JP2022550825A - 尿サンプル中において結核の診断を行なうための方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、結核（ＴＢ）の診断および処置方法を提供する。当該方法は、ＴＢが疑われる対象からの尿サンプルを、少なくとも２種のヒト由来バイオマーカー（そのうちの一方はＳＡＡ１であり、もう一方はＲＥＴＮまたはＲＢＰ４である）が存在するか否かについて試験する工程を含む。また、尿サンプルを、ＬＩＬＲＢ４、ＩＬ１８ＢＰ、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＣＤ５９、ＩＧＬＶ３．２１、ＩＧＫＶ１．１７、ＳＡＡ２、ＣＲＰ、ＴＳＰ４、ＡＸＡ８１、Ａ８ＭＵＥ１、Ｏ５３７６４＿ＭＹＣＴＵ（Ｒｖ０５６７）、Ｉ６Ｙ０Ｗ５＿ＭＹＣＴＵ（ｆａｄＥ１９、Ｒｖ２５００ｃ）、Ｑ７９ＦＰ１＿ＭＹＣＴＵ（ＰＥ＿ＰＧＲＳ２８、Ｒｖ１４５２ｃ）、ＨＴＰＧ＿ＭＹＣＴＵ（ｈｔｐＧ、Ｒｖ２２９９ｃ）、ＲＰＯＢ＿ＭＹＣＴＵ（ｒｐｏＢ、Ｒｖ０６６７）、ＥＦＴＵ＿ＭＹＣＴＵ（ｔｕｆ、Ｒｖ０６８５）、ＡＣＲ＿ＭＹＣＴＵ（ｈｓｐＸ、Ｒｖ２０３１ｃ）、ＣＨ６０２＿ＭＹＣＴＵ（ｇｒｏＥＬ２、Ｒｖ０４４０）、ＣＬＰＰ１＿ＭＹＣＴＵ（ｃｌｐＰ１、Ｒｖ２４６１ｃ）、および／またはＣＨ１０＿ＭＹＣＴＵ（１０ｋＤａシャペロニン、Ｒｖ３４１８ｃ）から選択される１種以上のさらなるバイオマーカーが存在するか否かについても試験してよい。

Description

関連出願の相互参照
本願は、南アフリカ仮特許出願第２０１９／０６４２２号に基づく優先権を主張するものであり、これを引用により本明細書に援用する。

発明の分野
本発明は、対象における活動性結核疾患（ＴＢ）の診断を行なうための方法であって、対象からの尿サンプル中における特定のバイオマーカーを検出する工程を含む方法に関する。

発明の背景
結核（ＴＢ）についての画期的かつ正確な試験が緊急的に必要とされている、というのは、結核が、人類にとって歴史上最大の死因であり、かつ、南アフリカにおいて現時点で最も一般的な死因であるためである。推定によると、ＴＢは当該国の年間ＧＤＰに２～３％（１年あたり約２千億ランド）の打撃を与えている。

より良好なＴＢ診断の開発にあたって未だ対処されていない重大な課題は、臨床的に有用なバイオマーカーがないことと、ベッドサイドおよびコミュニティの両方において痰に依存しない単純かつ手頃なＴＢ検出プラットフォームがないことである。この問題は、患者の５０％かそれ未満（ＨＩＶに同時感染していて、痰を産生できないまたは痰に含有される細菌が非常に少ない（菌５０個未満／ｍｌ））にとって、特に緊急的である。多くのＴＢ蔓延国において使用されているＰＣＲに基づく現行最先端のＴＢ診断試験（Ｇｅｎｅ Ｘｐｅｒｔ Ｕｌｔｒａ；Ｃｅｐｈｅｉｄ）ではこの問題に対処できず、既存の尿リポアラビノマンナン（ＬＡＭ）アッセイ（Ａｌｅｒｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ（商標） ＴＢ ＬＡＭ Ａｇ）は、感度が低く、ＴＢおよびＨＩＶ同時感染患者の５０％未満しか検出できない。効果的な診断がないことと相まって、世界のＴＢ例のほぼ４０％が診断されず、報告もされていない。世界的には１年あたりのＴＢ例が４００万件を超え、ＴＢ発病率が最も高い国である南アフリカにおいては、１年あたりの新規ＴＢ例が～１５０，０００～２００，０００件である（WHO 2017 Global TB Report）。

発明の概要
本発明の第１の実施形態によれば、結核疾患（ＴＢ）の診断を行なうための方法であって、ＴＢが疑われる対象からの尿サンプルを、ＳＡＡ１とＲＥＴＮおよびＲＢＰ４のいずれかまたは両方とが存在するか否かについて試験する工程を含む方法が提供される。

特に、尿サンプルを、ＳＡＡ１およびＲＥＴＮ、ＳＡＡ１およびＲＢＰ４、またはＳＡＡ１、ＲＥＴＮ、およびＲＢＰ４が存在するか否かについて試験してもよい。

また、尿サンプルを、ＬＩＬＲＢ４、ＩＬ１８ＢＰ、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＣＤ５９、ＩＧＬＶ３．２１、ＩＧＫＶ１．１７、Ｏ５３７６４＿ＭＹＣＴＵ（Ｒｖ０５６７）、Ｉ６Ｙ０Ｗ５＿ＭＹＣＴＵ（ｆａｄＥ１９、Ｒｖ２５００ｃ）、Ｑ７９ＦＰ１＿ＭＹＣＴＵ（ＰＥ＿ＰＧＲＳ２８、Ｒｖ１４５２ｃ）、ＨＴＰＧ＿ＭＹＣＴＵ（ｈｔｐＧ、Ｒｖ２２９９ｃ）、ＲＰＯＢ＿ＭＹＣＴＵ（ｒｐｏＢ、Ｒｖ０６６７）、ＥＦＴＵ＿ＭＹＣＴＵ（ｔｕｆ、Ｒｖ０６８５）、ＡＣＲ＿ＭＹＣＴＵ（ｈｓｐＸ、Ｒｖ２０３１ｃ）、ＣＨ６０２＿ＭＹＣＴＵ（ｇｒｏＥＬ２、Ｒｖ０４４０）、ＣＬＰＰ１＿ＭＹＣＴＵ（ｃｌｐＰ１、Ｒｖ２４６１ｃ）、および１０ｋＤａシャペロニン（Ｒｖ３４１８ｃ）からなる群より選択される１種以上のさらなるバイオマーカーが存在するか否かについても試験してよい。

特に、尿サンプルを、ＩＬ１８ＢＰ、ＬＩＬＲＢ４、またはＩＬ１８ＢＰとＬＩＬＲＢ４との両方が存在するか否かについても試験してよい。

尿サンプルを、さらに、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＣＤ５９、ＲＢＰ４、ＩＧＬＶ３．２１、およびＩＧＫＶ１．１７からなる群より選択される１～５種のさらなるバイオマーカーが存在するか否かについても試験してよい。特に、尿サンプルを、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＣＤ５９、またはＳＥＲＰＩＮＡ３とＣＤ５９との両方が存在するか否かについても試験してよい。

尿サンプルを、さらに、ＨｔｐＧ、ＰＥ＿ＰＧＲＳ２８、ＥＦＴＵ＿ＭＹＣＴＵ、および１０ｋＤａシャペロニンからなる群より選択される１～４種のさらなるバイオマーカーが存在するか否かについても試験してよい。

また、尿サンプルを、ＳＡＡ２、ＣＲＰ、ＴＳＰ４、Ａ８ＭＵＥ１、ＡＸＡ８１、およびＲＥＴＮからなる群より選択される１種以上（１～５種など）のその他のバイオマーカーが存在するか否かについても試験してよい。たとえば、尿サンプルを、少なくともＳＡＡ１、ＲＢＰ４、およびＳＡＡ２が存在するか否かについて；少なくともＳＡＡ１、ＲＢＰ４、ＳＡＡ２、およびＴＳＰ４が存在するか否かについて；少なくともＳＡＡ１、ＲＢＰ４、およびＣＲＰが存在するか否かについて；または、ＳＡＡ１、ＲＢＰ４、ＳＡＡ２、ＣＲＰ、ＴＳＰ４、Ａ８ＭＵＥ１、およびＲＥＴＮが存在するか否かについて試験してもよい。

