JP4231056B2 - 質量分析に基づいたｄｎａ診断 - Google Patents

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Description

発明の詳細な説明
［発明の背景］
全ての生きている生物（例えば動物、植物および微生物）の遺伝的情報はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）にコードされている。ヒトにおいては、完全ゲノムは、２４の染色体上に位置している約１０００００の遺伝子から構成されている（Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ，Ｔ．Ｓｔｒａｃｈａｎ，ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９２）。それぞれの遺伝子は、その転写および翻訳を介した発現後に、生細胞の内部で特定の生物学的機能を実現する特定のタンパク質をコードしている。ＤＮＡ配列中の変化は変異として知られ、改変された、または場合によっては生物学的活性を失ったタンパク質をもたらす；これが順に遺伝病を引き起こしうる。変異には、ヌクレオチドの欠失、挿入、変更（すなわち点変異）が含まれる。点変異は、タンパク質のアミノ酸配列の変化をもたらす「ミスセンス」、または停止コドンをコードし、それにより切断されたタンパク質へつながる「ナンセンス」の何れかで有り得る。
３０００より多くの遺伝病が現在知られており（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，Ｄ．Ｎ．Ｃｏｏｐｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｋｒａｗｃｚａｋ， ＢＩＯＳ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９３）、それには血友病、地中海貧血、デュシェーヌ筋肉ジストロフィー（ＤＭＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、アルツハイマー病および嚢胞繊維症（ＣＦ）が含まれる。変異遺伝子で、遺伝病をもたらすもの加えて、特定の出生欠陥は、トリソミー２１（ダウン症候群）、トリソミー１３（パタウ症候群）、トリソミー１８（エドワード症候群）、モノソミーＸ（ターナー症候群）および、クラインフェルター症候群（ＸＸＹ）等のその他の性染色体異数体等の、染色体異常という結果となる。さらに、特定のＤＮＡ配列は、個体を、数多くの病気、例えば糖尿病、細動脈硬化、肥満、多様な自己免疫疾患およびガン（結腸直腸、胸部、卵巣、肺）等にかかりやすくすることがあるという、増加している証拠がある。
ウイルス、バクテリア、カビおよびその他の感染性生物は、異なった核酸配列であって宿主細胞中に含まれているものとは異なったものを含んでいる。故に、感染性生物はそれらの特異的ＤＮＡ配列に基づいて検出、同定され得る。
約１６ヌクレオチドの配列が、ヒトゲノムのサイズに対してすら統計的背景において特異的であるため、比較的短い核酸配列を、通常および欠陥遺伝子を高度生物において検出するため、および感染性微生物（例えば細菌、菌類、原生動物および酵母）およびウイルスを検出するために利用することができる。ＤＮＡ配列は、同じ種のうちの異なった個体の検出のための指紋としてすら機能し得る（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｓ．ａｎｄ Ｍ．Ｗ．Ｔｏｍｐｓｏｎ，ｅｄｓ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ（１９８６）。
ＤＮＡ検出のためのいくつかの方法が現在用いられている。例えば、核酸配列は、増幅された核酸断片の移動性を公知の標準試料とゲル電気泳動によって比較することにより、または、同定されるべき配列と相補的なプローブとのハイブリダイゼーションにより、同定され得る。しかしながら、同定は核酸断片が敏感なレポーター機能でラベルされている場合のみに達成される（例えば、放射性（３２Ｐ、３５Ｓ）、蛍光または化学発光）。しかし、放射性標識は危険である場合も有り、それらの生産する信号は時間が経つにつれて低下する。非同位体性標識（蛍光等）は感度の欠如および高強度レーザーが用いられた場合の信号の減少が難点である。さらに、標識するにあたって、電気泳動およびそれに続く検出は、労力を要し、時間がかかり、誤差の起こりうる傾向にある工程である。電気泳動はとくに誤差が起こりやすいが、それは核酸の大きさまたは分子量が、ゲルマトリックスにおける移動性と直接的に相関しないからである。配列特異的効果、２次構造およびゲルマトリックスとの相互作用が原因となる人工的構造である。
一般に、質量分析は、真空中で分子をイオン化させ、それを揮発により「飛ばす」ことによる、個々の分子の「計重量」手段を提供している。電気的および磁気的場の組合せの影響の下で、イオンはそれらの個々の質量（ｍ）および電荷（ｚ）に応じて曲線をたどる。低分子量を有する分子の範囲では、質量分析は長い間、親分子イオンの質量の決定による有機分子の分析および性質決定のための、決まりきった物理−化学的レパートリーの一部であった。さらに、他の粒子（アルゴン原子等）とこの親分子イオンが衝突するよう手配することにより、分子イオンは断片化され、所謂衝突誘導解離（ＣＩＤ）による２次イオンを形成する。断片化のパターン／経路は、非常に頻繁に、詳細な構造情報を誘導することを可能とする。この分野、特に生物科学において、数多くの質量分析の応用方法が知られており、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１９３：”Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍeｔｒｙ”（Ｊ．Ａ．ＭｃＣｌｏｓｋｅｙ，ｅｄｉｔｏｒ），１９９０，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋにまとめられており、見ることができる。
高度な検出感度、質量測定の正確さ、ＭＳ／ＭＳ構成と組み合わされたＣＩＤによるより詳細な構造情報の提供、および速さ並びにコンピュータへのオンラインでのデータの転送における質量分析の明白な利点のため、核酸の構造分析のための質量分析の利用に対してかなりの関心が持たれてきている。この分野をまとめている最近の総説には、Ｋ．Ｈ．Ｓｃｈｒａｍ，”Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ．Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｉｔｏｎｓ ｏｆ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ”３４，２０３−２８７（１９９０）；およびＰ．Ｆ．Ｃｒａｉｎ，”Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓａｅｒｃｈ，”Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，９，５０５−５５４（１９９０）が含まれる。
しかしながら、核酸は、揮発させることが非常に難しい、非常に極性の高いバイオポリマーである。当然の結果として、質量分析的検出は、低分子量合成オリゴヌクレオチドの親分子イオンの質量決定、およびこれを通じての既知のオリゴヌクレオチド配列の確認、あるいは他には、ＭＳ／ＭＳ構成において、特にイオン化および揮発のためにＦａｓｔ ａｔｍｉｃ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ（ＦＡＢ質量分析）法またはプラズマ放出（ＰＤ質量分析）を用いたＣＩＤを介した２次イオン（断片イオン）の生成を通じた既知の配列の確認に限定されていた。例としては、オリゴヌクレオチドの化学合成のための保護二量体ブロックの分析へのＦＡＢの応用が、（Ｋｏｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ １４，１１１−１１６（１９８７））に記載されている。
さらに２つの最近のイオン化／放出技術とは、電子スプレー／イオンスプレー（ＥＳ）およびマトリックス補助レーザー放出／イオン化（ＭＡＬＤＩ）である。ＥＳ質量分析は、Ｆｅｎｎ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．８８，４４５１−５９（１９８４）ＰＣＴ出願Ｎｏ．ＷＯ９０／１４１４８）によって導入され、現在の用途は最近の総説記事（Ｒ．Ｄ．Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ，６２，８８２−８９（１９９０）およびＢ．Ａｒｄｒｅｙ，Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ Ｅｕｒｏｐｅ，４，１０−１８（１９９２））においてまとめられている。テトラデカヌクレオチドの分子量（Ｃｏｖｅｙ ｅｔ ａｌ．”Ｔｈｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔｓ ｂｙ Ｉｏｎｓｐｒａｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ”，Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，２，２４９−２５６（１９８８））、および２１ｍｅｒ（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９３，”Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ”（ＭｃＣｌｏｓｋｅｙ，ｅｄｉｔｏｒ），ｐ．４２５，１９９０，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）が出版されている。質量分析器として、クワドラポールが最も頻繁に用いられる。１０兆分の１モルの量の試料中の分子量の決定には、分子量の計算のために全て用いることができる複数のイオンピークの存在のために非常に正確である。
ＭＡＬＤＩ質量分析は、これと対照的に、質量分析器として飛行時間（ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ；ＴＯＦ）構成が用いられた場合に特に魅力的である。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析は、Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．（”Ｍａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ ＵＶ−Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ： Ａ Ｎｅｗ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｏｆ Ｌａｒｇｅ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ ａｎｄ ＭｃＣｌｏｓｋｅｙ．ｅｄｉｔｏｒｓ），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ｐｐ．４９−６０，１９９０）により導入された。この技術に関しては、ほとんどの場合、複数のピークが生成されないため、質量分析は、原理においては、ＥＳ質量分析と比較して単純に見える。
分子量４１００００ダルトンまでのＤＮＡ分子は放出され揮発されているが（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，”Ｖｏｌａｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｉｇｈ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ ＤＮＡ ｂｙ Ｐｕｌｓｅｄ Ｌａｓｅｒ Ａｂｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｒｏｚｅｎ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４５，１５８５−８７（１９８９））、この技術はこれまで非常に低い分解能を示してきた（１８ヌクレオチドまでのオリゴチミジル酸，Ｈｕｔｈ−Ｆｅｈｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，６，２０９−１３（１９９２）；ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｕｐ ｔｏ ５００ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｉｎ ｌｅｎｇｔｈ Ｋ．Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，８，７２７−７３０（１９９４）：および２８塩基対の二本鎖ＤＮＡ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，”Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ｂｙ Ｌａｓｅｒ Ａｂｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ａ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｍａｔｒｉｘ”，Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，４，３４８−３５１（１９９０）。
日本国特許出願第５９−１３１９０９号には、電気泳動、液体クロマトグラフィーまたは高速ゲル濾過の何れかで分離された核酸断片を検出する装置が記載されている。質量分析検出は、核酸中に、Ｓ、Ｂｒ、ＩまたはＡｇ、Ａｕ、Ｐｔ、Ｏｓ、Ｈｇ等の通常はＤＮＡ中に存在しない原子を取り込むことにより実現される。
［発明の概要］
本発明は、生物学的試料中の特定の核酸配列を検出するための質量分析方法を提供するものである。検出されるべき配列に応じて、方法を利用、例えば、遺伝病または染色体異常；病気または状態になる傾向（例えば肥満、動脈硬化、ガン）または病原性生物（ウイルス、細菌、寄生生物または菌類）による感染の診断（出産前、出産後等）；または同定、遺伝または適合性（ＨＬＡ表現型等）に関する情報を提供することができる。
第１の実施例では、検出されるべき核酸配列（即ち標的）を含む核酸分子は、最初に固体支持体に固定化される。固定化は、例えば、標的核酸分子の標的検出サイトとは異なる部分と、予め固体支持体上に固定化されている捕捉核酸分子との間のハイブリダイゼーションに基づいて、なされてもよい。他には、固定化は、標的核酸分子と固体支持体との直接的結合によってなされてもよい。好ましくは、標的核酸分子と支持体との間にはスペーサー（核酸分子等）が存在する。標的検出サイトと相補的な検出核酸分子（オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体等）を、続いて、標的検出サイトと接触させ、そして標的検出サイトの存在を示す二重体の形成を、質量分析によって検出することができる。好ましい実施態様においては、標的検出サイトは検出に先立って増幅されており、核酸配列分子は調整されている。更に好ましい実施態様においては、標的検出配列は複数の同時検出（多重化）並びにオリゴヌクレオチド配置（ＤＮＡチップ）を用いた平衡処理が可能であるような形式に配置されている。
第２の実施例においては、標的核酸分子の固定化は必須の段階というよりはむしろ選択的段階である。その代わりに、一旦核酸分子が生物学的試料から得られると、その標的配列は増幅され、質量分析で直接検出される。好ましい実施態様においては、標的検出サイトおよび／または検出オリゴヌクレオチドは質量分析検出に先立って調整されている。別の好ましい実施態様においては、増幅された標的検出サイトは、複数の同時検出（多重化）並びにオリゴヌクレオチド配置（ＤＮＡチップ）を用いた平衡処理が可能であるような形式に配置されている。
第３の実施態様においては、生物学的試料より得られた核酸分子から複製された核酸分子を、１またはそれ以上のヌクレアーゼを用いて（ＤＮＡにデオキシリボヌクレアーゼ、またはＲＮＡにリボヌクレアーゼを用いて）特異的に消化することが可能で、対応する相補的な配列を担持している固体支持体上で断片が捕捉される。ハイブリダイゼーション事象および捕捉された標的配列の実際の分子量は、遺伝子中に変異があるか、またどこにあるかについて情報を提供する。このアレイは質量分析を用いて部分ごとに分析することができる。ＤＮＡは同様に、制限エンドヌクレアーゼを含むヌクレアーゼカクテルを用いて消化することができる。好ましい実施例においては、核酸断片は質量分析検出に先立って調整されている。
第４の実施例においては、対立形質遺伝子（変異または正常）に相補的な３’末端塩基を有する少なくとも１つのプライマーを、その対立形質遺伝子を含む標的核酸分子とハイブリダイズさせる。適当なポリメラーゼ、および、完全ヌクレオシド３リン酸のセットまたは１つだけのヌクレオシド３リン酸を、別々の反応において用いて、異なったプライマー伸長を供給する。プライマーが適切にアニーリングし（即ち、３’ミスマッチが無い）、正確な（即ち相補的な）ヌクレオチドが付加された場合のみ、プライマーは伸長される。その産物は、質量分析により決定されるように、分子量シフトによって分析することができる。
第５の実施態様においては、検出されるべき核酸配列（即ち標的）を含む核酸分子が最初に固体支持体に固定化される。固定化は、例えば、標的核酸分子の標的検出サイトとは異なる部分と、予め固体支持体上に固定化されている捕捉核酸分子との間のハイブリダイゼーションに基づいて、なされてもよい。他には、固定化は、標的核酸分子と固体支持体との直接的結合によってなされてもよい。好ましくは、標的核酸分子と支持体との間にはスペーサー（核酸分子等）が存在する。変異サイトの５’に隣接している標的検出サイトの部分に相補的である核酸分子を、続いて標的核酸分子とハイブリダイズさせる。ジデオキシヌクレオシドまたは３’デオキシヌクレオシド３リン酸（ｐｐｐＡｄｄ、ｐｐｐＴｄｄ、ｐｐｐＣｄｄ、およびｐｐｐＧｄｄ等）の完全セットおよびＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼの添加により、Ｘに相補的なただ１つのジデオキシヌクレオシドまたは３’デオキシヌクレオシド３リン酸の添加が可能となる。ハイブリダイゼーション産物は続いて質量分析によって検出することができる。
第６の実施態様においては、標的核酸は、変異Ｍを含む領域内部の標的とハイブリダイズする相補的なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる。この異種二重体を続いて、ハイブリダイズしていない部分で特異的に分解可能な試薬（例えば、一本鎖特異的エンドヌクレアーゼ）と接触させ、変異の存在を示すミスマッチが、標的核酸の分解という結果となるようにする。２つの分解産物は質量分析により検出することができる。
第７の実施態様においては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）に基づき、標的核酸はライゲーション反応物のセットおよび熱安定性ＤＮＡリガーゼを用いてハイブリダイズされ、リガーゼ反応物が互いに共有結合的に結合され、ライゲーション産物を形成するようにする。ライゲーション産物は、続いて質量分析により検出し、公知の数値と比較することができる。反応がサイクル方式で実行された場合は、得られたライゲーション産物は、少量の標的核酸の検出をよりよく実行するために増幅されることが可能である。ライゲーション点での野生型と変異プライマーとの間の選択は、点変異の検出という結果となる。
本発明の方法は、質量分析による核酸検出の増加された精度と信頼性を提供する。加えて本方法は、偽陰性および偽陽性結果を防止するための厳重な制御を可能とする。本方法は電気泳動段階；標識化およびそれに続く標識の検出を回避している。事実、全体の手順は、核酸の単離、増幅、質量分析解析を含めて、わずか２−３時間の時間のみを必要とする。故に、ここに開示された方法は、現存しているＤＮＡ検出システムよりも、実行がより迅速でより安価である。更に、本開示の方法は、核酸断片を、それらの特異的な分子量（曖昧ではない物理的基準）によって同時に検出、同定することを可能としているので、開示された方法は現在利用しうる方法よりも、はるかに正確で信頼できるものである。
［発明の詳しい説明］
一般に、本発明は、生物学的試料中の特定の核酸配列を検出するための質量分析方法を提供するものである。ここで用いられているように、用語「生物学的試料」とは、生きている給源から得られた何れの物質をも指す（ヒト、動物、植物、細菌、菌類、原生動物、ウイルス等）。本発明においての利用のために、生物学的試料は核酸を含んでいなければならない。本発明において用いるために適当な生物学的試料の例には、固体物質（組織、細胞、沈殿、生検等）および生物学的液体（尿、血液、唾液、羊水、口洗浄液等）が含まれる。
核酸分子は特定の生物学的試料から、当業者によく知られている数多くの手順を用いて、単離することが可能であり、特定の生物学的試料に好適な特定の単離手順が選択される。例えば、凍結融解およびアルカリ溶解手順は、固体から核酸分子を得るために有用である；加熱およびアルカリ溶解手順は尿から核酸分子を得るために有用である；そして、プロテイナーゼＫ抽出は血液から核酸を得るために用いられる（Ｒｏｌｆｆ，Ａ ｅｔ ａｌ．ＰＣＲ：ＣｌｉｎｉｃａｌＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（１９９４））。
