CN110291037A - 用于确定对象中的感染水平的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了构造用于快速检测来自患者样品的疾病特异性肽的纳米颗粒，所述患者样品包括基于血液的样品。还提供了通过分离和定量来自患者样品的疾病特异性肽来测量感染水平的方法。该纳米颗粒用作用于基质辅助激光解吸/电离质谱的共基质。

Description

用于确定对象中的感染水平的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年2月17日提交的发明名称为“COMPOSITION AND METHODS OFDETERMINING A LEVEL OF ACTIVE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS INFECTION IN ASUCBJECT”的美国临时专利申请第62/460,280号的权益；所述申请的全部内容通过引用并入本文。
政府支持
本发明是在美国国立卫生研究院(National Institute of Health)批准的基金号R01-AI113725-01A1和R01-AI-122932-01A1的政府支持下完成的。
政府对本发明拥有部分权益。
引用序列表、表格、或计算机程序
与本说明书同时经由EFS-Web以ASCII格式文本文件提交了序列表的官方复印件，文件名称为“PCT1Sequence Listing_ST25.txt”，建立日期2018年1月29日，大小为2kb。经由EFS-Web提交的序列表是本说明书的一部分，并且通过引用以其全文并入本文。
技术领域
本发明一般涉及用于确定对象中的疾病水平的组合物和方法；更具体而言涉及用于选择性识别和靶向代表对象样品中的感染物的一个或多个生物标志物的组合物和方法；还更具体地涉及用于选择性靶向和富集样品内经识别的生物标志物的组合物和方法，其中在样品测试期间所述生物标志物促进标靶生物分子的信号增强。
背景技术
传染病由传染物引起并可传染。传染病占世界总死亡人数的四分之一还多。主要病原体导致肺炎、HIV/AIDS、腹泻、肺结核和疟疾。而且，由于洲际旅行的容易性和体量以及人类活动的扩张，随着人群分隔的屏障持续缩小，流行病的速度和风险日益增加。最近的例子包括2014年广泛传播的埃博拉爆发和2015-2016期间南非和中非的寨卡爆发。
导致肺结核(TB)的微生物结核分枝杆菌(Mtb)是分枝杆菌属内的一个物种。活动性Mtb传染是一种严重的全球性健康威胁。遗憾的是，检测活性TB病例和监测其对治疗的响应充满挑战。最为广泛使用的TB诊断方法依赖于痰液样品。
将微生物技术应用于痰液样品的方法如耐酸杆菌(AFB)涂片镜检法和Mtb培养存在灵敏度、特异性不高和/或周转时间长的问题。微生物技术的一个替代方案是基于PCR的Xpert MTB/RIF痰液测定。相比微生物技术，Xpert MTB/RIF更为快速、特异性更强，但是存在在低细菌负荷的情况下灵敏度差和不能区分活Mtb分量和非活性Mtb分量的问题。在症状改善之后，痰液样品也难以获得，并且经常在诊断方面不能用于肺外TB(EPTB)病例。在同时患有HIV和TB的患者中，诊断问题还可能被进一步放大。除了这些缺点之外，这些技术均未提供能够被用于监测治疗效果的定量结果。
存在不依赖于痰液的诊断方法，但是其并未克服上述问题中的多种问题。例如，在添加Mtb毒力抗原之后测量患者血液样品中的体外免疫应答的基于非痰液的干扰素-γ释放测试(IGRAs)在区分活性TB和潜伏性TB感染(LTBI)方面无效，并且在诊断患有EPTB或HIV/TB并发感染的患者方面表现较差。用于直接检测血液中循环的Mtb毒力抗原的方法存在灵敏度和特异性低的问题，其原因可能是宿主蛋白的表位掩蔽效应和具有几种非结核分枝杆菌(NTM)的相关抗原的同源性。
因此，当前并不存在可用于所有的TB显示和患者群体的快速、加速和敏感检测活性Mtb感染的方法，并且TB一直与高发病率和高死亡率相关。
而且，通常被称为非结核分枝杆菌(NTM)的其他分枝杆菌物种也会导致使人虚弱的肺病发生率增加。然而，与Mtb不同(尽管也存在其他缺陷)，目前并不存在商业可行的、用于诊断来自临床样品的NTM感染的经FDA批准的分子检验法。而且，由于存在大量的NTM物种，所以将会需要多种检验来涵盖临床相关的NTM谱。虽然已经存在一些实验室开发的用于一种或多种NTM物种的方法，但是这些方法并未标准化，从而限制了其更为广泛的应用。因此，并不存在令人满意的可用于快速而准确的NTM诊断的方法。
如上所述，传染病源超出了分枝杆菌属(包括埃博拉、寨卡、HIV/AIDS)和一些尚未发现或演化的分枝杆菌。这些病原物可自发导致疾病爆发以及导致全球性流行病。相应地，需要能够解决新型传染病并且能够被快速部署和协助进行治疗和控制的快速响应平台。
发明内容
本发明提供了允许对几类患者中的感染进行快速、特异性和高灵敏度定量的组合物和方法。该组合物包括协助传递激光能量以增强用于靶肽的质谱仪灵敏度的能量介导纳米颗粒(ENP)。ENP可以是任意类型的纳米颗粒，可以包括磁性材料或非磁性材料，并且包括诸如二氧化硅的材料，其允许纳米颗粒用作用于基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)的共基质。然而，本领域的普通技术人员将会理解，本领域的纳米颗粒可用于下文讨论的质谱技术或其他检验类型(例如免疫检测、生物传感器、免疫PCR)。
可选地，ENP也可以缀合(共价结合)至结合到抗原标志性肽的抗体。在本发明的一些方面，抗体可以是专门开发用于选择性结合至这些标志肽的非天然存在抗体。例如，在感染期间可能分泌某些标志肽，例如CFP-10、ESAT-6、MPB64、Ag85B、和针对TB的LAM或针对埃博拉的VP40，等等。因此，可以使用纳米颗粒来捕获来自患者样品的疾病特异性肽，例如基于血液的样品、痰液、或其他体液，并且对肽水平进行定量，从而允许确定感染水平。
在一个实例中，且不受限制地，ENP可以通过包含特异性结合至ESAT-6的肽的一种或多种抗体以及特异性结合至CFP-10的肽的抗体而缀合至结合至Mtb抗原的标志肽的抗体。抗体可以缀合至ENP的表面或ENP的孔隙的一个或多个内表面。特定的非限制性实例可以包括结合到衍生自具有SEQ ID NO：1氨基酸序列的多肽的ESAT-6肽的抗体，更具体地结合至具有SEQ ID NOS：1-2中任意一种或多种氨基酸序列的肽。另外或者作为替代方案，抗体可以结合到衍生至具有SEQ ID NO：3氨基酸序列的多肽的CFP-10的肽，更具体地结合至具有SEQ ID NOS：3-7中任一种或多种氨基酸序列的肽。
在本发明的一个方面，纳米颗粒可以具有任意形状，例如但不限于盘状、杆状、球形、圆柱形等。纳米颗粒可以是实心或多孔的。在某些实施方案中，纳米颗粒为盘状，并且具有大致平行于盘轴线的孔隙。纳米颗粒还可以包含通过增加肽解吸/离子化而增强MALDI质谱仪信号的材料。增强质谱仪信号的材料可以是颗粒外表面上的涂层，或者在某些实施方案中为纳米颗粒孔隙内表面上的涂层。例如，纳米颗粒的外表面和/或内表面可以涂有二氧化硅、金、金属氧化物或金属氧化物-氢氧化物。
根据本发明的一个方面，纳米颗粒可以配置为吸收紫外(UV)和/或可见光。例如，纳米颗粒可以吸收波长为约100至约500nm的光。纳米颗粒可以具有约300nm、约325nm、约350nm、约375nm、约400nm、约425nm、450nm、约475nm或约500nm的吸收峰。
而且，可以引导本文提供的抗体对抗特定抗原域内的特定肽，由此区分一种特定感染物质与其他类似物种，例如属于同一属的那些物种。在一个非限制性实例中，可以引导抗体对抗得自Mtb CFP-10和ESAT-6消化的特定肽。以该方式，本发明的组合物和方法能够区分Mtb和NTM感染并且不受宿主蛋白的表位-掩蔽效应阻碍。
本发明还提供了确定患者中的感染水平的方法。该方法可以包括从患者样品中分离源自病院的或与疾病相关的抗原的标志肽，例如基于血液的样品(全血、血浆、或血清)、痰液、或其他体液。对象可能感染有多于一种的感染物。例如，对象可能感染Mtb以及病毒，例如HIV。分离肽可能需要按如下方式处理样品：产生代表造成疑似疾病的感染的一种或多种靶蛋白的肽，将样品与本发明的纳米颗粒接触，以及从纳米颗粒移除未结合的肽。处理和接触步骤可以按顺序进行或同事进行。可以以将蛋白或多肽破碎成肽的任意方式来处理样品。例如，可以用蛋白酶如胰蛋白酶消化样品。在本发明的一个方面，在将样品暴露于微波辐射的同时用胰蛋白酶处理样品。
该方法还包括通过质谱仪分析样品中的肽和对标志肽的水平进行定量，从而允许确定感染水平。该方法可能需要使样品与缀合为包括一种或多种肽的ENP接触，所述一种或多种肽被选择为结合分离的标志肽。ENP还可以包含用作用于MALDI的共基质的材料。根据本发明的一个方面，可以通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)来分析肽，由此利用纳米颗粒的共基质组合物。然而，本领域的普通技术人员将会认识到，可以使用其他质谱方法来分析肽。适于本发明方法的用于肽分析的其它示例性质谱技术包括电喷雾电离、快原子轰击、化学电离、电子冲击电离或常压化学电离。可以在肽结合至纳米颗粒的同时进行质谱分析。作为替代方案，可以将肽从纳米颗粒洗脱，并且可以对洗脱的肽进行质谱分析。
本发明的方法可以用于检测源自病原的蛋白的表达和毒力因子以区分潜在感染和活动性疾病。本发明纳米颗粒所提供的灵敏度和特异性允许可靠地检测所有患者类型中的感染，包括例如成人和儿童患者、HIV阳性和HIV阴性患者等。另外，由于该方法允许对病原水平进行定量，所以其可用于评价感染的严重程度以监测感染对治疗的响应。而且，本发明的纳米颗粒可以用于区分疾病水平，例如但不限于潜在疾病、过渡性疾病、活动性疾病和早期及晚期疾病。
本文描述的组合物和方法可用于诊断应用，因为他们克服了用于评估感染的现有方法的几种限制。例如，因为本发明的组合物有效用于基于血液的患者样品，所以其可用于诊断患有EPTN或原本在其痰液中具有低细菌负荷的患者。
附图说明
图1显示可进行颗粒改性的不同类型ENP的示意性图示。示例性ENP包括纳米球作为示例基质。可以采用表面添加和移除方法在中空颗粒或实心颗粒上产生织构表面，并且可以利用多种材料来制备ENP；
图2A显示其中使用对抗宿主蛋白的亲和性分子来富集靶蛋白的样品处理示例。一些潜在的病原性生物标志物明显与宿主蛋白互相作用，并且这点可以用于富集如下蛋白：所述蛋白可能缺乏包含适于其直接分离的保守区域的肽；
图2B显示其中可由复杂患者样品中富集对抗靶肽的亲和性分子的样品处理示例；
图3显示根据本发明的示例性方法的一般流程图；
图4显示用于选定的病原标靶的肽标志物选择的流程图；
图5是分枝杆菌物种的表，其中粗下划线文本描述两个靶肽中不同的氨基酸，在肽排列下方显示的星号(*)表示氨基酸位置处的完整序列识别，带下划线的星号表示能够通过捕获的抗体或其他亲和性分子识别的保守氨基酸序列；
图6是示例性候选生物标志物肽的列表，所述生物标志物肽用于分化通过胰蛋白酶消化埃博拉病毒基质蛋白VP40所产生的已知埃博拉病毒物种，其中粗下划线文本描述所有埃博拉病毒物种中保留的靶蛋白区域不同的氨基酸。肽排列下方显示的星号(*)表示氨基酸位置处的完整序列识别，带下划线的星号表示能够通过捕获的抗体或其他亲和性分子识别的保守氨基酸序列；
图7显示适合用于分析一组物种特异性肽抗体的示例性靶肽。肽排列描述了多种相关病原性物质中保留的毒力因子的共享区域，其中彩色圆圈表示给定位置处的氨基酸变种。用能量介导颗粒消化和温育来自具有疑似感染的患者的样品，所述能量介导颗粒耦合有亲和性分子，所述亲和性分子识别对各病原性物质或有限数目的高相关性病原具有特异性的氨基酸序列；