より具体的には、尿サンプルを、さらに、以下のバイオマーカーが存在するか否かについても試験してよい：
ａ）ＳＡＡ１、ＲＥＴＮ、およびＬＩＬＲＢ４；
ｂ）ＳＡＡ１、ＲＥＴＮ、およびＩＬ１８ＢＰ；
ｃ）ＳＡＡ１、ＲＥＴＮ、ＩＬ１８ＢＰ、およびＬＩＬＲＢ４；
ｄ）ＳＡＡ１、ＲＥＴＮ、ＩＬ１８ＢＰ、およびＩＧＫＶ１．１７；
ｅ）ＳＡＡ１、ＲＥＴＮ、ＩＬ１８ＢＰ、ＬＩＬＲＢ４、およびＳＥＲＰＩＮＡ３；
ｆ）ＳＡＡ１、ＲＥＴＮ、ＩＬ１８ＢＰ、ＬＩＬＲＢ４、ＳＥＲＰＩＮＡ３、およびＣＤ５９；
ｇ）ＳＡＡ１、ＲＥＴＮ、ＬＩＬＲＢ４、ＩＬ１８ＢＰ、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ならびに、ＣＤ５９、ＲＢＰ４、ＩＧＬＶ３．２１、ＣＡＤＭ１、およびＣＦＨＲ２のうち任意の２種；
ｈ）ＳＡＡ１、ＲＢＰ４、ＨｔｐＧ、およびＰＥ＿ＰＧＲＳ２８；または
ｉ）ＳＡＡ１、ＲＢＰ４、ＨｔｐＧ、ＰＥ＿ＰＧＲＳ２８、ＥＦＴＵ＿ＭＹＣＴＵ、および１０ｋＤａシャペロニン。

本発明の第２の実施形態によれば、結核疾患（ＴＢ）を有する対象を診断および処置する方法であって、
上述される方法を実施する工程と、
サンプル中におけるバイオマーカーの検出に基づいて対象がＴＢを有するか否かを判断する工程と、
対象にとって必要である場合に対象に有効量のＴＢ処置を投与する工程とを含む方法が提供される。

本発明の第３の実施形態によれば、対象における結核疾患（ＴＢ）の診断を行なうための、コンピュータにより実施される方法であって、コンピュータは、
対象からの尿サンプル中におけるＳＡＡ１とＲＥＴＮおよびＲＢＰ４のいずれかまたは両方とのレベルについての値を含む、入力された対象のデータを受信する工程と、
任意に、尿サンプル中における１種以上のその他のバイオマーカーのレベルについての値を含む、入力された対象のデータを受信する工程であって、その他のバイオマーカーは、ＬＩＬＲＢ４、ＩＬ１８ＢＰ、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＣＤ５９、ＲＢＰ４、ＩＧＬＶ３．２１、ＩＧＫＶ１．１７、Ｏ５３７６４＿ＭＹＣＴＵ（Ｒｖ０５６７）、Ｉ６Ｙ０Ｗ５＿ＭＹＣＴＵ（ｆａｄＥ１９、Ｒｖ２５００ｃ）、Ｑ７９ＦＰ１＿ＭＹＣＴＵ（ＰＥ＿ＰＧＲＳ２８、Ｒｖ１４５２ｃ）、ＨＴＰＧ＿ＭＹＣＴＵ（ｈｔｐＧ、Ｒｖ２２９９ｃ）、ＲＰＯＢ＿ＭＹＣＴＵ（ｒｐｏＢ、Ｒｖ０６６７）、ＥＦＴＵ＿ＭＹＣＴＵ（ｔｕｆ、Ｒｖ０６８５）、ＡＣＲ＿ＭＹＣＴＵ（ｈｓｐＸ、Ｒｖ２０３１ｃ）、ＣＨ６０２＿ＭＹＣＴＵ（ｇｒｏＥＬ２、Ｒｖ０４４０）、ＣＬＰＰ１＿ＭＹＣＴＵ（ｃｌｐＰ１、Ｒｖ２４６１ｃ）、ＳＡＡ２、ＣＲＰ、ＴＳＰ４、Ａ８ＭＵＥ１、およびＣＨ１０＿ＭＹＣＴＵ（１０ｋＤａシャペロニン、Ｒｖ３４１８ｃ）からなる群より選択される、工程と、
これらの値を、該当するバイオマーカーについての所定値と比較する工程と、
対象がＴＢを有するか否かを判断する工程と、
対象の診断に関する情報を表示する工程とを含む工程群を実施する、方法が提供される。

本発明の第４の実施形態によれば、対象における結核疾患（ＴＢ）の診断を行なうための、コンピュータにより実施される方法であって、コンピュータは、
対象からの尿サンプル中におけるＳＡＡ１およびＲＢＰ４のレベルについての値を含む、入力された対象のデータを受信する工程と、
任意に、サンプル中における１種以上のその他のバイオマーカーのレベルについての値を含む、入力された対象のデータを受信する工程であって、その他のバイオマーカーは、ＨｔｐＧ、ＰＥ＿ＰＧＲＳ２８、ＥＦＴＵ＿ＭＹＣＴＵ、および１０ｋＤａシャペロニンからなる群より選択される、工程と、
これらの値を、該当するバイオマーカーについての所定値と比較する工程と、
対象がＴＢを有するか否かを判断する工程と、
対象の診断に関する情報を表示する工程とを含む工程群を実施する、方法が提供される。

本発明の第５の実施形態によれば、上述される方法に従って、対象からの血液サンプル中において結核の診断を行なうためのキットであって、
患者からサンプルを受け取る手段と、
少なくともＳＡＡ１とＲＥＴＮおよびＲＢＰ４のいずれかまたは両方とに結合する捕獲剤と、
捕獲剤が上記バイオマーカーに結合した際にそれを示す少なくとも１つの指標とを含むキットが提供される。

当該キットは、さらに、
尿サンプル採取デバイス、
バイオマーカーに対する抗体をつけたメンブレンおよび／もしくはテストストリップ、
ＬＩＬＲＢ４、ＩＬ１８ＢＰ、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＣＤ５９、ＲＢＰ４、ＩＧＬＶ３．２１、ＩＧＫＶ１．１７、Ｏ５３７６４＿ＭＹＣＴＵ（Ｒｖ０５６７）、Ｉ６Ｙ０Ｗ５＿ＭＹＣＴＵ（ｆａｄＥ１９、Ｒｖ２５００ｃ）、Ｑ７９ＦＰ１＿ＭＹＣＴＵ（ＰＥ＿ＰＧＲＳ２８、Ｒｖ１４５２ｃ）、ＨＴＰＧ＿ＭＹＣＴＵ（ｈｔｐＧ、Ｒｖ２２９９ｃ）、ＲＰＯＢ＿ＭＹＣＴＵ（ｒｐｏＢ、Ｒｖ０６６７）、ＥＦＴＵ＿ＭＹＣＴＵ（ｔｕｆ、Ｒｖ０６８５）、ＡＣＲ＿ＭＹＣＴＵ（ｈｓｐＸ、Ｒｖ２０３１ｃ）、ＣＨ６０２＿ＭＹＣＴＵ（ｇｒｏＥＬ２、Ｒｖ０４４０）、ＣＬＰＰ１＿ＭＹＣＴＵ（ｃｌｐＰ１、Ｒｖ２４６１ｃ）、もしくはＣＨ１０＿ＭＹＣＴＵ（１０ｋＤａシャペロニン、Ｒｖ３４１８ｃ）、ＳＡＡ２、ＣＲＰ、ＴＳＰ４、Ａ８ＭＵＥ１、もしくはこれらの任意の組み合わせに結合する捕獲剤、
上記診断方法を実施するための説明、ならびに／または
上記診断を行なうためのソフトウェアを含んでもよい。

本発明の第６の実施形態によれば、ＴＢ診断方法において使用するためのキットまたは検出剤の製造における、ＳＡＡ１とＲＥＴＮおよびＲＢＰ４のいずれかまたは両方とのための捕獲剤の使用が提供される。

ＴＢ陽性個体およびＴＢ陰性個体の間で有意に差次的に発現（ＦＤＲ≦０．０５）している尿中のヒト由来タンパク質の、未加工のｌｏｇ２変換ｉＢＡＱデータの使用によるヒートマップ。 ＴＢ陽性個体とＴＢ陰性個体との区別において最も影響の大きいタンパク質の順で並べた、活動性結核尿中のヒト由来タンパク質（Ｇｉｎｉインデックスにおける平均低下が大きいほど影響が大きいことを示す）。 ＴＢ陽性個体およびＴＢ陰性個体の間で有意に差次的に発現（ＦＤＲ≦０．０５）している尿中のマイコバクテリウム・ツベルクローシス由来タンパク質の、未加工のｌｏｇ２変換ｉＢＡＱデータの使用によるヒートマップ。 ＴＢ陽性個体とＴＢ陰性個体との区別において最も影響の大きいタンパク質の順で並べた、活動性結核尿中のマイコバクテリウム・ツベルクローシス由来タンパク質（Ｇｉｎｉインデックスにおける平均低下が大きいほど影響が大きいことを示す）。 ＴＢ陽性個体とＴＢ陰性個体との区別におけるヒトおよびマイコバクテリウムのバイオマーカーの各々についての曲線下面積データを示すヒストグラム。 ＴＢ陽性（ｎ＝６０）個体およびＴＢ陰性（ｎ＝５８）個体における（Ａ）ＳＡＡ１および（ｂ）ＲＰＢ４の相対的な存在量レベルを示す箱ひげ図。 ＴＢ陽性個体およびＴＢ陰性個体の間で有意に差次的に発現している尿中のヒト由来タンパク質の、ｉＢＡＱデータの使用によるヒートマップ。 ＴＢ陽性個体とＴＢ陰性個体との区別において最も影響の大きいタンパク質の順で並べた、活動性結核尿中のヒト由来タンパク質（特徴を除去した場合の低下が大きいほど予測力が大きいことを示す）。 バイオマーカーの分布および頻度を示す箱ひげ図。

