から生じた８マーの質量スペクトル を示す。 実施例６ 媒介（intermediary）固相結合オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーション による切断可能な伸長したプライマーの固定化 配列番号12として本明細書に示した配列を有する、3'末端から５ヌクレオチド に位置する5'-(S)-チミジンを含む修飾M13逆方向プライマーを、アニーリング緩 衝液である10X「THERMOSEQUENASE」Buffer（260mM Tris-HCl，pH9.5，65mM MgCl2 ）（Amersham Life Sciences、Arlington Heights,．IL）を含むハイブリダイ ゼーション培地中で、一本鎖標的分子（配列番号14）にハイブリダイズした。ア ニーリング反応を、上記混合物を65℃に２分間加温することによって行い、次い でこの混合物を約30分間かけて室温までゆっくりと冷却した（Maniatisら、1982 ；Ausubelら、1989）。 ハイブリダイゼーション後、デオキシヌクレオチドおよびジデオキシヌクレオ シドの混合物の存在下でDNAポリメラーゼ（「THERMOSEQUENASE」DNAポリメラー ゼ）を使用して、修飾プライマーを伸長し、標的内のアデニンの位置に対応する （すなわち、反応産物内のチミジン）オリゴヌクレオチドフラグメントの１セッ トを生成した。反応を、標準的サイクル配列決定プロトコルおよび8:1の比のプ ライマー対テンプレートを使用して行った。用いられたプライマー対テンプレー トのために、プライマー伸長産物の得られるセットは主として（89％）一本鎖の 形態であった。 プライマー伸長後、配列番号13を有する、M13逆方向プライマーに相補的であ りそして3'末端でビオチン化された媒介オリゴヌクレオチドを、混合物に添加し 、そして標準的な加熱／冷却アニーリングプロセスを使用してプライマーにアニ ーリングした：95℃で２分30秒間；95℃で15秒間、45℃で20秒間、55℃で10秒間 、70℃で20秒間を25サイクル；95℃で30秒間、および70℃で20秒間を５サイクル ；次いで１秒当たり0.1℃の速度で１分間95℃から70℃まで冷却し、その後試料 を ４℃で維持した。次いで、ストレプトアビジンでコートした磁性ビーズ（MPG-St eptavidin，CPG，Inc.，Lincoln Park，NJ）を混合物に添加して、ビオチン化媒 介オリゴヌクレオチド／伸長したプライマーハイブリッドを捕獲した。固定化産 物を洗浄して、多工程洗浄プロセスにおいて、酵素、三リン酸、および塩類を除 去した。次いで、試料を硝酸銀（５μL、0.02mM、Aldrich、Milwaukee，WI）お よびDTTで処理して、溶液中に伸長セグメントを放出した。この溶液を、(i)固相 結合した媒介オリゴヌクレオチド−第１のプライマー領域複合体から分離し、(i i)3-ヒドロキシピコリン酸と混合し、(iii)シリコンプレート上で乾燥し、そし て(iv)上記実施例４に記載のようにMALDI TOF質量分析法によって分析した。放 出した伸長セグメントを図13に示す。 図13で見られるように、この方法は、少なくとも約33塩基対までの読みの長さ を有するオリゴヌクレオチド伸長セグメントの、良好な分解能での検出を可能に する。 実施例７ 単一塩基フィンガープリントを使用する点変異の検出 ２つのDNAテンプレート（一方はテンプレート「16-C/19-G」に対応する野生型 M13プラスミドと同一の配列を有する合成73マー（本明細書では配列番号14とし て示す）、および他方はテンプレート「16-A/19-T」と称する（配列番号15とし て本明細書に含まれる部分配列を有する）変異プラスミド）を、プライマー伸長 反応に使用した。テンプレートの配列は、3'末端に対して（プライミング領域の 末端から上流に数えて）16および19位の塩基のみが異なっており、第１のテンプ レートは配列番号14に示すように、16位にシトシンおよび19位にグアニンを有し 、一方第２のテンプレートは配列番号15に対応し、16および19位でそれぞれ置換 されたアデニンおよびチミンを含んでいた。 それぞれのテンプレートを、本明細書で配列番号16として示す配列を有するプ ライマーを使用してddCの存在下で酵素的伸長に供した。得られる産物の混合物 は、ddCで終結した親テンプレートに由来するオリゴヌクレオチドフラグメント を含み、次いでこれを上記のようにMALDI TOF質量分析法によって分析し、そし て図１４Ａ（テンプレート16-C/19-Gに由来する反応産物に対応する、配列番号1 7）および図１４Ｂ（テンプレート16-A/19-Tに由来する反応産物に対応する、配 列番号18）に示した。 