JP7349104B2 - ベロ毒素の検出方法 - Google Patents
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Description
本発明は、ベロ毒素の検出方法に関する。
腸管出血性大腸菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli: ＥＨＥＣ）により引き起こされる食中毒は、ＥＨＥＣが産生するベロ毒素が原因である。ベロ毒素には、血清学的に区別される１型および２型が存在し、１型および２型のそれぞれに複数の亜型が存在する。ベロ毒素の検出は、食中毒の原因となった食品の特定、診断または症状の予測等において重要である。
非特許文献１では、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）によりベロ毒素の遺伝子を増幅して検出している。この方法では、試料に含まれる細菌におけるベロ毒素の遺伝子の有無が判定できるが、当該細菌においてベロ毒素が発現しているか否かは区別できない。非特許文献２では、イムノクロマトによりベロ毒素の１型および２型を検出しているが、亜型を区別することはできない。非特許文献３では、質量分析においてベロ毒素に対応するｍ／ｚの近傍にピークが有るか否かにより、試料にベロ毒素が含まれているか否かを判定している。しかし、ベロ毒素に対応するｍ／ｚの近傍に夾雑物に対応するピークがあると、偽陽性となってしまう。
勢戸、他２名 "腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）検査・診断マニュアル" 、（日本）、国立感染症研究所、2019年9月25日
日本ハム株式会社、 "ＮＨイムノクロマトＶＴ １／２＜＜取扱説明書＞＞ 第１版"、（日本）、日本ハム株式会社、2009年12月
Fagerquist CK, Zaragoza WJ, Sultan O, Woo N, Quinones B, Cooley MB, Mandrell RE. "Top-down proteomic identification of Shiga toxin 2 subtypes from Shiga toxin-producing Escherichia coli by matrix-assisted laser desorption ionization-tandem time of flight mass spectrometry" Applied and environmental microbiology,（米国）, American Society for Microbiology, 2014年5月，Volume 80, Issue 9, pp.2928-2940
質量分析を用いて、より正確にベロ毒素の検出を行うことが好ましい。
本発明の第１の態様は、試料とベロ毒素に結合する分子とを用意することと、前記分子のベロ毒素との結合を利用して、前記試料におけるベロ毒素を精製するための操作を行うことと、前記操作で得られた前記試料を第１質量分析に供することとを備える、ベロ毒素の検出方法に関する。
本発明によれば、質量分析を用いて、より正確にベロ毒素の検出を行うことができる。
以下、図を参照して本発明を実施するための形態について説明する。
－実施形態－
本実施形態のベロ毒素の検出方法では、ベロ毒素に結合する分子を用いて試料におけるベロ毒素を精製するための操作を行った後、質量分析を行う。
本実施形態のベロ毒素の検出方法では、ベロ毒素に結合する分子を用いて試料におけるベロ毒素を精製するための操作を行った後、質量分析を行う。
図１は、本実施形態のベロ毒素の検出方法の流れを示すフローチャートである。ステップＳ１００１において、試料およびベロ毒素に結合する分子が用意される。
（試料について）
試料は、ベロ毒素を含むまたは含む可能性のある液体または固体等であれば、特に限定されない。例えば、試料には、腸管出血性大腸菌を含むまたは含む可能性のある液体または固体等が含まれる。ベロ毒素を含む可能性のある試料としては、例えば、食中毒の症状を有する人間等の生物が摂取したまたは接触した食品または飲料の他、当該生物の吐しゃ物が含まれ得る。更には、これらの試料から菌を培養した菌液または菌の集塊、および菌液または菌の集塊を溶菌して得られた溶菌液も本実施形態の方法の対象として適切な試料となる。ベロ毒素を含む可能性のある試料に対して本実施形態の方法を適用し、ベロ毒素の検出または型若しくは亜型の識別を行うことにより、食中毒の原因となった食品若しくは飲料の特定、診断または症状の予測等を行うことができる。本実施形態の方法を、ベロ毒素が検出された試料に対して行ってもよい。例えば、本実施形態の方法により、検出されたベロ毒素の型若しくは亜型が不明な場合に型若しくは亜型の識別を行ったり、ベロ毒素についての研究に役立てたり、他の方法によるベロ毒素の検出結果の確認を行ったりすることができる。