発明の詳細な説明
対象からの尿サンプル中において結核（ＴＢ）の診断を行なう（かつ、任意にこれの処置をも行なう）ための方法と、そのための、コンピュータにより実施される方法とが、本明細書中に記載される。好ましくは、当該方法は、潜在性Ｍ．ツベルクローシス感染（ＬＴＢＩ）または初発ＴＢの診断を行なうためではなく、活動性ＴＢの診断（ＴＢの兆候および症状ならびに／または一貫した画像エビデンスと、微生物学的な追認（培養での陽性、および／または増幅ＤＮＡの存在））を行なうためのものである。当該方法は、ＨＩＶ同時感染ステータスとは無関係である。

当該方法は、ＴＢが疑われる個体からの尿サンプルを、少なくとも２種のヒト由来バイオマーカー（そのうちの一方はＳＡＡ１であり、もう一方はＲＥＴＮまたはＲＢＰ４のいずれかである）が存在するか否かについて試験することを含む。一実施形態において、当該方法は、尿サンプルを少なくともＳＡＡ１およびＲＥＴＮについて試験することを含む。別の一実施形態において、当該方法は、尿サンプルを少なくともＳＡＡ１およびＲＢＰ４について試験することを含む。さらなる一実施形態において、当該方法は、尿サンプルを少なくともＳＡＡ１、ＲＥＴＮ、およびＲＢＰ４について試験することを含む。当該方法は、当該個体がＴＢを有するか否かについて診断することをさらに含む。

また、任意に、サンプルを、ＬＩＬＲＢ４、ＩＬ１８ＢＰ、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＣＤ５９、ＩＧＬＶ３．２１、ＩＧＫＶ１．１７、ＳＡＡ２、ＣＲＰ、ＴＳＰ４、ＡＸＡ８１、およびＡ８ＭＵＥ１などのその他のヒト由来バイオマーカー、またはこれらの任意の組み合わせが存在するか否かについても試験してよい。特に、尿サンプルを、ＩＬ１８ＢＰ、ＬＩＬＲＢ４、もしくはＩＬ１８ＢＰおよびＬＩＬＲＢ４の両方が存在するか否かについても試験してよい、ならびに／または、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＣＤ５９、もしくはＳＥＲＰＩＮＡ３およびＣＤ５９の両方が存在するか否かについても試験してよい、ならびに／または、ＳＡＡ２、ＴＳＰ４、ＣＲＰ、および／もしくはＡ８ＭＵＥ１が存在するか否かについても試験してよい。

また、サンプルを、表１中に列記されるものなどの、本出願人が尿中において特定した１種以上のマイコバクテリウム由来バイオマーカーが存在するか否かについても試験してよい。

より具体的には、サンプルを、以下のＭ．ツベルクローシス由来タンパク質のうちの１種以上が存在するか否かについて試験してもよい：Ｏ５３７６４＿ＭＹＣＴＵ（Ｒｖ０５６７）、Ｉ６Ｙ０Ｗ５＿ＭＹＣＴＵ（ｆａｄＥ１９、Ｒｖ２５００ｃ）、Ｑ７９ＦＰ１＿ＭＹＣＴＵ（ＰＥ＿ＰＧＲＳ２８、Ｒｖ１４５２ｃ）、ＨＴＰＧ＿ＭＹＣＴＵ（ｈｔｐＧ、Ｒｖ２２９９ｃ）、ＲＰＯＢ＿ＭＹＣＴＵ（ｒｐｏＢ、Ｒｖ０６６７）、ＥＦＴＵ＿ＭＹＣＴＵ（ｔｕｆ、Ｒｖ０６８５）、ＡＣＲ＿ＭＹＣＴＵ（ｈｓｐＸ、Ｒｖ２０３１ｃ）、ＣＨ６０２＿ＭＹＣＴＵ（ｇｒｏＥＬ２、Ｒｖ０４４０）、ＣＬＰＰ１＿ＭＹＣＴＵ（ｃｌｐＰ１、Ｒｖ２４６１ｃ）、および／またはＣＨ１０＿ＭＹＣＴＵ（１０ｋＤａシャペロニン、Ｒｖ３４１８ｃ）。さらにより具体的には、サンプルを、ＨｔｐＧ、ＰＥ＿ＰＧＲＳ２８、ＥＦＴＵ＿ＭＹＣＴＵ、および／または１０ｋＤａシャペロニンが存在するか否かについて試験してもよい。たとえば、試験されるマイコバクテリウム由来タンパク質は、ＨｔｐＧおよびＰＥ＿ＰＧＲＳ２８；ＨｔｐＧ、ＰＥ＿ＰＧＲＳ２８、および１０ｋＤａシャペロニン；ＨｔｐＧ、ＰＥ＿ＰＧＲＳ２８、およびＥＦＴＵ＿ＭＹＣＴＵ；ＰＥ＿ＰＧＲＳ２８、またはＥＦＴＵ＿ＭＹＣＴＵおよび１０ｋＤａシャペロニンであってもよい。

以下のバイオマーカーの組が特に有用であることを確認した：
ａ）ＳＡＡ１およびＲＥＴＮ；
ｂ）ＳＡＡ１、ＲＥＴＮ、およびＬＩＬＲＢ４；
ｃ）ＳＡＡ１、ＲＥＴＮ、およびＩＬ１８ＢＰ；
ｄ）ＳＡＡ１、ＲＥＴＮ、ＩＬ１８ＢＰ、およびＬＩＬＲＢ４；
ｅ）ＳＡＡ１、ＲＥＴＮ、ＩＬ１８ＢＰ、およびＩＧＫＶ１．１７；
ｆ）ＳＡＡ１、ＲＥＴＮ、ＩＬ１８ＢＰ、ＬＩＬＲＢ４、およびＳＥＲＰＩＮＡ３；
ｇ）ＳＡＡ１、ＲＥＴＮ、ＩＬ１８ＢＰ、ＬＩＬＲＢ４、ＳＥＲＰＩＮＡ３、およびＣＤ５９；
ｈ）ＳＡＡ１、ＲＥＴＮ、ＬＩＬＲＢ４、ＩＬ１８ＢＰ、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ならびに、ＣＤ５９、ＲＢＰ４、ＩＧＬＶ３．２１、ＣＡＤＭ１、およびＣＦＨＲ２のうち任意の２種；
ｉ）ＳＡＡ１およびＲＢＰ４；
ｊ）ＳＡＡ１、ＲＢＰ４、およびＳＡＡ２；
ｋ）ＳＡＡ１、ＲＢＰ４、およびＣＲＰ；
ｌ）ＳＡＡ１、ＲＢＰ４、ＳＡＡ２、ＴＳＰ４；
ｍ）ＳＡＡ１、ＲＢＰ４、ＳＡＡ２、ＴＳＰ４、およびＣＲＰ、Ａ８ＭＵＥ１、ＲＥＴＮのうち１種以上；
ｎ）ＳＡＡ１、ＲＢＰ４、ＳＡＡ２、ＴＳＰ４、およびＣＲＰ；
ｏ）ＳＡＡ１、ＲＢＰ４、ＳＡＡ２、ＴＳＰ４、およびＡ８ＭＵＥ１；
ｐ）ＳＡＡ１、ＲＢＰ４、ＳＡＡ２、ＴＳＰ４、およびＲＥＴＮ；
ｑ）ＳＡＡ１、ＲＢＰ４、ＳＡＡ２、ＣＲＰ；
ｒ）ＳＡＡ１、ＲＢＰ４、ＳＡＡ２、ＣＲＰ、およびＡＸＡ８１；
ｓ）ＳＡＡ１、ＲＢＰ４、ＳＡＡ２、ＣＲＰ、およびＴＳＰ４；
ｔ）ＳＡＡ１、ＲＢＰ４、ＳＡＡ２、ＣＲＰ、ＡＸＡ８１、およびＴＳＰ４；
ｕ）ＳＡＡ１、ＲＢＰ４、ＳＡＡ２、ＣＲＰ、ＡＸＡ８１、ＴＳＰ４、およびＡ８ＭＵＥ１；
ｖ）ＳＡＡ１、ＲＢＰ４、ＨｔｐＧ、およびＰＥ＿ＰＧＲＳ２８；
ｗ）ＳＡＡ１、ＲＢＰ４、ＨｔｐＧ、ＰＥ＿ＰＧＲＳ２８、およびＥＦＴＵ＿ＭＹＣＴＵ；
ｘ）ＳＡＡ１、ＲＢＰ４、ＨｔｐＧ、ＰＥ＿ＰＧＲＳ２８、および１０ｋＤａシャペロニン；
ｙ）ＳＡＡ１、ＲＢＰ４、ＨｔｐＧ、ＰＥ＿ＰＧＲＳ２８、ＥＦＴＵ＿ＭＹＣＴＵ、および１０ｋＤａシャペロニン。