反応産物の得られるスペクトルから見られ得るように、それぞれのスペクトル 中の選択ピーク間の差に対応する正確な質量値を算出して、5'末端から16および 19位での２つの単一ヌクレオチド置換の存在を確認した。図１４Ａ-１４Ｂで証 明されるように、ピーク対ピークの差について測定した質量値を大きな字体で示 し、一方、実際／理論的質量値を小さな字体で示す。ＧからＴへの塩基置換を、 テンプレート16-C/19-G（質量ピークｂ−質量ピークａ＝618.9）対テンプレート 16-A/19-T（質量ピークｆ−質量ピークｅ＝593）についてのΔm値の差によって 示す。観察された質量の差の25（618.9−593.4）は、グアニン（MW＝151）とチ ミン（MW＝126）との間の質量の差に一致する。ＣからＡへの変異の結果として1 9位で生じる単一塩基置換の確認を、同様に決定した（例えば、Δmd-b対Δmg-f ）。19位での単一塩基置換を、テンプレート16-A/19-Tに対応するスペクトルに おける19位でのピークの不在によってさらに確認した（図１４Ｂ）。 実施例８ 切断可能プライマー対完全プライマーを使用するプライマー伸長反応の比較 実施例６に記載の手順に従って、5'ビオチン基、およびプライマーの3'末端か ら５ヌクレオチドに位置するチオール-チミジンを含む、修飾M13逆方向プライマ ー（配列番号16）を、一本鎖標的分子（配列番号14）にハイブリダイズし、次い で、デオキシヌクレオチドおよびジデオキシ-Tの混合物の存在下で酵素的伸長を 行って、標的内のアデニンの位置に対応する１セットのオリゴヌクレオチドフラ グメントを生成した。ddT伸長反応後、ビオチン化プライマー／伸長産物を、ス トレプトアビジンでコートした磁性ビーズ上に捕獲した（固定化した）。次いで 、ビーズに固定化したプライマー／伸長産物を一連の洗浄工程に供し、テンプレ ート、酵素、三リン酸、およびさらなる塩類を除去した。次いで、固定化プライ マー／伸長産物をこの時含んでいるストレプトアビジンでコートした磁性ビーズ を、２つのチューブに分けた。第１のチューブの内容物を硝酸銀およびDTTで処 理し て、プライマーの5'-末端から５ヌクレオチドに位置するチオール-チミジンでプ ライマーを切断し、そして溶液中に伸長セグメントを放出した。第２のチューブ の内容物を煮沸して、ビオチン／ストレプトアビジン結合の破壊をもたらし、そ して溶液中に完全プライマー／伸長産物を放出した。次いで、２つの試料を、3- ヒドロキシピコリン酸と別々に混合し、乾燥し、そして上記のようにMALDI TOF 質量分析法によって分析した。 得られる質量スペクトルを図１５Ａ（完全長プライマー-伸長セグメント）お よび図１５Ｂ（増加した読みの長さを有する切断したプライマー-伸長セグメン ト）に示す。見られ得るように、本発明の方法による切断したプライマー-伸長 セグメント試料（図１５Ｂ）のスペクトルの分解能特性および読みの長さは、完 全プライマー-煮沸／放出試料（図１５Ａ）のものより優れている。切断されて いないプライマー試料（図１５Ａ）中の塩基番号15のまわりに集まる広いピーク はプライマーのダイマー化のためであり、そして試料が大量のプライマーを含む 場合にときどき生じる人工物である。プライマーの切断は、図１５Ｂに見られ得 るように、この人工物を除去する。 本発明は特定の方法および実施態様に関して記載されているが、種々の改変お よび変更が本発明から逸脱することなく行われ得ることが理解される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＣＮ，Ｊ Ｐ，ＫＲ (72)発明者 シャラー，トーマス アンドリュー アメリカ合衆国 カリフォルニア 94122, サンフランシスコ，４ティーエイチ アベ ニュー ナンバー３ 1384 (72)発明者 ポラート，ダニエル ジョセフ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94025, メンロパーク，アーボー ロード 855