試料は、ベロ毒素を含むまたは含む可能性のある液体または固体等であれば、特に限定されない。例えば、試料には、腸管出血性大腸菌を含むまたは含む可能性のある液体または固体等が含まれる。ベロ毒素を含む可能性のある試料としては、例えば、食中毒の症状を有する人間等の生物が摂取したまたは接触した食品または飲料の他、当該生物の吐しゃ物が含まれ得る。更には、これらの試料から菌を培養した菌液または菌の集塊、および菌液または菌の集塊を溶菌して得られた溶菌液も本実施形態の方法の対象として適切な試料となる。ベロ毒素を含む可能性のある試料に対して本実施形態の方法を適用し、ベロ毒素の検出または型若しくは亜型の識別を行うことにより、食中毒の原因となった食品若しくは飲料の特定、診断または症状の予測等を行うことができる。本実施形態の方法を、ベロ毒素が検出された試料に対して行ってもよい。例えば、本実施形態の方法により、検出されたベロ毒素の型若しくは亜型が不明な場合に型若しくは亜型の識別を行ったり、ベロ毒素についての研究に役立てたり、他の方法によるベロ毒素の検出結果の確認を行ったりすることができる。
試料が複数の微生物を含む場合等において、１種類の微生物についてベロ毒素を産生するかを判定する場合には、微生物を平板培地等で培養し、培養により得られたコロニーを回収することで単一の種類の微生物を抽出することが好ましい。この場合、上述のように、コロニーを含む菌液またはコロニーを溶菌して得られた溶菌液を試料とすることができる。
（ベロ毒素に結合する分子について）
以下では、ベロ毒素に結合する分子をベロ毒素結合分子と呼ぶ。ベロ毒素結合分子は、ベロ毒素結合分子とベロ毒素との結合を利用して、試料がベロ毒素を含む場合に、試料の精製を行うことができれば特に限定されない。ここで、試料の精製とは、試料におけるベロ毒素以外の分子の少なくとも一部の濃度が、ベロ毒素の濃度と比較して相対的に低下することを指す。
以下では、ベロ毒素に結合する分子をベロ毒素結合分子と呼ぶ。ベロ毒素結合分子は、ベロ毒素結合分子とベロ毒素との結合を利用して、試料がベロ毒素を含む場合に、試料の精製を行うことができれば特に限定されない。ここで、試料の精製とは、試料におけるベロ毒素以外の分子の少なくとも一部の濃度が、ベロ毒素の濃度と比較して相対的に低下することを指す。
ベロ毒素結合分子は、抗体または、細胞におけるベロ毒素の受容体であるグロボトリアオシルセラミドであることが好ましい。以下の実施形態において、「抗体」は、ＩｇＧ等の免疫グロブリンの他、免疫グロブリンではないが、免疫グロブリンにおいて抗原特異性を担う可変領域を含む免疫グロブリン様分子を含む。
検出したいベロ毒素の型若しくは亜型に結合可能な分子を、ベロ毒素結合分子として用いることができる。ベロ毒素は１つのＡサブユニットと、５つのＢサブユニットを含んで構成される。Ａサブユニットは、Ａ１サブユニットとＡ２サブユニットを含んで構成される。ベロ毒素結合分子は、Ａ１サブユニットに結合する分子でもよいし、Ａ２サブユニットに結合する分子でもよいし、Ｂサブユニットに結合する分子でもよい。
図２は、ベロ毒素の型および亜型と、各型および亜型のベロ毒素のＢサブユニットのアミノ酸配列を示す図である。ベロ毒素１型は、Ｓｔｘ１ａ、Ｓｔｘ１ｃおよびＳｔｘ１ｄの亜型が存在する。Ｓｔｘ１ａのＢサブユニットは、「TPDCVTGKVEYTKYNDDDTFTVKVGDKELFTNRWNLQSLLLSAQITGMTVTIKTNACHNGGGFSEVIFR」（配列番号１）のアミノ酸配列を有している。Ｓｔｘ１ｃのＢサブユニットは、「APDCVTGKVEYTKYNDDDTFTVKVGDKELFTNRWNLQSLLLSAQITGMTVTIKTNACHNGGGFSEVIFR」（配列番号２）のアミノ酸配列を有している。Ｓｔｘ１ｄのＢサブユニットは、「APDCVTGKVEYTKYNDDDTFTVKVADKELFTNRWNLQSLLLSAQITGMTVTIKTTACHNGGGFSEVIFR」（配列番号３）のアミノ酸配列を有している。