当該方法は、とりわけ、結核性胸膜炎、結核性髄膜炎、尿路性器結核、粟粒結核、ならびに、骨および関節における結核などの、肺ＴＢおよび肺外ＴＢの両方の診断を行なうために使用できる。

ＴＢ処置は、活動性ＴＢを有することが確認された対象に投与できる。
本明細書中において使用される場合、「備える」、「備えている」、「含む」、「含んでいる」、「含有する」、「含有している」などの用語、およびこれらの任意の変形体は、非排他的な包含をカバーすることを意図しており、具体的には言及されていないその他の要素を排除しない。

用語「マーカー」および「バイオマーカー」は区別なく使用されて、個体における正常もしくは異常なプロセスまたは個体における疾患もしくはその他の状態を示す（またはその徴候である）標的分子を指す。より具体的には、「マーカー」または「バイオマーカー」は、特定の生理学的状態またはプロセス（正常または異常のいずれも）の存在に関連する解剖学的、生理学的、生化学的、または分子的パラメータである。バイオマーカーは、小分子、ペプチド、タンパク質、および核酸を含み得る。

「バイオマーカー値」、「値」、「バイオマーカーレベル」、および「レベル」は区別なく使用されて、生体サンプル中のバイオマーカーを検出するための任意の分析方法を使用して得られる測定値であって、かつ、当該生体サンプル中の当該バイオマーカーの（またはこれについての、またはこれに対応する）存在、非存在、絶対的な量もしくは濃度、相対的な量もしくは濃度、力価、レベル、発現レベル、または測定レベル比などを示すものを指す。この「値」または「レベル」の厳密な性質は、当該バイオマーカーの検出に使用した具体的な分析方法の具体的な設計および構成要素に依存する。

バイオマーカーは、一般的には、個体における正常なプロセスを示すまたは疾患もしくはその他の状態の欠如を示す（またはその徴候である）当該バイオマーカーの発現レベルまたは値との比較において、過剰発現している、過少発現している、または差次的発現している、というように記載される。したがって、あるバイオマーカーの「過剰発現」、「過少発現」、および「差次的発現」は、当該バイオマーカーの「正常」または「コントロール」発現レベルからの変動ともいえる。

一実施形態において、バイオマーカーのサブセットまたは組（ｐａｎｅｌ）とするのに有用なバイオマーカーの数は、その特定のバイオマーカー値の組み合わせがもつ感度および特異度の値に基づく。「感度」および「特異度」という用語は、本明細書中において、生体サンプル中で検出されるバイオマーカー値に基づいて個体のＴＢ診断を正確に分類する能力に関して使用される。「感度」は、陽性ＴＢ診断（すなわち疾患のエビデンス（ＥＶＤ））を有する個体の正確な分類に関するバイオマーカーの性能を示す。「特異度」は、陰性ＴＢ診断（ＮＥＤ）を有する個体の正確な分類に関するバイオマーカーの性能を示す。たとえば、コントロールサンプルとＴＢ診断サンプルとの１セットを試験するのに使用される一組のマーカーについて、特異度８５％および感度９０％であるということは、コントロールサンプルのうち８５％が当該一組によってＮＥＤサンプルとして正確に分類され、陽性サンプルのうち９０％が当該一組によってＥＶＤサンプルとして正確に分類されたことを示す。

以下にさらに詳細に記載される通り、ＴＢ陽性／ＨＩＶ陰性群、ＴＢ陽性／ＨＩＶ陽性群、ＴＢ陰性／ＨＩＶ陽性群、およびＴＢ陰性／ＨＩＶ陰性群に臨床的に階層化された１２０人の尿プロテオームを調べるために、非標識プロテオミクスアプローチを採用した。当該１２０人に共通する尿プロテオームは、マイコバクテリウム由来の２６種を含む１８７０種のタンパク質を含んでいた。予期されたとおり、尿中のタンパク質のセットは個体間で大幅に異なっているようである。

活動性ＴＢ患者の尿中で差次的に発現していてＴＢ診断を行なうのに好適なマイコバクテリウム・ツベルクローシス特異的タンパク質とヒトタンパク質とのセットを特定した。これらのセットは、表２の遺伝子識別子、タンパク質、および／またはペプチド、ならびに、Ｍ．ツベルクローシス桿菌またはヒトのいずれかにおけるそれらの下流機能を包含する。とりわけ、これらのバイオマーカー組の特定を、ＨＩＶ陰性個体およびＨＩＶ陽性個体の両方の尿中にて行なった。本出願人の知る限りでは、これらのバイオマーカー組は、ＴＢが疑われる患者の尿中では報告されていない。また、これらの組を構成する個々のタンパク質についての知識から、または、ＴＢ患者の他の体液中に見られるタンパク質についての知識からは、到達できないと考える、というのは、多くのタンパク質は尿中に現れる前に著しく分解されるためである。

表２のバイオマーカーの大集団から、ＴＢ診断のために、２種のヒト由来タンパク質からなる中核的なセットを特定した（ＳＡＡ１およびＲＥＴＮ、ＳＡＡ１およびＲＢＰ４）。任意に、表２中に列記されるものなどの、その他のヒト由来タンパク質を、これら２種のタンパク質に加えて、バイオシグネチャの順列を創出できる。

また、高い感度および特異度を有する３、４、５、６、および７種の宿主由来タンパク質からなる組も特定した。

これらのタンパク質は、ＴＢ陽性個体の尿中においては信頼性をもって検出されるが、ＴＢ陰性個体においてはそうではないようである。尿中の宿主由来バイオマーカーシグネチャは、個々の尿サンプル間でのばらつきが大きく、とりわけ、特定した上位のバイオマーカーのうちいくつかが急性期炎症反応タンパク質であるために、信頼できないと考えられるが、しかしながら、このコホートにおいては、これらのタンパク質が尿中に存在するかしないかによってＴＢ陽性／ＴＢ陰性がほぼ完全に説明された。総合すると、これらの提案されたバイオマーカーのセットの組み合わせは、その他の炎症性または非ＴＢの呼吸器疾患と区別してＴＢを診断するための特異度に寄与している可能性がある。

また、表１中の１種以上のマイコバクテリウムタンパク質を加えることによって、尿中に特異的に見いだされるヒト宿主特異的バイオマーカーおよびＭ．ツベルクローシス特異的バイオマーカーの両方を含む組み合わせ型の多次元バイオシグネチャを創出することもできる。マイコバクテリウム・ツベルクローシス由来およびヒト由来のタンパク質および／またはペプチドであるバイオマーカーを選択することによって、活動性結核の包含（陽性予測試験値（ＰＰＶ）＞０．８）および除外（陰性予測試験値（ＮＰＶ）＞０．８）の両方が可能となる。

一実施形態において、試験したバイオマーカーのうち２、３、４種またはそれ以上が検出された場合に、または、検出されたバイオマーカーのレベルが、ＴＢを有さない対象における同バイオマーカーの典型的なレベルよりも高い場合に、ＴＢ陽性と診断できる。

カットオフまたは閾値は、活動性ＴＢを有するまたは有さない対象において典型的に見られるバイオマーカーのレベルに基づいて決めることができ、対象が活動性ＴＢを有しているか否かを判断する際に、当該サンプル中で検出されるバイオマーカーの測定レベルを、当該カットオフレベルと比較することができる。言い換えると、この方法は、活動性ＴＢを有さない対象を基準として、当該組中のバイオマーカーが過少発現しているかまたは過剰発現しているかを検出できる。

一実施形態において、尿サンプルをアッセイすることによって、目的のバイオマーカーの存在を検出し、かつ、各バイオマーカーについてのバイオマーカー値を求める（典型的には、マーカーＲＦＵ（相対蛍光単位）として測定する）。バイオマーカーを検出してバイオマーカー値を割り当てたら、当技術分野において周知される様々な方法によって各マーカーをスコア化または分類する。次いで、マーカースコアを合計することにより、当該個体が疾患のエビデンスを有するか否かを反映する合計評価スコアを提供する。