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．プライマー伸長産物のサイズを決定する方法であって、 (a) プライマーを標的核酸とハイブリダイズする工程であって、該プライマ ーが、(i)該標的核酸に相補的であり；(ii)該プライマーの5'末端を含む第１の 領域を有し、そして(iii)該プライマーの3'末端を含む第２の領域を有し、ここ で、該3'末端が酵素的伸長のためのプライミング部位として作用し得、そして該 第２の領域が切断可能部位を含む、工程、 (b) 該プライマーおよび伸長セグメントから構成される産物を含む混合物を 生成するために、該プライマーを酵素的に伸長する工程； (c) 該伸長セグメントを放出するために、該切断可能部位で切断する工程； および (d) 質量分析法により該伸長セグメントをサイズ計測する工程であって、こ こで、該伸長セグメントの読みの長さが(b)の産物の読みの長さに比例して増加 する、工程、 を包含する、方法。 ２．前記標的核酸が固定化される、請求項１に記載の方法。 ３．前記標的核酸が、前記伸長の前に固定化される、請求項２に記載の方法。 ４．前記標的核酸が、前記切断の前に固定化される、請求項２に記載の方法。 ５．前記切断可能部位が5'→3'酵素により促進される消化をブロックし得るヌ クレオチドであり、そして前記切断が5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を有する酵 素でプライマーの第１の領域を消化することにより行われる、請求項１に記載の 方法。 ６．前記切断可能部位が、前記プライマーの3'末端から約５ヌクレオチドにま たは約５ヌクレオチド以内に位置する、請求項１に記載の方法。 ７．前記プライマーの前記第２の領域は前記切断可能部位も含む単一のヌクレ オチドである、請求項６に記載の方法。 ８．前記第２の領域がリボヌクレオチドである、請求項７に記載の方法。 ９．前記切断可能部位が、ジアルコキシシラン、3'-(S)-ホスホロチオエート 、5'-(S)-ホスホロチオエート、3'-(N)-ホスホルアミデート、5'-(N)ホスホルア ミデート、ウラシル、およびリボースからなる群より選択される、請求項１に記 載の方法。 １０．工程(b)において前記プライマーを伸長するための酵素がDNAポリメラー ゼである、請求項１に記載の方法。 １１．工程(b)において前記プライマーを伸長するための酵素がリガーゼであ る、請求項１に記載の方法。 １２．前記切断する工程の前に、前記固定化された標的核酸から(b)の産物を 分離する工程をさらに包含する、請求項４に記載の方法。 １３．前記サイズ計測が飛行時間型質量分析法による、請求項１に記載の方法 。 １４．前記伸長が、(i)固定化付着部位および(ii)放出可能部位を含むヌクレ オチドの存在下で行われ、ここで前記伸長セグメントが該固定化付着部位および 該放出可能部位を含む、請求項１に記載の方法。 １５．前記サイズ計測の前に、前記伸長セグメントを前記固定化付着部位で固 定化する工程、および該伸長セグメントを前記放出可能部位で放出する工程をさ らに包含する、請求項１４に記載の方法。 １６．プライマー伸長産物のサイズを決定する方法であって、 (a) プライマーを標的核酸とハイブリダイズする工程であって、該プライマ ーが、(i)該標的核酸に相補的であり；(ii)該プライマーの5'末端を含む第１の 領域、および固定化付着部位を有し、そして(iii)該プライマーの3'末端を含む 第２の領域を有し、ここで、該3'末端が酵素的伸長のためのプライミング部位と して作用し得、そして該第２の領域が切断可能部位を含む、工程、 (b) 該プライマーおよび伸長セグメントから構成される産物を含む混合物を 生成するために、該プライマーを酵素的に伸長する工程； (c) 該伸長セグメントを放出するために、該切断可能部位で切断する工程で あって、ここで、該切断の前に該プライマーが該固定化付着部位で固定化される 、工程；および (d) 質量分析法により該伸長セグメントをサイズ計測する工程であって、こ こで、該伸長セグメントの読みの長さが(b)の産物の読みの長さに比例して増加 する、工程、 を包含する、方法。 １７．前記切断可能部位が、前記プライマーの3'末端から約５ヌクレオチドに または約５ヌクレオチド以内に位置する、請求項１６に記載の方法。 １８．前記プライマーの前記第２の領域が、前記切断可能部位も含む単一のヌ クレオチドである、請求項１７に記載の方法。 １９．前記第２の領域が、リボヌクレオチドである、請求項１８に記載の方法 。 ２０．前記切断可能部位が、ジアルコキシシラン、3'-(S)-ホスホロチオエー ト、5'-(S)-ホスホロチオエート、3'-(N)-ホスホルアミデート、5'-(N)ホスホル アミデート、ウラシル、およびリボースからなる群より選択される、請求項１６ に記載の方法。 ２１．工程(b)において前記プライマーを伸長するための酵素がDNAポリメラー ゼである、請求項１６に記載の方法。 ２２．工程(b)において前記プライマーを伸長するための酵素がリガーゼであ る、請求項１６に記載の方法。 ２３．前記切断する工程の前に、前記固定化された産物を洗浄する工程をさら に包含する、請求項１６に記載の方法。 ２４．前記サイズ計測が、イオン化を付随するマトリクス援助レーザー脱着質 量分析法により完了される、請求項１６に記載の方法。 ２５．前記サイズ計測が飛行時間型質量分析法による、請求項２４に記載の方 法。 ２６．前記伸長セグメントが、前記サイズ計測の前に、化学的マトリクスに包 埋される、請求項２４に記載の方法。 ２７．前記プライマーが、固体支持体に結合された介在スペーサーアームへの 前記固定化付着部位での付着によって該固体支持体上に固定化される、請求項１ ６に記載の方法。 ２８．前記介在スペーサーアームが６原子以上の長さである、請求項２７に記 載の方法。 ２９．前記固定化付着部位が、前記プライマーの塩基または糖の１つの上での 置換基として生じる、請求項１６に記載の方法。 ３０．前記固定化付着部位がビオチンまたはジゴキシゲニンである、請求項１ ６に記載の方法。 ３１．前記プライマーが、ガラス、シリコン、ポリスチレン、アルミニウム、 スチール、鉄、銅、ニッケル、銀、および金からなる群より選択される固体支持 体上に固定化される、請求項１６に記載の方法。 ３２．前記プライマーの前記固定化付着部位が、媒介オリゴヌクレオチドに相 補的な一連の塩基から構成され、そして該プライマーが、固体支持体に結合され た該媒介オリゴヌクレオチドへの該固定化付着部位の特異的ハイブリダイゼーシ ョンにより固定化される、請求項１６に記載の方法。 ３３．プライマー伸長産物のサイズを決定する方法であって、 (a) 核酸へのプライマーのハイブリダイゼーションを促進する条件下で、第 １および第２のプライマーを標的核酸と組み合わせて、プライマー／核酸複合体 を生成する工程であって、 ここで、該第１のプライマーが、(i)5'末端および3'末端を有し、(ii)該標的 核酸に相補的であり、(iii)該第１のプライマーの該5'末端を含む第１の領域を 有し、そして(iv)該第１のプライマーの該3'末端を含む第２の領域を有し、ここ で該3'末端が酵素的伸長のためのプライミング部位として作用し得、そして該第 ２の領域が切断可能部位を含み、 そして、ここで、該第２のプライマーが、(i)5'末端および3'末端を有し、(ii )該標的核酸に相補的であり、(iii)該第２のプライマーの該3'末端を含む第１の セグメントを有し、そして(iv)該第２のプライマーの該5'末端を含む第２のセグ メント、および固定化付着部位を有する、工程、 (b) DNAポリメラーゼおよびデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で、該プ ライマー／核酸複合体を二本鎖フラグメントに変換する工程、 (c) (i)一本鎖フラグメントを生成するために、該二本鎖フラグメントを変性 する工程、(ii)ストランド／プライマー複合体を形成するために、該一本鎖フラ グメントを該第１および第２のプライマーとハイブリダイズする工程、(iii)DNA ポリメラーゼおよびデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で、該ストランド／ プライマー複合体から増幅産物を生成する工程、および(iv)所望の程度の増幅が 達成されるまで、工程(i)〜(iii)を繰り返す工程、を連続的に繰り返すことによ り、プライマー含有フラグメントの数を増幅する工程、 (d) 該第２のプライマーを含む増幅産物を該固定化付着部位を介して固定化 する工程、 (e) 固定化されていない増幅フラグメントを除去する工程、 (f) 二本鎖産物を含む混合物を生成するために、該増幅産物を該切断可能部 位で切断する工程、 (g) 該伸長セグメントを放出するために該二本鎖産物を変性する工程、およ び (h) 質量分析法により該伸長セグメントをサイズ計測する工程であって、こ こで、該伸長セグメントの読みの長さが、(c)の該増幅されたストランド-プライ マー複合体の読みの長さに比例して増加する、工程、 を包含する、方法。 ３４．