質量分析を行うための適当な量の核酸分子を得るためには、増幅が必要であることもある。本発明において使用するための適切な増幅の手順には：クローニング（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｃ．Ｒ．Ｎｅｗｔｏｎ ａｎｄ Ａ．Ｇｒａｈａｍ，ＰＣＲ，ＢＩＯＳ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９４）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｉｅｄｍａｍｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９４）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄ Ａｐｐｌ．Ｖｏｌ．３，Ｐｐ．５７−６４；Ｆ．Ｂａｒａｎｙ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８，１８９−９３（１９９１），鎖変換増幅（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＳＤＡ）（Ｇ．Ｔｅｒｒａｎｃｅ Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２２，２６７０−７７（１９９４））およびＲＴ−ＰＣＲ等の変化型（Ｈｉｇｕｃｈｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１０２６−１０３０（１９９３）），対立形質特異的増幅（ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＡＳＡ）および転写ベースの手順が含まれる。
質量分析解析を実行するために、検出されるべき核酸配列を含んでいる核酸分子は固体支持体に固定化されていてもよい。適切な固体支持体の例には、ビーズ（例えばシリカゲル、制御孔ガラス、磁気、セファデックス／セファロース、セルロース）平面表面またはチップ（例えばグラスファイバーフィルター、ガラス表面、金属表面（鉄、金、銀、アルミニウム、銅およびシリコン）、キャピラリー、プラスチック（例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリビニリデンジフルオライド膜またはマイクロタイタープレート））；または、ビーズまたは平面表面を含む同様の原料から製造されたピンまたはコーム、または例えばウエハー（シリコンウエハー等）等の平面表面上の孔におかれたビーズが含まれる。
固定化は、例えば、既に支持体に固定されている捕捉核酸配列と、検出されるべき核酸配列を含む核酸分子の内部にも含まれている相補的核酸配列との間のハイブリダイゼーションに基づいて成されてもよい（図１Ａ）。相補的核酸分子の間のハイブリダイゼーションが支持体によって妨害されないように、捕捉核酸は、固体支持体と捕捉核酸配列との間に、長さで少なくとも約５ヌクレオチドのスペーサー領域を含んでもよい。形成された二重体はレーザーパルスの影響下で分解され、放出が開始され得る。固体支持体結合塩基配列は、天然オリゴリボ−またはオリゴデオキシリボヌクレオチド並びにアナログ（チオ改変ホスホジエステルまたはホスホトリエステル骨格等）を通して、または、塩基配列を酵素的分解に対して感受性ではないようにし、それにより固体支持体上の捕捉塩基配列の全体の安定性を増加させるところのＰＮＡアナログ等のオリゴヌクレオチド類似体を用いて（Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４，１４９７（１９９７）を参照）提示されてもよい。
その他には、標的検出サイトは、標的核酸分子（Ｔ）上の適当な官能基（Ｌ’）と、捕捉分子上の適当な官能基（Ｌ）との間の可逆的または不可逆的結合を介して、固体支持体に直接結合されていてもよい。可逆的結合とは、質量分析の条件下で分解されるようなものであってもよい（即ち、荷電移送複合体または比較的安定な有機ラジカルの間で形成されている不安定な結合等の光分解性結合）。更には、結合は、４級アンモニア基であるＬ’とともに形成されてもよく、この場合には、好ましくは、固体支持体は陰性に荷電した核酸骨格を寄せ付けない陰性電荷を担持しており、それにより質量分析による解析のために要求される放出を実現している。放出は、レーザーパルスにより生成される加熱によって、および／またはＬ’に応じた、Ｌ’発色団と共鳴しているレーザーエネルギーの特異的吸収によって、の何れかで生じ得る。
例として、Ｌ−Ｌ’化学作用は、ジスルフィド結合型（例えばメルカプトエタノールまたはジチオエリスロールにより化学分解可能）、ビオチン／ストレプトアビジンシステム、トリチルエーテル基のヘテロ二重機能性（ｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）派生体（Ｋｏｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，”Ａ Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ａｃｉｄ−Ｌａｂｉｌｅ Ｌｉｎｋｅｒ ｆｏｒ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３１．７０９５（１９９０））で弱酸性条件下および質量分析条件下で分解され得るもの、ヒドラジニウム／酢酸バッファーおよび中性条件下で分解されうるレブリニル基、トリプシン等のエンドペプチダーゼ酵素によって分解されるアルギニン−アルギニンまたはリジン−リジン結合、ピロホスファターゼにより分解されるピロリン酸結合、または、例えばリボヌクレアーゼまたはアルカリ等で分解され得るオリゴデオキシリボヌクレオチド配列の間にあるリボヌクレオチド結合の型であってもよい。
官能基ＬおよびＬ’はまた、荷電移動複合体を形成し、それにより一時的Ｌ−Ｌ’結合を形成していてもよい。多くの場合に「荷電移動バンド」はＵＶ／可視分光で決定できるので（例えばＯｒｇａｎｉｃ Ｃｈａｒｇｅ Ｔｒａａｎｓｆｅｒ Ｃｏｍｐｌｅｘｓ ｂｙ Ｒ．Ｆｏｓｔｅｒ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９６９等を参照されたい）、レーザーエネルギーは電荷移動波長に相当するエネルギーに転換され、そして、固体支持体からの特異的放出が開始される。当業者はいくつかの組み合わせがこの目的のために働き、ドナー官能基は固体支持体上に存在するかまたは検出されるべき核酸分子に結合されているかの何れか、またはその逆であってもよいことを認識するであろう。
さらに別のアプローチにおいては、可逆的Ｌ−Ｌ’結合が、比較的安定なラジカルのホモリシス的形成によって発生されてもよい。レーザーパルスの影響の下、放出（前述のとおり）並びにイオン化はラジカル位置で起こるであろう。当業者は、他の有機ラジカルが選択され得ること、およびそれらの間の結合のホモリシス的分解に必要である解離エネルギーに関して、対応するレーザー波長が選択され得ること（例えばＲｅａｃｔｉｖｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｂｙ Ｃ．Ｗｅｎｔｒｕｐ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９８４を参照されたい）を認識するであろう。
官能基Ｌ’の固定装置は、適当なプライマーを用いて、ＰＣＲ（図４）ＬＣＲ（図５）または転写増幅（図６Ａ）等の増幅手順の間に、標的捕捉配列（ＴＣＳ）中に取り込むことが可能である。
質量分析解析に先立って、核酸分子を、例えば揮発のために要求されるレーザーエネルギーを減少させるためおよび／または断片化を最少にするために、「調整」することは有用であり得る。調整は好ましくは、標的検出サイトが固定化されている間に実行される。調整の例には核酸分子のホスホジエステル骨格の修飾（陽イオン交換）であって、ヌクレオチド単位毎に結合している陽イオンの非相同性によるピークの広がりを排除するために有用であるものが挙げられる。核酸分子を、沃化アルキル、沃化アセトアミド、β沃化エタノールまたは２，３エポキシ−１−プロパノール等のアルキル化剤と接触させると、核酸分子中のモノチオホスホジエステル結合がホスホチオエステル結合に転換される。同様に、ホスホジエステル結合は塩化トリアルキルシリルを用いて、非荷電派生体に変換できる。さらにこの調整は、脱プリン化（ＭＳの間の断片化）への感受性を減少させる、例えばＮ７またはＮ９デアザプリンヌクレオチド等のヌクレオチド、またはＲＮＡ構成単位（building block）またはオリゴヌクレオチドトリエステルの取り込み、またはアルキル化されたホスホチオエート原子団の取り込み、またはＰＮＡ等のオリゴヌクレオチド類似体の採用に関与する。
特定の応用のためには、特定の捕捉された核酸断片（配置の１つのスポット）上の１より多くの（変異）座を同時に検出することは有用であり得、また、多様な固体支持体上のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体配置を利用して平行処理を実行することが有用で有り得る。「多重化」はいくつかの方法論により成すことが可能である。例えば、幾つかの変異を同時に、１つの標的配列上で、対応する検出（プローブ）分子（オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体等）を用いることにより同時に検出することが可能である。しかしながら、検出オリゴヌクレオチドＤ１、Ｄ２およびＤ３の間の分子量の差は、同時検出（多重化）が可能であるように大きくなければならない。このことは配列それ自体（組成または長さ）、または検出オリゴヌクレオチドに質量改変官能基Ｍ１−Ｍ３を導入すること、の何れかにより達成される（図２）
質量改変部分は、例えば、オリゴヌクレオチドの５’末端部分（Ｍ１）、核塩基（または塩基）（Ｍ２、Ｍ７）、リン酸骨格（Ｍ３）およびヌクレオシドの２’位置（ヌクレオシド）（Ｍ４、Ｍ６）および末端３’位置の何れかに取り付けることが可能である。質量改変部分の例には、例えば、ハロゲン、アジド、またはＸＲ型で、ここにおいてＸは結合原子団であってＲが質量改変官能基であるものが含まれる。質量改変官能基はこのように、オリゴヌクレオチド分子中に質量増加を導入するために用いることが可能である。
ここにおいて、質量改変部分Ｍは、核塩基Ｍ２（ｃ７−デアザヌクレオシドの場合はまたＣ−７、Ｍ７へ）、アルファリン酸の３リン酸基Ｍ３、またはヌクレオシド３リン酸の糖の環の２’位置、Ｍ４またはＭ６の何れかへ取り付けることが可能である。更には、質量改変官能基は連鎖終了に影響するように、例えばヌクレオシド３リン酸の糖の環の３’位置Ｍ５に取り付ける等のように取り付けられてもよい。当業者には、本発明の目的のための数多くの組合せが、同じように好適に機能することは明白である。同じように、当業者は鎖伸長ヌクレオシド３リン酸もまた、数多くの変化型および官能基および取付位置の組合せで、同じようなやり方で質量改変され得ることは明白である。
本発明の範囲を限定することなく、質量改変Ｍは、ＸＲのＸとして並びにオリゴ／ポリエチレングリコール派生体をＲとして導入することが可能である。この場合の質量改変の増加は４４、即ち５つの異なった質量改変種を、ｍを単に０から４まで変化させ、このように４５（ｍ＝０）、８９（ｍ＝１）、１３３（ｍ＝２）、１７７（ｍ＝３）および２２１（ｍ＝４）の質量単位を核酸分子（検出オリゴヌクレオチド（Ｄ）、またはヌクレオシド３リン酸（各々図６（Ｃ）））に付加することにより生成することができる。オリゴ／ポリエチレングリコールはまた、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔ−ブチルおよびそのようなもの等の低級アルキルによりモノアルキル化することも可能である。結合官能基Ｘの選択は、既に記述した。質量改変化合物において用いられることができる他の化学物質は、例えば、細菌Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ．Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ｅｄｉｔｏｒ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ．Ｏｘｆｏｒｄ，１９９１に記載されているものである。
さらに他の実施態様においては、多様な質量改変官能基、Ｒ、オリゴ／ポリエチレングリコール以外のものを選択し、適切な化学物質Ｘを介して取り付けることが可能である。単純な質量改変はＨを、Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒおよび／またはＩ等のハロゲン、またはＳＣＮ、ＮＣＳ等の偽ハロゲン、または異なったアルキル、アリール、、またはアラルキル部分、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔ−ブチル、ヘキシル、フェニル、置換フェニル、ベンジル等、または官能基ＣＨ２Ｆ、ＣＨＦ２、ＣＦ３、Ｓｉ（ＣＨ３）３、Ｓｉ（ＣＨ３）２（Ｃ２Ｈ５）
、Ｓｉ（ＣＨ３）（Ｃ２Ｈ５）２、Ｓｉ（Ｃ２Ｈ５）３等で置換することにより実行することができる。更に別の質量改変は、ホモまたはヘテロペプチドを、核酸分子（例えば検出（Ｄ））またはヌクレオシド３リン酸を通して取り付けることにより得られる。質量増加５７で質量改変された種を得るために有用な１つの例は、オリゴグリシンの取り付け、例えば、７４（ｒ＝１）、１３１（ｒ＝１、ｍ＝２）、１８８（ｒ＝１、ｍ＝３）、２４５（ｒ＝１、ｍ＝４）の質量改変が成される。単純オリゴアミドもまた用いることが可能で、７４（ｒ＝１）、８８（ｒ＝２、ｍ＝０）、１０２（ｒ＝３、ｍ＝０）、１１６（ｒ＝４、ｍ＝０）等が得られる。当業者には、上で言及されたものに加えて数多くの可能性が存在することは明白である。
ここで用いられるように、上の０−ｉは、ｉ＋１の質量改変ヌクレオチド、プライマーまたはタグを意味する。いくつかの例では、上の０は特定の反応物の修飾されてない種を意味し、上のｉは、ｉ番目の反応物の質量改変種を意味する。もし、例えば、１より多くの核酸種が共存して検出された場合は、ｉ＋１の異なった質量改変検出オリゴヌクレオチド（Ｄ０、Ｄ１・・・Ｄｉ）を、質量分析によって、質量改変検出ヌクレオチド（Ｄ）を他のものから区別するために用いることができる。
異なった質量改変検出オリゴヌクレオチドは、同時に、全ての同時に起こりうる派生体／変異体を検出するために用いることができる（図６Ｂ）。別の態様としては、変異サイトでの、４つの塩基全ての置換を、検出オリゴヌクレオチドを、ＤＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼのプライマーとして機能するように設計し、位置させることにより検出することができる（図６Ｃ）。例えば、質量改変は増幅工程において取り込まれることもまた可能である。
図３は、異なった多重検出フォーマットであって、認識が、位置特異的に平面表面上に固定化された異なった特異的捕捉配列（「チップ配置」等）を用いることにより実現されている。異なった標的配列Ｔ１−Ｔｎが存在した場合、それらの標的捕捉サイトＴＣＳ１−ＴＣＳｎは、相補的な固定化された捕捉配列Ｃ１−Ｃｎと特異的に相互作用する。検出は、適切な、それらの配列または質量改変官能基Ｍ１−Ｍｎによって質量を区別した、質量区別検出オリゴヌクレオチドＤ１−Ｄｎを用いて実行できる。
本発明において用いるための好ましい質量分析フォーマットは、マトリックス補助レーザー放出イオン化（ＭＡＬＤＩ）、電子スプレー、イオンサイクロトロン共鳴（ＩＣＲ）およびフーリエ変換である。ＥＳについては、試料は水中または揮発性バッファー中に溶解され、連続的または断続的に、大気圧イオン化インターフェース（ＡＰＩ）に注入され、四極で質量分析される。ＥＳ質量分析を用いて得られる複数のイオンピークの発生は、質量決定の正確さを向上させる。特異的構造に関するより詳細な情報さえ、ＭＳ／ＭＳ四極構成を用いることにより得られる。
ＭＡＬＤＩ質量分析において、多様な質量分析器を用いることができ、例えば、単一または三重四極モード（ＭＳ／ＭＳ）での磁性セクタ／磁性偏光装置、フーリエ変換および飛行時間（ＴＯＦ）構成が質量分析計の分野で知られている。放出／イオン化工程のために、数多くのマトリックス／レーザーの組合せを用いることができる。イオントラップおよびリフレクトロン構成もまた用いることが可能である。
上記の質量分析方法は、例えば、３０００より多くの現在知られ、または同定されている遺伝病の何れも診断にも利用可能である（例えば血友病、地中海貧血、デュシェーヌ筋肉ジストロフィー（ＤＭＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）
、アルツハイマー病および嚢胞繊維症（ＣＦ））。
以下の実施例３は、嚢胞繊維症膜間通過制御遺伝子（ＣＦＴＲ）の変異（ΔＦ５０８）であって、野生型のＣＦＴＲとわずか３塩基対（９００ダルトン）違うものを検出するための質量分析方法が提供されている。実施例３に更に記載されているように、検出は、３’末端塩基が正常または変異対立形質と相補的であるプライマーのペアを用いる、単一チューブ、競合的オリゴヌクレオチド１塩基伸長（ＣＯＳＢＥ）反応に基づいている。ハイブリダイゼーション、およびポリメラーゼおよび１塩基下流のヌクレオシド３リン酸の添加において、適切にアニーリングした（即ち、３’末端にミスマッチが無い）プライマーのみが伸長される；その産物は、マトリックス補助レーザー放出イオン化飛行時間質量分析により決定される分子量シフトにより解析される。嚢胞繊維症ΔＦ５０８多型性のために、２８ｍｅｒ「正常」（Ｎ）および３０ｍｅｒ「変異」（Ｍ）プライマーが、２９および３１ｍｅｒの、それぞれＮおよびＭの同型接合を生成させ、両方は異型接合である。プライマーおよび産物の分子量が比較的小さく（＜１０ｋＤａ）、これらの質量差が少なくとも、３０Ｄａまでの１本鎖ヌクレオチド単位でなければならないので、これらの測定のためには低分解能の装置が好適である。
変異遺伝子で遺伝病という結果となるものに加えて、特定の出生欠陥、トリソミー２１（ダウン症候群）、トリソミー１３（パタウ症候群）、トリソミー１８（エドワード症候群）、モノソミーＸ（ターナー症候群）および、クラインフェルター症候群（ＸＸＹ）等のその他の性染色体異数体等は、染色体異常という結果となる。
さらに、特定のＤＮＡ配列は、個体を、数多くの病気、例えば糖尿病、細動脈硬化、肥満、多様な自己免疫疾患およびガン（結腸直腸、胸部、卵巣、肺）等または染色体異常（出産前または出産後）にかかりやすくすることがある；または病気もしくは状態（肥満、動脈硬化、ガン）になる傾向にあるという、増加している証拠がある。さらにまた、「ＤＮＡフィンガープリント」、例えば「ミクロサテライト配列」等の多型性等は、同定および遺伝（父性または母性等）の決定に有用である。
以下の実施例４は、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４対立形質にコードされている、ヒトアポリポタンパク質Ｅの３つの異なったイソ型の同定のための質量分析方法を提供する。ここでは、ＤＮＡ断片の適当な制限エンドヌクレアーゼでの制限の後に得られるＤＮＡ断片の分子量は変異の存在を検出するために用いることができる。
生物学的試料に応じて、遺伝病、染色体異数体および遺伝的傾向の診断が、出産前、出産後の何れかに実行できる。
ウイルス、細菌、菌類その他の感染性生物は、独自の核酸配列であって、宿主細胞に含まれる配列とは異なっているものを有する。感染性生物に特異的な核酸配列の検出または定量は、感染の診断またはモニターにとって重要である。ヒトおよび動物に感染し、開示された方法で検出可能な病原性ウイルスには、レトロウイルス（例えばヒト免疫不全ウイルス、例えばＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ，ＬＡＶまたはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶとも称される、Ｒａｔｎｅｒ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３１３，Ｐｐ．２２７−２８４（１９８５）；Ｗａｉｎ Ｈｏｂｓｏｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．４０：Ｐｐ．９−１７（１９８５）を参照されたい）；ＨＩＶ−２（Ｇｕｙａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３２８，Ｐｐ．６６２−６６９（１９８７）；ヨーロッパ特許公報第０２６９５２０号；Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３２８，Ｐｐ．５４３−５４７（１９８７）；およびヨーロッパ特許出願第０６５５５０１号：および他の単離体、ＨＩＶ−ＬＰ（国際特許出願第ＷＯ９４／００５６２、「新規ヒト免疫不全ウイルス」とタイトル；ピコルナウイルス（例えばポリオウイルス、肝炎Ａ型ウイルス（Ｇｕｓｔ，Ｉ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２０，Ｐｐ．１−７（１９８３）；エンテロウイルス、ヒトコックサッキーウイルス、ライノウイルス、エコウイルス）；カルシウイルス（例えば胃腸炎を引き起こす株）；トガウイルス（例えばウマ脳炎ウイルス、ルビウイルス）；フラビウイルス（デング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス；コロナウイルス（コロナウイルス等）；ラブドウイルス（水抱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス（エボラウイルス）；パラミクソウイルス（パラインフルエンザウイルス、オタフクカゼウイルス、麻疹ウイルス、ニューモウイルス）；オルトミクソウイルス（インフルエンザウイルス等）；ブンガウイルス（ハンターンウイルス、ブンガウイルス、フィレボウイルスおよびナイロウイルス等）；アレナウイルス（出血熱ウイルス）；レオウイルス（レオウイルス、オルビウイルス、ロタウイルス等）；ビルナウイルス；ヘパドナウイルス（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス（パルボウイルス）；パポーバウイルス（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス（ほとんどのアデノウイルス）；ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス）（ＨＳＶ）１および２、水痘−疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス）；ポックスウイルス（疱瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；イリドウイルス（アフリカブタ熱ウイルス）；および未分類ウイルス（スポンジ型脳障害の病因、デルタ肝炎剤（Ｂ型肝炎ウイルス欠損サテライトと考えられている）、非Ａ非Ｂ肝炎（クラス１＝内部転移、クラス２＝非経口転移（即ちＣ型肝炎）；ノーウォークおよび関連ウイルス、およびアストロウイルス）が含まれる。