图8显示适合用于具有单个肽抗体的多重分析的示例性病原性肽生物标志物。肽排列描述了多种相关病原性物质中保留的毒力因子的共享区域，其中彩色圆圈表示给定位置处的氨基酸变种。用能量介导颗粒消化和温育来自具有疑似感染的患者的样品，所述能量介导颗粒耦合有亲和性分子，所述亲和性分子识别相关病原性物种的大组中高度保留的“亲和性捕获区域”；
图9显示根据本发明一个方面的示例性能量介导纳米颗粒(ENP)平台的示意性图示。示例性ENP平台可以布置为纳米盘，但是本领域的普通技术人员会理解，可以使用替代平台，例如但不限于杆、球、圆柱体等。(A)CFP-10和ESAT-6从活性Mtb感染中分泌到循环中。(B)对血清样品进行微波辅助胰蛋白酶消化并且与功能化纳米盘和稳定同位素标记的内标肽混合。(C)肽定量。步骤1：通过抗体缀合的纳米盘识别和富集靶蛋白和稳定同位素标记的内标肽。步骤2：增强MALDI信号的纳米盘效应允许对通过标靶和同位素标记的内标肽的MS强度比确定的低浓度的靶肽进行定量；
图10示出对Mtb靶肽进行优化和多路定量的方法。(A)单独分析或利用石墨烯、银(Au)金(Au)、硅(Si)、二氧化硅颗粒(ENP)或纳米盘分析靶肽的MS信号强度。(B)纳米盘结构的扫描电镜图像，和(C)横截面结构以及(D)纳米盘内部孔隙表面的二氧化硅改性的透射电镜图像。(E)掺有抗原的健康血清样品中的CFP-10 1593.75(左)和ESAT-6 1900.95(右)强度，所述样品在从标靶特异性Dynabeads或纳米盘IP和洗脱之后用胰蛋白酶消化过夜(12小时)或通过快速微波辐射(20分钟)且随后在不进行免疫沉淀法(IP)的情况下进行分析；或通过纳米盘-MS法进行分析。(F)血清中针对CFP-10和ESAT-6定量的校准曲线(n＝3；R2＞0.98)。(G-H)CFP-10和ESAT-6肽(m/z 1593.75和1900.95)及其在健康对照(蓝色)的(G)血清和通过纳米盘MS分析的TB病例(红色)以及(H)进行或不进行Dynabead富集的情况下通过MALDI-TOF/TOF MS分析或在32倍血清稀释之后通过纳米盘-MS分析的TB病例血清中的内标(m/z 1603.60和1910.80)的MS谱。数据代表平均值±SEM；n＝3；***p＜0.001；
图11显示儿童和成人患者中的活性TB识别。成人(A)HIV阴性和(B)HIV阳性组中的血清CFP-10(红色)和ESAT-6(蓝色)浓度，其中每个柱代表按照CFP1-10排序的患者样品，对此抗原水平用匹配渐变条中的颜色强度显示抗原水平。(C)组合的Mtb抗原(CFP-10+ESAT-6)浓度以及针对所代表组的平均值(黑线)。数据代表平均值；n＝3；**p＜0.01；
图12示出抗-TB治疗功效的评价。(A-C)抗TB治疗(2-11对8-21个月)期间(A)HIV-/TB+和(B)HIV+/TB+患者的存档血清样品中以及(C)在处理之前和开始处理之后4或9天收集的具有活性TB的随机招募患者血清样品中的CFP-10和ESAT-6定量。治疗开始和结束日期分别用蓝色和红色虚线表示。数据代表平均值±SEM；n＝3；
图13显示用胰蛋白酶消化的CFP-10和ESAT-6片段的MALDI-TOF MS信号。重组(A)CFP-10和(B)ESAT-6胰蛋白酶消化产物的质谱。插图：显示靶肽天然同位素变种的放大谱图。(C)CFP-10和(D)ESAT-6胰蛋白酶消化产物的理论[M+H]+值；
图14显示来自重组CFP-10和ESAT-6的靶肽的LC-MS/MS谱。选择对应于2+充电状态(m/z 797.88和951.48)的CFP-10和ESAT-6前体离子用于MS/MS碎裂。b离子和y离子系列代表(A)TDAATLAQEAGNFER，[M+H]2+，m/z 797.88(CFP-10)的序列；(B)b离子和y离子系列表示WDATATELNNALQNLAR，[M+H]2+，m/z 951.48(ESAT-6)的序列；
图15显示Mtb CFP-10和ESAT-6靶肽区域的序列排列。CFP-10和ESAT-6靶肽的序列排列靶向具有来自常见NTM临床分离物的同系物中的对应序列区域的肽。(A)与鸟型分枝杆菌(MAC)物种(其占NTM病例的大部分)的对比和(B)与其他常见NTM物种的对比。通过CLUSTAL Omega(1.2.4)多序列对比(http://www.uniprot.org/align/)对Mtb CFP-10和ESAT-6及其在UniProtKB数据库中的NTM同系物的序列进行对比。Mtb CFP-10TDAATLAQEAGNFER(m/z 1593.75)和ESAT-6WDATATELNNALQNLAR(m/z 1900.95)靶序列(用虚线表示)显示为具有相邻序列或其N端序列(CFP-10)的5个氨基酸。对比序列中的红色文本(R和K)表示潜在的胰蛋白酶裂解位点；
图16示出微波辅助消化。(A)在传统的过夜或微波辅助胰蛋白酶消化和脱盐之后掺有CFP-10和ESAT-6的健康血清的MALDI-TOF MS谱。显示(B)CFP-10靶肽1593.75和(C)ESTA-6靶肽1900.95的相应放大谱图；
图17显示UV-纳米盘谱图。纳米盘表现出宽吸收光谱(λmax＝402nm)，其随着纳米盘密度增加而增加，并且与MALDI-TOF MS UV激光的激发波长(λ＝337nm)重叠；
图18显示氧化的纳米盘的扫描电镜和透射电镜。(A)单个氧化纳米盘的扫描电镜图像。(B)纳米盘多孔结构中的Si/SiO2界面的高分辨率TEM图像；
图19显示MALDI-TOF MS信号增强。利用纳米盘作为MALDI共基质和不利用纳米盘作为MALDI共基质所产生的(A)CFP-10 1593.75和(B)ESTA-6 1900.95信号区域的MALDI-TOF MS谱图；
图20是纳米盘表面官能化方法的示意性图示。(A)利用GLYMO进行的纳米盘环氧官能化。(B)纳米盘上的靶肽抗体固定；
图21显示CFP-10和ESTA-6肽(m/z 1593.75和1900.95)及其在以下中的对应内标的代表性MS谱图：在没有富集的情况下通过MALDI-TOF MS检测的2×稀释患者血清(上图)；在Dynabeads富集的情况下通过MALDI-TOF MS检测的2×稀释患者血清(中图)；通过纳米盘-MS法检测的2×稀释患者血清；和
图22显示针对利用TB病例作为患者和利用非TB对象作为对照的(A)CFP-10和(B)ESTA-6的受试者工作特征曲线(ROC)。
具体实施方式
本发明一般涉及用于确定患者中与特定疾病相关的生物标志物的水平和评估患者中疾病严重程度的组合物及这种组合物的使用方法。如在说明书和权利要求书中通篇使用的，术语“疾病”应涵盖任何感染阶段或疾病水平，例如但不限于潜伏期、活动期、早期或晚期疾病或从潜伏期疾病到活动期疾病的过渡，除非上下文另有规定或说明。此外，如在说明书和权利要求书中通篇使用的，术语“感染/传染”应涵盖任何病原水平，而与其和活动期、早期或晚期疾病或从潜伏期到活动期疾病的过渡的关系无关。该组合物包括任选缀合有亲和性配体如抗体的能量介导颗粒(ENP)。如上文讨论的，ENP可缀合至一个或多个抗体，所述抗体结合至感染期间分泌的抗原的签名肽，例如CFP-10、EAST-6、MPB64、Ag85B和针对的LAM或针对埃博拉的VP40等。ENP还可以包括诸如二氧化硅的材料，其允许纳米颗粒用作用于基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)的共基质。因而，可以使用ENP来从患者样品(例如基于血液的患者样品)捕获疾病特异性肽并且对这些肽的水平进行定量。在本发明的一个方面，疾病特异性肽的定量可允许确定疾病的水平/严重程度以及随后在治疗期间对其进行监测。
根据本发明一个方面，提供了确定患者中疾病水平的方法。一种示例性方法可包括通过例如在将样品暴露于微波辐射或不暴露于微波辐射的情况下用蛋白酶或化学裂解剂消化样品来从患者样品(例如基于血液的患者样品)中分离一种或多种疾病的标志肽。之后可以将消化的蛋白暴露于ENP，所述ENP被改性为包括与标志肽互补的亲和性配体以捕获和富集标志肽用于进一步分析。另外或作为替代方案，该示例性方法还可以包括利用根据本发明的ENP从患者样品中分离全蛋白。靶蛋白可结合至ENP，使得可以去除其余周边物质的全部或大部分，以产生分离的靶蛋白。然后，如上文所述，对分离的蛋白进行消化，通过包括相关亲和性配体的第二组纳米颗粒捕获所得肽。
根据本发明另一方面，示例性方法也可以包括通过质谱法分析样品中的肽和对标志肽的水平进行定量，其可以允许确定疾病水平。在特定实施方案中，可以利用本发明的ENP实施本发明的示例性方法，其中通过MALDI-TOF MS对纳米颗粒直接进行分析以使捕获的肽离子化。ENP可以增强所捕获的肽的离子化，从而增加MALDI-TOF质谱法中的检测灵敏度。
能量介导纳米颗粒(ENP)
在过去十年中，由于其高精度和高通量筛选能力，解吸/电离质谱法(DIMS)已经在临床诊断应用中获得大量关注。然而，化学基质的使用带来某些限制，包括需要选择与标靶分析物相容的基质、化学基质在低分子量范围内产生干扰以及数据质量低(即灵敏度低且可再现性差)。为了克服这些问题，已经开发了纳米结构材料如硅(Si)纳米线和多孔Si基材来取代化学基质。纳米结构化Si材料上的高能激光吸附强力增强分析物解吸和电离的效率。然而，在使用Si基材时的一个常见问题是其对烃和其他环境物质具有高亲和力。这些物质的解吸在质谱下端产生背景干扰。第二个问题与离子分离机制的性质相关。可通过电喷雾电离MS和核磁共振容易地检测的许多生物分子无法通过DIMS检测，因为后者方法对具有高质子亲和力、低电离能量和高稳定化能量的化合物具有强选择性。利用DIMS的第三个问题是由于在将样品沉积在靶板上时点-点精度差导致的定量性能差。
下面参考附图，尤其是参考图1，为了解决当前DIMS法在检测低丰度生物标志物方面存在的障碍，显示了示例性能量介导纳米颗粒(ENP)。ENP可以提供增强的分析物激光解吸/电离，如在下文更为详细描述的。“纳米颗粒”是指通常在纳米尺度测量的尺寸的颗粒，例如1-1000nm。“微米颗粒”是指具有通常在微米尺度上测量的尺寸的颗粒，例如1-1000μm。然而，“纳米颗粒”和“微米颗粒”之间的界限并不是离散的，对于其尺寸在纳米尺度上高或在微米尺度上低的颗粒，例如直径为100nm(0.1μm)至约10,000nm(10μm)的颗粒，该术语在本文中可互换使用。通过控制沉积在ENP上的材料的尺寸、表面密度和分布，可以选择性调节ENP的光学性能和表面性能，由此允许可控地产生用于非常灵敏地检测各种靶肽的合适ENP。
根据本发明的一个方面，ENP可以具有适合用于应用的形状和尺寸。例如，但不限于，可以将ENP形成为任何形状，例如盘状、杆状、球状、圆柱体状或任何其他合适的构造。例如，ENP可以成形为类似于球状，其直径为约500nm、约600nm、约700nm、约800nm、约900nm、约1000nm、约1100nm、约1200nm、约1300nm、约1400nm、约1500nm、约200nm至约2000nm、约500nm至约2000nm、约800nm至约2000nm、约200nm至约1500nm、约500nm至约1500nm、或约800nm至约1500nm。
在另一实施例中，ENP可以成形为类似于盘状，并且具有类似于上述球状的直径和以下高度：约100nm、约200nm、约300nm、约400nm、约500nm、约600nm、约700nm、约800nm、约900nm、约1000nm、约100nm至约1000、约200nm至约1000、约400nm至约1000、约100nm至约500、约200nm至约500、或约300nm至约500。
