JP4803986B2 - サンプル中のアルブミンを低減する装置および方法 - Google Patents

Description

本出願は２００３年９月２５日に出願された特許文献１、２００３年９月２６日に出願された特許文献２、および２００３年１２月１９日に出願された特許文献３の利益を主張するものである。

本発明はアルブミン低減サンプルに向けられたものである。さらに詳細には、本発明は血清、血漿および／または血液サンプル中のアルブミン含量を低減する装置に関する。この装置は配位子を結合した不溶性担体を含む。本発明はアルブミン低減サンプルを生成する方法にも関する。本発明の方法は、アルブミンを含んだ血清、血漿および／または血液サンプルを処理し、アルブミン低減サンプルを提供するようにサンプル中のアルブミン含量を低減する方法を含んでいる。アルブミンおよび／または１種または複数種のさらなるタンパク質を低減したサンプルを提供する方法がさらに含まれ、そのような方法によって生成したタンパク質低減サンプルももちろん含まれる。

ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は血清総タンパクの５７〜７１％を構成している。ＨＳＡの低減または除去により、より低い濃度で存在している残存タンパク質の検出を高めることができる等の様々な利点が得られる。

典型的には、アルブミンは血清または血漿から２つの方法のうち１つを用いることによって除去されてきた。まず第１に、標準的なアフィニティークロマトグラフィを使用して、抗体によってアルブミンを除去してもよい。標準的なアフィニティークロマトグラフィの利点は、理論的な特異性および配位子との堅固な会合および結合であろう。欠点としては、高価で、不動化（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）の可能性があり、またそれ故に二次相互作用を通してさらなるタンパク質が低減する可能性もあることである。第２の方法はＳｅｐｈａｄｅｘなどの典型的なカラムマトリックスに結合されたチバクロンブルー（Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ）を用いることを含む。例えば、いわゆる、「膨潤ゲル」（”ｓｗｅｌｌ−ｇｅｌ”）カラムがチバクロンブルーの結合に基づいたアルブミン低減用に現在販売されている。この方法はアルブミンの結合がより弱く、他のタンパク質もまた色素に結合する、すなわち特異性が欠如しているという点で不利である。チバクロンブルーの結合については、非特許文献１および非特許文献２にさらに詳細に記載されている。

より特異的に担体にＨＳＡを結合させ、それによって血清中のアルブミン含量を低減するという試みがなされてきた。例えば、ヒト血清アルブミンを結合させるための抗体配位子を用いた方法が記載されている。この配位子は装置の能力が非常に低いという点で不利である。

米国特許仮出願第６０／５０６，６３４号明細書 米国特許仮出願第６０／５０６，５７９号明細書 米国特許仮出願第６０／５３１、３７７号明細書 Ｓ．Ｔ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，"Ｂｌｕｅ Ｄｅｘｔｒａｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ：Ａｎ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｏｌｕｍｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｆｏｌｄ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，"Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７２：６６９−６７２（１９７５） Ｊ．Ｔｒａｖｉｓ，ｅｔ ａｌ．，"Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｂｍｉｎ ｆｒｏｍ Ｗｈｏｌｅ Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｓｍａ ａｎｄ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｂｍｉｎ−Ｄｅｐｌｅｔｅｄ Ｐｌａｓｍａ，"Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１５７：３０１−３０６（１９７６）

したがって、血液、血清および／または血漿サンプルからアルブミンを低減させる効果的な方法が当技術分野で必要とされている。

ブロモスルホフタレイン（ＢＳＰ）または他の適切な配位子などの優先的にアルブミンを結合することができる配位子を不溶性担体に結合させ、アルブミンを含むサンプルをその担体上に通過させることによって、他の知られている方法によるよりもより高い特異性およびより低い非アルブミンタンパク質に対する非特異的結合性を持って、ＨＳＡのようなアルブミンが血液、血清、および／または血漿サンプルから分離され得ることが見出された。

本発明は血清、血漿および／または血液サンプル中のアルブミン含量を低減する装置および方法に向けられたものである。本発明の装置は、例えば、ＢＳＰ配位子などの優先的にアルブミンを結合することができる配位子のような適切な配位子を結合した不溶性担体を含んでいる。本発明に従ってアルブミン低減サンプルを生成する方法は、サンプルを提供するステップ、優先的にアルブミンを結合することができる配位子が結合した不溶性担体上にサンプルを通過させるステップ、およびその配位子にアルブミンを結合しアルブミン低減サンプルを提供できるようにするステップを含む。本発明の方法は、アルブミンおよび／または１種もしくは複数種のさらなるタンパク質が低減したタンパク質低減サンプルのを提供する方法をさらに含んでよく、そのような方法によって生成されたタンパク質低減サンプルももちろん含んでもよい。