感染性細菌の例には：ヘリコバクター ピロリス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉｓ）、ボレリア バーゴドルフェリ（Ｂｏｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、レジオネラ プヌモフィリア（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）、ミコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ） ｓｐｓ（Ｍ．チュバーキュロシス（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｍ．アビウム（ａｖｉｕｍ）、Ｍ．イントラセルラエ（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕａｒｅ）、Ｍ．カンサイイ（ｋａｎｓａｉｉ）、Ｍ．ゴードナアエ（ｇｏｒｄｏｎａｅ）、スタフィロコッカス アウレウス、ネイッセリア ゴノロエアエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ネイッセリア メニンギチディス（ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、リステリア モノサイトジーンス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス ピオジーンス（ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（グループＡストレプトコッカス）、ストレプトコッカス アガラクティアエ（ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（グループＢストレプトコッカス）、ストレプトコッカス（ビリダン（ｖｉｒｉｄａｎｓ）グループ）、ストレプトコッカス ファエカリス（ｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス ボビス（ｂｏｖｉｓ）、ストレプトコッカス （嫌気性種）、ストレプトコッカス フモニアエ（ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、病原性カンプリオバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）ｓｐ．、エンテロコッカス ｓｐ．ハエモフィラス インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、バシルス アントラシス（ａｎｔｒａｃｉｓ）、コルネバクテリウム ディフセリアエ（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、コルネバクテリウム ｓｐ．、エリシペロスリックス ルシオパシアエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、クロストリジウム パーフリンガース（ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｒｓ）、クロストリジウム テタニ（ｔｅｔａｎｉ）、エンテロバクター アエロジーンス、クレブシエラ プモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、パスツレラ マルトシダ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、バクテロイド（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｏ） ｓｐ．、フソバクテリウム ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、ストレプトバシルス モニリフォルミス（ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、トレポネマ パリジウム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｉｕｍ）、トレポネマ パルテヌエ（ｐｅｒｔｅｎｕｅ）、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、およびアクチノマイセス イスラエリ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｌｉ）が含まれる。
感染性菌類には：クリプトコッカス ネオフォルマンス、ヒストプラズマ カプスラタム、コシジオイド イミティス、ブラストマイセス デルマティティディス（ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、クラミジア トラコマティス（ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、カンディダ アラビカンスが含まれる。その他の感染性生物（原生動物）には：プラズモジウム ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、およびトクソプラズマ ゴンジ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）が含まれる。
以下の実施例５は、ネスティド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲおよび質量分析ベースの、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＤＮＡを血液試料中において検出するために用いられる方法を提供する。同様に、ブラッド−ボーン（ｂｌｏｏｄ−ｂｏｒｎｅ）ウイルス（例えばＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、C型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）およびその他の肝炎ウイルス（例えば非Ａ非Ｂ肝炎、肝炎Ｇ、肝炎Ｅ）、サイトメガロウイルス、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）が、それぞれ単独で、またはここに記載された方法に基づいた組合せで検出可能である。
約１６ヌクレオチドの配列が統計的背景においては特異的であるので（ヒトゲノムほどの大きさのゲノムであっても）、比較的短い核酸配列を、高度な生物において正常および欠損遺伝子を検出するために、および感染性微生物（細菌、菌類、原生動物および菌類）およびウイルスの検出のために用いることができる。ＤＮＡ配列は異なった個体を同じ種の内部で検出するためのフィンガープリントとしてさえも機能しうる。（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｓ．ａｎｄ Ｍ．Ｗ．Ｔｈｏｍpｓｏｎ，ｅｄｓ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ（１９８６）．
標的（Ｔ）核酸配列中の野生型（Ｄｗｔ）および／または変異（Ｄｍｕｔ）配列の検出のための１つの方法が図１Ｃにおいて示されている。特異的捕捉配列（Ｃ）を固体支持体（ｓｓ）にスペーサー（Ｓ）を介して取り付ける。付加的には、捕捉配列は標的配列（Ｔ）上の相補的配列、ハイブリダイゼーションを通した検出標的捕捉サイト（ＴＣＳ）と特異的に相互作用するよう選択される。しかしながら、標的検出サイト（ＴＤＳ）が、質量を増加または減少させる変異Ｘを含む場合は、変異ＴＤＳは野生型から質量分析により区別することが可能である。例えば、アデニン塩基の挿入の場合は、ＤｗｔとＤｍｕｔとの分子量の差は約３１４ダルトンになるであろう。
好ましくは、検出核酸（Ｄ）は、変異が分子の中にあり、野生型検出オリゴヌクレオチド（Ｄｗｔ）が対照として変異標的検出配列に接触された場合安定なハイブリッドが形成されないために十分に隣接領域が短くあるように設計されている。変異はまた、変異位置にマッチした塩基を有する変異検出オリゴヌクレオチド（Ｄｍｕｔ）をハイブリダイゼーションに用いた場合にもまた検出可能である。生物学的試料から得られた核酸が特定の配列に関して異型（即ちＤｗｔおよびＤｍｕｔの両方を含有）であった場合、ＤｗｔおよびＤｍｕｔの両方は適当な鎖に結合し、質量の差はＤｗｔおよびＤｍｕｔが同時に検出されることを可能とするであろう。
本発明の方法は、公知の標的配列および公知の変異サイトの情報を利用する。
しかしながら、新規な変異もまた検出され得る。例えば、図８に示されているように、生物学的試料から得られた核酸配列の転写は１またはそれより多くのヌクレアーゼを用いて特異的に消化されることが可能であり、対応する相補的な核酸配列を担持する固体支持体上に断片が捕捉されることが可能である。ハイブリダイゼーションの検出および捕捉された標的配列の分子量は、遺伝子中のどこに変異があるか無いかに関する情報を提供する。他には、ＤＮＡは１またはより多くの特定のエンドヌクレアーゼで、断片の混合物を形成するために分解されることも可能である。野生型と変異断片混合物との間の分子量の比較により変異の検出という結果となる。
本発明はさらに、何れの点でも限定としては構築されていない、以下の実施例によって説明される。引用された文献の内容は（参考文献、査定された特許、出版された特許出願を含む（国際特許出願番号第９４／１６１０１号、ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙと題されているＫ．Ｋｏｅｓｔｅｒによるもの；国際特許出願番号第９４／２１８２２号、ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｖｉａ Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎと題されているＫ．Ｋｏｅｓｔｅｒによるものを含む）および共に係属している特許出願（米国特許出願番号第０８／４０６１１９号、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｖｉａ Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎと題されているＫ．Ｋｏｅｓｔｅｒによるものを含む）を、この出願の全体を通して引用されているように、ここにおいて参考文献として明白に取り込まれている。
実施例１ 固体支持体上に直接あるオリゴヌクレオチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ放出
１ｇＣＰＧ（制御孔ガラス）を３−（トリエトキシシリル）−エポキシプロパンで機能化し、ポリマー表面上にＯＨ基を形成させた。１３ｍｇのＯＨ−ＣＰＧとの標準オリゴヌクレオチド合成を、ＤＮＡ合成器（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ．モデル７５００）で、ベータシアノエチルーホスホアミジト（Ｋｏｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１２，４５３９（１９９４））およびＴＡＣ Ｎ−保護基（Ｋｏｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，３６２（１９８１））を用いて行い、５０のヌクレオチドが「仮説上の」５０ｍｅｒ配列と相補的な３’−Ｔ５−５０ｍｅｒオリゴヌクレオチド配列を合成した。Ｔ５はスペーサーとして働く。メタノール中の飽和アンモニアでの室温、２時間の脱保護により、ＤＭＴ基の決定に従って、約１０μｍｏｌ ５５ｍｅｒ／ｇ ＣＰＧを含むＣＰＧを供給した。この５５ｍｅｒは２６ｍｅｒ（５’ＤＭＴ基とともに）との、および４０ｍｅｒ（ＤＭＴ基を含まず）とのハイブリダイゼーションのテンプレートとして働く。反応容量は１００μｌで約１ｎｍｏｌのＣＰＧ結合５５ｍｅｒをテンプレートとして、および等量のオリゴヌクレオチドを２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２および２５ｍＭ ＮａＣｌの溶液中（２６ｍｅｒまたは４０ｍｅｒ）に含んでいる。この混合物は６５℃で１０分間加熱し、３７℃で３０分間冷却した（アニーリング）。ポリマー結合テンプレートにハイブリダイズしなかったオリゴヌクレオチドは、遠心および３つの連続した、それぞれ１００μｌの氷冷５０ｍＭクエン酸アンモニウムでの洗浄／遠心段階で除去した。ビーズを風乾させ、マトリックス溶液（３−ヒドロキシピコリン酸／１０ｍＭクエン酸アンモニウム、アセトニトリル／水、１：１中）と混合し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって解析した。結果は図１０および１１に示されている。
実施例２ 電子スプレー（ＥＳ）放出および１８ｍｅｒおよび１９ｍｅｒの区別
２−プロパノール／１０ｍＭ炭酸アンモニウム（１／９、ｖ／ｖ）中の濃度５０ｐｍｏｌｅ／μｌのＤＮＡ断片を同時に電子スプレー質量分析計によって分析した。
電子スプレー質量分析による成功した放出および１８ｍｅｒおよび１９ｍｅｒの区別は、図１２に示されている。
実施例３ 嚢胞繊維症変異ΔＦ５０８の１段階ジデオキシ伸長およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析による検出
材料と方法
ＰＣＲ増幅および鎖固定化 増幅を、エクソン１０特異的プライマーで、標準ＰＣＲ条件を用いて（３０サイクル；１分間＠９５℃、１分間＠５５℃、２分間＠７２℃）行った；逆プライマーはビオチンで５’標識を標識され、カラム精製された（Ｏｌｉｃｏｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ，Ｃｒｕａｃｈｅｍ）。増幅後、ＰＣＲ産物はカラム分離によって精製され（Ｑｉａｇｅｎ Ｑｕｉｃｋｓｐｉｎ）、ストレプトアビジンコート磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｄｙｎａｌ、Ｎｏｒｗａｙ）上で、それらの標準プロトコルに従って固定化された；ＤＮＡは０．１Ｍ ＮａＯＨを用いて変性させ、非ビオチニル化センス鎖を除去するために０．１Ｍ ＮａＯＨ、１ｘＢ＋ＷバッファーおよびＴＥバッファーで洗浄した。
ＣＯＳＢＥ条件 ライゲーションされたアンチセンス鎖を含むビーズを続いて、１８μｌの反応混合物１（２μｌ １０ｘＴａｑバッファー、１μｌ（１ユニット）Ｔａｑポリメラーゼ、２μｌの２ｍＭｄＧＴＰおよび１３μｌのＨ２Ｏ）に再懸濁させ、８０℃で５分間、反応混合物２（おのおの１００ｎｇのＣＯＳＢＥプライマー）の添加の前に保温した。温度を６０℃まで下げ、混合物を５分間のアニーリング／伸長期間、保温した；ビーズは続いて、２５ｍＭトリエチルアンモニウム酢酸（ＴＥＡＡ）で、続いて５０ｍＭクエン酸アンモニウム中で洗浄した。
プライマー配列 全てのプライマーは Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＥｘＤｅｄｉｔｅ ８９００ ＤＮＡシンセサイザーで、従来のホスホアミジト化学（Ｓｉｎｈａ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：４５３９を用いて合成した。ＣＯＳＢＥプライマー（共に３’末端の前に、１つの塩基の意図的なミスマッチを含んでいる）は、以前のＡＲＭＳの研究（Ｆｅｒｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ５１：２５１−２６２）に用いられたものだか、正常型の５’末端から２つの塩基が除去されたところは例外である。
Figure 0004231056
質量分析 洗浄の後、ビーズを１μｌ １８Ｍｏｈｍ／ｃｍ Ｈ２Ｏに再懸濁した。３００ｎｌの各々のマトリックス（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，１９９３）溶液（０．７Ｍ ３−ヒドロキシピコリン酸、０．７Ｍ二塩基クエン酸アンモニウム、１：１Ｈ２Ｏ：ＣＨ３ＣＮ中）および再懸濁ビーズ（Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ ８：７２７−７３０）を試料標的と混合させ、風乾させた。２０までの試料をプローブ標的ディスク上に、リフレクトロンモード５、および、標的および変換ダイノードにそれぞれ２０ｋＶで操作されている非修飾Ｔｈｅｒｍｏ Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ（ふぉｒｍｅｒｌｙ Ｆｉｎｎｉｇａｎ）Ｖｉｓｉｏｎｓ ２０００ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの供給領域への導入のためにスポットした。理論上の平均分子量（Ｍｒ（ｃａｌｃ））は原子組成から計算した。販売者が提供したソフトウェアを、外部測定を用いてピーク中心軌跡を決定するために用いた；１．０８Ｄａをこれらから引き、電荷を担持しているプロトンを補正し、試験Ｍｒ（ｅｘｐ）値を得た。
スキーム 結合テンプレートへのアニーリングにおいて、ＮおよびＭプライマー（それぞれ８５０８．６および９１４８．０Ｄａ）をｄＧＴＰとともに供する；可変（Ｖ）位置で適切なワトソン−クリック塩基対を形成するプライマーのみがポリメラーゼにより伸長される。このように、ＶがＮの３’末端塩基とペアになる場合、Ｎは８８３７．９Ｄａの産物（Ｎ＋１）へと伸長される。同様に、Ｖが適切にＭとマッチした場合、Ｍは９４７７．３ＤａのＭ＋１産物へと伸長される。
結果 図１４−１８は、ＣＯＳＢＥ反応産物の代表的なマススペクトルを示している。ＰＣＲ産物がビオチニル化されたアンチセンス鎖が結合される前に生成されていた場合により良い結果が得られた。
実施例４ 質量分析によるヒトアポリポタンパク質Ｅイソ型の区別
アポリポタンパク質Ｅ（アポＥ）は、リポタンパク質のタンパク質成分であるが、脂質代謝で不可欠な役割を果たしている。例えば、それはコレステロール移送、リポタンパク質粒子の代謝、免疫制御および数多くの脂質分解酵素の活性化にに関与している。
ヒトアポＥの通常のイソ型（Ｅ２、Ｅ３、およびＥ４対立形質）がある。最も普通のものはＥ３である。Ｅ２対立形質は細胞質中のコレステロールを減少させることが知られており、それ故にアテローム性動脈硬化の発展に対して防御的効果を有している可能性が有る。故に、特定の個体のアポＥ対立形質の同定は、心血管病の発展のリスクの重要な決定因子である。
図１９に示されるとおり、アポリポタンパク質ＥをコードしているＤＮＡは患者から得て、増幅（ＰＣＲを介して等）することが可能であり；ＰＣＲ産物は適当な酵素（ＣｆｏＩ等）を用いて消化することが可能である。得られた制限消化は続いて多様な手段により分析化膿である。図２０に示されるように、３つのアポリポタンパク質Ｅ（Ｅ２、Ｅ３、およびＥ４は異なった核酸配列を有し、それ故にまた区別しうる分子量値を有している。
図２１Ａ−Ｃに示されているように、異なったアポリポタンパク質Ｅ遺伝子型は、３．５％ＭｅｔＰｈｏｒアガロースゲルまたは１２％ポリアクリルアミドゲル中において異なった制限パターンを有する。図２２および２３に示されているように、多様なアポリポタンパク質Ｅ遺伝子型はまた、正確かつ迅速に質量分析によって決定することが可能である。
実施例５ 血清試料中のＢ型肝炎ウイルスの検出
材料と方法
試料の調製
ウイルスＤＮＡのフェノール／クロロホルム抽出および最終エタノール沈殿を標準的なプロトコルに従って行った。
第１のＰＣＲ：
それぞれの反応は５μｌの血清からのＤＮＡ調製物で行った。１５ｐｍｏｌの各々のプライマーおよび２ユニットＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗｅｉｔｅｒｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた。各々のｄＮＴＰの終濃度は２００μＭ、反応の最終容量は５０μｌであった。１０ｘＰＣＲバッファー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗｅｉｔｅｒｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）は、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５００ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０１％ゼラチン（ｗ／ｖ）を含んでいた。
Figure 0004231056
ネスティド（Ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ：