バイオマーカーレベルを比較、スコア化、および／または分類するためのソフトウェアを備えるコンピュータを使用して、対象がＴＢを有するか否かを診断することができる。

いくつかの実施形態において、捕獲剤を使用してバイオマーカーの各々に特異的に結合させ、捕獲剤とバイオマーカーの各々との結合が生じた際に、指標がそれを示すことができる。捕獲剤は、典型的には抗体であるが、その他の可能な捕獲剤の例は、アフィボディ（ａｆｆｙｂｏｄｉｅｓ）、アンキリンリピートタンパク質、アルマジロリピートタンパク質、核酸アプタマー、ペプチド、炭化水素配位子、合成配位子、および合成ポリマーを含む。

「抗体」という用語は、任意の抗体産生哺乳類（たとえば、マウス、ラット、ウサギ、およびヒトを含む霊長類）に由来し、目的とするポリペプチド標的に特異的に結合する抗体およびその抗体断片を含む。抗体の例は、ポリクローナル、モノクローナル、および組換え抗体；多重特異性抗体（たとえば、二重特異性抗体）；ヒト化抗体；マウス抗体；キメラ、マウス－ヒト、マウス－霊長類、霊長類－ヒトモノクローナル抗体；ならびに、抗イディオタイプ抗体を含み、かつ、任意の完全な分子またはその断片であってよい。抗体断片は、全長抗体に由来またはこれに関連し、好ましくはその抗原結合または可変領域を含む、部分である。

指標は、熱量測定用、電気化学的、発色性、光学性、蛍光性、または放射標識性の指標などであってよい。

一実施形態において、尿サンプルを、固相支持体または担体と接触させることができる。「固体担体」は、本明細書中において、分子が直接または間接的に共有結合または非共有結合により付着できる表面を有する任意の基材を指す。「固体担体」は様々な物理的様式を有し得て、これには、たとえば、メンブレン；チップ（たとえばプロテインチップ）；スライド（たとえば、スライドグラスまたはカバースリップ）；カラム；たとえばビーズなどの、中空状、固体状、半固体状の、孔または空洞を有する粒子；ゲル；光ファイバー材料を含む繊維；マトリックス；およびサンプル収容部が含まれ得る。サンプル収容部の例は、サンプルウェル、チューブ、毛細管、バイアル、およびサンプルを保持できるその他の任意の容器、溝、またはくぼみを含む。サンプル収容部は、マイクロタイタープレート、スライド、およびマイクロ流体デバイスなどのマルチサンプルプラットフォーム上に含まれ得る。支持体は、天然または合成の材料、有機物または無機物から構成され得る。捕獲試薬を付着させる固体担体の組成は、一般的に、付着方法（たとえば、共有結合）に依存する。収容部のその他の例は、微小滴およびマイクロ流体制御またはバルク油性／水性エマルション（その内部でアッセイおよび関連操作を実施できるもの）を含む。好適な固体担体は、たとえば、プラスチック、樹脂、多糖、シリカまたはシリカに基づく材料、機能化ガラス、変性シリコーン、炭素、金属、無機ガラス、メンブレン、ナイロン、天然繊維（たとえば、シルク、ウール、およびコットンなど）、およびポリマーなどを含む。固体担体を構成する材料は、たとえばカルボキシ、アミノ、またはヒドロキシル基などの反応性基を含み得て、これらが捕獲試薬の付着に使用される。ポリマーの固体担体は、たとえば、ポリスチレン、ポリエチレングリコールテトラフタレート、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリビニルピロリドン、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリル酸メチル、ポリテトラフルオロエチレン、ブチルゴム、スチレンブタジエンゴム、天然ゴム、ポリエチレン、ポリプロピレン、（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）フッ化ビニリデン、ポリカーボネート、およびポリメチルペンテンを含み得る。使用できる好適な固体担体粒子は、たとえば、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）型のコード化された粒子などのコード化された粒子、磁性粒子、およびガラス粒子を含む。

バイオシグネチャは、光学式、ＳＥＲＳ、蛍光性、電気化学的、熱的、比色、またはその他の検出プラットフォームを含み得る好適なイムノアッセイ検出プラットフォーム上において使用できる。特に、ＥＬＩＳＡ様式および／またはラテラルフロー様式での多重定量のために当該バイオシグネチャのバイオマーカーを表面上に捕獲できる抗体を創出できる。次いで、これらを使用して、ＴＢ疾患のためのポイントオブケア診断試験を開発できる。

また、本発明を実施するためのキットも提供できる。
市販されている他の方法とは異なり、本方法では、活動性結核と潜在性結核とを区別でき、このことは、対象のための処置を決定するために重要である。活動性結核は、生体の体液もしくは組織がスメア顕微鏡法もしくは培養によりＭ．ツベルクローシス陽性であるような、または、活動性ＴＢ疾患の臨床的および放射線学的特徴を有する対象における核酸増幅試験によりＭ．ツベルクローシスを検出可能であるような、疾患状態であり、多くの場合には、体質的な症状がある。潜在性結核感染では、生存できる可能性のあるＭ．ツベルクローシスがヒト組織中に存在するが、その個体は無症候性であり、活動性疾患の臨床放射線学的特徴を有さない。

以下に、下記の非限定的な例を用いて、本発明がより詳細に記載される。
実施例１：
材料および方法
コホート募集および臨床分類
南アフリカ国の西ケープにある複数のＴＢクリニックにおいて、患者を募集した。胸部Ｘ線、培養／スメア、ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ、およびＬＡＭ検査の結果に応じて、患者を４つの臨床群に分類した（ＴＢ陽性／ＨＩＶ陽性、ＴＢ陽性／ＨＩＶ陰性、ＴＢ陰性／ＨＩＶ陽性、およびＴＢ陰性／ＨＩＶ陰性）。初回通過尿サンプルを途中で採取して、処理するまで－２０℃において保管した。最初にサンプルを匿名にし、無作為に１２個のバッチに分けて処理した。

タンパク質沈殿
尿サンプルを室温で解凍し、ボルテックスにかけて、沈殿物があればそれを均質化した。４ｍｌのアリコートをガラスバイアル中に移し、メタノールおよびクロロホルムを１：０．７５の比率で加えてタンパク質を沈殿させた。４０００ｒｐｍで２分間遠心分離することによって、沈殿を複数の相に分け、上相を慎重に除去した。残りのタンパク質沈殿を１倍体積のメタノールで洗浄し、４０００ｒｐｍで２分間遠心分離することによってペレット状に沈殿させた。上清を除去し、ペレットをドラフト中で１時間かけて乾燥させた。次いで、ボルテックスしながら、２００μｌの変性バッファー（１０ｍＭのｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）中の６Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素）中にペレットを再懸濁し、次いでサンプルをエッペンドルフチューブに移して、使用するまで－２０℃において保管した。

溶液中でのトリプシン消化
改変されたブラッドフォード法（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、０．１ＭのＨＣｌを９０μｌ添加して、タンパク質サンプルを定量した。各サンプルの１００μｇのアリコートを、新しいエッペンドルフチューブ中に移した。サンプルを、１ｍＭのＤＴＴ（ジチオトレイトール）で１時間かけて室温で還元し、５．５ｍＭのヨードアセトアミドで２０分間かけて室温でアルキル化し、次いで５０ｍＭの重炭酸アンモニウムで５倍希釈した。各サンプルにトリプシン（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を比率５０：１で添加して、サンプルを室温で一晩、１６時間かけてインキュベートした。０．１％ギ酸（ＦＡ）を添加して、トリプシン消化を停止した。

Ｃ１８ ｓｔａｇｅ ｔｉｐによる脱塩
トリプシン処理したペプチドを、研究室で作製したＣ１８ ｓｔａｇｅ ｔｉｐで脱塩した。まず、Ｃ１８の栓を、溶媒Ｂ（６０％アセトニトリル（ＡＣＮ）、０．１％ ＦＡ）で活性化し、次いで溶媒Ａ（２％ ＡＣＮ、０．１％ ＦＡ）で平衡とした。各サンプルについて、低速で遠心分離することによってペプチド１０μｇをＣ１８に結合させ、次いで溶媒Ａで３回洗浄した。エッペンドルフチューブ中にガラスのインサートを入れ、このガラスインサートの中に、脱塩後のペプチドを、４０μｌの溶媒Ｃ（８０％ ＡＣＮ、０．１％ ＦＡ）を用いて３回溶出させた。次いで、ペプチドを真空遠心分離機で３５℃において１時間乾燥させ、使用するまで－２０℃において保管した。