また、本発明者は不溶性担体にそのような配位子を結合させる有利な方法も発見した。これらの方法は、例えば、優先的にアルブミンを結合することのできる配位子をエポキシ活性化セファロースビーズにアルカリ性条件下で接触させることを含み、該方法において配位子から水素が除去され、アニオンがエポキシと反応することができる。したがって本発明の別の特徴は、血清、血漿および／または血液サンプル中のアルブミン含量を低減する装置を作製する方法であり、該方法は優先的にアルブミンを結合することのできる配位子をセファロースビーズなどの担体に結合させることを含む。さらに本発明の種々の構成要素を含むキットが提供され、そのようなキットは優先的にアルブミンを結合することのできる配位子が結合した不溶性担体を含んでいる。

スピンカラム、スピンカラムを含むキット、および本発明のスピンカラムを用いてアルブミン低減サンプルを生成する方法もまた提供される。

本発明は多数の異なる形態の実施形態によって達成されるが、本願明細書の開示は本発明の原理の例示として解釈されるべきであり、説明および記載した実施形態に本発明を制限することを意図したものでないという理解の下に、本願明細書において本発明の実施形態を詳細に記載する。当業者は本発明の精神から逸脱することなく多数の変形を行ってよい。

本発明は血清、血漿および／または血液サンプル中のＨＳＡのようなアルブミンの含量を低減する装置に関する。ＨＳＡに加えて、ウシ、イヌ、ヤギ、マウス、ウサギ、およびラット（もっとも、これらに限定はしない）のような他の哺乳動物からのサンプルのアルブミンを低減することも意図されている。本発明は血清、血漿および／または血液サンプル中のアルブミン含量を低減する方法にも関する。本発明は本発明の方法によって生成されたアルブミン低減サンプルにも向けられている。本発明の別の特徴は血清、血漿および／または血液サンプル中のＨＳＡ含量を低減する装置を作製する方法に関する。さらに、本発明は血清、血漿および／または血液サンプル中のＨＳＡ含量を低減するキットに関し、このキットは不溶性担体および優先的にアルブミンを結合することのできる配位子を含んでいる。さらに、本発明はスピンカラム、スピンカラムおよび／またはその構成要素を含んだキット、スピンカラムを用いてアルブミン低減サンプルを生成する方法が含まれる。

サンプル中のアルブミン含量を低減する装置
本発明の装置は配位子が結合した不溶性担体を有している。該不溶性担体をカラム、ボトル、皿、フィルタプレート、プレートインサート（ｐｌａｔｅ ｉｎｓｅｒｔ）等の容器内に有し、および／または該不溶性担体が該容器によって担持されていてもよい。この配位子は直接的あるいは間接的に［例えば、種々の長さおよび組成のリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を用いて］不溶性担体に結合されていてよい。

本発明に使用する配位子は、特定のタンパク質に結合することを可能にする化学的性質を有する１種または複数種の配位子、すなわち、優先的にアルブミンを結合することのできる配位子のような、タンパク質が該配位子に対する親和性を有する１種または複数種の配位子を含んでよい。特に、ＢＳＰ、またはその塩あるいはエステルなどの配位子が使用されてよい。ＢＳＰは以下の構造を有している：

本発明に従ってその他の配位子を用いてよい。例えば、他の適切な配位子としては、アルブミンおよび／または他のタンパク質が、該配位子に対して高い結合親和性を有するワーファリン（Ｗａｒｆａｒｉｎ）などの配位子を含んでよい。本発明による別の配位子はチバクロンブルーを含む。アルブミンに堅固に結合しうるその他の配位子の例には、酸性および／または親油性の配位子が含まれる。この適切なさらなる配位子のスクリーニングをより好都合にするために、該配位子はアルデヒド部位またはケトン部位を有してもよい。該配位子は少なくとも１つの芳香環（例えば、テニル環、ベンゼン環等）、カルボキシル基および／またはフェノール基、ならびにケトンまたはアルデヒドを有する化合物を含んでもよい。これらの部位は例示的なものであって、排他的なものではなく、他の部位を除外することを意味するものではないことに注意するべきである。