プライマー伸長産物のサイズを決定する方法であって、 (a) 核酸へのプライマーのハイブリダイゼーションを促進する条件下で、第 １および第２のプライマーを標的核酸と組み合わせて、プライマー／核酸複合体 を生成する工程であって、ここで、該第１のプライマーが、(i)該標的核酸に相 補的であり；(ii)該プライマーの5'末端を含む第１の領域、および固定化付着部 位を有し、そして(iii)該プライマーの3'末端を含む第２の領域を有し、ここで 、該3'末端が酵素的伸長のためのプライミング部位として作用し得、そして該第 ２の領域が切断可能部位を含み、そして該第２のプライマーが、該標的核酸に相 同である、工程、 (b) DNAポリメラーゼおよびデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で、該プ ライマー／核酸複合体を二本鎖フラグメントに変換する工程、 (c) (i)一本鎖フラグメントを生成するために、該二本鎖フラグメントを変性 する工程、(ii)ストランド／プライマー複合体を形成するために、該一本鎖フラ グメントを該第１および第２のプライマーとハイブリダイズする工程、(iii)DNA ポリメラーゼおよびデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で、該ストランド／ プライマー複合体から二本鎖増幅産物を生成する工程、および(iv)所望の程度の 増幅が達成されるまで、工程(i)〜(iii)を繰り返す工程、を連続的に繰り返すこ とにより、プライマー含有フラグメントの数を増幅する工程、 (d) 該第１のプライマーおよび伸長セグメントから構成される産物を含む混 合物を生成するために、該増幅フラグメントを変性する工程； (e) 該固定化付着部位を利用して該第１のプライマーを含む増幅フラグメン トを固定化し、そして固定化されていない増幅フラグメントを除去する工程、 (f) 該伸長セグメントを放出するために、該第１のプライマーを該切断可能 部位で切断する工程；および (g) 質量分析法により該伸長セグメントをサイズ計測する工程であって、こ こで、該伸長セグメントの読みの長さが、(d)の産物の読みの長さに比例して増 加する、工程、 を包含する、方法。 ３５．標的DNA配列のDNA配列を決定する方法であって、 (a) プライマーを標的DNAとハイブリダイズする工程であって、該プライマー が、(i)該標的DNAに相補的であり；(ii)該プライマーの5'末端および固定化付着 部位を含む第１の領域を有し、そして(iii)該プライマーの3'末端を含む第２の 領域を有し、ここで、該3'末端が酵素的伸長のためのプライミング部位として作 用し得、そして該第２の領域が切断可能部位を含む、工程、 (b) プライマー伸長産物の混合物を生成するために、４つの異なるジデオキ シヌクレオチドの第１番目の存在下で、該プライマーを酵素で伸長する工程であ って、各産物がプライマーおよび伸長セグメントを含む、工程； (c) 該伸長セグメントを放出するために、該切断可能部位で切断する工程で あって、ここで該切断の前に該プライマーが該固定化付着部位で固定化される、 工程； (d) 質量分析法により該伸長セグメントをサイズ計測する工程であって、こ こで、該伸長セグメントの読みの長さが(b)の産物の読みの長さに比例して増加 する、工程、 (e) 該４つの異なるジデオキシヌクレオチドの第２番目、第３番目、および 第４番目について工程(a)〜(d)を繰り返す工程、および (f) ４つの伸長反応のそれぞれから得られる該伸長セグメントのサイズの比 較によって、該標的DNAのDNA配列を決定する工程、 を包含する、方法。 ３６．標的DNA配列のDNA配列を決定する方法であって、 (a) プライマーを標的DNAとハイブリダイズする工程であって、該プライマー が、(i)該標的DNAに相補的であり；(ii)該プライマーの5'末端および固定化付着 部位を含む第１の領域を有し、そして(iii)該プライマーの3'末端を含む第２の 領域を有し、ここで、該3'末端が酵素的伸長のためのプライミング部位として作 用し得、そして該第２の領域が切断可能部位を含む、工程、 (b) ホスホロチオエート結合を含むプライマー伸長産物の混合物を生成する ために、４つの異なるデオキシヌクレオチドα-チオ三リン酸アナログ（dNTPαS ）の第１番目の存在下で、該プライマーを酵素で伸長する工程、 (c) 該ホスホロチオエート結合で特異的に切断する試薬で該プライマー伸長 産物を処理する工程であって、 ここで、該処理が限定された切断を生じる条件下で行われて、１セットのプラ イマー伸長分解産物の生成を生じる、工程、 (d) 該プライマー伸長分解産物を洗浄する工程であって、ここで、該洗浄の 