ベロ毒素２型は、Ｓｔｘ２ａ、Ｓｔｘ２ｂ、Ｓｔｘ２ｃ、Ｓｔｘ２ｄ、Ｓｔｘ２ｅ、Ｓｔｘ２ｆおよびＳｔｘ２ｇの亜型が存在する。Ｓｔｘ２ａのＢサブユニットは、「ADCAKGKIEFSKYNEDDTFTVKVDGKEYWTSRWNLQPLLQSAQLTGMTVTIKSSTCESGSGFAEVQFNND」（配列番号４）のアミノ酸配列を有している。Ｓｔｘ２ｂのＢサブユニットは、「ADCAKGKIEFSKYNENDTFTVKVAGKEYWTNRWNLQPLLQSAQLTGMTVTIKSNTCASGSGFAEVQFN」（配列番号５）のアミノ酸配列を有している。Ｓｔｘ２ｃのＢサブユニットは、「ADCAKGKIEFSKYNENDTFTVKVAGKEYWTSRWNLQPLLQSAQLTGMTVTIKSSTCESGSGFAEVQFNND」（配列番号６）のアミノ酸配列を有している。Ｓｔｘ２ｄのＢサブユニットは、「ADCAKGKIEFSKYNENDTFTVKVAGKEYWTSRWNLQPLLQSAQLTGMTVTIKSSTCASGSGFAEVQFNND」（配列番号７）のアミノ酸配列を有している。Ｓｔｘ２ｅのＢサブユニットは、「ADCAKGKIEFSKYNEDNTFTVKVSGREYWTNRWNLQPLLQSAQLTGMTVTIISNTCSSGSGFAQVKFN」（配列番号８）のアミノ酸配列を有している。Ｓｔｘ２ｆのＢサブユニットは、「ADCAVGKIEFSKYNEDDTFTVKVSGREYWTNRWNLQPLLQSAQLTGMTVTIISNTCSSGSGFAQVKFN」（配列番号９）のアミノ酸配列を有している。Ｓｔｘ２ｇのＢサブユニットは、「ADCAKGKIEFSKYNGDNTFTVKVDGKEYWTNRWNLQPLLQSAQLTGMTVTIKSNTCESGSGFAEVQFNND」（配列番号１０）のアミノ酸配列を有している。
以下では、特定の型または亜型のベロ毒素に結合し、他の型または亜型に結合しないことを、「選択的に結合する」と呼ぶ。ベロ毒素結合分子は、ベロ毒素１型に選択的に結合する抗体、ベロ毒素２型に選択的に結合する抗体、または、ベロ毒素１型および２型に結合可能な抗体とすることができる。ベロ毒素結合分子は、Ｓｔｘ１ａ、Ｓｔｘ１ｃ、Ｓｔｘ１ｄ、Ｓｔｘ２ａ、Ｓｔｘ２ｂ、Ｓｔｘ２ｃ、Ｓｔｘ２ｄ、Ｓｔｘ２ｅ、Ｓｔｘ２ｆおよびＳｔｘ２ｇの少なくとも一つに結合可能な抗体とすることができる。ベロ毒素結合分子は、ベロ毒素の各型または各亜型に共通する部位をエピトープとするものが望ましいが、特にこれに限定されない。
ベロ毒素結合分子は、モノクローナル抗体でも、ポリクローナル抗体でもよい。また、本実施形態において、ベロ毒素結合分子として、複数の種類の分子を用いてもよい。ベロ毒素結合分子は、抗原特異性または構造の異なる複数の種類の抗体を含むことができ、この場合、後述の精製操作において、複数の種類の抗体が試料と接触させられることになる。
図１に戻って、ステップＳ１００１が終了したら、ステップＳ１００３が開始される。ステップＳ１００３において、ベロ毒素を精製するための操作が行われる。以下では、この操作を精製操作と呼ぶ。精製操作により、試料にベロ毒素が含まれている場合、ベロ毒素が精製される。
精製操作によるベロ毒素の精製は、ベロ毒素結合分子とベロ毒素との結合を利用して精製が行われれば、その方法は特に限定されない。精製操作では、ベロ毒素結合分子とベロ毒素とを結合させる反応が行われる。例えば、試料とベロ毒素結合分子を含む溶液とが接触させられる。精製操作によるベロ毒素の精製は、ベロ毒素結合分子とベロ毒素とが結合して得られた複合体を限外ろ過により分離することにより行うことが好ましい。以下では、単に複合体と記載すればベロ毒素結合分子とベロ毒素との複合体を指す。精製操作によるベロ毒素の精製は、ベロ毒素結合分子を用いるアフィニティ精製により行うことができる。アフィニティ精製の例は、免疫沈降法、プルダウンアッセイ、ならびに、カラム、ピペットチップ、マイクロ流路またはスピンカラム等を用いたアフィニティクロマトグラフィを含むことができる。ベロ毒素結合分子とベロ毒素とを結合させる際に、ベロ毒素はサブユニットに分離した状態でも、分離していない状態でもよい。ベロ毒素結合分子とベロ毒素とを結合させる操作の前に、ベロ毒素を各サブユニットへと分離させる操作を行ってもよい。
限外ろ過では、多孔質の限外ろ過膜における細孔により、水中に溶存するタンパク質等の高分子および微粒子を分離することができる。細孔径のばらつきや測定の難しさを理由として、細孔径ではなく分画分子量が、膜の分離性能を表す指標として用いられる。限外ろ過膜の各メーカーはそれぞれ異なった基準で公称分画分子量（Ｎｏｍｉｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｌｉｍｉｔ：ＮＭＷＬ）を定義している。分画分子量と同程度の分子量の分子は、限外ろ過膜を透過する場合もあれば、透過しない場合もある。以下では、分子量の異なる複数の標準物質を、限外ろ過膜に導入して得られた分画曲線において、阻止率が９０％となる分子量を分画分子量とする。