本発明の不溶性担体の非限定的実施形態には、例えば、カラムまたはマイクロタイタープレート用担体、標準的なカラム用充填剤およびセファデックス膜材料などの膜、セファロースビーズ、フィルタプレート、マトリックス、アフィニティーカートリッジ等が含まれる。例えば、非常に小さなサンプルの場合、不溶性担体として拡張平板（ｅｘｐａｎｄｅｄ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｔｅ）を採用してよく、該サンプルをその平板に塗布して結合させ、この後、手動または標準的なロボット式液体処理ステーションを用いて、上澄（結合したアルブミンを除去したもの）を引き出す。この不溶性担体は本明細書に記載したものに限定されず、例えば、標準的なカラム材料に加えて、デキストラン、ポリチリン（ｐｏｌｙｔｈｉｒｉｎｅ）、またはガラスで作られたものを含めて、当業者に知られている任意の不溶性担体材料またはマトリックスを含んでよい。

一例として、抗アルブミンまたは抗ＨＳＡカートリッジ担体を利用してもよく、例えば、ＢＳＰ配位子が結合した該カートリッジ担体を利用してよい。また、カートリッジ担体を用いて、媒質をヒト血清サンプル中のアルブミンに結合させてもよい。

ＢＳＰは、当業者が利用可能な任意の手段または本発明のある実施形態によって提供される手段を用いて不溶性担体に結合されてよい。本発明の実施形態によれば、担体にＢＳＰを結合させる方法は、アルカリ性条件下でＢＳＰまたはその塩もしくはエステルを、エポキシ活性化担体と接触させるステップを含む。このような条件下で、水素原子がＢＳＰから除去され、これによりＢＳＰアニオンが提供されて、ＢＳＰが担体に結合するように該エポキシと反応することが可能となる。不溶性担体としてセファロースビーズを用いたこのような結合方法の一例を図１に（および以下の実施例１にも）示すが、他の配位子および／または担体を用いた変形も本発明の範囲内にある。

本発明の容器はカラム、ボトル、フィルタプレート、皿、プレートインサート等の当業者には知られている任意の容器を含んでよい。そのような容器に関する不溶性担体の配置および不溶性担体の位置決めも当業者に知られている。

アルブミン低減を達成する際の性能を向上させるために、適切な容器の寸法および形状を修正してもよい。この容器またはカラムの形状は、図２に関して以下にさらに記載する性能に影響が及ぶ可能性がある。

サンプル中のアルブミン含量を低減する方法およびアルブミン低減サンプルを生成する方法
本発明による血清、血漿および／または血液中のＨＳＡのようなアルブミン含量を低減する方法ならびにアルブミン低減サンプルを生成する方法は、低減または除去されるべきアルブミンを含む血清、血漿および／または血液のサンプルを提供するステップ、優先的にアルブミンを結合することができる配位子が結合された不溶性担体上にサンプルを通過させるステップ、および該サンプルからのアルブミンを該配位子に結合させることにより、アルブミン低減サンプルを提供するステップを含む。該配位子は、例えば、ＢＳＰまたはその塩もしくはエステルであってよい。続いて、このアルブミン低減サンプルは回収されてよい。本発明によれば、例えば、血清タンパク質を含むサンプル中のある非アルブミンタンパク質がアルブミン低減サンプル（すなわち、不溶性担体上にサンプルを通した後の血清、血漿または血液のサンプル）中に残存してよい。本発明の方法は、元のアルブミン低減サンプルに比してさらにアルブミン含量がより低いサンプル（すなわち、さらなるアルブミン低減サンプル）を得るために、アルブミン低減サンプルを用いて必要に応じて何回も任意選択的に繰り返されてよい。特に、本発明の方法は、１回またはさらに複数回不溶性担体上にアルブミン低減サンプルを通過させるステップ、およびアルブミン低減サンプルからのアルブミンを配位子と結合させることにより、アルブミンをさらに低減したサンプルを提供できるようにするステップを含む。

本発明の方法はまた、例えば、サンプルを平板（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｔｅ）に塗布し、そのサンプルを平板に結合させるステップを含む血清、血漿および／または血液サンプルを処理する手段を含む。