前に、該プライマー伸長分解産物が該固定化付着部位で固定化され、各固定化さ れたプライマー伸長分解産物がプライマーおよび伸長セグメントを含み、該洗浄 が固定化されていない種を除去するために効果的である、工程、 (e) 該伸長セグメントを放出するために、該切断可能部位で切断する工程、 (f) 質量分析法により該伸長セグメントをサイズ計測する工程であって、こ こで、いずれかの所定の伸長セグメントの読みの長さがその対応するプライマー 伸長分解産物の読みの長さに比例して増加する、工程、 (g) 該４つの異なるdNTPαSの第２番目、第３番目、および第４番目について 工程(a)〜(f)を繰り返す工程、および (h) ４つの伸長反応のそれぞれから得られる該伸長セグメントのサイズの比 較によって、該標的DNAのDNA配列を決定する工程、 を包含する、方法。 ３７．工程(c)の前記試薬が、エキソヌクレアーゼ、2-ヨードエタノール、お よび2,3-エポキシ-1-プロパノールからなる群より選択される、請求項３６に記 載の方法。 ３８．標的DNA配列の単一塩基のフィンガープリントを決定する方法であって 、 (a) プライマーを標的DNAとハイブリダイズする工程であって、該プライマー が、(i)該標的DNAに相補的であり；(ii)該プライマーの5'末端および固定化付着 部位を含む第１の領域を有し、そして(iii)該プライマーの3'末端を含む第２の 領域を有し、ここで、該3'末端が酵素的伸長のためのプライミング部位として作 用し得、そして該第２の領域が切断可能部位を含む、工程、 (b) プライマー伸長産物の混合物を生成するために、該単一塩基に対応する ジデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で、該プライマーを酵素で伸長する工 程であって、各産物がプライマーおよび伸長セグメントを含む、工程； (c) 該伸長セグメントを放出するために、該切断可能部位で切断する工程で あって、ここで、該切断の前に、該プライマーが該固定化付着部位に固定化され る、工程； (d) 質量分析法により該伸長セグメントをサイズ計測する工程であって、こ こで、いずれかの所定の伸長セグメントの読みの長さが(b)のその対応するプラ イマー伸長産物の読みの長さに比例して増加する、工程、および (e) 該伸長セグメントのサイズの比較によって、該標的DNA内の該単一塩基の 位置を決定する工程、 を包含する、方法。 ３９．標的DNA配列のアデニンフィンガープリントを決定する方法であって、 (a) プライマーを標的DNAとハイブリダイズする工程であって、該プライマー が、(i)該標的DNAに相補的であり；(ii)該プライマーの5'末端および固定化付着 部位を含む第１の領域を有し、そして(iii)該プライマーの3'末端を含む第２の 領域を有し、ここで、該3'末端が酵素的伸長のためのプライミング部位として作 用し得、そして該第２の領域が切断可能部位を含む、工程、 (b) 該標的中のdATPに対応する位置にdUTPを含むプライマー伸長産物の混合 物を生成するために、デオキシアデノシン三リン酸（dATP）、デオキシチミジン 三リン酸（dTTP）、デオキシシチジン三リン酸（dCTP）、デオキシグアノシン三 リン酸（dGTP）、およびデオキシウリジン三リン酸（dUTP）の存在下で、該プラ イマーを酵素で伸長する工程であって、各産物がプライマーおよび伸長セグメン トを含む、工程、 (c) dUTP位置で特異的にフラグメント化するためにウラシルDNA-グリコシラ ーゼで該プライマー伸長産物の生成を処理する工程であって、１セットのプライ マー伸長分解産物の生成を生じる、工程、 (d) 該プライマー伸長分解産物を洗浄する工程であって、ここで、該洗浄の 前に、該プライマー伸長分解産物が該固定化付着部位で固定化され、各固定化さ れたプライマー伸長分解産物がプライマーおよび伸長セグメントを含み、ここで 、該洗浄が固定化されていない種を除去するために効果的である、工程、 (e) 該伸長セグメントを放出するために、該切断可能部位で切断する工程、 (f) 質量分析法により該伸長セグメントをサイズ計測する工程であって、こ こで、いずれかの所定の伸長セグメントの読みの長さがその対応するプライマー 伸長分解産物の読みの長さに比例して増加する、工程、および (g) 該放出された伸長セグメントのサイズの比較によって、該標的DNA中のア デニンの位置を決定する工程、 を包含する、方法。
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