限外ろ過を用いる方法では、ベロ毒素結合分子とベロ毒素とを接触させ結合させた後、得られた複合体を限外ろ過により分離する。ベロ毒素のＡ１サブユニットの分子量は約２８ｋＤａ、Ａ２サブユニットの分子量は約４ｋＤａ、Ｂサブユニットの分子量は１つあたり７５００～８０００Ｄａ程度、抗体のＩｇＧの分子量は約１５０ｋＤａである。従って、複合体の分子量はおおよそ１５０～２３０ｋＤａとなる。従って、精製操作における限外ろ過の分画分子量は、１０ｋＤａ～２００ｋＤａが好ましく、４０ｋＤａ～１５０ｋＤａがより好ましく、７０ｋＤａ～１２０ｋＤａがさらに好ましい。これにより、複合体を限外ろ過膜に留めながら、ベロ毒素のＡサブユニットまたはＢサブユニットの分子量に近い質量の夾雑物をろ液に分離することができる。その結果、限外ろ過膜に残った成分を質量分析する際に、ベロ毒素のＡサブユニットまたはＢサブユニットに由来するイオンのｍ／ｚの近傍において、夾雑物に対応するピークを低減することができる。以下では、質量電荷比としてｍ／ｚを用いるが、イオンの質量と電荷の比を示すことができれば、特に限定されない。
限外ろ過を用いる方法では、溶液において、遊離されたベロ毒素結合分子と遊離されたベロ毒素とが結合するように反応を行うことが好ましい。これにより、担体に固定した抗体をベロ毒素と結合させる場合に比べ、反応時間を短くし、迅速にベロ毒素の精製を行うことができる。迅速なベロ毒素の精製は、短い時間でのベロ毒素の検出を実現するため、特に臨床上好ましい。また、ベロ毒素とベロ毒素結合分子とを結合させる操作を行う前に、精密ろ過または限外ろ過等により、抗体と同程度以上の分子量の分子または、ベロ毒素の分子量よりも質量の大きい分子を取り除く操作を行ってもよい。
精製操作では、複合体が分離された後、ベロ毒素とベロ毒素結合分子とを分離する操作およびベロ毒素を各サブユニットに分離する操作を行ってもよい。これらは例えば、複合体に有機溶媒を加えたり、硫酸またはトリフルオロ酢酸（trifluoroacetic acid; ＴＦＡ）等の酸を加えることにより行うことができる。しかし、後述のようにＭＡＬＤＩ用の質量分析用試料を調製する場合は、マトリックス溶液によりベロ毒素は抗体等のベロ毒素結合分子と分離され、また各サブユニットへ分離されるため、あえてこれらの操作を行う必要はない。
なお、ステップＳ１００３において、限外ろ過の代わりに、または限外ろ過に加えて、透過させる分子の分子量について同等の特性を有する精密ろ過膜を用いて精密ろ過を行ってもよい。
なお、ステップＳ１００３において、限外ろ過の代わりに、または限外ろ過に加えて、透過させる分子の分子量について同等の特性を有する精密ろ過膜を用いて精密ろ過を行ってもよい。
ステップＳ１００３が終了したら、ステップＳ１００５が開始される。ステップＳ１００５では、質量分析用試料が調製される。
（質量分析用試料の調製について）
質量分析用試料の調製は、後述の質量分析（ステップＳ１００７）におけるイオン化の種類に応じた方法で行われれば、その方法は特に限定されない。
質量分析用試料の調製は、後述の質量分析（ステップＳ１００７）におけるイオン化の種類に応じた方法で行われれば、その方法は特に限定されない。
以下では、質量分析においてマトリックス支援レーザー脱離イオン化（Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization; ＭＡＬＤＩ）を行う場合の例を説明する。精製操作により得られた、ベロ毒素を含むまたはベロ毒素を含む可能性がある溶液を用意する。この精製された溶液を固相抽出チップなどを用いて脱塩し、マトリックスを含む溶液（以下、マトリックス溶液と呼ぶ）を加えてＭＡＬＤＩ用試料プレートに滴下して乾燥させることで、試料とマトリックスを含む結晶が得られる。この結晶が質量分析用試料となる。精製操作により得られた上記溶液をＭＡＬＤＩ用試料プレートに配置した後、マトリックス溶液を加えてもよい。マトリックスの種類は特に限定されず、ＣＨＣＡ（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid）、シナピン酸またはＤＨＢ（2,5-dihydroxybenzoic acid）等を適宜用いることができる。マトリックス溶液の溶媒は、アセトニトリル等の有機溶媒を数十体積％含む水溶液にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）が０～３体積％添加されたもの等を用いることができる。
なお、適宜感度等を高めるための添加剤を用いて質量分析用試料を調製してもよい。
なお、適宜感度等を高めるための添加剤を用いて質量分析用試料を調製してもよい。