本発明の実施形態によれば、アルブミン濃度で、サンプルからのアルブミンの少なくとも８０％［放射免疫アッセイ、ｒａｄｉａｌ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（ＲＩＡ）により測定される］が配位子に結合する。本発明のさらに別の実施形態によれば、アルブミン濃度で、サンプルからのアルブミンの少なくとも９０％（ＲＩＡにより測定）が配位子に結合する。さらに別の実施形態によれば、アルブミン濃度で、サンプルからのアルブミンの少なくとも９５％（ＲＩＡにより測定）が配位子に結合する。

アルブミンが配位子（その配位子は不溶性担体に結合している）に結合した後、装置および担体ならびにサンプルサイズの形式に応じて、アルブミン低減サンプルからの血清タンパク質を、例えば、チューブ内またはプレート上で収集されてよい。例えば、９６ウェル（９６−ｗｅｌｌ）のレシーバプレートを用いれば、より小さなサンプルが９６ウェルカラム形式（９６−ｗｅｌｌ ｃｏｌｕｍｎ ｆｏｒｍａｔ)に収めることができる。より大きなサンプルの場合は、より典型的なカラムを用いてよい。

本発明はさらに、本発明の方法によって得られるアルブミン低減サンプルに向けられたものである。例えば、本発明の実施形態は、血清、血漿および／または血液などのアルブミンを含むサンプルを提供するステップ、ＢＳＰあるいはその塩またはエステルなどの優先的にアルブミンを結合することができる配位子が結合した不溶性担体上にサンプルを通過させるステップ、およびそのサンプルからのアルブミンを該配位子に結合させることにより、アルブミン低減サンプルを提供するステップを含む方法によって調製されたアルブミン低減サンプルを含む。

本発明の方法は、異なる配位子および分離技術を用いた従来の方法に比して、タンパク質に対するアルブミンの比によって測定されるような特異性を高める結果をもたらす。本発明の実施形態によれば非特異的結合性は最小になってよい。

図２は（１）サンプルがマトリックスを通過するのにかかる時間量に及ぼすカラム形状が重要であること、および（２）本発明のアセンブリ（ａｓｓｅｍｂｌｙ）および方法に従えば、同一のカラムに基づいたものと比較してアルブミン低減の良好な選択性を得ることができることを示す。総タンパク質量は市販の色素結合法を用いて測定することができ、アルブミンは放射免疫拡散法（ｒａｄｉａｌ ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）を用いて測定することができる。このカラムのフロースルー中の２つの濃度の比を図２に示す。「フロースルー（ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ）」とはサンプルを加えた後であって、任意の洗浄緩衝液を加える前にカラムを通過する材料を意味するものである。実験では、ヒト血清０．０２５ｍｌをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）０．０５ｍｌと混合してカラムに添加した。レーン１（Ｌａｎｅ １)および２はＢｉｏＲａｄカラムにおいて、ＢＳＰマトリックス（すなわち、不溶性担体に結合されたＢＳＰ）を用いて０．２の比が得られたことを示しており、この値はＢｉｏＲａｄカラム中のブルーセファデックス（レーン３）についての約０．３という比よりも良好であり、ＢｉｏＲａｄカラム中のＭｏｎｔａｇｅ樹脂（レーン５）に等価なものである。レーン１とレーン２を比較すると、カラム中のＢＳＰマトリックスをより多くするとタンパク質に対するアルブミンの比が改善されることが分かる。レーン４および６とレーン３および５とをそれぞれ比較すると、２つの異なる樹脂については、タンパク質に対するアルブミンの比はＭｏｎｔａｇｅカラムを用いて改善しており、流速はより遅くなるが故にカラムにサンプルが接触している時間が長くなっていることが分かる。

図３はいくつのカラムからの材料のＳＤＳゲルを示している。「ＭＷ」レーンは分子量マーカである。「ＳＲ」レーンはカラム上に何が置かれたかを示すための血清を用いたレーンである。「ＦＴ」はフロースルーレーンである。「Ｗ」（洗浄液）レーンはサンプルとして同じ緩衝液を用いた、カラムへの第２の適用である。「ＥＬ」（溶出液）は、カラムからアルブミンを溶出させるためにより高い塩濃度を用いたカラムへの第３の適用である。このフロースルーはユーザが使用するであろうもの、すなわちアルブミン低減サンプルを示している。セット１および４は、洗浄液中のアルブミンが低減したこと、およびアルブミンを含む溶出液中の他のタンパク質がより少ないことを示す。セット２および３はＭｏｎｔａｇｅ樹脂の性能が、それが充填されているカラムのタイプによって影響を受けていること、および溶出液画分にいくつもの他のタンパク質のバンドが存在することを示している。これらはユーザにとって重要である可能性のあるタンパク質である。