如图1所示，ENP可以成形为实心纳米颗粒100、102或成形为中空纳米颗粒104。根据本发明一个方面，ENP 100、102、104可以包含允许纳米颗粒用作用于基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)的共基质的材料。优选地，ENP材料用作通过提高肽解吸/电离效率来增强质谱信号的共基质。例如，实心ENP 100和中空ENP 104可以各自由增强质谱信号的一种材料形成，例如二氧化硅、金、金属氧化物或金属氧化物-氢氧化物。或者，可以将增强质谱信号的材料(二氧化硅或金等)形成为ENP102表面上的涂层106。在该情况下，ENP 102的芯108可以为第二材料，例如硅，或能够用作共基质的其他材料。芯108也可以由磁性材料组成，例如但不限于铁、镍、钴及其氧化物和合金。磁性芯可以协助从样品环境中分离ENP 102，如在下文更为详细讨论的。根据本发明的另一方面，ENP 100、102、104中的任一种或全部也都可以进行表面改性，例如表面添加100a、102a、104a或表面移除100b、102b、104b。在下文，在提及ENP100时应包括ENP 100、100a、100b；在提及ENP 102时应包括ENP 102、102a、102b；在提及ENP 104时应包括ENP 104、104a、104b，除非上下文另有指示或说明。这些表面改性可以产生对应的织构化表面110a、110b；112a、112b；和114a、114b(在本文统称为织构化表面110)，从而限定诸如孔隙、峰、脊和谷或其他类似形貌(在本文统称为孔隙)的特征。织构化表面110可以由共基质形成，或者可以由随后涂有共基质材料的非共基质材料形成。在本发明的另一方面中，ENP100、102(芯108和/或涂层106)、104也可以为磁性或者具有磁性性能。
由织构化表面110限定的任选孔隙可以具有任何形状。例如，但不限于，孔隙可以具有约10nm、约20nm、约30nm、约40nm、约50nm、约60nm、约70nm、约80nm、约90nm、约100nm的平均最大直径。孔隙可以具有约5nm至约200nm、约10nm至约100nm、约20nm至约80nm、约30nm至约60nm的平均直径。
参考图2A和2B，可以对ENP 100、102、104的外表面或织构化表面110的全部或部分进行改性以包含一种或多种亲和性试剂，例如但不限于抗体116。例如，如图2A所示，抗体116可以包括对特定宿主蛋白120具有高亲和力的抗体116a，使得宿主蛋白120与抗体116a结合。靶病原蛋白122可对宿主蛋白120具有高亲和力，由此靶病原蛋白122选择性地结合至宿主蛋白120。以该方式，可以如上文所述去除其余的样品周围物质，使得宿主蛋白120和结合的靶病原蛋白122基本上被分离和富集。靶病原蛋白122然后可以进行蛋白水解，如将在下文中更详细描述的。
如图2B所示，可以对ENP 100、102、104进行肽消化，使得代表感染的靶肽124可结合至抗体116b。蛋白消化可得自图2A中富集的分离靶病原蛋白122，或者可以得自患者样品的全蛋白组分或其一部分的消化。以该方式，亲和试剂可以选择性和特异性结合至病原特异性蛋白，由此增加肽富集，使得随后的检测技术能够检测和识别飞摩尔浓度范围内的病原特异性肽。
例如但不限于，抗体116b’可以特异性结合至ESAT-6的肽126和/或抗体116b”可以特异性结合至CFP-10的肽128，其中ESAT-6和CFP-10各自为代表Mtb的生物分子。在该实例中，抗体116b’可以结合至具有SEQ ID NOS：1-2中任一者或两者氨基酸序列的ESAT-6的肽。示例性抗体116b”可以结合至具有SEQ ID NOS：3-7氨基酸序列的CFP-10的肽。被称为氨基酸的术语“序列”与给定氨基酸链(例如肽或多肽)内氨基酸的线性N端至C端顺序的全部或部分相关。
抗体116可以通过本领域中已知的任何方法缀合至纳米颗粒，例如ENP 100、102、104或织构化表面110。例如，抗体116可以不可逆地缀合至ENP 100、102、104或织构化表面110。例如，但不限于，可以用(3-缩水甘油基氧丙基)三甲氧基硅烷(GLYMO，Sigma-Aldrich)来处理ENP涂有二氧化硅的表面，所述(3-(2,3-环氧丙氧丙基))三甲氧基硅烷是一种双官能有机硅烷，其拥有反应性有机环氧化物和可水解的无机甲氧基甲硅烷基团。甲氧基甲硅烷基团与纳米颗粒的二氧化硅反应，并且有机环氧化物与抗体116形成共价键。或者，抗体116可以可逆地缀合至ENP 100、102、104或织构化表面110，例如通过可逆加成-断裂链转移反应(RAFT)聚合反应；将金属-螯合组氨酸标签添加至抗体116且共价附接另一螯合剂如次氨基乙酸至ENP；或利用将生物素化抗体116连接至已经涂有聚胸腺嘧啶低聚核苷酸的ENP100、102、104或织构化表面110的聚腺苷酸-链霉亲和素连接子。
根据本发明的一个方面，ENP 100、102、104可以配置为吸收紫外(UV)和/或可见光。例如，ENP 100、102、104可以配置为吸收波长为约300nm至约450nm的光。ENP 100、102、104可以具有约300nm、约325nm、约350nm、375nm、约400nm、约425nm、450nm、约475nm、或约500nm的吸收峰。因此，在执行MALDI-TOF MS时ENP 100、102、104可以增强肽的解吸/电离效率。然而，应当指出，ENP 100、102、104也可以用于各种检测方法，例如其他类型的质谱或非质谱分析方法，例如免疫测定、免疫-PCR，或者用作例如依赖于用于检测和/或分析的化学、电学、电化学和/或光学信号的生物传感器系统中的组分。
检测患者样品中的感染
本文描述各实施方案与样品中的一种或多种疾病特异性生物分子检测相关。样品可以包括或得自选自血清、血浆、血液、尿液、精液、精清、胸膜液、腹水、乳头抽出物、粪便和唾液的至少一种生物学流体。特别地，样品可以包含或得自至少一种体液，其包括但不限于痰液、胸腔积液、脑脊髓液、尿、全血、血清和血浆。优选地，体液可以得自患有、疑似患有和/或存在感染风险的脊椎哺乳动物，特别是人。
如本文所用的，术语“患者”、“宿主”或“对象”是指能够将本文公开的一种或多种药学组合物容纳于其中的任何实体。优选地，对象是脊椎哺乳动物，其意指任何动物种类(优选哺乳动物，例如人类)。在某些实施方案中，“患者”是指任何动物宿主，包括但不限于任何哺乳动物宿主。优选地，该术语是指任何哺乳动物宿主，后者包括但不限于人和非人灵长动物、牛、犬、公山羊、乌鸦、马、猫、山羊、兔(lapines)、野兔(leporines)、狼、鼠、绵羊、猪、蛙(ranines)、狐狸等，包括家畜、动物园标本、外来物种以及伴侣动物、宠物以及在兽医从业者护理之下的任何动物。患者可以为能够通过产生免疫应答来响应于本发明疫苗的接种的任何年龄。
如在下文更为详细讨论的，存在多种适合通过本文描述的方法进行检测的疾病特异性生物标志物，其包括但不限于生物学分子如蛋白、肽、多肽、抗体、多核苷酸、低聚核苷酸、核酸和/或多糖。根据本发明的一个方面，用于检测样品中的一种或多种疾病特异性生物分子的示例性方法200在图3中示出，另外参考图9。方法200中的各步骤中的每个步骤都将在下文中更为详细地描述。
识别和选择肽生物标志物
在示例性方法200的步骤202中，选择一种或多种肽，其中所述肽是物种特异性的，使得肽的检测表示存在特定物种。根据本发明的一个方面，可以通过使用数据库如公开可用的在先UniProt数据库、www.uniprot.org或其他类似的数据库来选择肽、蛋白和/或肽序列。
或者，如图4所示，可以采用一般算法400来分离和识别物种特异性肽。在步骤402中，必须首先确定病原(例如结核分枝杆菌、埃博拉、HIV/AIDS)是否分泌毒力因子。如果分泌一种或多种毒力因子，则接下来确定各因子间是否存在序列保留(步骤404)。如果不分泌一种或多种毒力因子，则分析病原结构和代谢蛋白的序列保留(步骤406)。在任一事件中，接下来确定不同的病原物种之间是否保留了毒力因子或病原蛋白(步骤408)。
如果未保留蛋白序列，则分析下一个毒力因子(如果可用的话)或分析下一个病原蛋白(步骤406)。另外或作为替代方案，可以分析蛋白以确定蛋白是否包含病原特异性肽序列(步骤410)。如果否，则否决蛋白标靶(步骤412)，或如果是，则接受肽序列作为备选单病原特异性生物标志物肽(步骤414)；例如，参见图5，其关于分枝杆菌属和蛋白Ag85B的两种肽；SEQ ID NOS.1-7中的ESAT-6和CFP-10。然后可以针对每个单个识别的单病原特异性生物标志物肽构件标靶特异性ENP。例如，参见图7A。
如果在几种不同的病原物种之间保留了蛋白，则分析蛋白以确定保留的序列释放还包括可变序列(步骤416)。如果不存在可变序列，则在步骤418中否决蛋白，原因是缺乏蛋白特异性。也就是说，蛋白的检查将不会导致阳性识别单个病原。然而，如果存在至少一个可变序列，则接下来确定变化是否区分病原物种或亚型(步骤420)。同样，如果否，则否决蛋白(步骤418)。如果可变序列确实区分物种或亚型，则在步骤422中选择该蛋白作为具有亲和性捕获区域的备选光谱病原特异性肽标志物；例如，参见图6和7B，其关于针对各种埃博拉病毒物种的蛋白VP40的一部分和识别适于靶向抗体的亲和性捕获区域肽序列的SEQ IDNO.8。
如图5和6所示，肽序列中的粗下划线文本代表两个靶肽之间不同的氨基酸。列表底部的星号代表完整的序列识别(序列保留)，而下划线星号代表能够被亲和试剂如抗体116识别的保留序列。
获得靶向肽的抗体
在识别和选择靶肽之后，可以在步骤204中获得这些肽的抗体。可以利用本领域中已知的技术来构建抗体，并且可以现场制作或从合适的供应商购得。为了确保选择性和特异性，将抗体构造成选择性结合至靶肽或由相关物种的肽共享的亲和性捕获区域，如在下文更为详细讨论的。不拘泥于任何特定理论，抗体可以特异性结合至其对抗原肽的亲和力高于对具有类似尺寸、类似氨基酸组成或类似但是不同氨基酸序列(例如具有一个或多个氨基酸取代基的肽)的亲和力的肽。
例如，针对抗原肽，抗体的Kd(抗体和其抗原之间的平衡解离常数)可以为针对非抗原肽的Kd的1/100、1/1000、1/10000或更低。如上所述，对于代表Mtb感染的示例性ESAT-6和CFP-10抗原，ESAT-6的抗体可以结合至具有SEQ IN NOS:3-7中任一个的氨基酸序列的肽。在另一实例中，检测多种埃博拉病毒物种的肽可以包含选择为靶向SEQ IN NOS:8的亲和性靶区域的抗体。然后MALDI-TOF分析可以将每种埃博拉病毒物种彼此区分开，如将在下文更为详细描述的。
本领域的普通技术人员将会理解，哺乳动物天然产生外源性分子的抗体，并且肽的抗体可以在自然界中存在。如果已知在自然界中不存在而是通过人为干预产生，则本发明的抗体被认为“非天然存在”。因此，如果其因产生该抗原的抗体之目的而得自将动物暴露于抗原，则在本发明范围内抗体被认为非天然存在，即使抗体的产生是动物的正常免疫反应也是如此。
制备患者样品
一旦已经识别和选择一种或多种生物标志物，并且已经获得从这些生物标志物中选择的抗体，则可以制备患者样品以在步骤206中进行分析。患者样品可以是得自患者的任意类型流体。例如，但不限于，患者样品可以是痰液、胸腔积液、脑脊髓液、尿、血清、血浆、全血、组织过滤物、组织溶解产物、组织匀浆、或淋巴液。优选地，患者样品是血液样品。基于血液的样品可以是得自血液的任何材料，例如全血、血浆或血清。可以通过标准抽血程序获得血液，然后进行分离。
用于制备血浆样品的典型分离方法包括对血液样品进行离心分离。例如，在抽血之后，可以立即将蛋白酶抑制剂和/或抗絮凝剂添加至血液样品。然后冷却试管并离心，并且可以随后将其置于冰上。所得样品被分离成以下组分：上层相中的血浆澄清溶液；白细胞层，其为混有血小板的白细胞薄层；和红细胞(血红细胞)。通常，8.5mL全血将会产生约2.5-3.0mL血浆。