各々の反応を、１μｌの第１の反応物または第１のＰＣＲの１：１０の希釈物それぞれをテンプレートとして用いて行った。１００ｐｍｏｌの各々のプライマー、２．５ｕ Ｐｆｕ（エキソ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、終濃度２００μＭの各々のｄＮＴＰおよび５μｌの１０ｘ Ｐｆｕバッファー（２００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．７５、１００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭＭｇＳＯ４、１％トリトンＸ−１００、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、最終容量５０μｌで用いた。反応は以下のプログラムで実行した：９２℃１分、６０℃１分および７２℃１分を２０サイクル。オリゴヌクレオチドの配列（ＮＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ，ＧｅｒｍａｎｙでＨＰＬＣ精製されたものを購入）：
Figure 0004231056
ＰＣＲ産物の精製：
各々のスペクトルを記録するために、１つのＰＣＲ ５０μｌ（上記のとおりに実行）を用いた。精製は以下の手順で行った：限外濾過をＵｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ濾過ユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｅｓｃｈｂｏｒｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、提供者のプロトコルに従って、８０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離とともに行った。２５μｌ（１０μｇ／μｌ）ストレプトアビジンＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、製造者の指示通りに調製し、２５μｌのＢ／Ｗバッファー（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２Ｍ ＮａＣｌ）中に再懸濁した。この懸濁液を、まだ濾過ユニット中にあるＰＣＲ試料に添加し、混合物を１５分間、室温で穏やかに振とうさせた。懸濁液を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、上清を磁性粒子コレクター、ＭＰＣ（Ｄｙｎａｌ，Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の補助により除去した。ビーズを５０μｌの０．７Ｍ クエン酸アンモニウム溶液、ｐＨ８．０で２回洗浄した（ＭＰＣを用いた各々の時、上清は除去された）。ビーズからの分解は、ホルムアミドを９０℃で用いて実行された。上清はスピードバック中で約１時間乾燥させ、４μの超純水（ＭｉｌｌｉＱ ＵＦプラス Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｅｃｈｂｏｒｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に再懸濁させた。この調製物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析に用いた。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ：
試料の０．５μｌをピペットで試料ホルダーに取り、続いて即座に０．５μｌマトリックス溶液（０．７Ｍ ３−ヒドロキシピコリン酸５０％アセトニトリル、７０ｍＭクエン酸アンモニウム）を添加した。この混合物は室温で乾燥され質量分析計中に導入された。全てのスペクトルは、リフレクトロン（５ｋｅＶ イオン給源、２０ｋｅＶ 加速後）および３３７ｎｍ窒素レーザーを装備したＦｉｎｎｉｇａｎ ＭＡＴ Ｖｉｓｉｏｎ ２０００（Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＭＡＴ、ＢΓｅｍｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて陽イオンモードで行った。補正を４０ｍｅｒおよび１００ｍｅｒの混合物について行った。各々の試料は異なったレーザーエネルギーで測定された。陰性の試料においては、ＰＣＲ産物は低および高レーザーエネルギーの何れにおいても検出されなかった。陽性試料においては、ＰＣＲ産物は異なった試料のスポット位置において、および変化したレーザーエネルギーにおいて検出された。
結果
ネスティドＰＣＲシステムを、ＨＢＶコア抗原（ＨＢＶｃＡｇ）をコードしているＨＢＶゲノムのｃ領域に相補的なオリゴヌクレオチド（プライマー１：地図位置１７６３から始まり、プライマー２は相補鎖の地図位置２０３２から始まる）を用いた血液試料中のＨＢＶ ＤＮＡの検出のために用いた。ＤＮＡは患者の血清から標準的なプロトコルにより単離した。第１のＰＣＲを、これらの調製物由来のＤＮＡについて、第１のセットのプライマーを用いて実行した。試料中にＨＢＶ ＤＮＡが存在する場合は２６９ｂｐのＤＮＡ断片が生成された。
第２の反応において、第１のＰＣＲにおいて生成されたＰＣＲ断片の内部の領域に相補的なプライマーが用いられた。ＨＢＶ関連ＰＣＲ産物が第１のＰＣＲにおいて存在した場合には、６７ｂｐのＤＮＡ断片が、このネスティドＰＣＲにおいて生成された（図２５Ａ参照）。ネスティドＰＣＲシステムの検出への利用は、高感度を提供し、さらに外部ＰＣＲに対する特異性制御としても働く（Ｒｏｌｆ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，１９９２）。さらなる利点は、第２のＰＣＲで生成された断片の量が、精製によるロスが避けられなくても、問題の無い検出を保証するために十分多いことである。
試料は、ストレプトアビジンＤｙｎａｂｅａｄｓ上に固定化する前に、プライマーを除去するために限外濾過を用いて精製した。この精製が行われるのは、立体的な理由でより短いプライマーが高い収量でビーズ上に固定化されてしまうためである。固定化は、膜上の非特異的吸収による物質のロスを避けるため限外濾過膜上で直接的に行った。固定化に続いて、ビーズを陽イオン交換を行うためにクエン酸アンモニウムで洗浄した（Ｐｉｅｌｅｓ，Ｕ．ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ ２１：３１９１−３１９６）。固定化ＤＮＡは、非常に短時間でＤＮＡのビーズからの分解を可能とするが、ナトリウム陽イオンを導入するという結果にはならない２５％アンモニアを用いてビーズから分解された。
ネスティドＰＣＲおよびＭＡＬＤＩ ＴＯＦ解析を、血清学的解析の結果を知ることなく行った。未知のウイルス力価のため、各々の第１のＰＣＲ試料は希釈せず、また１：１０で希釈してそれぞれテンプレートとして用いた。
試料１は、ＨＢｓ−およびＨＢｅ−抗原テストには陽性であるがドットブロット解析では陰性である長期活性ＨＢＶ感染した患者から集められた。試料２はドットブロット解析においてＨＢＶ陽性であり重いウイルス血症および活性ＨＢＶ感染状態にある患者からの血清試料である。試料３は変性血清試料であり、それ故に血清学的解析は実行できなかったが、肝臓病を示唆する増加されたトランスアミナーゼレベルが検出された。オートラジオグラフ解析（図２４）において、この試料の第１のＰＣＲは陰性であった。しかしながら、ＨＢＶ感染のいくつかの証拠があった。この試料はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析への関心がもたれたが、それは、精製手順の後に低レベルの量ではあったがＰＣＲ産物が検出されることが示されたからである。試料４はＨＢＶ感染を治療した患者からのものである。試料５および６は長期活性ＨＢＶ感染状態にある患者から集められた。
図２４はネスティドＰＣＲ反応のＰＡＧＥ解析の結果を示す。ＰＣＲ産物は明らかに１、２、３、５および６で見られた。試料４中にはＰＣＲ産物はおらず、血清学的解析に従ってもそれは勿論ＨＢＶ陰性であった。陰性および陽性対照を、＋および−でそれぞれ示した。増幅人工物はレーン２、５、６および＋において、希釈されなかったテンプレートが用いられた場合には見ることができた。１：１０に希釈されたテンプレートが用いられた場合には、人工物は生成されなかった。試料３においては、ＰＣＲ産物はテンプレートが希釈されなかった場合にのみＰＣＲ産物が検出された。このＰＡＧＥ解析は、上記のように、試料３を除いて血清学的解析により得られたデータと一致している。
図２５Ａは、上記のように生成され精製された試料番号１からの、ネスティドＰＣＲ産物のマススペクトルを示す。２０７５４Ｄａのシグナルは、一本鎖ＰＣＲ生産物（計算上：２０７３５Ｄａ）ビーズから分解されたＰＣＲ産物の両方の鎖の質量の平均）を示す。計算上と得られた質量の差は１９Ｄａ（０．０９％）である。図２５Ａに示されるように、試料番号１は大量のＰＣＲ産物を生成し、明白な検出という結果となった。
図２５Ｂは、試料番号３から得られたスペクトルを示す。図２４に示されているように、この区分で生成されたＰＣＲ産物の量は試料番号１と比較して顕著に低い。しかしながら、ＰＣＲ産物は２０７５１Ｄａ（計算上は２０７３５）の質量として明白に見られた。この質量の差は１６Ｄａであった（０．０８％）。図２５ＣにおけるスペクトルはＨＢＶ陰性である試料番号４から得られた（図２４にもまた示されている）。期待されたように、ＰＣＲ産物に対応するシグナルは検出されなかった。図２５に示されたすべての試料は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより分析されたが、そこにおいてＰＣＲ産物は全てのＨＢＶ陽性試料において検出されたが、ＨＢＶ陰性試料においてはされなかった。これらの結果はいくつかの独立した実験において再現された。
実施例６ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を介したリガーゼ連鎖反応産物の解析
材料と方法
オリゴデオキシヌクレオチド
ビオチニル化された１つを除き、他の全てのオリゴヌクレオチドは０．２μｍｏｌスケールで、ＭｉｌｌｉＧｅｎ７５００ＤＮＡ合成機（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）で、β−シアノエチルホスホアミジト法（Ｓｈｉｎａ，Ｎ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｎｕｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．１２，Ｐｐ．４５３９−４５７７）を用いて合成された。オリゴデオキシヌクレオチドはＲＰ−ＨＰＬＣ精製され、標準的プロトコルし従って脱保護された。ビオチニル化オリゴデオキシヌクレオチドはＢｉｏｍｅｔｒａ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙより購入した（ＨＰＬＣ精製）。
用いられたオリゴヌクレオチドの配列と計算上の分子量：
Figure 0004231056
オリゴヌクレオチドの５’リン酸化
ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎ）で、刊行された手順にしたがって実行し、５’リン酸化オリゴヌクレオチドは精製しないでＬＣＲに用いた。
リガーゼ連鎖反応
ＬＣＲはＰｆｕＤＮＡリガーゼ、および、２つの異なったｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＩＩファージミドを含むリガーゼ連鎖反応キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎ）で行った。Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＩ遺伝子の野生型を担持する１つおよび、ｌａｃＩのｂｐ１９１での単一の点変異を含むこの遺伝子の変異体である。
以下のＬＣＲ条件を、各々の反応に用いた：１００ｐｇテンプレートＤＮＡ（０．７４ｆｍｏｌ）と担体としての５００ｐｇの超音波破砕サケ精子ＤＮＡ、２５ｎｇ（３．３ｐｍｏｌ）の５’−ホスホリル化オリゴヌクレオチド、２０ｎｇ（２．５ｐｍｏｌ）の非ホスホリル化オリゴヌクレオチド、４Ｕ ＰｆｕＤＮＡリガーゼ、Ｐｆｕリガーゼ反応バッファー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で緩衝された最終容量２０μｌ。モデル実験において、化学合成されたｓｓ５０ｍｅｒをテンプレートとして用い（１ｆｍｏｌ）、この場合はオリゴＣもまたビオチニル化した。すべての反応は、サーモサイクラー（ＯｍｎｉＧｅｎｅ、ＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｅｂｅｒｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中で、以下のプログラムで行った：４分間９２℃、２分間６０℃、および２５サイクルの２０秒９２℃、４０秒６０℃。ＨＰＬＣ分析を除き、ビオチニル化ライゲーション反応物Ｃを用いた。対照実験において、ビオチニル化および非ビオチニル化オリゴヌクレオチドは、同じゲル電気泳動の結果を示した。反応は７．５％ポリアクリルアミドゲルで解析した。ライゲーション産物１（オリゴＡおよびＢ）の計算上の質量：１５４５０Ｄａ、ライゲーション産物２（おりごＣおよびＤ）の計算上の質量：１５３８７。
スマートＨＰＬＣ
イオン交換ＨＰＬＣ（ＩＥ ＨＰＬＣ）をスマートシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で、ファルマシア モノＱ、ＰＣ１．６／５カラムを用いて行った。溶出液はバッファーＡ（２５ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．３Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ８．０）およびバッファーＢ（Ａと同じ、但し１Ｍ ＮａＣｌ）であった。１００％Ａで５分間、流速５０μｌ／分で開始し、３０分で０から７０％Ｂのグラジエントをかけ、続いて２分間で１００％に増加させ、１００％Ｂで５分間保持した。野生型または変異体テンプレートの何れかについて行われた２つのプールされたＬＣＲ容量（４０μｌ）を注入した。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳのための試料調製
固定化ＤＮＡの調整：各々のスペクトルを記録するため、２つのＬＣＲ（上記のように行った）をプールし、１：１で２ｘＢ／Ｗバッファー（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２Ｍ ＮａＣｌ）で希釈した。５μｌのストレプトアビジンＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）試料を添加し、混合物は、室温で１５分間穏やかに振とうされ、結合を可能された。上清を磁性粒子コレクター、ＭＰＣ（Ｄｙｎａｌ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて除去し、ビーズを２回５０μｌの０．７Ｍクエン酸アンモニウム溶液（ｐＨ８．０）で洗浄した（上清はＭＰＣを用いる度に除去した）。ビーズを１μｌの超純水（ＭｉｌｌｉＱ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）に再懸濁した。この懸濁液は直接ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ解析に以下の記載のように用いた。
限外濾過とストレプトアビジンＤｙｎａＢｅａｄｓの組合せ：各々のスペクトルを記録するため、２つのＬＣＲ（上記のように行った）をプールし、１：１で２ｘＢ／Ｗバッファー（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２Ｍ ＮａＣｌ）で希釈し、５０００ＮＭＷＬ Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣフィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｅｓｃｈｂｏｒｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で、製造者の指示に従って濃縮した。濃縮後、試料を３００μｌの１ｘＢ／Ｗバッファーで洗浄し、ストレプトアビジンＤｙｎａＢｅａｄｓを添加した。ビーズは上記のように１回Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣフィルターユニット上で３００μｌの１ｘＢ／Ｗバッファーで洗浄し、上記のように処理した。ビーズを３０から５０μｌの１ｘＢ／Ｗバッファーに再懸濁し、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。上清を除き、ビーズを３回５０μｌの０．７Ｍクエン酸アンモニウム溶液（ｐＨ８．０）で洗浄した。最後に、ビーズを１回３０μｌのアセトンで洗浄し、１μｌの超純水に再懸濁した。ライゲーション混合物は、ビーズ上に固定化した後でＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ解析に以下のように用いた。
ＭＡＤＬＩ−ＴＯＦ−ＭＳ
固定化されたＤＮＡを有するストレプトアビジンコート磁性ビーズの懸濁液を、試料ホルダーでピペットで取り、続いて直ちに０．５μｌマトリックス溶液（５０％アセトニトリル中の０．７Ｍ ３−ヒドロキシピコリン酸、７０ｍＭクエン酸アンモニウム）と混合した。この混合物を室温で乾燥させ、質量分析計に導入された。全てのスペクトルは陽イオンモードで、リフレクトロン（５ｋｅＶ イオン給源、２０ｋｅＶ 加速後）および３３７ｎｍ窒素レーザーを装備したＦｉｎｎｉｇａｎ ＭＡＴ Ｖｉｓｉｏｎ ２０００で取られた。ＰｆｕＤＮＡリガーゼの解析のために、０．５μｌの溶液を試料ホルダー上で１μｌのマトリックス溶液と混合し、上記のように調製した。精製されていないＬＣＲの解析のために、１μｌのＬＣＲを１μｌのマトリックス溶液と混合した。
結果および議論
Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＩ遺伝子は、リガーゼ連鎖反応において生成された産物の検出方法としての、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの適性を調べるための単純な系として機能した。このテンプレートシステムは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＩＩファージミド中のＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＩ野生型遺伝子、および、同じプラスミド中のｂｐ１９１（ＣからＴへの変化）での単一点変異を含むＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＩ遺伝子を含む。４つの異なったオリゴヌクレオチドを用いたが、それらはＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＩ野生型遺伝子が存在する場合のみライゲーションした（図２６）。
ＬＣＲ条件は、ＰｆｕＤＮＡリガーゼを用いて最適化し、各々の陽性反応においては少なくとも１ｐｍｏｌのライゲーション産物を得た。ライゲーション反応はポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）およびスマートシステムでのＨＰＬＣにより解析した（図２７、２８および２９）。図２７は、野生型テンプレートでの陽性ＬＣＲ（レーン１）、変異型テンプレート（１および２）での陰性ＬＣＲ、および酵素、オリゴヌクレオチドを含むがテンプレートを含まない陰性対照を示す。ゲル電気泳動は、ライゲーション産物（５０ｂｐ）は野生型テンプレートとの反応においてのみ生成される一方、点変異を有するテンプレートおよびサケ精子ＤＮＡとの対照反応のどちらにおいても増幅産物は生成されなかったことを明白に示した。図２８においては、ＨＰＬＣは、野生型テンプレートについて同じ条件で実行された２つのプールされたＬＣＲの分析のために用いられた。ライゲーション産物は、明白に見られた。図２９は、変異テンプレートについての２つのプールされた陰性ＬＣＲが解析されたＨＰＬＣの結果を示している。これらのクロマトグラムは、図２７に示されたデータを確認し、その結果を一緒に合わせると、このシステムは、野生型テンプレートが提供されさえすれば大量のライゲーション産物を生成することを明白に示している。
適当な対照実験を、ＬＣＲ実験に関与する異なった化合物のリテンション時間を決定するために行った。これらには、４つのオリゴヌクレオチド（Ａ，Ｂ，ＣおよびＤ）、合成ｄｓ５０ｍｅｒ（ライゲーション産物と同じ配列を有する）、野生型テンプレートＤＮＡ、超音波破砕およびＰｆｕＤＮＡリガーゼをライゲーションバッファー中に含む。
ＬＣＲ反応がＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで解析される前に、どの精製手段を用いるべきかを決定するために、精製されていないＬＣＲのアリコート（図３０Ａ）および酵素ストック溶液のアリコート（図３０Ｂ）をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで解析した。適切な試料調製は絶対的に必要であることが示されたが、それは全てのＰｆｕＤＮＡリガーゼのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳでの分析において得られるシグナルに、精製されていないＬＣＲにおける全てのシグナルが対応しているからである。オリゴＡおよびライゲーション生産物の計算上の質量の値は、それぞれ７５２１Ｄａおよび１５４５０Ｄａである。図３０のデータは、酵素溶液はライゲーション反応物および生産物の期待されるシグナルと干渉し、それによりシグナルの曖昧でない割り当てを不可能とする質量のシグナルに繋がることを示している。さらに、酵素貯蔵バッファーの一部であり分析物／マトリックス混合物の結晶化行動に影響する界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０の信号を、好ましくない形で示している。