液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）
ペプチドサンプルを溶媒Ａ中で再構成して、最終濃度２００ｎｇ／μｌとした。サンプルを、複数の無作為のバッチで、Ｄｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００オートサンプラーに入れた。各サンプルにつき計４００ｎｇを、研究室にて充填した４ｃｍ Ｌｕｎａ Ｃ１８ ５μｍ トラップカラムに載せた（流速５μｌ／分）。次いで、弁を切り換えて、トラップカラムと、研究室にて充填した４０ｃｍ Ａｅｒｉｓ ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃ１８ ３．６μｍ分析カラム（ＩＤ ７５μｍ）とが直線状になるようにした。移動相の勾配は、Ｂ（０．１％ ＦＡを含むＡＣＮ）を６～３５％とした（１９０分、０．４μｌ／分、４０℃）。被検物質をＴｈｅｒｍｏ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅハイブリッド四重極Ｏｒｂｉｔｒａｐ機器中に直接溶出させ、これにより、最高の１０モードにてＭＳスキャンおよびＭＳ／ＭＳスキャンを得た。ＭＳスキャンは、分解能７００００で、ＡＧＣのターゲット値３ｅ６または注入時間２５０ｍｓで得た。ＭＳ／ＭＳスキャンは、分解能１７５００で、ＡＧＣのターゲット値５ｅ４または注入時間８０ｍｓで得た。動的除外ウィンドウは３０秒、標準化した衝突エネルギーは２８であった。

データ処理
データ分析を、ＭａｘＱｕａｎｔのバージョン１．５．３．１２を使用して、ランとランの間にマッチを行ない、ｉＢＡＱおよびＬＦＱをオンにして実施した。使用したデータベースは、２０１６年８月にＵｎｉｐｒｏｔからダウンロードしたもので、ホモ・サピエンスとマイコバクテリウム・ツベルクローシスＨ３７Ｒｖとを組み合わせたデータベースであった。研究室で作製したＱＣパイプラインを使用してＲでＭａｘＱｕａｎｔの出力フォルダ「．ｔｘｔ」を分析し、ランの品質を評価した。データからコンタミネーションおよびリバースヒットを除去した。ＭａｘＱｕａｎｔ分析の終了後、各サンプルについて臨床階層化を明らかにして、サンプルを非盲検化して統計分析に供した。

統計分析
ＭａｘＱｕａｎｔ ｉＢＡＱデータの下流分析を、Ｒで、Ｒパッケージｃａｒｅｔ（Kuhn (2008), “Building Predictive Models in R Using the caret” www.jstatsoft.org/article/view/v028i05/v28i05.pdf）およびランダムフォレスト（Svetnik, V., Liaw, A., Tong, C. and Wang, T., “Application of Breiman's Random Forest to Modeling Structure-Activity Relationships of Pharmaceutical Molecules”, MCS 2004, Roli, F. and Windeatt, T. (Eds.) pp. 334-343）を使用して実施した。データセットを無作為に分割して（臨床群に関係なく）、２／３をトレーニングセット（Ｎ＝７９、ＴＢ陽性が４１、ＴＢ陰性が３８）、１／３をテストセット（Ｎ＝３９、ＴＢ陰性が２０、ＴＢ陽性が１９）とした。トレーニングセットに対して、繰り返しの１０分割交差検証により、ランダムフォレストを実施した。次に、トレーニングセットに対する再分析を、影響の大きい方から上位４つの特徴だけを使用して実施した（１０分割交差検証に基づく；予測誤差を最小限（９％以下）とするためには４つの特徴で十分だと考えられる）。最後に、ランダムフォレスト（ＲＦ）分類の予測値を、上記の上位４つの予測特徴を用いてホールドアウトテストデータセット（Ｎ＝３９）において評価した。

ＲパッケージｅｄｇｅＲ（Robinson MD, McCarthy DJ and Smyth GK (2010)。ｅｄｇｅＲはデジタル式遺伝子発現データを差次的発現分析するためのＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒのパッケージ。Bioinformatics 26, 139-140）を使用して、差次的存在量試験を、ｌｏｇ２変換したｉＢＡＱ値について実施した（最初にゼロ値を１に設定）。まず、未加工のｉＢＡＱデータを存在量でフィルタリングして、５％未満のサンプルにだけ存在するタンパク質を外し、ここでは、ＦＤＲ≦０．０５および倍数変化≧１．５を有意とみなした（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ補正）。

Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａのバージョン１３．３を使用して、さらなる統計分析を実施した。

結果
合計１８７０種のタンパク質の群をＦＤＲ＜１％にて確たる自信をもって特定し、２６種がマイコバクテリウム由来、残りはヒト由来であった。各サンプル中における個々のマイコバクテリウムペプチドの頻度は低く、個々のマイコバクテリウムペプチドのほとんどはサンプルの１０％未満でしか特定されなかった。しかしながら、ヒトタンパク質およびマイコバクテリウムタンパク質はいずれも、普通は複数の固有のペプチドによって特定され、１６７２種のタンパク質は、２つまたはそれ以上の固有のペプチドによって特定された。

ＴＢ陽性個体およびＴＢ陰性個体の間で有意に差次的に存在するタンパク質を特定するために、ｉＢＡＱ値に対して差次的存在量試験を行なった（図１および図３）。差次的に存在するタンパク質が１０２種あった（ＦＤＲ≦５％、倍数変化≧１．５）。これらのタンパク質について、Ｓｔｒｉｎｇ ＤＢを使用した機能的エンリッチメント解析を行なって、エンリッチされたＧＯｔｅｒｍおよびパスウェイを特定した。

ＴＢステータスについての上位予測因子の重要性ランクを、精度の平均低下によって判断した（特徴を除去した場合の低下が大きいほど予測力が大きいことを示す）（図２および図４）。上位７種のヒトバイオマーカーは、ＳＡＡ１、ＲＢＰ４、ＳＡＡ２、Ａ８ＭＵＥ１、ＴＳＰ４、ＣＲＰ、およびＲＥＴＮであった。これらの７種のバイオマーカーのランダムフォレスト分析を、１０分割倍交差検証にて、トレーニングセット（ＴＢ陰性サンプルおよびＴＢ陽性サンプルがそれぞれ４１および３８）に対して行なった結果、精度は９４％であった（感度＝８９％、特異度＝９９％、陽性予測値（ＰＰＶ）＝９７％、陰性予測値（ＮＰＶ）＝９１％）（表３）。

バイオマーカーの段階的減少に関連する交差検証エラー率から、エラー率９％以下でＴＢステータスを予測するためには４種のバイオマーカーで十分であることが明らかになった。これらの上位４種のバイオマーカー、すなわち、ＳＡＡ１、ＲＰＢ４、ＳＡＡ２、およびＴＳＰ４について、無作為に選択した検証セット（ＴＢ陽性サンプルおよびＴＢ陰性サンプルがそれぞれ１９および２０）を使用して再度試験した結果、精度は９２％、ＰＰＶは１００％、ＮＰＶは８７％、感度は８４％、特異度は１００％であった（表４）。

また、２種のヒト宿主特異的バイオマーカー（ＳＡＡ１およびＲＢＰ４）、ならびにＳＡＡ１、ＲＢＰ４、および２～４種のＭ．ツベルクローシスバイオマーカーを含む組み合わせ型の多次元バイオシグネチャを、ＴＢの包含および除外について評価し、これらをＳＡＡ１のみのバイオシグネチャと比較した（図５および図６）。バイオシグネチャは以下の通りであった：
ＳＡＡ１、ＲＢＰ４、ＨｔｐＧ、ＰＥ＿ＰＧＲＳ２８、１０ｋＤａシャペロニン、ＥＦＴＵ＿ＭＹＣＴＵ；
ＳＡＡ１、ＲＢＰ４、ＨｔｐＧ、ＰＥ＿ＰＧＲＳ２８；および
ＳＡＡ１、ＲＢＰ４。

これらのバイオシグネチャについてのランダムフォレスト分析の結果が、表５中に示される。

ＢＭ、バイオマーカー；ＵＢＭ、尿バイオマーカー；ＡＵＣ、曲線下面積；ＢＥＲ、ｂａｌａｎｃｅｄ ｅｒｒｏｒ ｒａｔｅ；Ｓｅｎｓ．、感度；Ｓｐｅｃ．、特異度；ＰＰＶ、陽性予測値；ＮＰＶ、陰性予測値；ＳＡＡ－１、血清アミロイドＡ；ＲＢＰ－４、レチノール結合タンパク質４。

実施例２：
材料および方法
臨床分類法
上記のコホート（Ｎ＝１１８）を、ＴＢステータスに従って、ＴＢ陽性（ｎ＝５７）およびＴＢ陰性（ｎ＝６１）という２つの大きな群に分類した。