ステップＳ１００５が終了したら、ステップＳ１００７が開始される。ステップＳ１００７において、精製操作で得られた試料の質量分析が行われる。精製操作で得られた、試料がベロ毒素を含む場合にベロ毒素が含まれる精製後の画分が、質量分析に供されることになる。
質量分析の方法は、検出するベロ毒素のサブユニットに対応するｍ／ｚを有するイオンを質量分離して検出することができれば、特に限定されない。質量分析は、四重極型、イオントラップ型または飛行時間型等の任意の型の質量分析を行うことができる。１価のイオンを検出する場合、数ｋＤａ以上の高質量であるベロ毒素の各サブユニットを精度よく検出する観点から、飛行時間型質量分析が好ましい。本実施形態では、１段階の質量分析によりベロ毒素を検出することが可能である。質量分析は、四重極型、イオントラップ型または飛行時間型等の任意の質量分析器を１以上含む質量分析計により行うことができる。質量分析の前に、液体クロマトグラフィ等のクロマトグラフィを行ってもよい。
質量分析におけるイオン化の方法は特に限定されず、ＭＡＬＤＩまたはエレクトロスプレー法（Electrospray Ionization; ＥＳＩ）等を行うことができる。１価のイオンが生成しやすく、解析しやすいデータを得ることができる観点から、ＭＡＬＤＩが好ましい。ＭＡＬＤＩの場合、上述のように調製された質量分析用試料にレーザー光が照射され、試料がイオン化される。
質量分析では、質量分離するイオンのｍ／ｚを走査させて、マススペクトルを得るためのデータを取得することが好ましい。質量分析で得られたデータを質量分析データと呼ぶ。質量分析データは、電子計算機等の処理装置から参照可能な記憶媒体に記憶される。
ステップＳ１００７が終了したら、ステップＳ１００９が開始される。ステップＳ１００９において、質量分析データが解析される。質量分析データの解析は、電子計算機等の処理装置により行われる。質量分析データから、マススペクトルに対応するマススペクトルデータを作成することが好ましい。例えば、飛行時間型質量分析の場合、質量分析データにおいて飛行時間と各飛行時間において検出されたイオンの検出信号の強度が対応付けられている。飛行時間を予め得られた較正データに基づいてｍ／ｚに変換し、ｍ／ｚと強度とが対応付けられたマススペクトルデータを得ることができる。
ベロ毒素の各型または各亜型のＡ１サブユニット、Ａ２サブユニットまたはＢサブユニットに由来するイオンのｍ／ｚから、質量分析の精度に基づいた許容範囲にあるｍ／ｚを有するイオンが検出されたか否かが判定される。当該許容範囲にｍ／ｚを有するイオンが検出された場合、対応する型または亜型のベロ毒素が検出されたものとされる。各型または亜型の各サブユニットに由来するイオンのｍ／ｚは、過去の実測値または、各型若しくは亜型の分子量（図２参照）に基づいて算出した値を用いることができる。例えば、ＭＡＬＤＩの場合、各サブユニットにプロトンが付加した１価のイオンが検出されるとして、各サブユニットの分子量にプロトンの分子量を加えた値を用いることができる。プロトン以外のカチオンまたは陰イオン等が付加するとしてもよい。このように、検出されたベロ毒素の質量電荷比に基づいて、ベロ毒素の型または亜型の少なくとも一つが識別される。特に１価のイオンを検出する場合、分子量の小さいＢサブユニットを検出する方が精度よく検出することができるため好ましい。
なお、検出対象のベロ毒素に結合するベロ毒素結合分子を用いずに精製操作と同じ手順の操作を行って得られたコントロール試料を質量分析に供してもよい。例えば、ベロ毒素結合分子の代わりに、ベロ毒素と結合しない分子を試料に加えて上記限外ろ過を行い、限外ろ過膜に残った成分を質量分析に供することができる。上述のステップＳ１００７の質量分析を第１質量分析とし、コントロール試料の質量分析を第２質量分析とする。第１質量分析で得られた質量分析データと、第２質量分析で得られた質量分析データとの比較に基づいて、試料にベロ毒素が含まれているかどうかを判定してもよい。例えば、第１質量分析で得られたマススペクトルと、第２質量分析で得られたマススペクトルとを比較し、ベロ毒素に対応するピークが前者に存在し、後者に存在しない場合、試料にベロ毒素が含まれるとすることができる。これにより、コントロール試料との比較により、より確実なベロ毒素の検出を行うことができる。
（態様）
上述した複数の例示的な実施形態またはその変形は、以下の態様の具体例であることが当業者により理解される。
上述した複数の例示的な実施形態またはその変形は、以下の態様の具体例であることが当業者により理解される。