１つの精製形式において、ストレプトアビジンコート磁性ビーズが用いられた。最近の論文に示されているとおり、ワトソン−クリック塩基対形成で、ビーズに共有結合的に結合している相補的ＤＮＡ断片に固定化されているＤＮＡの直接放出が可能であり、非ビオチニル化鎖は排他的に放出される（Ｔａｎｇ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２３：３１２６−３１３１）。固定化ｄｓＤＮＡを用いることにおけるこの手法は、非ビオチニル化鎖が放出することのみを確実としている。もし固定化されてないｄｓＤＮＡが解析された場合、両方の鎖が放出され（Ｔａｎｇ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．７：１８３−１８６）、２つの鎖の質量の差に依存した広いピークとなる。それ故に、このシステムをＬＣＲに用いると、計算上の分子量７５２１ＤａであるオリゴヌクレオチドＡ、および、オリゴＡとオリゴＢ由来のライゲーション産物（計算上の分子量１５４５０）のみが、もしオリゴＣが５’末端でビオチニル化されておりストレプトアビジンコートビーズに固定化されている場合には放出されるであろう。このことにより、簡単で曖味ではないＬＣＲ反応物および産物の同定という結果となる。
図３１Ａは、ストレプトアビジンＤｙｎａＢｅａｄｓを用いて精製され、ビーズから直接放出された２つのプールされたＬＣＲ（上記のように実行された）から得られたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルで、精製方法が効率的であったことを示すものを表している。ライゲーションしなかったオリゴＡを示すシグナルと、ライゲーション産物に相当するシグナルが検出された。計算上と実験で見られた質量の値の一致は顕著であり、曖昧ではないピークの割り当ておよび正確なライゲーション産物の検出を可能としている。これと対照的に、変異テンプレートについての２つのプールされたＬＣＲから得られたスペクトルにおいては、ライゲーション産物はなくオリゴＡのみが検出された（図３１Ｂ）。ＬＣＲ条件の特異性および選択性、およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ検出の感度はさらに、ライゲーション反応を、特定のテンプレート無しで行った場合にさらに示された。図３２は、サケ精子ＤＮＡのみが陰性対照として用いられた、２つのプールされたＬＣＲから得られたスペクトルを示しているが、期待されるように、オリゴＡのみが検出された。
図３１Ａに示されている結果は図２７のゲルのレーン１と関連づけることができるが、図３１Ｂに示されるスペクトルは図２７のレーン２に相当し、最後に、図３２のスペクトルは図２７のレーン３に相当する。これらの結果は、図２８および図２９に示されているＨＰＬＣ解析と一致している。ゲル電気泳動（図２７）およびＨＰＬＣ（図２８および２９）の両方がライケーション反応物に対して過剰または等量のライゲーション産物を示しているが、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析はライゲーション産物については小さいシグナルを発生している（図３１Ａ）。
ライゲーション産物のシグナルの低い強度は、２４ｍｅｒと５０ｍｅｒとの間の異なった放出／イオン化効率によるものであろう。２４塩基対と比較した５０の二重体のＴｍ値は著しく高いので、より多くの２４ｍｅｒが放出された。シグナル強度の減少はまた、より長いオリゴヌクレオチドの場合のより高い断片化の結果でも有り得る。
ストレプトアビジンＤｙｎａＢｅａｄｓでの精製にもかかわらず、図３２は２０００Ｄａあたりの領域のＴｗｅｅｎ２０の痕跡を示した。粘性の粘度の物質は結晶化工程に対しネガティブに作用し、それゆえに質量分析解析にとって有害で有り得る。酵素貯蔵溶液の一部であるＴｗｅｅｎ２０およびグリセロールは、それゆえ、質量分析解析に先立って完全に除くべきである。この理由から、ＤｙｎａＢｅａｄｓでの処理に先だつ付加的な限外濾過段階を含む改良された精製手順を調べた。当然、この試料精製はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析性能の顕著な改善という結果となった。
図３３は、それぞれ陽性（図３３Ａ）および陰性（３３Ｂ）の２つのプールされたＬＣＲから得られたスペクトルを示す。陽性反応は、化学合成された、オリゴＣおよびオリゴＤのライゲーション産物に相当する配列の一本鎖５０ｍｅｒをテンプレートとして実行した。オリゴＣは５’ビオチニル化されていた。故に、テンプレートは検出されなかった。期待されたように、オリゴＡおよびＢのライゲーション産物（計算上の分子量１５４５０Ｄａ）のみが、固定化され、ライゲーションされたオリゴＣおよびＤから放出された。この新規に生成されたＤＮＡ断片は、図３３Ａにおいて１５４４８Ｄａの質量シグナルとして示されている。図３２Ａと比較して、このスペクトルは明白に、この試料調製方法は、改善された分解能および強度のシグナルを生じさせた。
実施例７ プライマーの固相オリゴ塩基伸長による変異検出およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析による分析
要約
固相オリゴ塩基伸長法は、増幅されたＤＮＡにおける点変異および小さな欠失並びに小さな挿入を検出する。この方法は、ＤＮＡポリメラーゼ、３つのｄＮＴＰの混合物、および欠けている１つのジデオキシヌクレオチドを用いた、親和性捕捉された増幅テンプレート上の変異ヌクレオチド位置に隣接してアニールする検出プライマーの伸長に基づいている。得られた産物は、さらに標識化工程を必要とせずにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により評価され、分解される。以下の実験の目的は、速くて信頼性のある様式で変異体および野生型対立遺伝子を測定することにあった。
実験の説明
この方法では１つの検出プライマーを用い、続いて、オリゴヌクレオチド伸長工程を行って、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により容易に解明できる、変異体または野生型対立遺伝子に特異的ないくつかの塩基により長さが異なる産物を得た。この方法を、ＣＦＴＲ遺伝子のエキソン１０の例を用いて記載する。この遺伝子のエキソン１０は、同型接合状態において膵嚢胞性繊維症の臨床表現型となる、多くの人種集団において最も共通している変異（ΔＦ５０８）を負っている。
材料および方法
ゲノミックＤＮＡ
ゲノミックＤＮＡは健康な個体から得た。個体は同型接合体またはΔＦ５０８変異の異型接合体であり、ある個体は１５０６Ｓ変異に関して異型接合である。
野生型および変異体対立遺伝子は、標準的なサンガー法により確認した。
ＣＦＴＲ遺伝子のエキソン１０のＰＣＲ増幅
ＰＣＲ増幅のプライマーは、ＣＦＥｘ１０−Ｆ（イントロン９に位置し、ビオチニル化された、５−ＧＣＡＡＧＴＧＡＡＴＣＣＴＧＡＧＣＧＴＧ−３’（配列番号１３））およびＣＥＦｘ１０−Ｒ（イントロン１０に位置する、５’−ＧＴＧＴＧＡＡＧＧＧＣＧＴＧ−３’（配列番号１４））であった。プライマーは８ｐモルの濃度で用いた。１０ｘ緩衝液を含むＴａｑポリメラーゼはベーリンガーマンハイムから購入し、ｄＴＮＰはファーマシアから得た。全反応容積は５０μｌであった。ＰＣＲのサイクル条件は、最初に９５℃で５分間、続いて、９４℃で１分間、５３℃で４５秒間、そして、７２℃で３０秒間の４０サイクルと、最後に７２℃の５分間の延長時間であった。
ＰＣＲ産物の精製
製造業者の指示に従ってＱｉａｇｅｎのＰＣＲ精製キット（２８１０６番）を使用することにより、増幅産物を精製した。精製産物のカラムからの溶出は、５０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭのトリス、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中で行った。
二本鎖ＤＮＡの親和性捕捉および変性
精製ＰＣＲ産物の１０μＬのアリコートをストレプトアビジン被覆マイクロタイタ板（１６４５６８４番、ベーリンガーマンハイムまたは９５０２９２６２番ラブシステムス）の１つのウェルに移した。続いて、１０μｌの保温緩衝液（８０ｍＭのリン酸ナトリウム、４００ｍＭのＮａＣｌ、０．４％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．５）および３０μｌの水を加えた。室温での１時間の保温後、２００μｌの洗浄緩衝液（４０ｍＭのトリス、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．８）でウェルを３回洗浄した。二本鎖ＤＮＡを変性するために、ウェルを３分間に亘り５０ｍＭのＮａＯＨ溶液１００μｌで処理した。その後、ウェルを２００μｌの洗浄緩衝液で３回洗浄した。
オリゴ塩基伸長反応
２５ｐモルの検出プライマー（ＣＦ５０８：５’ＣＴＡＴＡＴＴＣＡＴＣＡＴＡＧＧＡＡＡＣＡＣＣＡ−３’（配列番号１５））のアニーリングを１０分間に亘り５０℃で５０μｌのアニーリング緩衝液（２０ｍＭのトリス、１０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ4）2ＳＯ4、２ｍＭのＭｇＳＯ、１％のトリトンＸ−１００、ｐＨ８．７５）中で行った。ウェルを２００μｌの洗浄緩衝液で３回、そして、２００μｌのＴＥ緩衝液で１回洗浄した。伸長反応は、ＵＳＢからのＤＮＡ配列決定キット（７０７７０番）のいくつかの成分およびファーマシアからのｄＮＴＰまたはｄｄＮＴＰを用いて行った。全反応容積は、２１μｌの水、６μｌのシーケナーゼ緩衝液、３μｌの１０ｍＭのＤＴＴ溶液、４．５μｌの０．５ｍＭの３つのｄＮＴＰ、４．５μｌの２ｍＭの欠けている１つのｄｄＮＴＰ、５．５μｌのグリセロール酵素希釈緩衝液、０．２５μｌのシーケナーゼ２．０，および０．２５のピロホスファターゼからなる４５μｌであった。反応物を氷上にピペットで取り、室温で１５分間、そして３７℃で５分間保温した。その後、ウェルを２００μｌの洗浄緩衝液で３回、そして７０ｍＭのクエン酸アンモニウム溶液６０μｌで１回洗浄した。
伸長プライマーの変性および沈殿
伸長プライマーを、１０分間に亘り８０℃で水中５０μｌの１０％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）内で変性した。沈殿に関して、１０μｌの酢酸アンモニウム（ｐＨ６．５）、０．５μｌのグリコーゲン（１０ｍｇ／ｍｌの水、シグマＧ１７６５番）、および１００μｌの脱水エタノールを上清に加え、室温で１時間に亘り保温した。１０分間の１３，０００ｇでの遠心分離後、ペレットを７０％のエタノール中で洗浄し、１μｌの１８Ｍｏｈｍ／ｃｍＨ2Ｏ水で再懸濁させた。
試料の沈殿およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析による分析
試料の沈殿は、０．３μｌのマトリクス溶液（Ｈ2Ｏ：ＣＨ3ＣＮの比率が１：１の０．７Ｍの３−ヒドロキシピコリン酸、０．０７Ｍの二塩基クエン酸アンモニウム）および試料標的上の０．３μｌの再懸濁ＤＮＡ／グリコーゲンペレットを混合することにより行い、空気乾燥させた。２０までの試料を、それぞれ、標的および転化ダイノード上５および２０ｋＶのリフレクトロンモードで運転している未改良サーモバイオアナリシス（以前はフィニガン）ビジョン２０００ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの供給領域に導入するために、プローブ標的ディスク上にプロットした。理論平均分子量（Ｍｒ（計算））は原子組成から計算した。報告された実験Ｍｒ（Ｍｒ（実験））値は、外部校正を用いて求めた、１つの電子を加えた形態の値であった。
結果
実験の目的は、遺伝病の診断において高品質で高処理量となる変異検出のための正確な厳重さに依存しない、速くて信頼性のある方法を開発することにあった。したがって、特定の種類のＤＮＡ配列決定法（１つの変異検出プライマーのオリゴ塩基伸長）を、マトリクスアシステッドレーザ脱着イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析（ＭＳ）により得られたミニ配列決定産物の評価と組み合わせた。可能な質量測定システムとして、飛行時間（ＴＯＦ）リフレクトロン配列を選択した。この仮説を証明するために、ＣＦＴＲ遺伝子のエキソン１０に関して実験を行った。ここでは、いくつかの変異により、コーカサス人の人口において最もありふれた単一遺伝病である、膵嚢胞清繊維症の臨床表現型が生じうる。
図３４に示した図は、ＣＦＴＲ遺伝子のエキソン１０の野生型および様々な変異体の理論的に計算された分子量を有する予測される短い配列決定産物を示している。短い配列決定産物は、ｄｄＴＴＰ（図３４Ａ）またはｄｄＣＴＰ（図３４Ｂ）のいずれかを用いて発生期のＤＮＡ鎖に固有配列関連停止を導入することにより産生した。健康な、変異異型個体、および変異同型個体のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルが図３４に示されている。全ての試料は、質量分析と比較して不一致を示さない標準サンガー法により確認した。様々な分子量の実験測定の精度は、予測した範囲に対してマイナス２１．８およびプラス８７．１ダルトン（Ｄａ）の範囲内にあった。これは、各々の場合において許容された結果の絶対的な判断である。この方法のさらなる利点は、ΔＩ５０７変異のあいまいな検出である。ｄｄＴＴＰ反応において、野生型対立遺伝子は検出されるけれども、ｄｄＣＴＰ反応においては、３つの塩基対の欠失が開示される。
ここに記載した方法は、ＤＮＡの単一点変異または微小損傷の検出に非常に適している。変異検出プライマーを注意深く選択することにより、多重化が可能となり、匹敵する対立遺伝子特異的方法に必要とされる正確な厳重さを必要とせずに、遺伝子診断が高処理量かつ高品質となる。遺伝情報の一意性のために、変異検出プライマーのオリゴ塩基伸長は、可変数の縦列配列（ＶＮＴＲ）または他の単一ヌクレオチド多型性（例えば、アポリポタンパクＥ遺伝子）のようなゲノムにおける各々の病気遺伝子または多型性領域に適用できる。
実施例８ マトリクスアシステッドレーザ脱着／イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析による７−デアザプリン部分を含有するポリメラーゼ連鎖反応産物の検出
材料および方法
ＰＣＲ増幅
以下のオリゴデオキシヌクレオチドプライマーを、２００ｎモルの規模でミリゲン７５００ＤＮＡ合成器（米国、マサチューセッツ州、ベッドフォードのミリポア）により標準ホスホアミジテ化学（Sinha,N.D,等、(1983)Tetrahedron Let．24巻、5843-5946頁；Sinha,N.D.等、(1984)Nucleic AcidsRes.、12巻、4539-4557頁）にしたがって合成したか、またはＭＷＧ−バイオテック（プライマー３、ドイツ国、エベルスベルグ）およびバイオメトラ（プライマー６−７、ドイツ国、ゴエッティンゲン）から購入した。
Figure 0004231056
９９ｍｅｒおよび２００ｍｅｒのＤＮＡ鎖（修飾および未修飾）並びにリボおよび７−デアザ−修飾１００ｍｅｒを、１０ｍモル／ＬのＫＣｌ、１０ｍモル／Ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4、２０ｍモル／ＬのトリスＨＣｌ（ｐＨ＝８．８）、２ｍモル／ＬのＭｇＳＯ4、（エキソ（−）Pseudococcus furiosus(Pfu)緩衝液、ドイツ国、フレイブルク、ファーマシア）、０．２ｍモル／Ｌの各々のｄＮＴＰ（ドイツ国、フレイブルク、ファーマシア）、１μモル／Ｌの各々のプライマーおよび１単位のエキソ（−）ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（ドイツ国、ハイデルベルク、ストラタジーン）を含有する１００μＬの反応容積内のｐＲＦｃｌＤＮＡ（１０ｎｇ、ハンブルク大学のS．Feyerabendから供給される）から増幅した。
９９ｍｅｒに関してはプライマー１および２を、２００ｍｅｒに関してはプライマー１および３を、１００ｍｅｒに関してはプライマー６および７を用いた。７−デアザプリン修飾核酸を得るために、ＰＣＲ増幅中に、ｄＡＴＰおよびｄＧＴＰを７−デアザ−ｄＡＴＰおよび７−デアザ−ｄＧＴＰと置換した。反応は、１分間に亘る９５℃での変性、１分間に亘る５１℃でのアニーリングおよび１分間に亘る７２℃での伸長のサイクルを用いて、サーマルサイクラー（ドイツ国、エバースブルクのＭＷＧ−バイオテック、オムニジーン）内で行った。全てのＰＣＲに関して、反応サイクルの数は３０であった。最後のサイクルの後、反応をさらに１０分間に亘り７２℃で行った。
１０３ｍｅｒＤＮＡ鎖（修飾および未修飾）を、全ての他の濃度は変えずに、プライマー４および５を用いて、１００μＬの反応容積内のＭ１３ｍｐ１８ＲＦＩＤＮＡ（１００ｎｇ、ドイツ国、フレイブルク、ファーマシア）から増幅した。反応は、１分間に亘る９５℃での変性、１分間に亘る４０℃でのアニーリングおよび１分間に亘る７２℃での伸長のサイクルを用いて行った。それぞれ、未修飾の１０３ｍｅｒに関しては３０回のサイクル、修飾１０３ｍｅｒに関しては４０回のサイクルの後、試料をさらに１０分間に亘り７２℃で保温した。
５’−［32−Ｐ］−標識されたＰＣＲプライマーの合成
プライマー１および４を、製造業者のプロトコルにしたがって、Ｔ４−ポリヌクレオチドキナーゼ（エピセントレテクノロジース）および（γ−32Ｐ）−ＡＴＰ（ドイツ国、デュポン、ＢＬＵ／ＮＧＧ／５０２Ａ）を用いて５’−［32−Ｐ］−標識した。反応は、その他の反応条件は変えずに、ＰＣＲのプライマー１および４の１０％を標識されたプライマーと置換することにより行った。増幅ＤＮＡは、１０％のポリアクリルアミドゲル上のゲル電気泳動により分離した。適切なバンドを切除し、パッカードＴＲＩ−ＣＡＲＢ４６０Ｃ液体シンチレーションシステム（米国、コネチカット州、パッカード）で計数した。
リボ修飾されたＰＣＲ産物からのプライマー切断
増幅したＤＮＡをウルトラフリーＭＣフィルタユニット（３０，０００ＮＭＷＬ）を用いて精製し、次いで、０．２モル／ＬのＮａＯＨ１００μｌ中で再度溶解させ、２５分間に亘り９５℃で加熱した。次いで、溶液をＨＣｌ（１モル／Ｌ）で酸性化し、さらに、以下に記載するように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析のために、ウルトラフリーＭＣフィルタユニット（１０，０００ＮＭＷＬ）を用いて精製した。
ＰＣＲ産物の精製
全ての試料を、製造業者の記載にしたがって、ウルトラフリーＭＣフィルタユニット３０，０００ＮＭＷＬ（ドイツ国、エシュボーン、ミリポア）を用いて精製し、濃縮した。ＰＣＲ産物を超純水の５μＬ（２００ｍｅｒに関しては３μＬ）溶解させた。この分析物溶液を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ測定のめたに直接的に用いた。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ
０．５μＬの分析物溶液および０．５μＬのマトリクス溶液（アセトニトリル／水（１：１，ｖ／ｖ）中０．７モル／Ｌの３−ＨＰＡおよび０．０７モル／Ｌのクエン酸アンモニウム）のアリコートを平らな金属試料支持体上で混合した。周囲温度での乾燥後、分析のために試料を質量分析器中に導入した。使用したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器は、フィニガンＭＡＴビジョン２０００（ドイツ国、ブレーメン、フィニガンＭＡＴ）であった。スペクトルを、５ｋｅＶイオン発生源および２０ｋｅＶ後加速による正イオンリフレクターモードで記録した。器具に窒素レーザ（３３７ｎｍの波長）を備え付けた。システムの真空は、分析器領域においては３−４・１０-8ｈＰａおよび発生源領域においては１−４・１０-7ｈＰａであった。修飾および未修飾ＤＮＡ試料のスペクトルを同一の相対レーザ源により得た。外部校正を合成オリゴデオキシヌクレオチド（７ｍｅｒから５０ｍｅｒ）の混合物により行った。
結果および議論
ＰＣＲによる７−デアザプリンヌクレオチド含有核酸の酵素合成
短いＰＣＲ産物の速くてゲルを用いない分析を行うＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの可能性を示すために、そしてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ条件下で核酸の７−デアザプリン修飾の効果を調べるために、２つの異なるプライマーテンプレート系を用いてＤＮＡ断片を合成した。配列を図３６および３７に示す。１０３ｍｅｒＰＣＲ産物の２つの一本鎖はほぼ等しい質量（Δｍ＝８ｕ）を有していたが、９９ｍｅｒの２つの一本鎖は５２６ｕだけ異なっていた。