以非常类似的方式制备血清。收集静脉血液，然后通过倒置将血液与蛋白酶抑制剂和絮凝剂混合。通过在室温下竖直静置试管来使血液凝结。然后对血液进行离心分离，其中所得上清液是指定的血清。随后应将血清样品置于冰上。
在一些实施方案中，可以对疑似包含一种或多种疾病特异性生物分子的样品进行“预浓缩”，然后施加到ENP 100、102、104上。如果在样品中存在的话，可以通过一种或多种常规方法预浓缩疾病特异性生物分子，包括例如通过沉淀样品的似蛋白部分。标准的蛋白沉淀方法是本领域普通技术人员已知的，可以包括例如使用硫酸铵。然后可以从含水级分中分离所得蛋白沉淀，并将其溶解在合适溶剂或稀释剂中，然后施加到ENP 100、102、104上。
或者，如上文参考图2A描述的，可以通过将样品施加到包含构造为选择性和特异性结合靶肽的亲和性试剂的ENP 100、102、104上来对样品进行预浓缩。然后，可以对样品进行离心，由此可以将ENP结合的蛋白或肽向下旋转到离心管底部。可以对其余的上清液进行倾析，然后可以将ENP结合的肽溶解在合适的溶剂或稀释剂中。
除了离心之外，还可以通过过滤来制备样品。用于去除颗粒的各种过滤介质包括滤纸，例如纤维素和利用再生纤维素、乙酸纤维素、尼龙、PTFE、聚丙烯、聚酯、聚醚砜、聚碳酸酯和聚乙烯吡咯烷酮的膜过滤器。用于去除颗粒和基质干扰物的各种过滤介质包括功能化膜，例如离子交换膜和亲和性膜、SPE(固相萃取)盒如基于硅和基于聚合物的盒；以及SPE盘，例如基于PTFE和基于玻璃纤维的盘。这些过滤器中的一些过滤器可以以盘的形式提供，用于松散地防止在过滤器托架/外壳中，而其他过滤器提供在能够被置于例如标准血液收集试管上的一次性尖端中，还有一些过滤器以阵列形式提供在用于容纳移液管移取样品的孔内。另一类过滤器包括选择过滤器。选择过滤器由具有乙酸纤维素滤膜的聚丙烯离心管构成，并且与离心联用来从样品中移除颗粒，例如血清和血浆样品，其通常被稀释在含水缓冲液中。
疾病特异性生物分子的蛋白水解
在任选的步骤208中，可以对疑似包含疾病特异性生物分子的样品进行蛋白水解，然后进行检测。例如，可以利用一种或多种蛋白水解剂如蛋白酶或肽酶消化样品，以使样品中存在的一种或多种多肽或蛋白发生蛋白水解裂解。各种蛋白酶或肽酶在本领域中是已知的，包括例如丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天门冬氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。根据本发明的一个方面，蛋白酶可以是胰蛋白酶、或其类似物或活性片段。可以在分析之前进行样品的蛋白水解，或者，在分析期间在ENP上或其内进行蛋白水解。
在一些实施方案中，可以直接在ENP自身上或内消化疾病特异性生物分子(即现场蛋白水解)。然后可以从ENP中提取由此产生的蛋白水解产物用于进一步表征或分析。可以通过例如利用一种或多种合适的洗脱缓冲液实现消化产物的提取。在其他实施方案中，可以从ENP中提取目标生物分子或蛋白水解副产物，然后在不同的位置进行消化。消化产物可以包括例如疾病特异性生物分子的一种或多种不同可识别片段。
例如，但绝不限于，结核分枝杆菌生物分子是ESAT-6蛋白或肽，其中消化产物可以包括例如具有约1895-1910Da质量指纹的至少一种肽。消化产物可以包含例如至少一种ESAT-6片段，其包含、基本上由以下组成、或由以下组成：WDATATELNNALQNLAR(SEQ ID NO:1)的序列；至少一种ESAT-6片段，其包含、基本上由以下组成、或由以下组成：LAAAWGGSGSEAYQGVQQK(SEQ ID NO:2)的序列；或两种片段的组合。
继续上述实例，结核分枝杆菌特异性生物分子是CFP-10蛋白或肽，其中消化产物可以包括例如得自蛋白水解的至少一种CFP-10片段。在这样的实施方案中，消化产物可以包括例如至少一种CFP-10特异性肽片段，其包含、基本上由以下组成、或由以下组成：TQIDQVESTAGSLQGQWR(SEQ ID NO：3)、ADEEQQQALSSQMGF(SEQ ID NO：4)、TDAATLAQEAGNFER(SEQ ID NO：5)、GAAGTAAQAAVVR(SEQ ID NO：6)和QAGVQYSR(SEQ ID NO：7)中任一种或多种的氨基酸序列。
在本发明的范围内，其他蛋白水解方法也是可以的。例如，可以通过将样品暴露于甲酸或其他非酶解蛋白水解试剂来实现或促进蛋白水解。处理除了蛋白酶消化之外，还可以进行微波辐射。可以通过其他方法来蛋白水解样品，例如化学断裂肽键等。
将制备的样品与ENP接触
在步骤210中，在已经制备疑似包含至少第一病原特异性生物标志物抗原的患者样品进行分析(并且任选在步骤208中进行蛋白水解)之后，将所制备的样品在允许生物标志物特异性抗原特异性结合至一种或多种抗体的条件下与多种ENP 100、102、104接触，后者包含其上固定有一种或多种生物标志物抗体116。生物标志物抗原特异性抗体可以包含一种或多种特定抗体，或其一种或多种抗原结合片段，或其组合。如上文所述，ENP 100、102、104也可以用作用于提高MALDI解吸/电离效率的共基质。不拘泥于任何特定理论，考虑的是ENP可以在MALDI-TOF MS分析期间增强一种或多种抗体结合抗原的气化和/或增加其电离，由此增加检测灵敏度，并且允许检测标靶病原特异性生物标志物，甚至当以非常低(即纳摩至飞摩)浓度存在于初始患者样品中时也是如此。
检测疾病特异性生物分子
在步骤210中接触ENP 100、102、104之后，然后可以在步骤212中利用本领域普通技术人员已知的任一种或多种技术检测疾病特异性生物分子的存在，该技术包括但不限于质谱、凝胶电泳、色谱层析、一种或多种生物测定、一种或多种免测测定、或两种或多种这种技术的组合。
根据本发明，可以使用质谱法来从目标样品中检测疾病特异性蛋白和肽的存在。可以使用任意合适的电离技术，例如但不限于，常压电离源，包括基质辅助激光解吸/电离(MALDI)、表面增强激光解吸/电离(SELDI)、电喷雾电离(ESI)、纳米电喷雾电离(nESI)、解吸电喷雾电离(DESI)、电喷雾辅助激光解吸/电离(ELDI)、直接实时分析(DART)和常压介质阻挡放电电离(DBDI)。合适的质量分析仪可以包括飞行时间(TOF)、傅里叶变换离子回旋加速器共振(FT-ICR)、四极子、或离子陷。根据本发明的一个方面，可以将质谱仪与另一分析模式联用，例如液相色谱(LC-MS)或毛细管电泳(CE-MS)。在本领域的又一方面中，可以将质谱仪配置为执行串联质谱分析(MS-MS)或多级质谱分析(MSn)、和/或质谱分析。例如，可以采用MALDI-TOF MS来检测一种或多种疾病特异性生物分子的存在，由此ENP 100、102、104可以与任意合适的MALDI基质一起用作共基质，以用于提高肽解吸和电离。
根据本发明的一个方面，可以通过例如找出特定目标生物分子所特有的一种或多种质谱“指纹”来检测疾病特异性生物分子的存在。质量指纹可以为特定目标生物分子的一种或多种酶解消化产物。具体实例可见于以下实施例中。
诊断试剂盒
本发明描述的方法和试剂盒在分子领域内具有广泛应用，因为许多传染病一直与具体微生物相关，所述具体微生物中的多种微生物具有已知类型的生物标志物或物种特异性生物标志物，其可以根据本文描述的方法来检测。适合利用所公开的方法检测的示例性病原包括但不限于细菌病原、病毒病原、真菌病原、单细胞真核病原如原生动物、螺旋菌、朊病毒、或其他病原性微生物有机体。具体实例包括但不限于检测病毒病原如HSV、HIV、西尼罗河病毒、汉坦病毒、甲型肝炎、乙型肝炎、诺如病毒、脊髓灰质炎病毒、轮状病毒等；检测细菌病原如肺炎致病因子、军团菌疾病、食物中毒、食物感染、食物醉酒、白喉、莱姆病；和/或检测原生动物病原，其包括但不限于疟原虫属的那些。
包括包含这些的一种或多种公开的病原特异性生物标志物或药物配方；和用于在诊断、治疗、预防、和/或其他临床实施方案中使用试剂盒的说明书也代表本公开的优选方面。如本文使用的，术语“试剂盒”可用于描述便携式自包含壳体的变化方案，其包括执行本发明诊断方法的一种或多种试剂、组分或药学配制的组合物。这样的试剂盒可以单独包括或与一种或多种额外的诊断化合物、药物等组合包括一种或多种公开的病原特异性生物标志物。可以包装根据本发明的试剂盒以用于商业分销，并且可以进一步任选地包括一种或多种递送、存储或测试组件。
用于这种试剂盒的容器通常可以包括至少一种小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其他容器，可以将病原特异性生物标志物组合物置于其中。或者，可以将多种不同的生物标志物组合物和/或不同的蛋白水解酶制备成单个制剂，并且可以将其包装在单个容器、小瓶、烧瓶、注射器、导管、套管、瓶子、试管、安瓿、或其他合适的容器中。试剂盒还可以包括较大的容器，例如箱，其包括上述容器连同其他设备、说明书等。
当然，这样的试剂盒可以是更大系统的一部分。例如，该系统还可以包括诸如用于检测和/或定量标靶分析物的质谱装置的仪器。也可以将样品分离项目包含在各种系统和试剂盒中，以及用于获得样品、对其进行处理、和/或执行本文公开方法的一个或多个步骤。
例如，可以提供用于涉及利用多种能量介导纳米颗粒来检测病原特异性生物标志物的用途的试剂盒，其包括以下中的一种或多种：
多个能量介导纳米颗粒；
生物标志物特异性靶蛋白、肽或抗原的至少一个片段，其具有可通过质谱法检测的至少一个质量指纹，
适于从多个能量介导纳米颗粒中提取所述靶蛋白的至少一个片段的洗脱缓冲液，
适于在添加消化缓冲液之前洗涤多个能量介导纳米颗粒的洗涤缓冲液，和
用于使用试剂盒以检测疾病生物标志物特异性靶蛋白、肽或抗原的说明书。
本领域的普通技术人员将会容易地想到选择用于举例说明目的的本发明实施方案的各种其他变化方案和修改方案。只要这样的修改方案和变化方案不脱离本发明精神，则其也应包含在本发明范围内。因此，本发明并不旨在受限于所描述的实施方案，而是将具有由所附权利要求的语言所限定的全部范围。
实施例
实施例1：检测ESAT-6和CFP-10的肽
在Mtb诊断测定中，同时从人体液中检测来自ESAT-6和CFP-10的肽。首先，建立ESAT-6和CFP-10的指纹谱。在谱图中观察ESAT-6(分子量1900.9511和1907.9246)的两个主要消化片段。与ESAT-6片段相比，在MALDI-TOF MS中观察到了更多的CFP-10片段，包括2003.9781、1668.7170、1593.7503、1142.6276和908.4584Da(表1)。最显著的CFP-10片段(2003.9781)的强度显示为ESAT-6片段的强度的10倍，其显著提高了测定的灵敏度。
表1：ESAT-6、CFP-10和VP40消化片段的氨基酸序列和MW
实施例2：基于能量介导颗粒的检测测定
尽管Mtb分泌的大量的CFP-10和ESAT-6，但是在感染个体的外周血中仅释放了少量的蛋白。为了定量来自血液样品的这些低丰度生物标志物，结合MALDI-TOF MS利用根据本发明的ENP开发了测定以识别和定量来自患者样品的病原特异性生物标志物，包括例如人的血清。该测定被称为ENP-MS。
ENP-MS测定可以采用一步快速微波辅助消化以有效地将血清蛋白质组学生物标志物(例如Mtb特异性肽、CFP-10和ESAT-6)消化成能够被纯化、富集和利用MALDI-TOF MS特异性检测和定量的更小片段。通过将定制的肽特异性抗体-ENP缀合物引入消化的血清样品中，已经利用根据本发明的方法检测和定量了标靶CFP-10和ESAT-6衍生的肽。
利用本测定示范了在识别活动性TB病例中临床使用ENP-MS和在多个不同的国家利用多路临床样品组来评价处理功效。
人血清样品的微波辅助胰蛋白酶消化