図４〜６は図２および３に示したものと同様のデータを示しているが、樹脂合成およびアルブミン低減の両方の再現性を示すためにＢＳＰマトリックスの新しいバッチを用いた異なる実験からのものである。図５および６では、図２に示した比にではなく、タンパク質およびアルブミンの実際の濃度をそれぞれ示している。本発明のサンプル（ＢＤサンプル）はフロースルー中のアルブミン濃度が９５％低減しており、フロースルーのタンパク質に対するアルブミンの比は約０．１５である。Ｍｏｎｔａｇｅサンプルはタンパク質が僅かに少なく、アルブミンが僅かに多く、その比は約０．２１である。Ｍｏｎｔａｇｅ溶出液はＢＳＰ樹脂を用いた場合よりも、より多くの「その他の」タンパク質が樹脂に結合していることを示しており、ＢＳＰ樹脂のより良好な選択性を示唆している。

サンプル中のアルブミン含量を低減する装置を作製する方法
本発明の別の特徴は血清、血漿および／または血液サンプル中のＨＳＡのようなアルブミンの含量を低減する装置を作製する方法を含む。この方法は、不溶性担体に配位子を結合させるステップを含む。一般に、本発明の実施形態は、ＢＳＰまたはその塩もしくはエステルなどの優先的にアルブミンを結合することができる配位子を不溶性担体に結合させることのできる方法を含み、該方法はアルカリ性条件下でエポキシ活性化不溶性担体に配位子を接触させて配位子アニオンを生成させ、これにより配位子が不溶性担体に結合するよう配位子アニオンがエポキシと反応させるステップを含んでいる。この担体は、例えば、マトリックス上を通過したサンプルからタンパク質を分離することのできるマクロ粒子マトリックスであってよい。非限定的な実施形態として、この担体はセファロースビーズであってよく、配位子はＢＳＰまたはその塩もしくはエステルであってよく、この場合、該方法は後記の実施例１に示す方法を含んでよい。

アルブミン除去と組み合わせた他のタンパク質の除去
本発明の装置は、血清、血漿および／または血液サンプルから他のタンパク質を除去することのできるカートリッジまたは他の装置と組み合わされて使用されてよい。本発明のある実施形態によれば、アルブミンを結合するための配位子が結合された不溶性担体を含む本発明の装置は、サンプルから１種または複数種の他のタンパク質を除去するように構成された担体を有する装置と共に使用される。本発明に従って除去されてよいタンパク質の非限定的実施形態としては、アルブミン、ＩｇＧ、ＩｇＡ、アルファリポタンパク質およびベータリポタンパク質、アルファ１−アンチトリプシン、アルファ２−マクログロブリン、フィブリノゲン、トランスフェリン、ハプトグロビン、補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）Ｃ３等が含まれる。したがって、本発明はサンプルから１種または複数種のこれらの、あるいは他のタンパク質を除去するように構成された装置を含む。ある実施形態によれば、アルブミンおよび１種または複数種の他のタンパク質をワンステップで除去することができるか、あるいはそれらのタンパク質を任意の順序の複数のステップで除去することができる。これら実施形態の非限定的例は、ＨＳＡおよび／またはＩｇＧを結合させるための担体としてアフィニティークロマトグラフィカートリッジを使用することを含む。本発明のある実施形態のカートリッジは特異的であってよく、ほとんどあるいは全く非特異的結合を呈さないものでもよく、そしてまた高いスループット処理性、洗浄可能性、および再利用性などの所望の特性も有してよい。

本発明はまた、例えば、アルブミンおよびＩｇＧなどの１種または複数種のさらなるタンパク質を低減したサンプルといった、タンパク質低減サンプルを生成する方法を含む。これら実施形態の方法は、例えば、アルブミンおよび１種または複数種のさらなるタンパク質を含んだサンプルを提供するステップ、優先的にアルブミンを結合することのできる配位子を有する不溶性担体上にサンプルを通過させるステップ、サンプルからアルブミンを配位子に結合させるステップ、サンプルから１種または複数種の非アルブミンタンパク質を配位子に優先的に結合することができるように、あるいはサンプルから１種または複数種の非アルブミンタンパク質を除去することができるように構成された１種または複数種の不溶性担体上にサンプルを通過させるステップ、および１種または複数種の非アルブミンタンパク質をサンプルから除去できるようにして、タンパク質低減サンプルを提供するステップとを含んでいる。本発明の方法はタンパク質低減サンプルを１つまたは複数の不溶性担体上に１回または複数回通過させるステップと、タンパク質低減サンプルからさらなるタンパク質を除去できるようにして、さらにタンパク質を低減させたサンプルを提供するステップとを含んでよい。本発明の方法はタンパク質低減サンプルを収集するステップをさらに含んでよい。適切な担体、配位子、収集容器、およびこれら実施形態の他の特徴は本願明細書を通して記載されている。