データ処理
上述されるように生成したＬＣ－ＭＳデータの分析を、ＭａｘＱｕａｎｔのバージョン１．６．１４．０を使用して、ランとランの間にマッチを行ない、ｉＢＡＱおよびＬＦＱをオンにして実施した。未加工データの分析に使用したデータベースは、２０１９年１１月にＵｎｉｐｒｏｔからダウンロードしたもので、ホモ・サピエンスとマイコバクテリウム・ツベルクローシスＨ３７Ｒｖとを組み合わせたデータベースで、７４０５３個のヒト配列と３９９９個のＭ．ツベルクローシス配列とを含むものであった。研究室で作製したＱＣパイプラインを使用してＲでＭａｘＱｕａｎｔの出力フォルダ「．ｔｘｔ」を分析し、ランの品質を評価した。データからコンタミネーションおよびリバースヒットを除去した。

統計分析
個々のバイオマーカーについてのｉＢａｑ値に対する統計検定を、上述されるランダムフォレスト分析と差次的存在量分析とを使用して、図２中に示される以下の２４種のヒトバイオマーカー候補に焦点を当てて行なった。

結果
ｉＢＡＱ値に対して差次的存在量試験を行なって、ＴＢ陽性個体およびＴＢ陰性個体の間で有意に差次的に存在する２４種のバイオマーカー候補のセット中のタンパク質を特定した（図７）。

ＴＢステータスについての上位予測因子の重要性ランクを、２４種のバイオマーカー候補のセット中において、精度の平均低下によって判断した（特徴を除去した場合の低下が大きいほど予測力が大きいことを示す）（図８）。上位２種のヒトバイオマーカーはＳＡＡ１およびＲＥＴＮであり、上位３種のヒトバイオマーカーはＳＡＡ１およびＲＥＴＮとＬＩＬＲＢ４またはＩＬ１８ＢＰのいずれかとの組み合わせであり、上位４種のヒトバイオマーカーはＳＡＡ１、ＲＥＴＮ、ＬＩＬＲＢ４、およびＩＬ１８ＢＰであった。

トレーニングセットの分析
２種のバイオマーカーからなる組（ＳＡＡ１およびＲＥＴＮ）のランダムフォレスト分析を、１０分割交差検証にて、トレーニングセット（ＴＢ陽性サンプルおよびＴＢ陰性サンプルがそれぞれ３８および４１）に対して行なった結果、感度＝８９％、特異度＝９１％、陽性予測値（ＰＰＶ）＝９０％、陰性予測値（ＮＰＶ）＝９０％であった。

３種のバイオマーカーからなる組（ＳＡＡ１、ＲＥＴＮ、およびＬＩＬＲＢ４）のランダムフォレスト分析を、１０分割交差検証にて、トレーニングセット（ＴＢ陽性サンプルおよびＴＢ陰性サンプルがそれぞれ３８および４１）に対して行なった結果、感度＝９２％、特異度＝９３％、陽性予測値（ＰＰＶ）＝９２％、陰性予測値（ＮＰＶ）＝９３％であった。

３種のバイオマーカーからなる組（ＳＡＡ１、ＲＥＴＮ、およびＩＬ１８ＢＰ）のランダムフォレスト分析を、１０分割交差検証にて、トレーニングセット（ＴＢ陽性サンプルおよびＴＢ陰性サンプルがそれぞれ３８および４１）に対して行なった結果、感度＝９７％、特異度＝９５％、陽性予測値（ＰＰＶ）＝９５％、陰性予測値（ＮＰＶ）＝９７％であった。

４種のバイオマーカーからなる組（ＳＡＡ１、ＲＥＴＮ、ＬＩＬＲＢ４、およびＩＬ１８ＢＰ）のランダムフォレスト分析を、１０分割交差検証にて、トレーニングセット（ＴＢ陽性サンプルおよびＴＢ陰性サンプルがそれぞれ３８および４１）に対して行なった結果、感度＝９７％、特異度＝９５％、陽性予測値（ＰＰＶ）＝９５％、陰性予測値（ＮＰＶ）＝９７％であった。

７種のバイオマーカーからなる組（ＳＡＡ１、ＲＥＴＮ、ＬＩＬＲＢ４、ＩＬ１８ＢＰ、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＣＤ５９、およびＣＡＤＭ１）のランダムフォレスト分析を、１０分割交差検証にて、トレーニングセット（ＴＢ陽性サンプルおよびＴＢ陰性サンプルがそれぞれ３８および４１）に対して行なった結果、感度＝８９％、特異度＝９８％、陽性予測値（ＰＰＶ）＝９６％、陰性予測値（ＮＰＶ）＝９３％であった。

７種のバイオマーカーからなる組（ＳＡＡ１、ＲＥＴＮ、ＬＩＬＲＢ４、ＩＬ１８ＢＰ、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＣＤ５９、およびＣＦＨＲ２）のランダムフォレスト分析を、１０分割交差検証にて、トレーニングセット（ＴＢ陽性サンプルおよびＴＢ陰性サンプルがそれぞれ３８および４１）に対して行なった結果、感度＝９５％、特異度＝９５％、陽性予測値（ＰＰＶ）＝９５％、陰性予測値（ＮＰＶ）＝９５％であった。

７種のバイオマーカーからなる組（ＳＡＡ１、ＲＥＴＮ、ＬＩＬＲＢ４、ＩＬ１８ＢＰ、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＩＧＬＶ３．２１、およびＲＢＰ４）のランダムフォレスト分析を、１０分割交差検証にて、トレーニングセット（ＴＢ陽性サンプルおよびＴＢ陰性サンプルがそれぞれ３８および４１）に対して行なった結果、感度＝９２％、特異度＝９８％、陽性予測値（ＰＰＶ）＝９７％、陰性予測値（ＮＰＶ）＝９３％であった。

試験セットに対する統計学的検証
次いで、これらの上位バイオマーカー組について、無作為に選択した検証セット（ＴＢ陽性サンプルおよびＴＢ陰性サンプルがそれぞれ１９および２０）を使用して再度試験した結果、表７中に示される精度（ＡＵＣ）、感度、特異度、ＰＰＶ、およびＮＰＶ値となった。

このセットの各バイオマーカーの分布および頻度を、箱ひげ図（図９）を使用してさらに分析して、特定したバイオマーカー組の有用性についてのさらなる洞察を得た。

臨床的に有用な診断組における理想的なバイオマーカーは、高い割合の症例および／またはコントロールにおいて発現されているべきであり、症例とコントロールとの明らかな区別を提供できるべきである。このデータおよび根拠と、上述されるランダムフォレスト分析（表７）および差次的存在量試験（図７）とに基づいて、ＴＢ疾患の診断にとって好ましいヒト尿バイオマーカーのセットを、ＳＡＡ１、ＲＥＴＮ、ＬＩＬＲＢ４（Ａ８ＭＵＥ１）、ＩＬ１８ＢＰ、ＳＥＲＰＩＮＡ３（ＡＡＣＴ）、ＣＤ５９（Ｅ９ＰＮＷ４）、ＲＢＰ４（Ｑ５ＶＹ３０）、ＩＧＬＶ３．２１（ＬＶ３２１）、およびＩＧＫＶ１．１７（ＫＶ１１７）を含むリストから抜き出す。

本発明の第５の実施形態によれば、上述される方法に従って、対象からの尿サンプル中において結核の診断を行なうためのキットであって、
患者からサンプルを受け取る手段と、
少なくともＳＡＡ１とＲＥＴＮおよびＲＢＰ４のいずれかまたは両方とに結合する捕獲剤と、
捕獲剤が上記バイオマーカーに結合した際にそれを示す少なくとも１つの指標とを含むキットが提供される。

Claims (16)