化学的ＤＮＡ合成のための７−デアザプリンヌクレオチド構造ブロックが通常のものよりも約１６０倍も高価であり（バージニア州、スターリング、グレンリサーチ社、製品情報）、標準β−シアノ−ホスホアミジテ化学におけるそれらの用途がささいなもの（バージニア州、スターリング、グレンリサーチ社、製品情報；KおよびB.T.Chait(1995)Nucleic Acids Res.23,1570）ではないことを考慮すると、７−デアザプリン修飾プライマーのコストは非常に高くなってしまう。したがって、この方法の適応性および範囲を増大させるために、全てのＰＣＲは、日常で入手可能な未修飾オリゴヌクレオチドプライマーを用いて行った。ポリメラーゼ連鎖反応においてｄＡＴＰおよびｄＧＴＰをｃ7−ｄＡＴＰおよびｃ7−ｄＧＴＰと置換することにより、それぞれ、９９ｍｅｒおよび１０３ｍｅｒに関して、約８０％、２００ｍｅｒに関しては約９０％の７−デアザ−プリン修飾ヌクレオシドを含有する産物が得られた。表Ｉは、全てのＰＣＲ産物の塩基組成を示している。
Figure 0004231056
しかしながら、８０−９０％の７−デアザ−プリン修飾が正確な質量分析検出に十分であるか否かを測定することが残っている。したがって、酵素増幅工程中に全てのプリンヌクレオチドを置換できるか否かを測定することが重要であった。このことは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを使用する場合、ｃ7−ｄＡＴＰはＰＣＲにおいてｄＡＴＰを完全には置換できないことが示されているので、ささいなことではなかった（Seela,F.およびA.Roelling(1992)Nucleic Acids Res.,20,55-61）。幸い、エキソ（−）ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼが実際に未修飾プリントリホスフェートの不在下でｃ7−ｄＡＴＰおよびｃ7−ｄＧＴＰを受容できることが分かった。しかしながら、取込みはそれほど効率的ではなく、ＰＣＲ産物の収率がより少なくなってしまう（図３８）。エチジウム−臭化物は、ＤＮＡ二重鎖の積み上げられた塩基による挿入により着色される。したがって、修飾ＤＮＡは必ずしも未修飾のものと同一のバンド強度を与える必要はないので、エチジウム−臭化物着色ゲルにおけるより小さいバンド強度はアーチファクトである。
これらの結果が正しいことを確認するために、［32Ｐ］標識されたプライマーによるＰＣＲを繰り返した。オートラジオグラム（図３９）は明確に修飾ＰＣＲ産物の収率が小さいことを示している。バンドをゲルから切除して計数した。全てのＰＣＲ産物に関して、修飾核酸の収率は５０％であり、対応する未修飾増幅産物に帰する。さらなる実験は、エキソ（−）ＤｅｅｐＶｅｎｔＤＮＡおよびＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼは、同様にＰＣＲ中にｃ7−ｄＡＴＰおよびｃ7−ｄＧＴＰを取り込むことができることを示した。しかしながら、全体的な性能は、増幅中にほとんど副産物を生じないエキソ（−）ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼに関して最良であることが判明した。３つのポリメラーゼ全てを用いると、それらの同配体ではなくｃ7−ｄＡＴＰおよびｃ7−ｄＧＴＰを用いたそのようなＰＣＲが副反応がそれほど無く、より純粋なＰＣＲ産物を生じることが分かった。増幅副産物の発生が減少することは、ＰＣＲ中に合成されたテンプレートを含有する７−デアザ−プリンおよびプライマーから形成された複合体の安定性が小さいことによるプライマーのミス対合が減少することにより説明が付く。７−デアザ−プリンを含有するＤＮＡ二重鎖の融点が減少することが記載されている（Mizusawa，S.等、(1986)Nucleic Acids Res.,14,1319-1324）。上述した３つのポリメラーゼ（エキソ（−）ＤｅｅｐＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼおよびエキソ（−）（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ）に加えて、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼ、シーケナーゼ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよびＵ ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼの大きなクレノー断片のような他のポリメラーゼを使用してもよいことが予測される。さらに、ＲＮＡがテンプレートである場合には、ＳＰ６またはＴ７ＲＮＡポリメラーゼのようなＲＮＡポリメラーゼを使用しなければならない。
修飾および未修飾ＰＣＲ産物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析
９９ｍｅｒ、１０３ｍｅｒおよび２００ｍｅｒのＰＣＲ産物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析した。過去の経験に基づいて、脱プリンの程度は、分析物の脱着およびイオン化に使用されるレーザエネルギーに依存することが知られている。脱プリンによる７−デアザプリン修飾の断片化への影響を調査すべきであるので、同一の相対レーザエネルギーで全てのスペクトルを測定した。
図４０ａおよび４０ｂは、修飾および未修飾１０３ｍｅｒ核酸の質量スペクトルを示している。修飾１０３ｍｅｒの場合には、断片化により広い（Ｍ＋Ｈ）+信号が生じる。ピークの最大値は、指定された質量が、（Ｍ＋Ｈ）+信号自体よりもむしろ、（Ｍ＋Ｈ）+信号および断片化イオンの信号の平均値を示すように小さい質量にシフトされている。修飾１０３ｍｅｒはまだオリゴヌクレオチドプライマーからのＡおよびＧを約２０％含有しているが、より狭く対称な信号により特徴付けられる断片化が少ないことを示している。脱プリンにより質量の小さい側に特にテールを有するピークが実質的に減少する。そして、測定した質量と計算した質量の差は、予測した質量よりもまだ小さいけれども著しく減少する。未修飾試料に関しては、３１６７０の（Ｍ＋Ｈ）+信号が観察された。この信号は、計算した質量に対して９７ｕまたは０．３％の差である。一方、修飾試料の場合には、この質量の差は、１０ｕまた０．０３％（３１７１３ｕが観察され、３１７２３が計算された）まで減少した。これらの観察は、２つの信号鎖の（Ｍ＋Ｈ）+信号の質量分析における著しい増加により正しいと実証される（未修飾試料に関する１８とは対照的にｍ／Δｍ＝６７、Δｍ＝最大値の半分での全幅、ｆｗｈｍ）。２つの信号鎖の間の質量差が小さいことにより（８ｕ）、個々の信号は分析されなかった。
９９の塩基対からなるＤＮＡ断片の結果に関して、ＤＮＡを含有する７−デアザプリンの増大した質量分析の結果はより明白になる。未修飾試料における２つの一本鎖は、ＰＣＲ産物の２つの鎖の間の質量差がプリンおよびピリミジンの等しくない分布により５２６ｕと非常に大きいので、分析できなかった（図４１ａ）。これとは対照的に、修飾ＤＮＡは、より理解しがたいゲル電気泳動法に対して分子量測定のこの手法の優位を示す２つの一本鎖の明確なピークを示した（図４１ｂ）。基線分解能は得られなかったけれども、個々の質量は０．１％の精度で指定できた：軽い鎖に関してはΔｍ＝２７ｕ（計算質量＝３１２２４ｕ）および重い鎖に関してはΔｍ＝１４ｕ（計算質量＝３１７５０ｕ）。再度、最大値の半分での全幅は、７−デアザプリン含有試料に関して実質的に減少したことが分かった。
９９ｍｅｒおよび１０３ｍｅｒの両方の場合において、７−デアザプリン含有核酸は、それらが約２０％の未修飾プリンヌクレオチドをまだ含有するにもかかわらず、より高い感度を示すように思われる。（Ｍ＋Ｈ）+信号に関して同様の強度で匹敵するＳＮ比を得るために、未修飾９９ｍｅｒは修飾したものの１２に対して２０のレーザショットを必要とし、１０３ｍｅｒは７−デアザプリンヌクレオシド含有ＰＣＲ産物の３に対して未修飾試料に関して１２のショットを必要とした。
修飾および未修飾の２００ｍｅｒアンプリコンのスペクトルを比較すると、７−デアザプリン含有試料に関して、増大した信号強度だけでなく、改良された質量分解能が再度観察された（図４２ａおよび４２ｂ）。信号鎖の信号は修飾試料のスペクトルにおいて顕著であるが、信号鎖のＤＮＡスプレクスおよびダイマーにより、未修飾試料に関して最強の信号が得られた。
核酸の完全な７−デアザプリン修飾は、ＰＣＲにおいて修飾プライマーを用いるかまたは部分的に修飾されたＰＣＲ産物からの未修飾プライマーを切断することにより行ってもよい。上述したように、欠点は修飾プライマーに関連しているので、リボ修飾によるプライマーを用いて１００ｍｅｒを合成した。本出願人の研究所において以前に開発した方法にしたがって、プライマーをＮａＯＨにより加水分解的に切断した（Koester,H.等、Z．Physiol．Chem.,359,1570-1589）。図１０ａおよび１０ｂは、プライマー切断の前後のＰＣＲ産物のスペクトルを示している。図１０ｂは、加水分解が成功したことを示している。加水分解されたＰＣＲ産物および２つの放出されたプライマーの両方は、残留した未切断１００ｍｅｒからの小さな信号とともに検出できる。プライマーから発生した未修飾プリンのシェアは、増幅配列の長さが減少するとともに増加するので、この方法は、非常に短いＰＣＲ産物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析にとって特に有用である。
７−デアザプリン修飾核酸の注目すべき特性は、より効果的な脱着および／またはイオン化、増大したイオン安定性および／または二重鎖プリン修飾核酸のより低い変性エネルギーのいずれかにより説明できる。Ｎ−７のメチン基との交換により、非ワトソン−クリック塩基対合により核酸の第２構造を形成する能力に影響を与える水素結合の受容体を１つ損失することになる（Seela,F.およびA.Kehne(1987)Biochemistry,26,2232-2238）。これは、ＭＡＬＤＩ工程中の良好な脱着の理由となる。このことに加えて、７−デアザプリンの芳香族系は、二重鎖の融点が減少する（Mizusawa,S.等(1986)Nucleic Acids Res.,14,1319-1324）こととなるワトソン−クリック塩基対合を弱める、より小さい電子密度を有している。この影響により、ＭＡＬＤＩ工程において二重鎖ＤＮＡの変性に必要なエネルギーが減少するかもしれない。これらの形態並びにＮ−７窒素上の正電荷をおそらく運搬する部位の損失により、７−デアザプリン修飾核酸は極性が弱くなり、脱着の有効性が促進されるかもしれない。
プロトン受容体としてのＮ−７の不在および７−デアザプリンヌクレオシドにおけるＣ−Ｎ結合の減少した極性のために、溶液中の加水分解に関して確立された機構に続く脱プリンが妨げられる。溶液中および気相中における反応の直接的な相関性は問題であるけれども、修飾核酸の脱プリンによる断片化が少なくなることがＭＡＬＤＩ工程において予測できる。脱プリンは、荷電種の全収率を減少させる電荷の損失により達成されるかもしれず、または非断片化分子イオン信号の強度を減少させる荷電断片化産物を産生するかもしれない。
７−デアザプリン含有試料の断片化か減少したことによる小さい質量側への（Ｍ＋Ｈ）+信号の減少したピークテーリングおよび増加した感度の両方を観察したことにより、Ｎ−７原子は実際にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ工程における脱プリンの機構に必須であることを示している。結論として、７−デアザプリン含有核酸は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ条件下で明らかに上昇したイオン安定性および感度を示し、したがって、質量精度および質量分解能がより高くなっている。
実施例９ 固体状態の配列決定および質量分析検出
材料および方法
オリゴヌクレオチドを未精製状態でオペロンテクノロジース（カリフォルニア州、アラメダ）から購入した。配列決定反応は、シーケナーゼバージョン２．０の配列決定キット（イリノイ州、アーリントンハイツ、アメルシャム）からの試薬を用いて固体表面上で行った。
Figure 0004231056
固体状態のＤＮＡ配列決定を実施するために、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによりテンプレート鎖ＤＮＡ１１６８３を３’−ビオチニル化した。６０ｐモルのＤＮＡ１１６８３、１．３ｎモルのビオチン１４−ｄＡＴＰ（ニューヨーク州、グランドアイランド、ギブコＢＲＬ）、３０単位の末端トランスフェラーゼ（イリノイ州、アーリントンハイツ、アメルシャム）、および１ｘ反応緩衝液（酵素とともに供給）を含有する３０μｌの反応液を１時間に亘り３７℃で保温した。１０分間に亘り７０℃で末端トランスフェラーゼを熱不活化することにより、反応を停止させた。得られた産物を、ＴＥ−１０回転カラム（クロネテック）に通過させることにより、脱塩した。１分子より多いビオチン−１４−ｄＡＴＰをＤＮＡ１１６８３の３’末端に加えることができた。ビオチニル化したＤＮＡ１１６８３を、３０分間に亘り周囲温度で３０μｌの１ｘ結合および洗浄緩衝液中の０．３ｍｇのダイナルストレプトアビジンビーズとともに保温した。ビーズをＴＥにより２回洗浄し、３０μｌのＴＥ中に再度溶解させ、配列決定反応のために１０μｌのアリコート（０．１ｍｇのビーズを含有する）を用いた。
以前の工程からの０．１ｍｇのビーズを、シーケナーゼキットからの２μｌの５ｘシーケナーゼ緩衝液（２００ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５，１００ｍＭのＭｇＣｌ2、および２５０ｍＭのＮａＣｌ）および５ｐモルの対応するプライマーＰＮＡ１６／ＤＮＡを含有する１０μｌの容積中に再懸濁させた。アニーリング混合物を７０℃まで加熱して、２０−３０分に亘り室温までゆっくりと冷却した。次いで、１μｌの０．１Ｍのジチオスレイトール溶液、１μｌのＭｎ緩衝液（０．１５Ｍのイソクエン酸ナトリウムおよび０．１ＭのＭｃＣ１２）、および２μｌの希釈シーケナーゼ（３．２５単位）を加えた。反応混合物を各々３μｌの４つのアリコートに分け、終止混合物（各々３μｌの適切な終止混合物からなる：５０ｍＭのＮａＣｌ中、３２μＭｃ７ｄＡＴＰ、３２μＭのｄＣＴＰ、３２μＭのｃ７ｄＧＴＰ、３２μＭのｄＴＴＰおよび３．２μＭの４つのｄｄＴＮＰのうちの１つ）に混合した。反応混合物を２分間に亘り３７℃で保温した。伸長の完了後、ビーズが沈殿し、上清を除去した。ビーズを２回洗浄し、ＴＥ中で再懸濁させ、４℃に保持した。
Figure 0004231056
標的ＴＮＲ．ＰＬＡＳＭ２をビオチニル化し、以前の章に記載したものと同様な方法（３９ｍｅｒ標的の配列決定）を用いて配列決定した。
Figure 0004231056
３０μｌの１ＭのＮａＣｌおよびＴＥ（１ｘ結合および洗浄緩衝液）中において６０ｐモルのＣＭ１Ｂ３Ｂを０．３磁気ビーズとともに３０分間に亘り室温で保温することにより、ダイナビーズＭ２８０上にストレプトアビジン（ノルウェー、ダイナル）とともにＣＭ１Ｂ３Ｂを固定化した。ビーズをＴＥにより２回洗浄し、３０μｌのＴＥ中に再度溶解させ、配列決定反応に１０または２０μｌのアリコート（それぞれ０．１または０．２ｍｇのビーズを含有する）を用いた。
シーケナーゼキットからの２μｌの５ｘシーケナーゼ緩衝液（２００ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＭｇＣｌｌ、および２５０ｍＭのＮａＣｌ）を含有する９μｌの容積内の１０ｐモルのＤＦ１１ａ５Ｆ（または０．２ｍｇのビーズに２０ｐモルのＤＦ１１ａ５Ｆ）とともに、以前の工程からの対応するアリコートのビーズをアニーリングすることにより、二重鎖ＤＮＡを形成した。アニーリング混合物を６５℃まで加熱して、２０−３０分間に亘り３７℃までゆっくりと冷却した。次いで、二重鎖ＤＮＡプライマーを１μｌの容積中で１０ｐモルのＴＳｌｏ（０．２ｍｇのビーズに２０ｐモルのＴＳ１０）とともに混合し、得られた混合物をさらに５分間に亘り３７℃で、５−１０分間に亘り室温で保温した。次いで、１μｌの０．１Ｍのジチオスレイトール溶液、１μｌのＭｎ緩衝液（０．１５Ｍのイソクエン酸ナトリウムおよび０．１ＭのＭｎＣｌ2）、および２μｌの希釈シーケナーゼ（３．２５単位）を加えた。反応混合物を各々３μｌの４つのアリコートに分け、終止混合物（各々４μｌの適切な終止混合物からなる：５０ｍＭのＮａＣｌ中に、１６μＭのｄＡＴＰ、１６μＭのｄＣＴＰ、１６μＭのｄＧＴＰ、１６μＭのｄＴＴＰおよび１．６μＭの４つのｄｄＮＴＰのうちの１つ）と混合した。反応混合物を５分間に亘り室温で、そして５分間に亘り３７℃で保温した。伸長の完了後、ビーズを沈殿させ、上清を除去した。ビーズを２０μｌのＴＥ中で再懸濁させ、４℃に保持した。各々の管から２μｌ（２０μｌから）のアリコートを採取し、８μｌのホルムアミドと混合し、得られた試料を５分間に亘り９０−９５℃で変性し、７Ｍの尿素および０．６ｘＴＢＥを含有する１０％のポリアクリルアミドゲルを用いて、２μｌ（合計で１０μｌから）をＡＬＦ ＤＮＡシーケンサーに適用した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析に残りのアリコートを用いた。
ＭＡＬＤＩ試料の調製および計測器
ＭＡＬＤＩ分析の前に、配列決定ラダー充填磁気ビーズを、５０ｍＭのクエン酸アンモニウムを用いて２回洗浄し、０．５μｌの純水中に再懸濁させた。次いで、懸濁液を質量分析器の試料標的上に装填し、０．５μｌの飽和マトリクス溶液（３−ヒドロピコリン酸（ＨＰＡ）：クエン酸アンモニウム＝５０％のアセトニトリル中１０：１のモル比）を加えた。質量分析の前に、混合物を乾燥させた。
分析には、リフレクトロンＴＯＦＭＳ質量分析器（ドイツ国、ブレーメン、フィニガンＭＡＴ、ビジョン２０００）を用いた。イオン発生源に５ｋＶを加えて、後加速には２０ｋＶを加えた。全てのスペクトルを正のイオンモードで取り、窒素レーザを用いた。通常、各々のスペクトルは、１００ショットよりも多いものの平均を取り、標準的な２５点の平滑化を行った。
結果および議論
従来の固体状態の配列決定
従来の配列決定法において、プライマーは直接的にテンプレートにアニールされ、次いで伸長され、サンガー法において終了される。通常、ビオチニル化されたプライマーを用いて、配列決定ラダーがストレプトアビジン被覆磁気ビーズにより捕捉される。洗浄後、ＥＤＴＡおよびホルムアミドを用いて、ビーズからその産物を溶離させる。しかしながら、以前の発見から、二重鎖ＤＮＡのアニールされた鎖のみが脱着され、固定された鎖はビーズに残留することが示された。したがって、テンプレートを固定化し、プライマーをアニールすることが有利である。配列決定反応および洗浄後、固定化されたテンプレートおよびアニールされた配列決定ラダーを有するビーズを質量分析器標的上に直接的に装填し、マトリクスと混合しても差し支えない。ＭＡＬＤＩにおいては、アニールされた配列決定ラダーのみが脱着され、イオン化され、固定化されたテンプレートは標的上に残留する。
最初に、３９ｍｅｒテンプレート（配列番号２３）を、末端トランスフェラーゼを有するビオチン−１４−ｄＡＴＰを加えることにより３’末端でビオチニル化した。１つより多いビオチン−１４−ｄＡＴＰ分子を酵素により加えても差し支えない。しかしながら、テンプレートは固定化され、ＭＡＬＤＩ中にビーズ上に残留したので、ビオチン−１４−ｄＡＴＰの数は、質量スペクトルには影響がない。固体状態の配列決定には、１４−ｍｅｒ（配列番号２９）を用いた。４つの配列決定ラダーのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルが図３４に示されており、予測される理論値が表ＩＩに示されている。
Figure 0004231056
Figure 0004231056
配列決定反応により比較的相同なラダーが産生され、全長配列が容易に求められた。全ての反応において現れた５１５０辺りの１つのピークは同定されない。
可能性のある説明としては、テンプレートの小さな部分がループのようなある種の２次構造を形成し、このことがシーケナーゼ伸長を阻害したというものがある。これらのピークの強度は配列決定ラダーのものよりも非常に小さかったので、結合ミスはそれほど重要ではない。配列決定反応には７−デアザプリンを用いたけれども、これにより、Ｎ−グリコシド結合を安定化させ、脱プリン反応を妨げられる。プライマーが７−デアザプリンにより置換されなかったので、わずかな塩基の損失がまだ観察された。３’末端でｄｄＡを有する全長のラダーが、Ａ反応において、１１８９９．８の見かけの質量で現れた。しかしながら、１２２のより強いピークが全ての４つの反応に現れ、これは、シーケナーゼ酵素による余分なヌクレオチドの追加によるもののようである。
同一の技術を用いて、より長いＤＮＡ断片の配列決定を行ってもよい。ＣＴＧの繰返しを含有する７８ｍｅｒテンプレート（配列番号２５）を、末端トランスフェラーゼとともにビオチン−１４−ｄＡＴＰを加えることにより３’−ビオチニル化した。１８ｍｅｒプライマー（配列番号２６）を、繰返しがプライマーの伸長後直ちに配列決定されるように、ＣＴＧの外側の右にアニールした。４つの反応を洗浄して、いつものようにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより分析した。Ｇ反応の実施例が図３５に示されており、予測される配列決定ラダーが各々のラダー成分に関する理論値とともに表ＩＩＩに示されている。最後の成分（理論値２０５７７．４）が背景から区別できなかったことを除いて、全ての配列決定ピークが良好に分析された。２つの隣接する配列決定ピーク（６２ｍｅｒおよび６３ｍｅｒ）もまた区別され、これは、そのような配列決定分析がより長いテンプレートに適用できることを示す。再度、シーケナーゼ酵素による余分なヌクレオチドの追加が、このスペクトルにおいて観察された。この追加は、テンプレートに特異的ではなく、同定を容易にする全ての４つの反応において見られた。プライマーピークと比較すると、配列決定ピークは、長いテンプレートの場合においてより強度が小さかった。さらに、配列決定反応の最適化が必要とされるかもしれない。
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捕捉およびプライミングを行う二重鎖ＤＮＡを用いた配列決定