優先的にアルブミンを結合することのできる配位子を有する不溶性担体、およびサンプルから１種または複数種の非アルブミンタンパク質を配位子に優先的に結合することができるように、あるいは、サンプルから１種または複数種の非アルブミンタンパク質を除去することができるように構成された不溶性担体は、同一または別個の単体であってよく、またこの担体（複数の担体）にサンプルを通過させるステップは１つまたは複数のステップで実行されてよいことに注目するべきである。さらに、種々の担体上にサンプルを流し、異なるタンパク質を分離するステップの順序は本願明細書に記載した本発明の方法のステップの順序によって限定することは意図していない。すなわち、サンプルから１種または複数種の非アルブミンタンパク質を優先的に除去できるように構成された１種または複数種の他の不溶性担体上にサンプルを通過させるステップ、およびサンプルから１種または複数種の非アルブミンタンパク質を除去するステップは、優先的にアルブミンを結合することができる配位子を有し、かつサンプルからのアルブミンを該配位子に結合させることのできる不溶性担体上にサンプルを通過させるステップの前、そのステップの間、あるいはそのステップの後に実行されてもよい。

本発明は本願明細書に記載した方法によって生成されたタンパク質低減サンプルをさらに提供する。

本発明の方法は、例えば、タンパク質カートリッジおよび抗ＨＳＡカートリッジ上に血清、血漿、または血液のサンプルを通過させるステップを含んでよい。次に、フロースルー（血清タンパク質）および溶出した分画（例えば、アルブミンおよび／またはＩｇＧ）を分析して、サンプルからのＨＳＡおよび／またはＩｇＧの除去量を定量し、かつ非特異的結合のレベルを検査してよい。サンプルは高スループットの多次元液体クロマトグラフィシステムを用いて処理されるか、あるいは固有のカートリッジ形式を用いて手動モードで処理されてよい。さらに、本発明の装置を２−Ｄゲル、ＩＣＡＴ試薬技術、液体クロマトグラフィ質量分析（ＬＣ／ＭＳ）またはマトリックス支援レーザー脱離イオン化法−飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）と共に用いてよい。

他のタンパク質と共にＨＳＡを抽出するためにクロマトグラフィを用いる例示的な方法を後記される実施例３に示す。

アルブミン低減スピンカラム
本発明の実施形態はサンプル中のアルブミンを低減するのに用いてよいスピンカラムを含む。本発明のスピンカラムの一例を図９に示す。図９に示したスピンカラムは標準的な卓上型の小型の遠心分離機用のスピンカラムであるが、他の大きさで他の形状を有するスピンカラムも本発明によって意図されている。本発明のある実施形態によれば、図９に示したような内部カラム（１２）が設けられてよい。本発明のある実施形態によれば、該内部カラムは任意選択的に専用のカラム底部（１４）を有してよい。アルブミン結合樹脂（１６）が専用のカラム底部と接触している内部カラム内に設けられてよい。このアルブミン結合樹脂は任意選択的にＢＳＰ、チバクロンブルー、ワーファリン、または他の優先的にアルブミンを結合することができる適切な配位子を含んでよい。

専用のカラム底部は１つまたは複数のフローディレクタ（ｆｌｏｗ ｄｅｒｅｃｔｏｒ）および／または膜アセンブリ（ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ）を含んでよい。該カラム底部は、例えば、スピン（ｓｐｉｎ）中に樹脂が乾燥するのを防ぎ、サンプルの滞留時間を延ばし、および／または樹脂のサンプルとの相互作用を高めるために、特定の形状に形成されてよい。本発明の適切な専用のカラム底部形状の非限定的実施例を、別の角度から図７および８に示す。図１０に示すように、スピンカラムの内部カラム（１２）は受取チューブ（１８）内に収まるように構成されている。この受取チューブは、例えば、図９および１０に示すように蓋（２０）を有してよい。この蓋は受取チューブを封止するように構成されてもよいし、または内部カラムおよび受取チューブの両方を封止するよう任意選択的に構成されてもよい。