1. 結核疾患（ＴＢ）の診断を行なうための方法であって、対象からの尿サンプルを、ＳＡＡ１とＲＥＴＮまたはＲＢＰ４のいずれかとが存在するか否かについて試験する工程を含む、方法。
2. 前記尿サンプルを、ＳＡＡ１およびＲＥＴＮが存在するか否かについて試験する工程を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記尿サンプルを、ＬＩＬＲＢ４、ＩＬ１８ＢＰ、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＣＤ５９、ＲＢＰ４、ＩＧＬＶ３．２１、ＩＧＫＶ１．１７、Ｏ５３７６４＿ＭＹＣＴＵ（Ｒｖ０５６７）、Ｉ６Ｙ０Ｗ５＿ＭＹＣＴＵ（ｆａｄＥ１９、Ｒｖ２５００ｃ）、Ｑ７９ＦＰ１＿ＭＹＣＴＵ（ＰＥ＿ＰＧＲＳ２８、Ｒｖ１４５２ｃ）、ＨＴＰＧ＿ＭＹＣＴＵ（ｈｔｐＧ、Ｒｖ２２９９ｃ）、ＲＰＯＢ＿ＭＹＣＴＵ（ｒｐｏＢ、Ｒｖ０６６７）、ＥＦＴＵ＿ＭＹＣＴＵ（ｔｕｆ、Ｒｖ０６８５）、ＡＣＲ＿ＭＹＣＴＵ（ｈｓｐＸ、Ｒｖ２０３１ｃ）、ＣＨ６０２＿ＭＹＣＴＵ（ｇｒｏＥＬ２、Ｒｖ０４４０）、ＣＬＰＰ１＿ＭＹＣＴＵ（ｃｌｐＰ１、Ｒｖ２４６１ｃ）、および１０ｋＤａシャペロニン（Ｒｖ３４１８ｃ）からなる群より選択される１種以上のさらなるバイオマーカーが存在するか否かについて試験する工程をさらに含む、請求項１または２に記載の方法
4. 前記尿サンプルを、ＩＬ１８ＢＰが存在するか否かについて試験する工程をさらに含む、請求項２に記載の方法。
5. 前記尿サンプルを、ＬＩＬＲＢ４が存在するか否かについて試験する工程をさらに含む、請求項２または４に記載の方法。
6. 前記尿サンプルを、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＣＤ５９、ＲＢＰ４、ＩＧＬＶ３．２１、およびＩＧＫＶ１．１７からなる群より選択される１～５種のさらなるバイオマーカーが存在するか否かについて試験する工程をさらに含む、請求項２、４、または５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記尿サンプルを、ＨｔｐＧ、ＰＥ＿ＰＧＲＳ２８、ＥＦＴＵ＿ＭＹＣＴＵ、および１０ｋＤａシャペロニンからなる群より選択される１～４種のさらなるバイオマーカーが存在するか否かについて試験する工程をさらに含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記サンプルを、以下のバイオマーカー：
   ａ）ＳＡＡ１、ＲＥＴＮ、およびＬＩＬＲＢ４；
   ｂ）ＳＡＡ１、ＲＥＴＮ、およびＩＬ１８ＢＰ；
   ｃ）ＳＡＡ１、ＲＥＴＮ、ＩＬ１８ＢＰ、およびＬＩＬＲＢ４；
   ｄ）ＳＡＡ１、ＲＥＴＮ、ＩＬ１８ＢＰ、およびＩＧＫＶ１．１７；
   ｅ）ＳＡＡ１、ＲＥＴＮ、ＩＬ１８ＢＰ、ＬＩＬＲＢ４、およびＳＥＲＰＩＮＡ３；
   ｆ）ＳＡＡ１、ＲＥＴＮ、ＩＬ１８ＢＰ、ＬＩＬＲＢ４、ＳＥＲＰＩＮＡ３、およびＣＤ５９；または
   ｇ）ＳＡＡ１、ＲＥＴＮ、ＬＩＬＲＢ４、ＩＬ１８ＢＰ、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ならびに、ＣＤ５９、ＲＢＰ４、ＩＧＬＶ３．２１、ＣＡＤＭ１、およびＣＦＨＲ２のうち任意の２種
   が存在するか否かについて試験する工程を含む、請求項３～７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記尿サンプルを、ＳＡＡ１およびＲＢＰ４が存在するか否かについて試験する工程を含む、請求項１に記載の方法。
10. 前記尿サンプルを、ＳＡＡ１、ＲＢＰ４、ＨｔｐＧ、およびＰＥ＿ＰＧＲＳ２８が存在するか否かについて試験する工程を含む、請求項９に記載の方法。
11. 前記尿サンプルを、ＳＡＡ１、ＲＢＰ４、ＨｔｐＧ、ＰＥ＿ＰＧＲＳ２８、ＥＦＴＵ＿ＭＹＣＴＵ、および１０ｋＤａシャペロニンが存在するか否かについて試験する工程を含む、請求項１０に記載の方法。
12. 結核疾患（ＴＢ）を有する対象を診断および処置する方法であって、
    ａ）請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法を実施する工程と、
    ｂ）前記尿サンプル中における前記バイオマーカーの検出に基づいて前記対象がＴＢを有するか否かを判断する工程と、
    ｃ）前記対象にとって必要である場合に前記対象に有効量のＴＢ処置を投与する工程とを含む、方法。
13. 対象における結核疾患（ＴＢ）の診断を行なうための、コンピュータにより実施される方法であって、前記コンピュータは、
    ａ）前記対象からの尿サンプル中におけるＳＡＡ１とＲＥＴＮおよびＲＢＰ４のいずれかまたは両方とのレベルについての値を含む、入力された前記対象のデータを受信する工程と、
    ｂ）任意に、前記尿サンプル中における１種以上のその他のバイオマーカーのレベルについての値を含む、入力された前記対象のデータを受信する工程であって、前記その他のバイオマーカーは、ＬＩＬＲＢ４、ＩＬ１８ＢＰ、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＣＤ５９、ＲＢＰ４、ＩＧＬＶ３．２１、ＩＧＫＶ１．１７、Ｏ５３７６４＿ＭＹＣＴＵ（Ｒｖ０５６７）、Ｉ６Ｙ０Ｗ５＿ＭＹＣＴＵ（ｆａｄＥ１９、Ｒｖ２５００ｃ）、Ｑ７９ＦＰ１＿ＭＹＣＴＵ（ＰＥ＿ＰＧＲＳ２８、Ｒｖ１４５２ｃ）、ＨＴＰＧ＿ＭＹＣＴＵ（ｈｔｐＧ、Ｒｖ２２９９ｃ）、ＲＰＯＢ＿ＭＹＣＴＵ（ｒｐｏＢ、Ｒｖ０６６７）、ＥＦＴＵ＿ＭＹＣＴＵ（ｔｕｆ、Ｒｖ０６８５）、ＡＣＲ＿ＭＹＣＴＵ（ｈｓｐＸ、Ｒｖ２０３１ｃ）、ＣＨ６０２＿ＭＹＣＴＵ（ｇｒｏＥＬ２、Ｒｖ０４４０）、ＣＬＰＰ１＿ＭＹＣＴＵ（ｃｌｐＰ１、Ｒｖ２４６１ｃ）、およびＣＨ１０＿ＭＹＣＴＵ（１０ｋＤａシャペロニン、Ｒｖ３４１８ｃ）からなる群より選択される、工程と、
    ｃ）これらの値を、該当するバイオマーカーについての所定値と比較する工程と、
    ｄ）前記対象がＴＢを有するか否かを判断する工程と、
    ｅ）前記対象の診断に関する情報を表示する工程とを含む工程群を実施する、方法。
14. 請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法に従って、対象からの血液サンプル中において結核の診断を行なうためのキットであって、
    ａ）患者からサンプルを受け取る手段と、
    ｂ）少なくともＳＡＡ１とＲＥＴＮおよびＲＢＰ４のいずれかまたは両方とに結合する捕獲剤と、
    ｃ）前記捕獲剤が前記バイオマーカーに結合した際にそれを示す少なくとも１つの指標とを含む、キット。
15. ｄ）尿サンプル採取デバイス、
    ｅ）前記バイオマーカーのための捕獲剤をつけたメンブレンおよび／もしくはテストストリップ、ならびに／または
    ｆ）請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法を実施するための説明をさらに含む、請求項１４に記載のキット。
16. ｇ）ＬＩＬＲＢ４、ＩＬ１８ＢＰ、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＣＤ５９、ＲＢＰ４、ＩＧＬＶ３．２１、ＩＧＫＶ１．１７、Ｏ５３７６４＿ＭＹＣＴＵ（Ｒｖ０５６７）、Ｉ６Ｙ０Ｗ５＿ＭＹＣＴＵ（ｆａｄＥ１９、Ｒｖ２５００ｃ）、Ｑ７９ＦＰ１＿ＭＹＣＴＵ（ＰＥ＿ＰＧＲＳ２８、Ｒｖ１４５２ｃ）、ＨＴＰＧ＿ＭＹＣＴＵ（ｈｔｐＧ、Ｒｖ２２９９ｃ）、ＲＰＯＢ＿ＭＹＣＴＵ（ｒｐｏＢ、Ｒｖ０６６７）、ＥＦＴＵ＿ＭＹＣＴＵ（ｔｕｆ、Ｒｖ０６８５）、ＡＣＲ＿ＭＹＣＴＵ（ｈｓｐＸ、Ｒｖ２０３１ｃ）、ＣＨ６０２＿ＭＹＣＴＵ（ｇｒｏＥＬ２、Ｒｖ０４４０）、ＣＬＰＰ１＿ＭＹＣＴＵ（ｃｌｐＰ１、Ｒｖ２４６１ｃ）、またはＣＨ１０＿ＭＹＣＴＵ（１０ｋＤａシャペロニン、Ｒｖ３４１８ｃ）、またはこれらの任意の組み合わせに結合する捕獲剤をさらに含む、請求項１４または１５に記載のキット。

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