一本鎖が張り出した二重鎖ＤＮＡプローブは、特定のＤＮＡテンプレートを捕捉できることが示され、固体状態配列決定のプライマーとして機能する。概要が図４６に示されている。二重鎖ＤＮＡプローブと一本鎖テンプレートとの間の積重相互作用により、５−塩基のみが捕捉に十分となることができる。この形式に基づいて、５’蛍光標識された２３ｍｅｒ（５’−ＧＡＴＧＡＴＣＣＧＡＣＧＣＡＴＣＡＣＡＧＣＴＣ）（配列番号２９）を３’−ビオチニル化された１８ｍｅｒ（５’−ＧＴＧＡＴＧＣＧＴＣＧＧＡＴＣＡＴＣ）（配列番号３０）にアニールして、５−塩基の張り出しを残した。二重鎖ＤＮＡにより１５ｍｅｒテンプレート（５’−ＴＣＧＧＴＴＣＣＡＡＧＡＧＣＴ）（配列番号３１）を捕捉し、５−塩基張り出しの伸長により、配列決定反応を行った。反応のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルが図４７Ａ−Ｄに示されている。比較的小さい強度であるけれども、全ての配列決定ピークが分析された。各々の反応における最後のピークは、シーケナーゼ酵素による全長伸長産物への１つのヌクレオチドの不特定追加によるものである。比較のために、同一の産物を従来のＤＮＡシーケンサーで測定し、結果の積重間接撮影図が図４８に示されている。図から分かるように、質量スペクトルは、２３ｍｅｒプライマーと比較してより小さい強度で、配列決定ピークを有する間接撮影図と同様のパターンを有していた。
検出技術としてのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法の改良
試料分布をより相同にすることができ、ピコリットルバイアル技術を実施することにより、信号の強度を増大させられるかもしれない。実際に、試料を１００ｕｍのサイズの正方形の開口部を有する小さなピットに装填することができる。固体状態配列決定において用いられるビーズは、直径が１０ｕｍ未満であり、マイクロリットルバイアル内に良好に適合する。マトリクスおよび「スイートスポット」を含むＤＮＡの微結晶がバイアル内に閉じ込められる。レーザスポットのサイズは直径が約１００μｍであるので、バイアルの全開口部を覆う。したがって、スイートスポットの調査は不必要であり、スペクトルを得るのに高繰返し率のレーザ（例えば、＞１０Ｈｚ）を使用することができる。初期の報告は、この装置は、従来のＭＡＬＤＩ試料調製技術と比較して数桁の大きさだけ、ペプチドおよびタンパク質の検出感度を増加することができることを示している。
１００塩基を越えて配列決定範囲を伸長させるために、ＤＮＡへのＭＡＬＤＩ分解能をさらに改良する必要がある。現在、マトリクスとしての３−ＨＰＡ／クエン酸アンモニウムおよび５ｋＶのイオン発生源と２０ｋＶの後加速を有するリフレクトロンＴＯＦ質量分析器を用いて、図３３（７３ｍｅｒ）のピークの分解能は、この場合の配列測定に十分な２００（ＦＷＨＭ）よりも大きい。この分解能はまた、７０ｍｅｒの範囲よりも大きいＭＡＬＤＩ脱着ＤＮＡイオンに関して報告された最高のものである。遅延抽出技術を使用することにより、さらに解像能を向上させてもよい。
上述した参照文献および公報の全てをここに引用する。
同等の内容
当業者には、通常の実験を用いて、ここに記載した特定の方法の数多くの同等な内容が理解され、確認される。このような同等の内容は、本発明の範囲内にあると考えられ、以下の請求の範囲により包含される。
図１Ａは、生物学的試料から得られた標的核酸分子（Ｔ）の内部に含まれている１つの標的検出サイト（ＴＤＳ）についての質量分析解析の実行のための方法を示す略図である。特異的捕捉配列（Ｃ）が固体支持体（ＳＳ）にスペーサー（Ｓ）を介して取り付けられている。この捕捉配列は、標的捕捉サイト（ＴＣＳ）として知られている標的核酸分子（Ｔ）上の相補的な配列と特異的にハイブリダイズするように選択される。スペーサー（Ｓ）は、邪魔されないハイブリダイゼーションを実現する。ＴＤＳに相補的である検出核酸配列（Ｄ）を、続いてＴＤＳに接触させる。ＤとＴＤＳとの間のハイブリダイゼーションはマススペクトルによって検出可能である。 図１Ｂは、固体支持体への直接結合を介した、少なくとも１つの標的検出サイト（ここではＴＤＳ１およびＴＤＳ２）についての質量分析解析の実行のための方法を示す略図である。標的検出サイト（ＴＤＳ１およびＴＤＳ２）を含む標的配列（Ｔ）は、標的核酸分子（Ｔ）上の適当な官能基（Ｌ’）と固体支持体上の適当な官能基（Ｌ）との間に形成された可逆的または不可逆的結合の形成を介して固体支持体上に固定化されている。標的検出サイト（ＴＤＳ１およびＴＤＳ２）に相補的な検出核酸配列（ここではＤ１およびＤ２）を、続いてＴＤＳと接触させる。ＴＤＳ１およびＤ１、および／または、ＴＤＳ２とＤＳとの間のハイブリダイゼーションは分子量の違いに基づいて検出および区別することができる。 図１Ｃは、標的（Ｔ）核酸分子中の野生型（Ｄｗｔ）および／または変異型（Ｄｍｕｔ）配列の検出のための方法を示す略図である。図１Ａのように、特異的捕捉配列（Ｃ）がスペーサー（Ｓ）を介して固体支持体に取り付けられている。それに加えて、捕捉配列は標的配列（Ｔ）上の相補的な配列、ハイブリダイゼーションによって検出されるべき標的捕捉配列（ＴＣＳ）と、特異的に相互作用するように選択される。しかしながら、標的検出サイト（ＴＤＳ）が、分子量を変化させる変異Ｘを含有していた場合は、変異標的検出サイトは質量分析によって野生型から区別することができる。好ましくは、検出核酸分子（Ｄ）は、変異が分子の内部で起こり、それ故に、野生型検出オリゴヌクレオチド（Ｄｗｔ）が標的検出検出配列と接触される、対照としてなどの場合に、安定なハイブリッドに到達しないように設計されている。変異はまた、変異位置にマッチした変異検出オリゴヌクレオチド（Ｄｍｕｔ）がハイブリダイゼーションに用いられた場合にも検出可能である。生物学的試料から得られた核酸分子が特定の配列に関して異型接合である（すなわちＤｗｔおよびＤｍｕｔの両方を含む）場合には、ＤｗｔおよびＤｍｕｔの両方が適当な鎖に結合し、質量の違いによりＤｗｔおよびＤｍｕｔの両方を同時に検出することが可能である。 図２は、対応する検出オリゴヌクレオチドを用いることにより、１つの標的配列上で同時にいくつかの変異が検出される方法を示したものである。検出オリゴヌクレオチドＤ１、Ｄ２およびＤ３の間の分子量の違いは、同時の検出（多重化）が可能であるように大きくなければならない。このことは、配列それ自体（組成または長さ）により、または質量改変官能基Ｍ１−Ｍ３の検出オリゴヌクレオチド中への導入のより実現することができる。 図３はさらに別の多重検出形式を示す略図である。この実施態様においては、区別は、位置特異的に平面表面に固定化された（チップ配列等）異なった特異的捕捉配列を用いることによって成されている。異なった標的配列Ｔ１からＴｎまでが存在する場合、それらの標的捕捉サイトＴＣＳ１−ＴＣＳｎは相補的な固定化捕捉配列Ｃ１−Ｃｎと相互作用するであろう。検出は、適切な、それらの配列によるかまたは質量改変官能基Ｍ１−Ｍｎにより質量を区別させた、質量の異なる検出オリゴヌクレオチドＤ１−Ｄｎを用いることによって成される。 図４は、事前に設計された標的捕捉サイト（ＴＣＳ）がＰＣＲ増幅を用いて標的配列中に取り込まれているフォーマットを示す略図である。ただ１つの鎖のみが捕捉され、その他は除去される（例えば、ビオチンと、ストレプトアビジンでコートされた磁性ビーズとの間の相互作用に基づく等）。ビオチンがプライマー１に取り付けられていた場合、ほかの鎖は適当にＴＣＳによって標識化されてもよい。検出は、上記のように、特異的検出オリゴヌクレオチドＤと対応する標的検出サイトＴＤＳとの相互作用を通し、質量分析を介するものである。 図５は増幅（ここではリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ））産物がどのように調製され質量分析により検出されるのかを示す略図である。質量の区別は、プライマー（Ｐ１からＰ４それぞれ）に取り付けられた質量改変官能基（Ｍ１およびＭ２）によって成されている。質量分析による検出は直接（即ち、固定化および標的捕捉サイト（ＴＣＳ）を用いることなく）行われる。複数のＬＣＲ反応を平行して、捕捉配列（Ｃ）の順序ある配置とすることにより実行することができる。このフォーマットは、質量の区別が十分であれば、ライゲーション産物の分離および質量分析を介した点毎の同定または多重化を可能にしている。 図６Ａは、転写増幅手順によって増幅された核酸分子の質量分析解析を示す略図である。ＲＮＡ配列が、そのＴＣＳ配列を介して、野生型および変異型標的検出サイトが上記のように適当な検出オリゴヌクレオチド（Ｄ）を用いることにより検出可能であるように捕捉される。 図６Ｂは、同じＲＮＡ上の２つの異なった（変異）サイトを、質量改変検出オリゴヌクレオチドＭ１−Ｄ１およびＭ２−Ｄ２を用いて同時の方式において検出するための多重化を示す略図である。 図６Ｃは、特定の変異の検出のための、質量改変ジデオキシヌクレオシドまたは３’−デオキシヌクレオシド３リン酸およびＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ用いた、異なった多重化手順の略図である。他には、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼおよびリボヌクレオチド３リン酸が用いられてもよい。このフォーマットは、変異部位（Ｘ）の４つ塩基全ての可能性の同時の検出を可能としている。 図７Ａは、生物学的試料から得られた標的核酸分子（Ｔ）の内部に含まれている１つの標的検出サイト（ＴＤＳ）の質量分析解析の実行のための方法を示す略図である。特異的捕捉配列（Ｃ）がスペーサー（Ｓ）を介して固体支持体（ＳＳ）に取り付けられている。捕捉配列は、標的捕捉サイト（ＴＣＳ）として知られているＴ上の相補的配列と特異的にハイブリダイズするように選択される。ＴＤＳの一部に相補的である核酸分子はＴＤＳの内部にある変異部位（Ｘ）のＴＤＳ５’とハイブリダイズする。ジデオキシヌクレオシドまたは３’デオキシヌクレオシド３リン酸（ｐｐｐＡｄｄ、ｐｐｐＴｄｄ、ｐｐｐＣｄｄ、ｐｐｐＧｄｄ等）の完全セットおよびＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼの添加は、Ｘに相補的１つのジデオキシヌクレオシドまたは３’デオキシヌクレオシド３リン酸の添加を可能とする。 図７Ｂは、核酸分子内部の潜在的変異サイト（Ｍ）での変異の存在を決定するための質量分析解析を実行するための方法を示す略図である。このフォーマットにより、２本鎖標的核酸分子の対立形質（Ａ）および（Ｂ）の両方の、同型接合正常、同型接合変異または異型接合であるかの診断が提供可能であるように、同時に分析することを可能とする。対立形質ＡおよびＢはそれぞれ、Ｍを含む領域の内部でＡおよびＢとハイブリダイズする相補的オリゴヌクレオチド（それぞれ（Ｃ）および（Ｄ））とハイブリダイズする。各々の異型二重体を続いて１本鎖特異的エンドヌクレアーゼと接触させ、Ｍでのミスマッチが変異の存在を指示し、（Ｃ）および／または（Ｄ）の分解という結果となるが、これは質量分析により検出可能である。 図８は、２つの異なったプロモーターを逆位置に有する（例えばＳＰ６およびＴ７プロモーター）転写ベクターを用いた、検出のための標的ＤＮＡの両方の鎖がどのように調製されたかを示す略図である。このフォーマットは異型接合標的検出サイト（ＴＤＳ）の検出のために特に有用である。ＳＰ６またはＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、両方の鎖は別々に、または同時に転写される。両方のＲＮＡは、適当な質量が区別された検出オリゴヌクレオチドを用いて、特異的に捕捉、同時に検出可能である。これは、溶液中で直接、または順序ある配置で特異的に固定化された捕捉配列上で多くの標的配列の平行処理の何れかにより達成される。 図９は、図６、７および８に記載されたように調製されたＲＮＡがどのように、１またはそれより多くのリボヌクレアーゼを用いて特異的に消化され、断片が対応する相補的配列を担持する固体支持体上に捕捉されたかを示す略図である。ハイブリダイゼーションおよび捕捉された標的配列の現実の分子量は、遺伝子中のどこに変異があるか無いかに関して情報を提供する。配置は、点毎に質量分析を用いて分析可能である。ＤＮＡは制限エンドヌクレアーゼを含むヌクレアーゼのカクテルを用いて同様に消化できる。変異は、野生型断片の分子量と比較した、特定の個々の断片の異なった分子量により検出可能である。 図１０Ａは、以下の実施例１に記載された実験の結果得られたスペクトルを示す。パネルｉ）はハイブリダイゼーション前の２６ｍｅｒの吸収を示す。パネルｉｉ）ハイブリダイゼーション後の遠心の濾液を示す。パネルｉｉｉ）は５０ｍＭクエン酸アンモニウムでの第１の洗浄の後の結果を示す。パネルｉｖ）は５０ｍＭクエン酸アンモニウムでの第２の洗浄の後の結果を示す。 図１０Ｂは、以下の実施例１に記載された実験の、３回の洗浄／遠心段階の後で得られたスペクトルを示す。 図１０Ｃは、以下の実施例１に記載された実験の結果得られた、ハイブリダイズした２６ｍｅｒの、ビーズからの、成功した放出を示すスペクトルである。 図１１は、以下の実施例１に記載された実験の結果得られた、ハイブリダイズした４０ｍｅｒの、成功した放出を示すスペクトルである。検出効率は、４０ｍｅｒよりずっと長い断片もまた放出可能であることを示唆していた。 図１２は、以下の実施例２に記載された実験の結果得られた、１８ｍｅｒおよび１９ｍｅｒの、電子スプレー質量分析による、成功した放出および区別を示すスペクトルである。混合物（上）、強調された１８ｍｅｒの結果のピーク（中）および強調された１９ｍｅｒの結果のピーク（下）。 図１２は、以下の実施例２に記載された実験の結果得られた、１８ｍｅｒおよび１９ｍｅｒの、電子スプレー質量分析による、成功した放出および区別を示すスペクトルである。混合物（上）、強調された１８ｍｅｒの結果のピーク（中）および強調された１９ｍｅｒの結果のピーク（下）。 図１２は、以下の実施例２に記載された実験の結果得られた、１８ｍｅｒおよび１９ｍｅｒの、電子スプレー質量分析による、成功した放出および区別を示すスペクトルである。混合物（上）、強調された１８ｍｅｒの結果のピーク（中）および強調された１９ｍｅｒの結果のピーク（下）。 図１３は、実施例３記載の嚢胞繊維症変異ΔＦ５０８の検出のための方法のグラフでの表示である。 図１４は、ΔＦ５０８同型接合正常体のＤＮＡ伸長産物のマススペクトルである。 図１５は、ΔＦ５０８異型接合変異体のＤＮＡ伸長産物のマススペクトルである。 図１６は、ΔＦ５０８同型接合正常体のＤＮＡ伸長産物のマススペクトルである。 図１７は、ΔＦ５０８同型接合変異体のＤＮＡ伸長産物のマススペクトルである。 図１８は、ΔＦ５０８異型接合変異体のＤＮＡ伸長産物のマススペクトルである。 図１９は、アポリポタンパク質Ｅ遺伝子型を実行するための多様な方法のグラフ的表示である。 図２０は、正常アポリポタンパク質Ｅの核酸配列（Ｅ３対立形質をコード）およびＥ２およびＥ４対立形質によってコードされている他のイソ型を示す。 図２０は、正常アポリポタンパク質Ｅの核酸配列（Ｅ３対立形質をコード）およびＥ２およびＥ４対立形質によってコードされている他のイソ型を示す。 図２１Ａは、アポリポタンパク質Ｅの多様な遺伝子型についての合成制限パターンを示す。 図２１Ｂは、アポリポタンパク質Ｅの多様な遺伝子型についての３．５％ＭｅｔＰｈｏｒアガロースゲルにおいて得られた制限パターンを示す。 図２１Ｃは、アポリポタンパク質Ｅの多様な遺伝子型についての１２％ポリアクリルアミドゲルにおいて得られた制限パターンを示す。 図２２Ａは、アポリポタンパク質Ｅの対立形質Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の制限酵素分解によって得られた９１、８３、７２、４８および３５塩基対の断片の分子量を示すチャートである。 図２２Ｂは、同型接合Ｅ４アポリポタンパク質Ｅ遺伝子型の制限産物のマススペクトルである。 図２３Ａは、同型接合Ｅ３アポリポタンパク質Ｅ遺伝子型の制限産物のマススペクトルである。 図２３Ｂは、同型接合Ｅ３／Ｅ４アポリポタンパク質Ｅ遺伝子型の制限産物のマススペクトルである。 図２４は、１０％（５μｌ）の各々のＰＣＲが充填された７．５％ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフである。試料Ｍ：ｐＢＲ３２２、ＡｌｕＩ消化；試料１：血清的分析においてＨＢＶ陽性；試料２：同様にＨＢＶ陽性；試料３：血清学的分析はされていないが増加されたトランスアミナーゼレベル、肝臓病を示唆；試料４：ＨＢＶ陰性；試料５：血清学的にＨＢＶ陽性；試料６：ＨＢＶ陰性（−）陰性対照；（＋）陽性対照。染色はエチジウムブロミドにより成された。 図２５Ａは、ＨＢＶ陽性の試料１のマススペクトルである。２０７５４ＤａのシグナルはＨＢＶ関連ＰＣＲ産物（６７ヌクレオチド、計算上の質量：２０７３５Ｄａ）を示す。１０３９０Ｄａの質量シグナルは［Ｍ＋２Ｈ］２＋信号（計算上：１０３７８Ｄａ）を示す。 図２５Ｂは、試料３、ＰＣＲ、血清およびドットブロットベースのアッセイに関してＨＢＶ陰性であるもののマススペクトルである。ＰＣＲ産物は痕跡程度の量のみが生成された。しかしながら、２０７５１Ｄａにおいて、それは曖昧ではなく検出された（計算上：２０７３５Ｄａ）。１０３９７Ｄａの質量シグナルは［Ｍ＋２Ｈ］２＋分子イオンを示す（計算上：１０３７６Ｄａ）。 図２５Ｃは、ＨＢＶ陰性であるがＣＭＶ陽性である試料４のマススペクトルである。期待されたように、ＨＩＶ特異的シグナルは得られなかった。 図２６は、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）において用いられた相補的オリゴヌクレオチドの結合サイトを有するＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＩ遺伝子の一部を示す。ここにおいては、野生型配列が示されている。変異体は、ライゲーションのサイトでもあるｂｐ１９１（太字）での点変異を含む。変異はＣからＴ（ＧからＡ、それぞれ）への変化である。このことは、オリゴＡとのＴ−Ｇミスマッチ（およびオリゴＢとのＡ−Ｃミスマッチ）に繋がる。 図２７は、エチジウムブロミドで染色された７．５％ポリアクリルアミドゲルである。Ｍ：鎖長標準（ｐＵＣ１９ＤＮＡ、ＭｓｐＩ消化）。レーン１：野生型テンプレートでのＬＣＲ。レーン２：変異テンプレートでのＬＣＲ。レーン３：テンプレート無しのＬＣＲ（対照）。ライゲーション産物（５０ｂｐ）は野生型テンプレートを含む陽性反応においてのみ生成された。 図２８は、２つのプールされた陽性ＬＣＲのＨＰＬＣクロマトグラムである。 図２９は、同じ条件であるが変異体テンプレートが用いられた場合のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。ライゲーション産物の小さなシグナルは反応物のテンプレート無しのライゲーション、または（Ｇ−Ｔ、Ａ−Ｃ）ミスマッチでのライゲーションの何れかによるものである。「偽陽性」シグナルは、図２８に示された野生型テンプレートでのライゲーション産物のシグナルよりも著しく低い。ライゲーション反応物の解析は「二重ピーク」に繋がっていたが、これは２つのオリゴヌクレオチドは５’−リン酸化されていたからである。 図３０のａにおいては、Ｐｆｕ ＤＮＡリガーゼ溶液のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ解析によって得られた複合体シグナルパターンが示されている。ｂにおいては、精製されていないＬＣＲのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルが示されている。質量シグナル６７５６９Ｄａが、おそらくＰｆｕ ＤＮＡリガーゼを示しているのであろう。 図３０のａにおいては、Ｐｆｕ ＤＮＡリガーゼ溶液のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ解析によって得られた複合体シグナルパターンが示されている。ｂにおいては、精製されていないＬＣＲのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルが示されている。質量シグナル６７５６９Ｄａが、おそらくＰｆｕ ＤＮＡリガーゼを示しているのであろう。 図３１は、２つのプールされた陽性ＬＣＲのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す（ａ）。７５２３ＤａのシグナルはライゲーションされていないオリゴＡ（計算上：７５２１Ｄａ）を示し、一方で１５４４９Ｄａは、ライゲーション産物（計算上：１５４５０Ｄａ）を示す。３７７４Ｄａのシグナルは、オリゴＡの［Ｍ＋２Ｈ］２＋のシグナルである。２０００Ｄａ未満の質量範囲のシグナルはマトリックスイオンによる。このスペクトルは、図２ａのレーン１および図２ｂのクロマトグラムに対応する。ｂにおいては、２つのプールされた陰性ＬＣＲ（変異テンプレート）のスペクトルが示されている。７５１７Ｄａのシグナルは、オリゴＡ（計算上：７５２１Ｄａ）を示す。ｃにおいては、２つのプールされた対照反応のスペクトル（サケ精子ＤＮＡをテンプレートとして）が示されている。約２０００Ｄａ前後の質量範囲におけるシグナルは、Ｔｗｅｅｎ２０によるものである。 図３１は、２つのプールされた陽性ＬＣＲのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す（ａ）。７５２３ＤａのシグナルはライゲーションされていないオリゴＡ（計算上：７５２１Ｄａ）を示し、一方で１５４４９Ｄａは、ライゲーション産物（計算上：１５４５０Ｄａ）を示す。３７７４Ｄａのシグナルは、オリゴＡの［Ｍ＋２Ｈ］２＋のシグナルである。２０００Ｄａ未満の質量範囲のシグナルはマトリックスイオンによる。このスペクトルは、図２ａのレーン１および図２ｂのクロマトグラムに対応する。ｂにおいては、２つのプールされた陰性ＬＣＲ（変異テンプレート）のスペクトルが示されている。７５１７Ｄａのシグナルは、オリゴＡ（計算上：７５２１Ｄａ）を示す。