したがって、本発明は受取チューブおよび該受取チューブ内に収まるように構成された内部カラムを有するスピンカラムを含んでいる。内部カラムはアルブミン結合樹脂、および任意選択的にはカラム底部を含み、該カラム底部はアルブミン結合樹脂と接触している。受取チューブは任意選択的に蓋を有する。さらなる実施形態によれば、スピンカラムは、受取チューブを封止するように構成され、かつ任意選択的には内部カラムを封止するようにさらに構成された蓋を含んでいる。該内部カラムは所望以上に内部カラムが受取チューブに入らないようにするために縁（ふち）を有してよい。ある実施形態によれば、アルブミン結合樹脂は、１種または複数種の優先的にアルブミンを結合することができる配位子を含み、ＢＳＰ、チバクロンブルー、ワーファリン、およびその塩またはエステルからなる群から選択された１種または複数種の配位子であってもよい。本発明のスピンカラムはサンプルからアルブミンおよび／または１種または複数種の他のタンパク質を除去するために、１種または複数種の他のタンパク質結合配位子を任意選択的に含んでよい。

本発明の方法によれば、アルブミンを含んだサンプルを得てスピンカラムに入れ、該サンプルをスピンカラム内に保持し、任意選択的に該スピンカラムを遠心分離機内でスピンさせる。専用のカラム底部に出現するアルブミン低減サンプルがスピンカラム（２２）の底部に収集できる。ある実施形態によれば、アルブミン低減したタンパク質サンプルを生成する方法は、スピンカラムを提供するステップであって、該スピンカラムは受取チューブおよび該受取チューブに収まるように構成された内部カラムを備え、該内部カラムはカラム底部およびアルブミン結合樹脂を備え、該カラム底部はアルブミン結合樹脂と接触しているステップ、アルブミンを含むサンプルをスピンカラムの内部カラム内に置くステップ、サンプルからのアルブミンが内部カラム内のアルブミン結合樹脂に結合し、かつ結合したアルブミンが除去されたサンプルを内部カラムに通過させることによって、アルブミン低減サンプル（フロースルー）を生成できるようにするのに十分な時間の間スピンカラム内にサンプルを保持するステップを含んでいる。該カラムは任意選択的には遠心分離機内でスピンさせてもよい。該カラムは任意選択的にアルブミン低減サンプルを収集する前に洗浄されてよい。所望ならば、結合した画分（アルブミンおよび他の保持されたタンパク質）を溶離液（ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を用いて回収してよい。蓋は受取チューブに取り付けられてもよいし、または受取チューブとは独立したものであってもよい。例えば、受取チューブの外側で上方にスライドするリングに蓋が取り付けられてよい。

本発明の方法はアルブミン低減サンプルを収集するステップをさらに含む。アルブミン低減サンプルは任意選択的に１回または複数回、内部カラムに再挿入されてよく、また、任意選択的に、回収され別の清浄なチューブまたは他の収集装置に移される前に、サンプルからのさらなるアルブミンが内部カラム内のアルブミン結合樹脂に結合するのに十分な時間の間、サンプルがスピンカラム中に保持されていてもよい。該内部カラムが受取チューブとは別のキットである場合、該方法は受取チューブに内部カラムを挿入するステップを含んでよい。

アルブミン結合樹脂はＢＳＰ、チバクロンブルー、ワーファリン、およびその塩またはエステルなどの優先的にアルブミンを結合することができる１種または複数種の配位子を含んでよい。これら実施形態にしたがったサンプルの例として、血清、血清、および血液が含まれてよい。

アルブミン低減率および非特異的結合量のような種々のものを測定するために、スピンカラムから除去する際に、溶出分画および／または結合分画を、当業者に知られている方法によって分析してよい。このような方法には、分析されるものが、溶出分画または結合分画のいずれであるかということ、および分析の目的に応じて、液体クロマトグラフィ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（ＳＤＳアクリルアミドゲル電気泳動法）およびＲＩＡ法を含む当業者に知られている方法を含んでよい。