（第１項）一態様に係るベロ毒素の検出方法は、試料とベロ毒素に結合する分子とを用意することと、前記分子のベロ毒素との結合を利用して、前記試料におけるベロ毒素を精製するための操作を行うことと、前記操作で得られた前記試料を第１質量分析に供することとを備える。これにより、質量分析を用いて、より正確にベロ毒素の検出を行うことができる。
（第２項）他の一態様に係るベロ毒素の検出方法では、第１項の態様に係るベロ毒素の検出方法において、前記第１質量分析で検出されたベロ毒素の質量電荷比に基づいて、ベロ毒素の型および亜型の少なくとも一つを識別することを備える。これにより、より正確にベロ毒素の型または亜型の検出を行うことができる。
（第３項）他の一態様に係るベロ毒素の検出方法では、第１項または第２項の態様に係るベロ毒素の検出方法において、前記ベロ毒素に結合する分子は、抗体およびグロボトリアオシルセラミドの少なくとも一つである。これにより、抗原－抗体反応またはリガンド－リセプター反応の特異性を生かして、より確実にベロ毒素の精製を行うことができる。
（第４項）他の一態様に係るベロ毒素の検出方法では、第３項の態様に係るベロ毒素の検出方法において、前記抗体は、ポリクローナル抗体である。これにより、モノクローナル抗体に比べ、迅速かつ容易に作成することができる。
（第５項）他の一態様に係るベロ毒素の検出方法では、第３項または第４項の態様に係るベロ毒素の検出方法において、前記ベロ毒素に結合する分子は、ベロ毒素１型およびベロ毒素２型の少なくとも一つに結合可能な抗体である。これにより、ベロ毒素１型、ベロ毒素２型またはこれらの両方が試料に存在するか否かを検出することができる。
（第６項）他の一態様に係るベロ毒素の検出方法は、第４項または第５項の態様に係るベロ毒素の検出方法において、前記精製では、複数の種類の抗体を前記試料と接触させる。これにより、さらに確実にベロ毒素の検出を行うことができる。
（第７項）他の一態様に係るベロ毒素の検出方法は、第１項から第６項までのいずれかの態様に係るベロ毒素の検出方法において、前記操作では、前記分子とベロ毒素とが結合した結合分子を含む溶液が限外ろ過および精密ろ過の少なくとも一つに供される。これにより、ベロ毒素の各サブユニットの分子量と、複合体の分子量との差を利用して、ベロ毒素の各サブユニットの分子量の近傍の分子量を有する分子を試料から除き、精度よく質量分析データの解析を行うことができる。
（第８項）他の一態様に係るベロ毒素の検出方法は、第１項から第７項までのいずれかの態様に係るベロ毒素の検出方法において、前記分子を用いずに、前記操作と同様の操作を行って得られた溶液を第２質量分析に供することと、前記第１質量分析で得られたデータと、前記第２質量分析で得られたデータとの比較に基づいて、ベロ毒素が前記試料に含まれているか否かを判定することとを備える。これにより、ベロ毒素に由来するイオンのｍ／ｚに対応するピークが、ベロ毒素に対応するピークか否かを確認することができ、より確実にベロ毒素の検出を行うことができる。
本発明は上記実施形態の内容に限定されるものではない。本発明の技術的思想の範囲内で考えられるその他の態様も本発明の範囲内に含まれる。
以下に、本実施形態に係る実施例を示すが、本発明は下記の実施例に限定されることを意図したものではない。
（実施例１）
実施例１では、未知の試料に対し抗ベロ毒素1抗体および抗ベロ毒素2抗体のそれぞれを用いて精製操作を行い、質量分析によりベロ毒素を検出した。以下の1-5の順に各操作を行った。
実施例１では、未知の試料に対し抗ベロ毒素1抗体および抗ベロ毒素2抗体のそれぞれを用いて精製操作を行い、質量分析によりベロ毒素を検出した。以下の1-5の順に各操作を行った。
1. 腸管出血性大腸菌感染症の患者に由来する大腸菌株をBHI(brain heart infusion)寒天培地で培養した。培養により形成したコロニーをポリミキシンB溶液に30分間浮遊させた後に遠心分離に供し、その上清を試料溶液とした。
2. 1.で得られた試料溶液を150 μＬずつ、2本のチューブに分注し、それぞれに5 mMのn-オクチル-β-D-グルコシドを含むＰＢＳ緩衝溶液150 μＬを加えた。得られた溶液を、限外ろ過デバイス(NMWL:100K Da、メルクミリポア、UFC510096)に適用し、2本のチューブを同時に遠心分離(14,000G、5分間)に供した。
3. 2.の遠心分離で得られたろ液の片方に、0.5 μｇの抗ベロ毒素1抗体(ナカライテスク、01770-74)を加え、もう片方には0.5 μｇの抗ベロ毒素2抗体(ナカライテスク、01771-64)を加え、それぞれ30分間インキュベーションした。
4. 3.のインキュベーション後の溶液を新しい限外ろ過デバイス(NMWL:100K Da)に適用し、2本のチューブを同時に遠心分離に供した。遠心分離の後、限外ろ過のフィルター内の残渣液に100 μＬの2.5 mMのn-オクチル-β-D-グルコシドを含むＰＢＳ緩衝溶液を加えて全量を回収した。