利用再悬浮缓冲液(Promega，Madison，WI)将序列等级的经修饰胰蛋白酶再悬浮至1mg/ml。对于每个人血清样品，在1.5mL离心管(Eppendorf，Hauppauge，NY)中利用400μL100mM NH4HCO3溶液和10μL胰蛋白酶溶液混合100μL样品。将样品管置于具有1000mL水作为水浴以吸收额外微波能量的容器中。在1200W家用微波炉中消化样品(Panasonic，LakeForest，CA)，以20％功率工作20分钟。每隔10分钟更换水浴中的新鲜水。在微波辐照之后，通过将三氟乙酸(TFA)添加至每个样品至0.1％的最终浓度来终止消化。
表征ENP
在5kV加速电压下利用Zeiss Neon 40扫描电镜获取ENP的形貌。利用高精度TEM(JEOL 2100，200kV，Peabody，MA)对ENP的表面氧化成像。利用具有能量分散X光谱(EDS)检测仪(Peabody，MA)的扫描TEM产生元素X光分析地图。
ENP功能化
构建裸ENP并存放在异丙醇(IPA)中以获得最大稳定性。为了使ENP功能化，将50mLIPA中的约70亿ENP转移到每个离心管中。以4000rcf使每个管离心20分钟以分离IPA和ENP，然后在真空中干燥以完全去除IPA。将3mL DMSO添加至每个管，并且在旋转下温育1小时以将ENP的表面氧化成二氧化硅。然后通过离心(4000rcf，20分钟)去除DMSO并用乙醇洗涤ENP3次。使用(3-缩水甘油基氧丙基)三甲氧基硅烷(GLYMO，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)来使氧化的ENP功能化。通过混合3.5mL乙醇、3.5mL DI水和3mL GLYMO来制备GLYMO溶液。通过利用HCl将pH值调节至3.5活化溶液，然后添加至ENP。在旋转下在GLYMO溶液中温育3小时后，通过离心(4000rcf，20分钟)分离ENP并用乙醇洗涤三次。将所得功能化ENP再悬浮在10mL丙酮中用于后续使用。
抗体固定
通过抗体氨基和GLYMO的环氧基团之间的直接偶联将每个定制的肽特异性抗体(GL Biochem，Shanghai，China)在ENP上。简言之，在1.5mL离心管(Eppendorf)中对来自前述母液的1mL ENP溶液进行离心(10000rcf，5分钟)，然后在真空中干燥以完全去除丙酮(rcf＝相对离心力)。将干ENP再悬浮在包含20μL抗体(抗-1593.75或抗-1900.95)的1mL 1×磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH＝8.6)中，并且在旋转下温育2小时。然后通过离心(10000rcf，5分钟)从抗体溶液中分离抗体缀合的ENP，并且再悬浮于1mL 200MM Tris+100mM NaCl溶液(pH＝7)温育30分钟，以使游离的环氧基团失活。最后，通过离心(10000rcf，5分钟)和再悬浮利用1×PBS(pH＝7.4)洗涤抗体缀合的ENP三次。将所得抗体缀合的ENP再悬浮于60μL 1×PBS(pH＝7.4)中用于后续使用。
同时直接捕获CFP-10和ESAT-6片段
将10nM同位素标记的1593.75片段(1603.60)和10nM同位素标记的1900.95片段(1910.80)添加至每个胰蛋白酶消化的人血清样品中以用于定量目的。接下来，将10μL抗-1593.75缀合的ENP和10μL抗1900.95-缀合的ENP添加至每个胰蛋白酶消化的人血清样品，并且在旋转下温育2小时以获取CFP-10和ESAT-6片段。然后通过离心(10000rcf，5分钟)从人血清样品中分离缀合的ENP，并且通过离心(10000rcf，5分钟)和再悬浮用1mg/mL 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷-L丝氨酸(DOPS，Avanti Polar Lipids，Alabaster，Alabama)水溶液洗涤三次。将所得缀合ENP再悬浮于6μL去离子水中以进行MALDI-TOF-MS分析。
MALDI-TOF-MS分析
将1.5μL每个样品点状分布在靶盘上并使其在真空中完全干燥。接下来，将1.5μL基质溶液(50CAN和0.1TFA中的4g/Lα-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA))点状分布在每个样品点上，并且使其在真空中完全干燥。在1000-3000Da范围内的正反射模式中获取MALDI-TOF质谱。低质量偏差设定为800Da。所有的测试都在10-7Torr或更低的高真空下进行。加速电压、电子电压和透镜电压分别为19kV、20kV和9.75kV，延迟时间为100nm。对每个样品用3000激光打印机获取质谱。利用肽校准标准对所有的谱图进行外部校准，并且利用flexAnanlysis3.0(Bruker Daltonics，Billerica，MA)对原始谱图数据进行处理。
实施例3：利用本发明的组合物检测TB
测定执行表征
为了识别适合用于在MALDI-TOF MS平台上进行检测的CFP靶肽和EAST-6靶肽，利用胰蛋白酶消化CFP-10(重组体)和ESAT-6(重组体)并利用MALDI-TOF MS进行分析。由于其在所得谱图上的高信噪比(图13)，选择CFP-10肽1593.75和ESAT-6肽1900.95作为代表性靶肽。传统的胰蛋白酶消化在消化复杂人体体液如血清方面缺乏效率。为了克服该障碍，利用微波辐射进行胰蛋白酶消化以加速蛋白水解。已发现，得自微波辅助消化的肽产生效率明显优于单独的标准过夜消化(图16A-C)。当采用微波辅助消化时，靶肽(1593.75和1900.75)产率提高了～20和～10倍(图16A-C)。另外，微波辅助消化通过将消化时间从过夜减少至20分钟来提供了更短的样品应答时间。
采用ENP纳米技术来克服利用MALDI-TOF MS检测低丰度生物标志物时信号强度低的主要限制。对两种靶肽进行MS分析，并且将信号强度与混有ENP的靶肽信号强度进行比较。由于其在紫外范围内的高吸收率，ENP用作用于激光辐射的能量容器，因此增强了靶肽的气化和电离。MALDI-TOF MS结果表明，肽1593.75和肽1900.95的信号强度分别提高了～9倍和～6倍(图10A)。首先利用混有包含已知浓度预消化CFP-10和ESAT-6蛋白的样品的ENP建立肽1593.75和肽1900.95的校准曲线，其示范了新型ENP MS平台的高可再现性和线性(图10F)。
除了增强MALDI信号强度和提高灵敏度之外，ENP还用作用于纯化和富集靶肽的基材。为了特异性识别靶肽1593.75和1900.95，获得两种定制的肽特异性抗体(抗-1593.75和抗-1900.95)首先利用二甲基亚砜(DMSO)氧化ENP，然后进行扫描电镜法(SEM)和透射电镜法(TEM)来表征ENP的表面。SEM和TEM图像证实具有1000-nm(直径)×400-nm ENP的可再现性，平均孔隙直径为40-nm(图10B、10C和18A)。在氧化之后，利用TEM(图10D和18B)观察ENP内部孔隙结构和外表面两者上的二氧化硅薄层。最后，利用环氧基团使ENP的二氧化硅表面功能化丙利用靶肽抗体(抗-1593.75和抗-1900.95)固定(图20)。
多路检测和定量人血清中的靶生物标志物
接下来使用ENP-MS平台同时检测人血清样品中的CFP-10和ESAT-6蛋白水平。已知CFP-10和ESAT-6天然形成异源二聚体和同源二聚体两者，因此其表达水平在同一对象内可能不同。如果在取自疑似感染患者的样品中检测到所述生物标志物中的一者或两者，则可以诊断为活动性TB。
为了使ENP-MS平台有效用于超快TB诊断，测试具有临床证实的活动性TB的志愿患者，以及具有LTBI的志愿患者和健康患者作为TB阴性对照。对于每个对象，消化100μL人血清并且用ENP处理。利用再悬浮缓冲液(Promega)将序列等级修饰胰蛋白酶(Promega)溶解至1mg/mL。对于每个人血清样品，在1.5mL离心管(Eppendorf)中用400μL 100mM NH4HCO3溶液和10μL胰蛋白酶溶液混合100μL样品。将样品管置于具有1000mL水作为水浴以吸收额外微波能量的容器中。将样品在1200W家用微波炉(Panasonic)中消化，以20％功率工作20分钟。在微波辐射之后，通过添加三氟乙酸(TFA)(0.1％最终浓度来停止每个样品消化)。
在MALDI-TOF MS分析之后，可以将活动性TB与LTBI病例区分开；而且，健康志愿对照样品均非活性的。质谱上1593.75和/或1900.95处的峰信号表明在TB感染样品中存在肽1593.75(CFP-10)和/或肽1900.95(ESAT-6)。为了定量靶肽，将同位素标记的肽1593.75和1900.95引入人血清样品中作为对应靶肽的内标。在峰1593.75和1900.95的信号强度归一化为内标强度(MW 1603.60和1910.80)。然后使用初始峰强度与内标峰强度之比用于进一步定量。通过制备由掺有已知浓度的CFP-10和/或ESAT-6蛋白人血清样品构成的对准来获得CFP-10和ESAT-6的校准曲线，然后利用与用于测试样品相同的方法进行处理和测定。对于每种肽建立峰比和生物标志物浓度之间的线性关联性(图10F)。注意，在不同的ENP制备中校准曲线表现出＞0.98的决定系数，其中CFP-10和ESAT-6的检测极限分别为0.1nM和0.5nM。
实施例4：监测治疗功效的基于纳米颗粒的测定
本发明提供了一种用于监测病原特异性生物标志物(例如CFP-10和ESAT-6)随时间的波动作为特定TB治疗方式和/或疗法有效性指标的新型方法。为了示范本发明方法在监测治疗功效方面的能力，随时间对具有全医疗记录的TB患者(图12)进行随访，其中在其治疗方案之前和在其治疗方案开始之后收集血液样品。
活动性TB的临床诊断经常涉及多个测试和从临床症状和接触历史进行评价。除了这些工作之外，TB诊断仍然存在灵敏度和特异性低、缺乏区分LTBI的能力和长周转时间等问题。利用上文描述的多路TB特异性生物标志物检测和定量平台，已经有效示范了活动性TB患者治疗的连续评价。
用于TB的大部分诊断方法依赖于Mtb细菌的检测。目前，这些检测技术的主要限制在于灵敏度和特异性低。最近已经做了大量的工作来寻找用于以改善的性能诊断活动性TB的简单方法。例如，已经报道，基于PCR的GeneXpertTM(Cepheid，Sunnyvale，CA)提供了定量的特异性，但是其在肺外和儿童患者方面的中等灵敏度阻止其被用于常规的TB测试。最近开发的T细胞活化标志物测定已经使得能够对儿童进行TB诊断。然而，由于外周血中的T细胞记忆应答，测量T细胞活化标志物可能导致假阳性。
在测量血清中的低丰度蛋白如CFP-10和ESAT-6时，由于与高丰度血清蛋白非特异性结合，基于免疫亲和性的常规检测技术如ELISA、蛋白微阵列、量子点和磁性纳米颗粒存在高背景信号的问题。为了实现可接受的特异性，牺牲了灵敏度来降低背景信号。然而，通过将ENP测定与MALDI-TOF MS结合，可以将质谱上CFP-10和ESAT-6的标志峰与非特异性结合的蛋白/肽区分开，甚至以高灵敏度区分开。通过跟踪治疗之前和治疗之后CFP-10和ESAT-6表达曲线的变化，医生应当能够预测和评价治疗功效，但是该过程不能通过现有技术来实现。
除了解决用于改善TB诊断的当前临床需求之外，ENP-MS平台能够对宽范围内的不同疾病进行蛋白质组学生物标志物检测。而且，该技术能够利用便携式MS装置用于早期疾病筛选和检测来最终用于资源受限区域。
实施例5：循环M.结核病抗原肽的定量允许快速诊断活动性疾病和治疗应答Mtb特异性血清肽的灵敏性纳米颗粒介导检测