ｃにおいては、２つのプールされた対照反応のスペクトル（サケ精子ＤＮＡをテンプレートとして）が示されている。約２０００Ｄａ前後の質量範囲におけるシグナルは、Ｔｗｅｅｎ２０によるものである。 図３２は、サケ精子ＤＮＡのみが陰性対照として用いられた、２つのプールされたＬＣＲから得られたスペクトルを示し、期待されたように、オリゴＡのみが検出された。 図３３は、２つのプールされた陽性ＬＣＲのスペクトルを示す（ａ）。精製は、限外濾過およびストレプトアビジンＤｙｎａＢｅａｄｓを組み合わせて本文記載のとおりに行った。１５４４８Ｄａのシグナルはライゲーション産物（計算上：１５４５０Ｄａ）を示す。７５２７のシグナルはオリゴＡ（計算上：７５２１Ｄａ）を示す。３７６１Ｄａは、オリゴＡの［Ｍ＋２Ｈ］２＋シグナルを示し、一方５１４０Ｄａのシグナルはライゲーション産物の［Ｍ＋３Ｈ］２＋シグナルである。ｂにおいては、２つのプールされた陰性ＬＣＲ（テンプレート無し）のスペクトルが示されている。７５１４ＤａのシグナルはオリゴＡ（計算上：７５２１Ｄａ）を示す。 図３３は、２つのプールされた陽性ＬＣＲのスペクトルを示す（ａ）。精製は、限外濾過およびストレプトアビジンＤｙｎａＢｅａｄｓを組み合わせて本文記載のとおりに行った。１５４４８Ｄａのシグナルはライゲーション産物（計算上：１５４５０Ｄａ）を示す。７５２７のシグナルはオリゴＡ（計算上：７５２１Ｄａ）を示す。３７６１Ｄａは、オリゴＡの［Ｍ＋２Ｈ］２＋シグナルを示し、一方５１４０Ｄａのシグナルはライゲーション産物の［Ｍ＋３Ｈ］２＋シグナルである。ｂにおいては、２つのプールされた陰性ＬＣＲ（テンプレート無し）のスペクトルが示されている。７５１４ＤａのシグナルはオリゴＡ（計算上：７５２１Ｄａ）を示す。 図３４は、変異検出プライマーｂの、ｄｄＴＴＰ（Ａ）またはｄｄＣＴＰ（Ｂ）をそれぞれ反応混合物中で用いたオリゴ塩基伸長の模式的表示である。理論上の質量計算は括弧内に示されている。示されている配列は、最も普通の嚢胞繊維症変異ΔＦ５０８およびかなりまれな変異Δ１５０７並びにＩｌｅ５０６Ｓｅｒを担持するＣＦＴＲ遺伝子のエクソン１０の部分である。 図３４は、変異検出プライマーｂの、ｄｄＴＴＰ（Ａ）またはｄｄＣＴＰ（Ｂ）をそれぞれ反応混合物中で用いたオリゴ塩基伸長の模式的表示である。理論上の質量計算は括弧内に示されている。示されている配列は、最も普通の嚢胞繊維症変異ΔＦ５０８およびかなりまれな変異Δ１５０７並びにＩｌｅ５０６Ｓｅｒを担持するＣＦＴＲ遺伝子のエクソン１０の部分である。 図３５は、沈殿された変異検出のためのオリゴ塩基伸長プライマーから直接記録されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルである。各々のパネル（それぞれｄｄＴＴＰまたはｄｄＣＴＰ）の頂上のスペクトルは、さらなる伸長反応のなかったアニーリングしたプライマー（ＣＦ５０８）を示す。診断テンプレートはそれぞれのスペクトルの下に見られ、観察された／期待される分子量は括弧内に記載されている。 図３５は、沈殿された変異検出のためのオリゴ塩基伸長プライマーから直接記録されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルである。各々のパネル（それぞれｄｄＴＴＰまたはｄｄＣＴＰ）の頂上のスペクトルは、さらなる伸長反応のなかったアニーリングしたプライマー（ＣＦ５０８）を示す。診断テンプレートはそれぞれのスペクトルの下に見られ、観察された／期待される分子量は括弧内に記載されている。 図３５は、沈殿された変異検出のためのオリゴ塩基伸長プライマーから直接記録されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルである。各々のパネル（それぞれｄｄＴＴＰまたはｄｄＣＴＰ）の頂上のスペクトルは、さらなる伸長反応のなかったアニーリングしたプライマー（ＣＦ５０８）を示す。診断テンプレートはそれぞれのスペクトルの下に見られ、観察された／期待される分子量は括弧内に記載されている。 図３５は、沈殿された変異検出のためのオリゴ塩基伸長プライマーから直接記録されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルである。各々のパネル（それぞれｄｄＴＴＰまたはｄｄＣＴＰ）の頂上のスペクトルは、さらなる伸長反応のなかったアニーリングしたプライマー（ＣＦ５０８）を示す。診断テンプレートはそれぞれのスペクトルの下に見られ、観察された／期待される分子量は括弧内に記載されている。 図３５は、沈殿された変異検出のためのオリゴ塩基伸長プライマーから直接記録されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルである。各々のパネル（それぞれｄｄＴＴＰまたはｄｄＣＴＰ）の頂上のスペクトルは、さらなる伸長反応のなかったアニーリングしたプライマー（ＣＦ５０８）を示す。診断テンプレートはそれぞれのスペクトルの下に見られ、観察された／期待される分子量は括弧内に記載されている。 図３５は、沈殿された変異検出のためのオリゴ塩基伸長プライマーから直接記録されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルである。各々のパネル（それぞれｄｄＴＴＰまたはｄｄＣＴＰ）の頂上のスペクトルは、さらなる伸長反応のなかったアニーリングしたプライマー（ＣＦ５０８）を示す。診断テンプレートはそれぞれのスペクトルの下に見られ、観察された／期待される分子量は括弧内に記載されている。 図３５は、沈殿された変異検出のためのオリゴ塩基伸長プライマーから直接記録されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルである。各々のパネル（それぞれｄｄＴＴＰまたはｄｄＣＴＰ）の頂上のスペクトルは、さらなる伸長反応のなかったアニーリングしたプライマー（ＣＦ５０８）を示す。診断テンプレートはそれぞれのスペクトルの下に見られ、観察された／期待される分子量は括弧内に記載されている。 図３５は、沈殿された変異検出のためのオリゴ塩基伸長プライマーから直接記録されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルである。各々のパネル（それぞれｄｄＴＴＰまたはｄｄＣＴＰ）の頂上のスペクトルは、さらなる伸長反応のなかったアニーリングしたプライマー（ＣＦ５０８）を示す。診断テンプレートはそれぞれのスペクトルの下に見られ、観察された／期待される分子量は括弧内に記載されている。 図３６は、修飾されていない７−デアザプリン含有９９ｍｅｒおよび２００ｍｅｒ核酸のＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして用いられたｐＲＦｃ１ ＤＮＡの配列の部分、並びに１９ｍｅｒプライマーおよび２つの１８ｍｅｒ逆プライマーの配列を示す。 図３７は、修飾されていない７−デアザプリン含有１０３ｍｅｒ核酸のＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして用いられたＭ１３ｍｐ１８ＲＦＩ ＤＮＡのヌクレオチド配列の部分を示す。同時に示されているのはＰＣＲにおいて用いられた１７ｍｅｒプライマーのヌクレオチド配列である。 図３８は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析のために精製され濃縮されたＰＣＲ産物のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す。Ｍ：鎖長マーカー、レーン１：７−デアザプリン含有９９ｍｅｒＰＣＲ産物、レーン２：非修飾９９ｍｅｒ、レーン３：７−デアザプリン含有１０３ｍｅｒおよびレーン４：非修飾１０３ｍｅｒＰＣＲ産物。 図３９は、５’−［３２Ｐ］−標識されたプライマー１および４で行ったＰＣＲ反応のポリアクリルアミドゲル電気泳動のオートラジオグラムである。レーン１および２：非修飾および７−デアザプリン修飾１０３ｍｅｒＰＣＲ産物（５３３２１および２３５２０カウント）、レーン３および４：非修飾および７−デアザプリン修飾２００ｍｅｒＰＣＲ産物（７１１２３および３９５８２カウント）、およびレーン５および６：非修飾および７−デアザプリン修飾９９ｍｅｒＰＣＲ産物（１７３２１６および９４４００カウント）。 図４０Ａは、非修飾１０３ｍｅｒのＰＣＲ産物の（１２のシングルショットスペクトルの合計）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを示す。２つの一本鎖について計算された分子量（３１７６８ｕおよび３１７５９ｕ）の平均値は３１７６３ｕである。質量分解能：１８。 図４０Ｂは、７−デアザプリン含有１０３ｍｅｒのＰＣＲ産物の（３つのシングルショットスペクトルの合計）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを示す。２つの一本鎖について計算された分子量（３１７２７ｕおよび３１７１９ｕ）の平均値は３１７２３ｕである。質量分解能：６７。 図４１Ａは、非修飾９９ｍｅｒのＰＣＲ産物の（２０のシングルショットスペクトルの合計）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを示す。２つの一本鎖について計算された分子量は（３０２６１ｕおよび３０７９４ｕ）である。 図４１Ｂは、７−デアザプリン含有９９ｍｅｒのＰＣＲ産物の（１２のシングルショットスペクトルの合計）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを示す。２つの一本鎖について計算された分子量は（３１７２７ｕおよび３１７１９ｕ）である。 図４２Ａは、非修飾２００ｍｅｒのＰＣＲ産物の（３０のシングルショットスペクトルの合計）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを示す。２つの一本鎖について計算された分子量（６１８７３ｕおよび６１５９５ｕ）の平均値は６１７３４ｕである。質量分解能：２８。 図４２Ｂは、７−デアザプリン含有２００ｍｅｒのＰＣＲ産物の（３０つのシングルショットスペクトルの合計）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを示す。２つの一本鎖について計算された分子量（６１７７２ｕおよび６１５１４ｕ）の平均値は６１６４３ｕである。質量分解能：３９。 図４３Ａは、リボ改変プライマーを用いた７−デアザプリン含有１００ｍｅｒのＰＣＲ産物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを示す。２つの一本鎖について計算された分子量（３０５２９ｕおよび３１０９５ｕ）の平均値は３０８１２ｕである。 図４３Ｂは、加水分解的プライマー分解後のＰＣＲ産物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを示す。２つの一本鎖について計算された分子量（２５１０４ｕおよび２５２２９ｕ）の平均値は２５１６７ｕである。分解されたプライマーの平均値（５４３７ｕおよび５９１８ｕ）は５６７７ｕである。 図４４Ａ−Ｄは、３’ビオチニル化を介してストレプトアビジンビーズに固定化された３９ｍｅｒテンプレート（配列番号１５）から得られた、４つの配列決定ラダーの固体状態配列決定のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを示す。１４ｍｅｒプライマー（配列番号１４）を配列決定に用いた。 図４４Ａ−Ｄは、３’ビオチニル化を介してストレプトアビジンビーズに固定化された３９ｍｅｒテンプレート（配列番号１５）から得られた、４つの配列決定ラダーの固体状態配列決定のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを示す。１４ｍｅｒプライマー（配列番号１４）を配列決定に用いた。 図４４Ａ−Ｄは、３’ビオチニル化を介してストレプトアビジンビーズに固定化された３９ｍｅｒテンプレート（配列番号１５）から得られた、４つの配列決定ラダーの固体状態配列決定のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを示す。１４ｍｅｒプライマー（配列番号１４）を配列決定に用いた。 図４４Ａ−Ｄは、３’ビオチニル化を介してストレプトアビジンビーズに固定化された３９ｍｅｒテンプレート（配列番号１５）から得られた、４つの配列決定ラダーの固体状態配列決定のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを示す。１４ｍｅｒプライマー（配列番号１４）を配列決定に用いた。 図４５は、３’ビオチニル化を介してストレプトアビジンビーズに固定化された７８ｍｅｒテンプレート（配列番号１５）の固体状態配列決定のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを示す。１８ｍｅｒプライマー（配列番号１６）およびｄｄＧＴＰを配列決定に用いた。 図４６は、一本鎖突出を有する二重ＤＮＡプローブが特定のＤＮＡを捕捉し、固体状態シークエンスのためのプライマーとしても機能するスキームを示している。 図４７Ａ−Ｄは、３’ビオチニル化１８ｍｅｒ（配列番号２０）とアニーリングし、５塩基突出し、１５ｍｅｒテンプレート（配列番号２１）を捕捉したとことの５’蛍光標識された２３ｍｅｒ（配列番号１９）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを示す。 図４７Ａ−Ｄは、３’ビオチニル化１８ｍｅｒ（配列番号２０）とアニーリングし、５塩基突出し、１５ｍｅｒテンプレート（配列番号２１）を捕捉したとことの５’蛍光標識された２３ｍｅｒ（配列番号１９）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを示す。 図４７Ａ−Ｄは、３’ビオチニル化１８ｍｅｒ（配列番号２０）とアニーリングし、５塩基突出し、１５ｍｅｒテンプレート（配列番号２１）を捕捉したとことの５’蛍光標識された２３ｍｅｒ（配列番号１９）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを示す。 図４７Ａ−Ｄは、３’ビオチニル化１８ｍｅｒ（配列番号２０）とアニーリングし、５塩基突出し、１５ｍｅｒテンプレート（配列番号２１）を捕捉したとことの５’蛍光標識された２３ｍｅｒ（配列番号１９）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを示す。 図４８は図３５に記載された反応から得られた同じ産物の、従来のＤＮＡシークエンサー上で分析されたスタッキング・フルログラム（ｓｔａｃｋｉｎｇ ｆｌｕｒｏｇｒａｍ）を示す。

Claims (50)

  1. 生物学的試料由来の標的核酸の存在または非存在を検出する方法であって、以下を含む方法：
    a) 生物学的試料由来の核酸を増幅する；
    b) 工程 a)の産物をイオン化し、揮発させる；
    c) 工程 b)の産物を質量分析により分析し、工程 b)の産物の測定分子量を決定する；および
    d) 該工程 b)の産物の測定分子量を、少なくとも１つの既知配列の核酸の計算分子量と比較する、ここで、該少なくとも１つの既知配列の核酸の計算分子量は、該少なくとも１つの既知配列の核酸の塩基組成に由来する；
    それにより、(d)の比較に基づき標的核酸の存在または非存在を検出する。
  2. 工程 (c) が、(i) フォワード鎖PCR産物を質量分析により分析し、該フォワード鎖PCR産物の測定分子量を決定すること、および(ii) リバース鎖PCR産物を質量分析により分析し、該リバース鎖PCR産物の測定分子量を決定すること、を含む、請求項１の方法。
  3. 標的核酸が少なくとも１つの変異を含む、請求項１の方法。
  4. 生物学的試料が、ヒト、動物、植物、真菌、寄生虫、またはウイルスから得られた物質を含む、請求項１の方法。
  5. 標的核酸の存在の検出により同じ種内の異なる個体または株が同定される、請求項４の方法。
  6. 生物学的試料がヒトから得られた物質を含む、請求項１の方法。
  7. 生物学的試料が感染性生物から得られた物質を含む、請求項１の方法。
  8. 標的核酸が、感染性生物に存在し宿主細胞の配列と区別される配列である、請求項７の方法。
  9. 工程 (a)の産物が、10〜200 塩基、40〜200 塩基、80〜200 塩基、または100〜200 塩基である、請求項１の方法。
  10. 工程 (a)の産物が18〜46 塩基である、請求項１の方法。
  11. 工程 (a)の産物を調整する、請求項１の方法。
  12. 調整が陽イオン交換を含む、請求項１１の方法。
  13. 標的核酸を工程 (a)の直後に陽イオン交換にかけ、工程 (b)を該陽イオン交換の直後に行う、請求項１２の方法。
  14. 工程 b)およびc)を工程 a)の直後に行う、請求項１の方法。
  15. 工程 c)が電子スプレー (ES) 質量分析の使用を含む、請求項１の方法。
  16. 工程 c)がマトリックス補助レーザー放出／イオン化 (MALDI) 質量分析の使用を含む、請求項１の方法。
  17. 標的核酸が特異的に消化されない、請求項１の方法。
  18. 標的核酸がヌクレアーゼにより特異的に消化されない、請求項１７の方法。
  19. 標的核酸が二本鎖である、請求項１の方法。
  20. 標的核酸がDNAである、請求項１の方法。
  21. 溶液中において、(i) 核酸が生物学的試料から単離される、および(ii) 単離された核酸が直接工程 (a)にかけられる、請求項１の方法。
  22. 生物学的試料が細胞を含み、該細胞を溶解することにより該生物学的試料から核酸が単離される、請求項１の方法。
  23. 生物学的試料を収集することを含む、請求項１の方法。
  24. 生物学的試料から核酸を単離することを含む、請求項１の方法。
  25. RNAを工程 a)において増幅する、請求項１の方法。
  26. 工程 a)の産物がRNA分子である、請求項１の方法。
  27. 生物学的試料由来の標的核酸を検出する方法であって、以下を含む方法：
    a) 生物学的試料由来の核酸をPCRにより少なくとも１つのプライマーペアを用いて増幅する、ここで該少なくとも１つのプライマーペアはフォワードプライマーとリバースプライマーとを含む；
    b) 工程 a)の産物をイオン化し、揮発させる；
    c) 工程 b)の第１産物を質量分析により分析し、該工程 b)の第１産物の測定分子量を決定する、ここで該工程 b)の第１産物はフォワードプライマーから伸長した産物である；
    d) 工程 b)の第２産物を質量分析により分析し、該工程 b)の第２産物の測定分子量を決定する、ここで該工程 b)の第２産物はリバースプライマーから伸長した産物である；
    e) 該工程 b)の第１産物の測定分子量を、第１の既知配列の核酸の計算分子量と比較する、ここで該第１の既知配列の核酸の計算分子量は、該第１の既知配列の核酸の塩基組成に由来する；および
    f) 該工程 b)の第２産物の測定分子量を、第２の既知配列の核酸の計算分子量と比較する、ここで該第２の既知配列の核酸の計算分子量は、該第２の既知配列の核酸の塩基組成に由来する；
    それにより、(e)および(f)の比較に基づき標的核酸の存在または非存在を検出する。
  28. 工程 (c)が、(i) フォワード鎖PCR産物を質量分析により分析し、該フォワード鎖PCR産物の測定分子量を決定すること、および(ii) リバース鎖PCR産物を質量分析により分析し、該リバース鎖PCR産物の測定分子量を決定すること、を含む、請求項２７の方法。
  29. 標的核酸が少なくとも１つの変異を含む、請求項２７の方法。
  30. 生物学的試料が、ヒト、動物、植物、真菌、寄生虫、またはウイルスから得られた物質を含む、請求項２７の方法。
  31. 標的核酸の存在の検出により同じ種内の異なる個体または株が同定される、請求項３０の方法。
  32. 生物学的試料がヒトから得られた物質を含む、請求項２７の方法。
  33. 生物学的試料が感染性生物から得られた物質を含む、請求項２７の方法。
  34. 標的核酸が、感染性生物に存在し宿主細胞の配列と区別される配列である、請求項３３の方法。
  35. 工程 (a)の産物が、10〜200 塩基、40〜200 塩基、80〜200 塩基、または100〜200 塩基である、請求項２７の方法。
  36. 工程 (a)の産物が18〜46 塩基である、請求項２７の方法。
  37. 工程 (a)の産物を調整する、請求項２７の方法。
  38. 調整が陽イオン交換を含む、請求項３７の方法。
  39. 標的核酸を工程 (a)の直後に陽イオン交換にかけ、工程 (b)を該陽イオン交換の直後に行う、請求項３８の方法。
  40. 工程 b)およびc)を工程 a)の直後に行う、請求項２７の方法。
  41. 工程 c)が電子スプレー (ES) 質量分析の使用を含む、請求項２７の方法。
  42. 工程 c)がマトリックス補助レーザー放出／イオン化 (MALDI) 質量分析の使用を含む、請求項２７の方法。
  43. 標的核酸が特異的に消化されない、請求項２７の方法。
  44. 標的核酸がヌクレアーゼにより特異的に消化されない、請求項４３の方法。
  45. 標的核酸が二本鎖である、請求項２７の方法。
  46. 標的核酸がDNAである、請求項２７の方法。
  47. 溶液中において、(i) 核酸が生物学的試料から単離される、および(ii) 単離された核酸が直接工程 (a)にかけられる、請求項１の方法。
  48. 生物学的試料が細胞を含み、該細胞を溶解することにより該生物学的試料から核酸が単離される、請求項２７の方法。
  49. 生物学的試料を収集することを含む、請求項２７の方法。
  50. 生物学的試料から核酸を単離することを含む、請求項２７の方法。
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