5. 4.で回収された溶液を固相抽出チップ(アジレントテクノロジー、Bond Elut OMIX、A57009100)を用いて脱塩した。脱塩後の溶出液をステンレスプレートに滴下して質量分析計(島津製作所、MALDI-8020)によって質量分析に供しマススペクトルを得た。
2. 1.で得られた試料溶液を150 μＬずつ、2本のチューブに分注し、それぞれに5 mMのn-オクチル-β-D-グルコシドを含むＰＢＳ緩衝溶液150 μＬを加えた。得られた溶液を、限外ろ過デバイス(NMWL:100K Da、メルクミリポア、UFC510096)に適用し、2本のチューブを同時に遠心分離(14,000G、5分間)に供した。
3. 2.の遠心分離で得られたろ液の片方に、0.5 μｇの抗ベロ毒素1抗体(ナカライテスク、01770-74)を加え、もう片方には0.5 μｇの抗ベロ毒素2抗体(ナカライテスク、01771-64)を加え、それぞれ30分間インキュベーションした。
4. 3.のインキュベーション後の溶液を新しい限外ろ過デバイス(NMWL:100K Da)に適用し、2本のチューブを同時に遠心分離に供した。遠心分離の後、限外ろ過のフィルター内の残渣液に100 μＬの2.5 mMのn-オクチル-β-D-グルコシドを含むＰＢＳ緩衝溶液を加えて全量を回収した。
5. 4.で回収された溶液を固相抽出チップ(アジレントテクノロジー、Bond Elut OMIX、A57009100)を用いて脱塩した。脱塩後の溶出液をステンレスプレートに滴下して質量分析計(島津製作所、MALDI-8020)によって質量分析に供しマススペクトルを得た。
図３は、抗ベロ毒素2抗体を用いて精製操作を行った場合の、質量分析で得られたマススペクトルであり、図４は、抗ベロ毒素1抗体を用いて精製操作を行った場合の、質量分析で得られたマススペクトルである。マススペクトルは、横軸に検出したイオンのｍ／ｚ、縦軸に当該イオンの検出信号の強度を示すグラフであり、図３～図６の各図において同様である。図３と図４の比較では、図４にのみm/z 7692.1のピークＰ１が高い強度で観察され、他のピークについてはほぼ同程度の強度であった。このピークＰ１をベロ毒素に由来するピークの候補として図２の表と比較し、ピークＰ１がStx1a型のベロ毒素のＢサブユニットに由来すると判断した。つまり、この実施例１に用いた試料からはベロ毒素が検出され、その型および亜型はStx1aであると結論することができた。
（実施例２）
実施例２では、既知の試料に対し抗ベロ毒素1抗体および抗ベロ毒素2抗体のそれぞれを用いて精製操作を行い、質量分析によりベロ毒素を検出した。以下の1-5の順に各操作を行った。
実施例２では、既知の試料に対し抗ベロ毒素1抗体および抗ベロ毒素2抗体のそれぞれを用いて精製操作を行い、質量分析によりベロ毒素を検出した。以下の1-5の順に各操作を行った。
1. 遺伝子検査によりStx1cの遺伝子を持つと判断された大腸菌株をTSA(Trypticase soy agar)平板培地で培養した。培養により形成したコロニーを生理食塩水に懸濁し、超音波破砕装置を用いて溶菌し、試料溶液を得た。
2. 1.で得られた試料溶液を150 μＬずつ、２本のチューブに分注し、それぞれに5 mMのn-オクチル-β-D-グルコシドを含むＰＢＳ緩衝溶液150 μＬを加えた。得られた溶液を、限外ろ過デバイス(NMWL:100K Da、メルクミリポア、UFC510096)に適用し、2本のチューブを同時に遠心分離(14,000G、5分間)に供した。
3. 2.の遠心分離で得られたろ液の片方に、0.5 μｇの抗ベロ毒素1抗体(ナカライテスク、01770-74)を加え、もう片方には0.5 μｇの抗ベロ毒素2抗体(ナカライテスク、01771-64)を加え、それぞれ30分間インキュベーションした。
4. 3.のインキュベーション後の溶液を新しい限外ろ過デバイス(NMWL:100K Da)に適用し、2本のチューブを同時に遠心分離に供した。遠心分離の後、限外ろ過のフィルター内の残渣液に100 μＬの2.5 mMのn-オクチル-β-D-グルコシドを含むＰＢＳ緩衝溶液を加えて全量を回収した。
5. 4.で回収された溶液を固相抽出チップ(アジレントテクノロジー、Bond Elut OMIX、A57009100)を用いて脱塩した。脱塩後の溶出液をステンレスプレートに滴下して質量分析計(島津製作所、MALDI-8020)によって質量分析に供しマススペクトルを得た。