血清CFP-10和ESAT-6表达在理论上能够用于诊断所有的活动性Mtb感染，包括EPTB病例；然而，一些NTM菌株表达可能降低这些蛋白作为生物标志物的效用的同系物。由于肽序列是用于蛋白识别的金标准，所以检查胰蛋白酶肽来将源自Mtb的ESAT-6和CFP-10与由其他物种产生的同系物区别开。重组蛋白胰蛋白酶消化的MALDI-TOF MS分析检测到具有高信噪比的CFP-10(SEQ ID NO.5；m/z 1593.75)和ESAT-6(SEQ ID NO.1；m/z1900.95)，其随后通过液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)得到证实，并且在与来自12种NTM物种的同系物对照时表现出强Mtb特异性(图13-15)。两种肽都表现出与来自牛结核分枝杆菌(M.Bovis)的那些肽具有完美的同源性，所述牛结核分枝杆菌为导致相对稀有形式TB的紧密相关病原，同时与造成大部分NTM感染的两种分枝杆菌物种即鸟型分枝杆菌(M.avium)和胞内分枝杆菌(M.intracellulare)以及大部分其他NTM物种不同。ESAT-6肽揭示了跟任何NTM同系物都几乎没有同源性，而CFP-10肽仅对堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、海分枝杆菌(M.marinum)和溃疡分枝杆菌(M.ulcerans)的菌株表现出全部的同源性，所述三种菌株预计并不会明显干扰临床应用中的诊断特异性。
大的动态范围的血清蛋白表达可能使完全裂解和随后对低丰度血清蛋白的检测变得复杂。已发现，补充的微波辐射使得血清CFP-10和ESAT-6消化能够在20分钟内完成而不用如这种复杂的蛋白样品通常所需的那样过夜，从而降低“样品应答”时间至4小时且同时使针对靶肽的MS信号提高了三倍以上(图16)。
分析了几种潜在纳米颗粒富集平台用作MALDI共基质的能力，所述共基质通过提高肽解吸/电离效率来增强MS信号。在分别混有不同纳米颗粒的CFP-10和ESAT-6的MALDI-TOF MS分析中，已经发现，金和二氧化硅纳米颗粒稳定地增强MS信号，而石墨烯和银和硅纳米颗粒几乎没有效果或有负面效果(图10A)。然而，与金和二氧化硅颗粒不同，硅颗粒能够被容易地修饰以精确控制颗粒孔隙度，因而精确控制可用表面区域和吸收性能。开发了可以规模化的方法来快速制造均匀和廉价的ENP，其具有包括MALDI-TOF MS UV激光激发波长的吸收范围(图17)。ENP的表面被氧化成氧化硅以用于进一步功能化。这些ENP的电镜图像揭示了涂有薄二氧化硅层的具有40nm孔隙的高度可再现1000×400nm盘(图10B-D和18)。
这些ENP表现出最强的共基质效果(图10A和19)，其原因可能在于其促进激光诱导的肽解吸/电离的UV吸收性能和热约束作用、以及预计会将肽陷获于共基质附近的大表面-体积比。然后对ENP进行环氧修饰并与1593.75和1900.95肽特异性抗体缀合(图20)以产生高亲和性、高容量肽富集平台。利用掺有抗原的健康人血清进行微波消化、ENP富集和共基质性能对MS信号增强的系统性分析，其中所述血清被分开并进行过夜或微波辅助胰蛋白酶消化，然后对非免疫沉淀的血清进行MALDI-TOF MS分析，肽被从标靶特异性Dynabeads或ENP中洗脱出来，并且肽仍然结合于标靶特异性ENP(图10E)。在利用或不用常规Dynabeads的情况下，Mtb靶肽在过夜或微波辅助消化中基本上不可检测，但是当使用ENP用于肽富集或作为富集/共基质平台时被稳定地检测。平均Mtb肽信号通过微波辅助消化提高了2.5倍(CFP-10)和2.6倍(ESAT-6)，通过ENP介导的富集额外提高了6.6倍(CFP-10和ESAT-6)，并且通过ENP共基质活性额外提高了9.9倍(CFP-10)和10.2倍(ESAT-6)。
人血清中Mtb特异性肽的定量
通过消化无TB人血清中的重组CFP-10和ESAT-6产生了用于精确定量的校准曲线，然后所述血清被掺入稳定同位素标记的内标，与靶特异性抗体缀合ENP温育，然后通过MALDI-TOF MS进行分析。对利用不同ENP批次制得的曲线观察到了良好的关联性(R2＞0.98)，其中的值表现出14-22％的批次内变异系数和16-23％的批次间变异系数。CFP-10揭示了50pM和200pM的检测极限(LOD)和定量(LOQ)，而ESAT-6具有200pM LOD和500pM LOQ，其中测量精度为～74％(1nM)至～90％(20nM)(表2)。在多路测定中EMP-MS容易区分患有TB和未患TB的患者(图10G)。相反，利用先进的MALDI-TOF/TOF MS仪器进行的分析因为血清盐和脂质的MALDI抑制效应而没能直接检测具有高CFP-10和ESAT-6水平的TB患者血清中未进行ENP富集的靶肽，仅在利用肽特异性Dynabeads进行常规处理之后才微弱地检测到了靶信号，但其在2×血清稀释之后丢失(图10H和21)。然而，利用该系统(图10H和21)或更为经济的MALDI-TOF MS(未显示)中ENP-MS测定在低至最低测试稀释(32×)的2×系列稀释试样中稳定地检测到了两种肽。
表2.通过ENP-MS进行的CFP-10和ESAT-6浓度测量(1593.75和1900.95)的精度和准确度
HIV-阴性群体中的ENP-MS诊断灵敏度和特异性
利用任一种肽的阳性信号作为TB诊断标准，利用HIV阴性HTI患者的血清测定了ENP-MS诊断性能。在该研究之前，基于包括25个活动性TB病例和25个非TB对照的开发队列中的最大Youden指数建立了CFP-10(200pM)和ESAT-6(650pM)浓度的截止值(图22)。本文的病例对照研究包含27个活动性PTB、31个LTBI和32个NTM以及21个健康对照。ENP-MS盲测在27个TB病例中的25个中(92.6％)检测到了靶肽(表3，图11A)，其中在涂片阳性和涂片阴性病例中的灵敏度为100％和91.0％。在健康对照中没有检测到靶信号，但是在31个LTBI患者中的4个和32个NTM(疾病对照)患者中的3个中发现了假阳性信号，特异性为87.1％和90.6％。注意，LTBI信号可能揭示了亚临床TB病例，而NTM假阳性可能是由于检测到相对稀有NTM物种(堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌)导致的，所述稀有NTM物种(包括端点值)占＜5％的NTM病例，因为这些菌株的NTM菌株分析与靶肽匹配(图15B)。需要LBTI随访和NTM菌株分析来解决这些问题。然而，堪萨斯分枝杆菌病例在NTM组(表4)中严重超比例(13/32)，并且3个NTM假阳性中的2个具有堪萨斯分枝杆菌感染，其表明最多的假阳性可能是由于来自这种堪萨斯分枝杆菌菌株的CFP-10信号引起的。
表3：ENP-MS对活动性TB检测的灵敏度和特异性。
表4.针对所研究患者和对照的人口统计学、微生物学和诊断数据
HIV阳性群体中的ENP-MS诊断灵敏度和特异性
由于这些唾液样品的含菌较少性质，EPTB的非侵入式针对是挑战性的，因此Mtb培养经常使用更多的非侵入式抽样，包括淋巴结和胸膜液或脑脊髓液。EPTB病例在HIV/TB共同感染患者中特别常见，因为HIV感染破坏肺肉芽肿以降低基于唾液的针对测试的效用，而这些患者中被改变的免疫应答可能限制T细胞介导的针对测定的效用。因此，分析来自具有培养物阳性或阴性PTB或EPTB的HIV阳性HTI患者的唾液样品。盲试分析分别识别出91.3％(21/23)和82.4％(14/17)的培养物阳性和阴性PTB病例，以及92.3％(12/13)和75.0％(6/8)的培养物阳性和阴性EPTB病例(表3和图11B)，同时对TB阴性和HIV阳性对象表现出89.7％特异性(26/29)。因此EMP-MS明显优于PTB(57.5％；23/40)和EPTB(61.9％；13/21)的基于Mtb的诊断，并且在涂片阳性和阴性病例中表现出100％和84.3％的灵敏度。这些结果还超过了得自另一组的研究结果，该研究分析了针对HIV阳性群体中的培养物阳性PTB病例(86.2％；50/58)和培养物阳性(67.7％；21/31)和阴性(29.4％；5/17)EPTB病例的XpertMTB/RIF灵敏度。
HIV感染患者者的血清CFP-10和ESAT-6水平
HIV和TB共感染患者代表了诊断方面具有挑战但是在人口统计方面重要的TB群体，因为HIV感染个体多20倍发展成活动性TB病例的可能性，并且据估计占2014年中960万新增TB病例中的12％。然而，在这些患者中循环Mtb抗原水平可能增加，如针对其他细菌抗原所观察到的。实际上，组合CFP+ESAT-6水平在具有培养物阳性PTB病例的HIV阳性(9.8nM)患者中明显高于HIV阴性(3.3nM)患者(图11C)。ENP-MS结果可允许对HIV阳性患者进行稳定的TB诊断，因为ENP-MS性能超过常规方法的灵敏度，包括第一线替代方案如Xpert MTB/RIF和IGRA。
采用抗TB治疗的患者中的CFP-10和ESAT-6的纵向定量
在抗TB治疗期间的血清Mtb抗原浓度可反映治疗功效。因此，利用在6-12个月抗TB治疗方案及随访期间收集的样品分析了来自抗TB治疗期间和之后9个HIV阴性和12个HIV阳性TB患者的系列血液样品。在大部分HIV阴性(8/9)和HIV阳性(11/12)TB患者后治疗中血清Mtb肽水平降低或不可检测(图12A和B)。已发现，单个非应答HIV阴性患者(ID：20020493)由于醇诱导的肝功能不全而接受了不完全抗TB方案(11/20月剂量)并且在复查其健康记录时已经表现出一致的培养物阳性结果。一个HIV阳性患者(ID：20020282)表现出CFP-10降低，其在治疗完成之后2个月反弹，其原因可能是缺乏与G6PD缺陷相关的白细胞杀菌活性、由于来自G6PD缺乏红细胞的溶解导致的感染敏感性增加或CD4+T淋巴细胞的种群减少。然而，在治疗期间并未实现Mtb抗原清除的大部分HIV阳性患者在治疗后表现出持续降低并且最终具有不可检测的抗原水平，其中仅一个患者在治疗完成后表现出降低但是相对稳定的Mtb抗原水平(ID：20010278)。
还收集了来自抗TB治疗开始之前和之后不久前瞻性招募的患有活动性TB的患者的样品。通过9天治疗，两类患者表现出明显的Mtb抗原降低(图12C)，并且在治疗1个月之后呈症状阴性和培养物阴性。
实施例6：利用CFP-10和EAST-6的肽和本发明组合物检测TB
持续和有效的TB控制并不是“第三世界国家”所独有的疾病管理问题，因为缺乏有效的疫苗、出现耐药性TB菌株、诊断策略不佳和基于培养物的治疗评价缓慢一直在世界范围内夺去数百万人的生命。本文描述的ENP-MS测定解决了具有诊断挑战的患者群体中与活动性TN诊断相关的灵敏度和速度问题，并且满足WHO托管的非侵入式TB测定的几项标准，因为其：(1)使用小的非侵入式试样；(2)不需要细菌隔离；(3)对其中诊断经常需要多次测试的具有诊断挑战队列中的活动性TB病例(例如，肺外的培养物阴性和HIV感染TB患者)具有高灵敏度和特异性；(4)直接定量用于快速监测抗TB治疗效果的Mtb抗原；(5)使用可修改为在临床和研究环境两者中高输出工作的流线型工艺；和(6)能够在已经被FDA批准用于其他诊断测定的设备上执行。
ENP-MS对所研究的HIV阳性群体中的PTB(87.5％)和具有临床挑战的EPTB(85.7％)病例表现出类似的灵敏度，其中它等于或明显优于利用高侵入性淋巴结(84％)、胸腔液(17％)和脑脊髓液(56％)检测EPTB病例的最新Xpert MTB/RIF元分析估算法和对AFB涂片、MGIT培养物和Xpert MTB/RIF结果观察到31％、69％和66％灵敏度的研究。而且，所获得结果与Mtb培养物状态无关，并且在培养物阳性样品中获得更高灵敏度的同时，得自培养物阴性样品的结果明显优于WHO限定的针对新型高优先级非痰液诊断测试的66％最佳灵敏度。ENP-MS还准确诊断了患有HIV共感染(其可能不利地影响基于血液的宿主应答免疫测定(例如IGRA和TAM-TB)的结果)的患者中的活动性TB病例，其中已发现Mtb肽浓度等于或高于见于HIV阴性对象的浓度。