2. 1.で得られた試料溶液を150 μＬずつ、２本のチューブに分注し、それぞれに5 mMのn-オクチル-β-D-グルコシドを含むＰＢＳ緩衝溶液150 μＬを加えた。得られた溶液を、限外ろ過デバイス(NMWL:100K Da、メルクミリポア、UFC510096)に適用し、2本のチューブを同時に遠心分離(14,000G、5分間)に供した。
3. 2.の遠心分離で得られたろ液の片方に、0.5 μｇの抗ベロ毒素1抗体(ナカライテスク、01770-74)を加え、もう片方には0.5 μｇの抗ベロ毒素2抗体(ナカライテスク、01771-64)を加え、それぞれ30分間インキュベーションした。
4. 3.のインキュベーション後の溶液を新しい限外ろ過デバイス(NMWL:100K Da)に適用し、2本のチューブを同時に遠心分離に供した。遠心分離の後、限外ろ過のフィルター内の残渣液に100 μＬの2.5 mMのn-オクチル-β-D-グルコシドを含むＰＢＳ緩衝溶液を加えて全量を回収した。
5. 4.で回収された溶液を固相抽出チップ(アジレントテクノロジー、Bond Elut OMIX、A57009100)を用いて脱塩した。脱塩後の溶出液をステンレスプレートに滴下して質量分析計(島津製作所、MALDI-8020)によって質量分析に供しマススペクトルを得た。
図５は、抗ベロ毒素2抗体を用いて精製操作を行った場合の、質量分析で得られたマススペクトルであり、図６は、抗ベロ毒素1抗体を用いて精製操作を行った場合の、質量分析で得られたマススペクトルである。図５と図６の比較では、図６にのみm/z 7662.4のピークＰ２が高い強度で観察され、他のピークについてはほぼ同程度の強度である。このピークＰ２をベロ毒素に由来するピークの候補として図２の表と比較し、ピークＰ２がStx1c型のベロ毒素のＢサブユニットに由来すると判断した。つまり、この実施例２に用いた試料からはStx1cのベロ毒素が検出され、遺伝子検査の結果と同じ型および亜型のベロ毒素が発現していると結論することができた。
Claims (8)
- 試料と、ベロ毒素のＡサブユニット又はＢサブユニットに結合する分子とを用意することと、
前記分子のベロ毒素との結合を利用して、前記試料におけるベロ毒素が精製された精製試料を得るための操作を行うことと、
前記操作で得られた前記精製試料を第１質量分析に供することと、
前記分子が結合するベロ毒素に結合しない分子を前記試料に加えたコントロール試料を用意し、前記ろ過膜を用いて該コントロール試料を限外ろ過および精密ろ過の少なくとも一つに供することにより得られた前記ろ過膜に残った成分を第２質量分析に供することと、
前記第１質量分析で得られたデータと、前記第２質量分析で得られたデータとの比較に基づいて、ベロ毒素が前記試料に含まれているか否かを判定することと
を備え、
前記操作では、前記分子とベロ毒素のＡサブユニット又はＢサブユニットとが結合した結合分子を含む溶液が限外ろ過および精密ろ過の少なくとも一つに供され、
前記限外ろ過および精密ろ過の少なくとも一つでは、前記結合分子を透過させず、ベロ毒素のＡサブユニット又はＢサブユニットを透過させるろ過膜を用い、
前記第１質量分析に供される前記精製試料は、前記ろ過膜を透過しなかった前記結合分子を含む、ベロ毒素の検出方法。 - 請求項１に記載のベロ毒素の検出方法において、
前記第１質量分析で検出されたベロ毒素の質量電荷比に基づいて、ベロ毒素の型および亜型の少なくとも一つを識別することを備える、ベロ毒素の検出方法。 - 請求項１または２に記載のベロ毒素の検出方法において、
前記ベロ毒素に結合する分子は、抗体およびグロボトリアオシルセラミドの少なくとも一つである、ベロ毒素の検出方法。 - 請求項３に記載のベロ毒素の検出方法において、
前記抗体は、ポリクローナル抗体である、ベロ毒素の検出方法。 - 請求項３または４に記載のベロ毒素の検出方法において、
前記ベロ毒素に結合する分子は、ベロ毒素１型およびベロ毒素２型の少なくとも一つに結合可能な抗体である、ベロ毒素の検出方法。 - 請求項４または５に記載のベロ毒素の検出方法において、
前記精製では、複数の種類の抗体を前記試料と接触させる、ベロ毒素の検出方法。 - 請求項１から６までのいずれか一項に記載のベロ毒素の検出方法において、
前記ろ過膜の分画分子量が１０ｋＤａ～２００ｋＤａである、ベロ毒素の検出方法。 - 請求項１から７までのいずれか一項に記載のベロ毒素の検出方法において、
前記第１質量分析で得られたマススペクトルに存在するピークであって、前記第２質量分析で得られたマススペクトルに存在しないピークを検出することによって、ベロ毒素が前記試料に含まれているか否かを判定する、ベロ毒素の検出方法。
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