ENP-MS还能够精确定量血清抗原浓度，其对于监测对抗治疗方案的分枝杆菌应答是非常期望的特征，因为目前用于检测治疗应答的测定提供了定性或半定量结果(涂片和培养物)或表现出明显的延迟(Xpert)。ENP-MS平台还能够多路检测血清Mtb肽浓度以稳定地检测活动性TB病例。
微波辅助和过夜胰蛋白酶消化人血清样品
在1.5mL Eppendorf离心管中将100μL样品与400μL 100mM NH4HCO3和10μL1mg/mL序列等级的修饰胰蛋白酶(Promega)混合，置于1000mL水浴中，用利用20％功率的1200W微波辐照20分钟，然后与0.1％最终浓度的三氟乙酸混合。利用相同的胰蛋白酶量和缓冲条件在37℃下温育过夜胰蛋白酶消化12小时。
ENP的表征、功能化和抗体固定
制造裸ENP并且存放在ACS级99.9％异丙醇中以实现最大的稳定性。在5kV的加速电压下利用Zeiss Neon 40扫描电镜分析形貌。利用高分辨率透射电镜(JEOL 2100，200kV)对表面氧化成像。在10000g下对功能化的ENP悬浮液(1mL)制丸，真空干燥，悬浮在包含由GLBiochem(中国上海)合成的20μg抗1593.75或抗1900.95抗体的1mL PBS(pH 8.6)中，并且在25℃混合2小时，在10000×g下制丸5分钟，在1mL 200nM Tris(pH7)/100nM NaCl溶液中温育30分钟，用PBS(pH 7.4)洗涤3次，制丸并悬浮在60μL PBS(pH 7.4)，然后在4℃存放备用。
定量临床血清样品中的Mtb抗原
通过对健康供体血清掺入0-100nM重组CFP-10或EAST-6来产生标准曲线，所述血清进行微波辅助消化，掺入10nM稳定同位素标记的内标肽(m/z 1603.60和1910.80)；GenScipt USA Inc.，与抗体缀合的ENP混合2小时，在10000g下制丸5分钟，用1mg/mL 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷-L丝氨酸(Avanti Polar Lipids)洗涤3次，悬浮在6μL去离子水和4.5μL(1.5μL×3)中，并利用每种靶肽和内标的MS强度比通过MALDI-TOF-MS进行分析。通过代入该校准曲线中来将临床样品MS强度比转化成绝对摩尔浓度。通过用于健康人血清系列稀释TB患者血清(2×、4×、8×、16×和32×)来制备用于在进行或不进行Dynabeads介导肽富集或ENP-MS肽富集的情况下确定来自胰蛋白酶处理血清的来自抗原的MS信号和共基质活性。
统计学分析
使用GraphPad Prism 7软件(San Diego，CA)产生热图，并且利用Bonfeeroni后测试计算单因素ANOVA(偏差分析)或利用通过样品分布和偏差确定的Dunn后测试计算Kruskal-wallis单因素ANOVA。据认为差值在P＜0.05时具有统计学显著性。利用接收受试者工作特征(ROC)曲线来评价测试的诊断准确度。参考图22。在各种灵敏度和特异性下评价并且在最大Youden指数下确定截止值，即灵敏度+特异性-1。数据表示为平均值±SEM，除非另有说明。
ENP的表征、功能化和抗体固定
为了实现功能化，在4000×g下对～7×109裸ENP离心20分钟，真空干燥，悬浮在3mL DMSO中并且在室温下旋转混合1小时。在4000×g下对氧化的ENP制丸20分钟，利用100％乙醇洗涤3×次5，然后在室温下通过旋转与(3-缩水甘油基氧丙基)三甲氧基硅烷(GLYMO，Sigma-Aldrich)混合1小时。通过混合3.5mL乙醇、3.5mL去离子水和3mL GLYMO来制备GLYMO溶液，并且通过用HCl将其pH调节至3.5来进行活化。在3小时GLYMO温育之后，在4000×g对功能化的ENP制丸20分钟，用100％乙醇洗涤3次，然后悬浮在10mL ACS级99.9％丙酮中备用。
Dynabeads测定
对于每10个样品，对200μL蛋白G功能化Dynabeads(ThermoFisher Scientific)制丸，洗涤并悬浮在300μL PBS+0.02％吐温(PBST)中，然后补充100μL抗1593.75或抗1900.95抗体，并且在旋转下在25℃温育60分钟。然后用400μL PBST洗涤抗体缀合的Dynabeads3次，并且均分为40μL PBST以与消化的血清样品一起温育3小时。对加载抗原的Dynabeads制丸，用PBS洗涤2次，用去离子水洗涤1次，然后在6μL 1％TFA中洗脱，然后进行MALDI-TOF MS分析。
MALDI-TOF MS分析
对于每个样品，将1.5μL加载肽的ENP点状分布在靶板上并且在真空干燥器中干燥，然后将1.5μL混合溶液(50％乙腈和0.1％三氟乙酸中的4g/L a-氰基4-羟基肉桂酸(CHCA))移液到每个样品点上并且在真空中蒸发。利用Bruker Microflex仪器以阳性反射模式在m/z 1000-3000范围内获取MALDI-TOF质谱(其中低质量偏差设定为800Da)，并且在≤10-7Torr下进行所有的测试。将加速电压、电子电压、和透镜电压分别设定为19kV、20kV和9.75kV，延迟时间为100ns。从3000个激光点获取每个样品的质谱，利用肽校准曲线进行外部校准，并且利用flex Analysis 3.0(Bruker Daltonics)处理原始谱图数据。如所规定的，利用Bruker UltrafleXtreme仪以类似条件进行高灵敏度MALDI-TOF MS实验。
在临床血清样品中定量Mtb抗原
在信噪比≥3和≥10时分别测定LOD和LOQ。通过在一个批次中以三种浓度(1、10和20nM，掺入血清样品)运行五个重复试验来测定批次内精度。通过在三个不同的白天在五个重复试验中分析相同的三个样品(冷冻等分)测定批次间精度。利用相同的三个样品等分测定并且作为平均测量值与真实值之比来计算精确度。在HIV阴性和HIV阳性PTB患者中对血清CFP-10和ESAT-6浓度求和以允许直接比较这些患者群体之间的相对Mtb抗原水平。
序列表
<110> 卫理公会医院
<120> 用于确定对象中的感染水平的组合物和方法
<130> NA285.107884PCT1
<150> 62/460,280
<151> 2017-02-17
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 1
Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala
1 5 10 15
Arg
<210> 2
<211> 19
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 2
Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser Glu Ala Tyr Gln Gly Val
1 5 10 15
Gln Gln Lys
<210> 3
<211> 18
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 3
Thr Gln Ile Asp Gln Val Glu Ser Thr Ala Gly Ser Leu Gln Gly Gln
1 5 10 15
Trp Arg
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 4
Ala Asp Glu Glu Gln Gln Gln Ala Leu Ser Ser Gln Met Gly Phe
1 5 10 15
<210> 5
<211> 15
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 5
Thr Asp Ala Ala Thr Leu Ala Gln Glu Ala Gly Asn Phe Glu Arg
1 5 10 15
<210> 6
<211> 13
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 6
Gly Ala Ala Gly Thr Ala Ala Gln Ala Ala Val Val Arg
1 5 10
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 7
Gln Ala Gly Val Gln Tyr Ser Arg
1 5
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> 扎伊尔埃博拉病毒(Zaire ebolavirus)
<400> 8
Gln Pro Leu Pro Ala Ala Thr Trp Thr Asp
1 5 10
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种纳米颗粒，其包含：
a)能量介导纳米颗粒，其由一种或多种无机材料组成，其中所述能量介导纳米颗粒的无机外表面被织构化，并且其中所述一种或多种材料中的至少一种用作基质辅助激光解吸/电离共基质；和
b)缀合至所述能量介导纳米颗粒的外表面的至少一种亲和性试剂。
2.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述至少一种亲和性试剂包括一种或多种抗体。
3.根据权利要求2所述的纳米颗粒，其中所述一种或多种抗体结合与感染相关的第一疾病特异性靶肽。
4.根据权利要求3所述的纳米颗粒，其中所述一种或多种抗体结合与结核分枝杆菌感染相关的肽。
5.根据权利要求4所述的纳米颗粒，其中至少一种抗体特异性结合CFP-10的肽或ESAT-6的肽。
6.根据权利要求5所述的纳米颗粒，其中所述至少一种抗体特异性结合至选自SEQ IDNOS:1-7的氨基酸序列。
7.根据权利要求3所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包含特异性结合所述第一疾病特异性靶肽的至少一种第一抗体和特异性结合第二疾病特异性靶肽的至少一种第二抗体。
8.根据权利要求7所述的纳米颗粒，其中所述至少一种第一抗体和至少一种第二抗体结合与结核分枝杆菌感染相关的对应肽。
9.根据权利要求8所述的纳米颗粒，其中所述至少一种第一抗体特异性结合CFP-10的肽，所述至少一种第二抗体特异性结合ESAT-6的肽。
10.根据权利要求9所述的纳米颗粒，其中所述至少一种第一抗体特异性结合选自SEQID NOS:3-7的氨基酸序列，所述至少一种第二抗体特异性结合选自SEQ ID NOS:1-2的氨基酸序列。
11.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒吸收波长为100nm至约500nm的光。
12.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述一种或多种材料选自二氧化硅、金、金属氧化物或金属氧化物-氢氧化物。
13.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包含由第一无机材料组成的内芯和由第二无机材料组成的外层，其中所述第二材料用作基质辅助激光解吸/电离共基质。
14.根据权利要求8所述的纳米颗粒，其中所述第一材料是硅，第二材料是二氧化硅。
15.根据权利要求8所述的纳米颗粒，其中所述第一材料是磁性的。
16.一种诊断患者中疾病的方法，所述方法包括：
a)从对象样品中分离疾病特异性靶肽，其包括以下步骤：
i)以产生多种肽的方式制备所述对象样品，所述多种肽包括所述疾病特异性靶肽；
ii)将经处理的对象样品与纳米颗粒接触，
其中所述纳米颗粒包含：
A)能量介导纳米颗粒，其由一种或多种无机材料组成，其中所述能量介导纳米颗粒的无机外表面被织构化，并且其中所述一种或多种材料中的至少一种用作基质辅助激光解吸/电离共基质；和
B)缀合至所述能量介导纳米颗粒的外表面的抗体，其中所述抗体特异性结合所述疾病特异性靶肽；和
iii)从所述纳米颗粒中除去未结合的肽；
b)将所述疾病特异性靶肽引入质谱仪中；和
c)利用所述质谱仪检测所述疾病特异性靶肽。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述疾病特异性靶肽与结核分枝杆菌感染相关。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述抗体特异性结合CPF-10的肽或ESAT-6的肽。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述抗体特异性结合至选自SEQ ID NOS:1-7的氨基酸序列。
20.根据权利要求16所述的方法，其还包括以下步骤：
d)对所述疾病特异性靶肽定量；和
e)部分基于定量的疾病特异性靶肽评价所述疾病的严重性。
21.根据权利要求16所述的方法，其中所述引入步骤包括对经处理的对象样品执行基质辅助激光解吸/电离。
22.根据权利要求21所述的方法，其中在所述疾病特异性靶肽结合至所述纳米颗粒时对所述纳米颗粒执行基质辅助激光解吸/电离。
23.根据权利要求16所述的方法，其中所述制备步骤是选自以下的技术：用蛋白酶消化、用化学试剂消化、暴露于微波辐射及其组合。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述蛋白酶是胰蛋白酶。
25.根据权利要求16所述的方法，其中依次进行所述制备步骤和接触步骤。
26.根据权利要求16所述的方法，其中同时进行所述制备步骤和接触步骤。
27.根据权利要求16所述的方法，其中所述对象样品是基于血液的样品，其包括全血、血浆或血清。
28.根据权利要求16所述的方法，其中所述纳米颗粒构造成具有球状、盘状、杆状、圆柱体状或规则或不规则三维形状的形状。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述纳米颗粒是直径为约50nm至约1500nm的球。
30.根据权利要求28所述的方法，其中所述纳米颗粒是盘状的，直径为约500nm至约1500nm，高度为约200nm至约500nm。
31.根据权利要求16所述的方法，其中所述一种或多种材料选自二氧化硅、金、金属氧化物或金属氧化物-氢氧化物。
32.根据权利要求16所述的方法，其中所述纳米颗粒吸收波长为100nm至约500nm的光。
33.根据权利要求16所述的方法，其中所述纳米颗粒包含由第一材料组成的内芯和由第二材料组成的外层，其中所述第二材料用作基质辅助激光解吸/电离共基质。
34.根据权利要求16所述的方法，其中在步骤a)之前，所述方法还包括以下步骤：
d)识别所述疾病特异性靶蛋白；
e)获得结合所述疾病特异性靶肽的所述抗体；和
f)将所述抗体缀合至所述能量介导纳米颗粒的外表面。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述识别步骤包括以下步骤：
i)确定导致所述疾病的病原是否分泌毒力因子；
ii)分析所述毒力因子的丰度和/或所述病原的结构或代谢蛋白；
iii)确定在两种或多种病原物种之间是否保留了丰度因子和/或结构或代谢蛋白，其中
a)如果未保留丰度因子和/或结构或代谢蛋白，则确定所述丰度因子和/或结构或代谢蛋白是否包含病原特异性肽序列，由此选择所述丰度因子或结构或代谢蛋白作为备选的单病原特异性生物标志物肽，或
b)如果保留所述丰度因子和/或结构或代谢蛋白，则进行步骤iv)；
iv)确定所述丰度因子和/或结构或代谢蛋白是否还包括可变序列部分；和
v)确定病原物种间的所述可变序列部分是否不同，由此，如果病原物种间的所述可变序列部分不同，则选择保留的丰度因子或结构或代谢蛋白作为备选的广谱病原特异性肽生物标志物。
36.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述能量介导纳米颗粒的织构化无机外表面包括经由所述能量介导纳米颗粒的化学蚀刻形成的脊、谷或孔隙中的一种或多种。

Claims (37)

1.一种纳米颗粒，其包含：
a)一种或多种材料，其中所述一种或多种材料中的至少一种用作基质辅助激光解吸/电离共基质；和
b)与其缀合的至少一种亲和性试剂。
2.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述至少一种亲和性试剂包括一种或多种抗体。
3.根据权利要求2所述的纳米颗粒，其中所述一种或多种抗体结合与感染相关的第一疾病特异性靶肽。
4.根据权利要求3所述的纳米颗粒，其中所述一种或多种抗体结合与结核分枝杆菌感染相关的肽。
5.根据权利要求4所述的纳米颗粒，其中至少一种抗体特异性结合CFP-10的肽或ESAT-6的肽。
6.根据权利要求5所述的纳米颗粒，其中所述至少一种抗体特异性结合至选自SEQ IDNOS:1-7的氨基酸序列。
7.根据权利要求3所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包含特异性结合所述第一疾病特异性靶肽的至少一种第一抗体和特异性结合第二疾病特异性肽的至少一种第二抗体。
8.根据权利要求7所述的纳米颗粒，其中所述至少一种第一抗体和至少一种第二抗体结合与结核分枝杆菌感染相关的对应肽。
9.根据权利要求8所述的纳米颗粒，其中所述至少一种第一抗体特异性结合CFP-10的肽，所述至少一种第二抗体特异性结合ESAT-6的肽。
10.根据权利要求9所述的纳米颗粒，其中所述至少一种第一抗体特异性结合选自SEQID NOS:3-7的氨基酸序列，所述至少一种第二抗体特异性结合选自SEQ ID NOS:1-2的氨基酸序列。
11.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒吸收波长为100nm至约500nm的光。
12.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述一种或多种材料选自二氧化硅、金、金属氧化物或金属氧化物-氢氧化物。
13.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒限定织构化表面，其中所述至少一种亲和性试剂缀合至所述织构化表面。
14.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包含由第一材料组成的内芯和由第二材料组成的外层，其中所述第二材料用作基质辅助激光解吸/电离共基质。
15.根据权利要求8所述的纳米颗粒，其中所述第一材料是硅，第二材料是二氧化硅。
16.根据权利要求8所述的纳米颗粒，其中所述第一材料是磁性的。
17.一种诊断患者中疾病的方法，所述方法包括：
a)从对象样品中分离疾病特异性靶肽，其包括以下步骤：
i)以产生多种肽的方式制备所述对象样品，所述多种肽包括所述疾病特异性靶肽；
ii)将经处理的对象样品与纳米颗粒接触，所述纳米颗粒包含特异性结合所述疾病特异性靶肽的抗体，并且其中所述纳米颗粒包含一种或多种材料，使得所述纳米颗粒用作基质辅助激光解吸/电离共基质；和
iii)从所述纳米颗粒中除去未结合的肽；
b)将所述疾病特异性靶肽引入质谱仪中；和
c)利用所述质谱仪检测所述疾病特异性靶肽。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述疾病特异性靶肽与结核分枝杆菌感染相关。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述抗体特异性结合CPF-10的肽或ESAT-6的肽。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述抗体特异性结合至选自SEQ ID NOS:1-7的氨基酸序列。
21.根据权利要求17所述的方法，其还包括以下步骤：
d)对所述疾病特异性靶肽定量；和
e)部分基于定量的疾病特异性靶肽评价所述疾病的严重性。
22.根据权利要求17所述的方法，其中所述引入步骤包括对经处理的对象样品执行基质辅助激光解吸/电离。
23.根据权利要求22所述的方法，其中在所述疾病特异性靶肽结合至所述纳米颗粒时对所述纳米颗粒执行基质辅助激光解吸/电离。
24.根据权利要求17所述的方法，其中所述制备步骤是选自以下的技术：用蛋白酶消化、用化学试剂消化、暴露于微波辐射及其组合。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述蛋白酶是胰蛋白酶。
26.根据权利要求17所述的方法，其中依次进行所述制备步骤和接触步骤。
27.根据权利要求17所述的方法，其中同时进行所述制备步骤和接触步骤。
28.根据权利要求17所述的方法，其中所述对象样品是基于血液的样品，其包括全血、血浆或血清。
29.根据权利要求17所述的方法，其中所述纳米颗粒构造成具有球状、盘状、杆状、圆柱体状或规则或不规则三维形状的形状。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述纳米颗粒是直径为约50nm至约1500nm的球。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述纳米颗粒是盘状的，直径为约500nm至约1500nm，高度为约200nm至约500nm。
32.根据权利要求17所述的方法，其中所述纳米颗粒限定织构化表面。
33.根据权利要求17所述的方法，其中所述一种或多种材料选自二氧化硅、金、金属氧化物或金属氧化物-氢氧化物。
34.根据权利要求17所述的方法，其中所述纳米颗粒吸收波长为100nm至约500nm的光。
35.根据权利要求17所述的方法，其中所述纳米颗粒包含由第一材料组成的内芯和由第二材料组成的外层，其中所述第二材料用作基质辅助激光解吸/电离共基质。
36.根据权利要求17所述的方法，其中在步骤a)之前，所述方法还包括以下步骤：
d)识别所述疾病特异性靶蛋白；
e)获得结合所述疾病特异性靶肽的所述抗体；和
f)将所述抗体缀合至所述纳米颗粒。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述识别步骤包括以下步骤：
i)确定导致所述疾病的病原是否分泌毒力因子；
ii)分析所述毒力因子的丰度和/或所述病原的结构或代谢蛋白；
iii)确定在两种或多种病原物种之间是否保留了丰度因子和/或结构或代谢蛋白，其中
a)如果未保留丰度因子和/或结构或代谢蛋白，则确定所述丰度因子和/或结构或代谢蛋白是否包含病原特异性肽序列，由此选择所述丰度因子或结构或代谢蛋白作为备选的单病原特异性生物标志物肽，或
b)如果保留所述丰度因子和/或结构或代谢蛋白，则进行步骤iv)；
iv)确定所述丰度因子和/或结构或代谢蛋白是否还包括可变序列部分；和
v)确定病原物种间的所述可变序列部分是否不同，由此，如果病原物种间的所述可变序列部分不同，则选择保留的丰度因子或结构或代谢蛋白作为备选的广谱病原特异性肽生物标志物。
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