キット
本発明はさらにサンプル中のアルブミン含量を低減するのに用いられてよいキットに関し、該キットは不溶性担体および優先的にアルブミンを結合することができる配位子を含む。該配位子は任意選択的に本発明のキット内の不溶性担体に結合されてよい。本発明のある実施形態によれば、該キット内の配位子はＢＳＰまたはその塩もしくはそのエステルを含んでよい。

本発明のキットは、任意選択的に本願明細書に記載したような容器、本願明細書に記載したような担体および／または例えば、収集チューブのような本願明細書に記載したような収集装置を含んでよく、該収集装置はアルブミン低減サンプルを回収するのに使用されてもよい。

本発明はまた１種または複数種の非アルブミンタンパク質を結合することのできる１種または複数種のさらなる不溶性担体を含んでよい。１種または複数種のさらなる不溶性担体の非限定的実施形態としては、タンパク質Ａカートリッジ、タンパク質Ｇカートリッジ、および／またはタンパク質Ａカートリッジおよびタンパク質Ｇカートリッジを組み合わせたものなどのＩｇＧを結合するように構成された担体を含んでよい。

本発明のキットは、任意選択的にはアフィニティーカラム、微量遠心分離用チューブ、緩衝液（平衡化緩衝液、洗浄緩衝液および／またはストリッピング緩衝液）、および／または、例えば、種々のタイプおよび量のサンプルを通過させるための様々な大きさおよび量の試薬を含んでよい。

本発明はアルブミン低減スピンカラムまたはその構成要素を含むキットをさらに備えてよい。特に、本発明のキットは受取チューブおよび内部カラムを備えてよく、該内部カラムはアルブミン結合樹脂、および任意選択的にカラム底部を含み、該スピンカラムは任意選択的に蓋を含む。ある実施形態によれば、アルブミン結合樹脂は、例えば、ＢＳＰ、チバクロンブルー、ワーファリン、またはそれらの塩もしくはエステルなどの任意選択的にアルブミンを結合することができる１種または複数種の配位子を含んでよい。本発明のキットは結合分画を回収する溶離液を含んでよい。

以下の実施例は本発明の特定の実施形態を示している。本願明細書に記載した実施例は例示的なものであることを意味し、また、特許を請求している本発明の範囲を一切制限するものではない。当業者には明白であろうが、記載した本発明の範囲内で種々の変更および変形が可能であり、また種々の変更および変形が意図されている。

アルブミン低減用のブロモスルホフタレインを結合させたセファロースゲルの調製
本発明のセファロースビーズの不溶性担体にＢＳＰを結合させる方法を図１に示す。図１に示すように、アルカリ性条件下（例えば、水酸化ナトリウム（４）を用いて）でエポキシ活性化セファロースビーズ（８）にＢＳＰ（２）を接触させる。これらの条件下で、ＢＳＰ（２）からの水素原子を除去すると、アニオン（６）を有するＢＳＰがエポキシと反応し、その結果、セファロースビーズ不溶性担体（１０）に結合されたＢＳＰ配位子を形成することができる。次に、ＢＳＰ配位子が結合したビーズをカラム内に保持して本発明の一態様であるアセンブリを形成する。

特に、本方法は以下のように進めてよい：
−市販の供給源からエポキシ活性化セファロース６Ｂを入手する。
−市販の供給源からブロモスルホフタレインナトリウム塩を入手する。
−以下のステップを用いて１グラムのエポキシ活性化セファロース６Ｂにブロモスルホフタレインを結合させる。：
−１グラムのエポキシ活性化セファロース６Ｂを計りとり、純水に懸濁させる。ゲルは直ちに膨潤する。このゲルを純水で２回洗浄する。
−０．１Ｍの水酸化ナトリウム５ｍｌに０．５グラムのブロモスルホフタレインを溶解させる。
−結合ステップ：上記ブロモスルホフタレイン溶液をゲルと混合し、室温にて振盪機で４８時間インキュベートする。
−純水を用いて余分なブロモスルホフタレインを洗い流す。
−残存する任意の活性基を封鎖するステップ：ｐＨ８．０の１Ｍのエタノールアミンにゲルを移す。
−室温にて振盪機で一晩インキュベートする。
−生成物を純水で完全に洗う。

サンプル中のアルブミン含量を低減する方法
ヒト血清サンプルを入手する。該サンプルを例えば、ＰＢＳを用いて希釈する。次に、ブロモスルホフタレイン配位子の結合したアフィニティーカラム内に充填されたセファロースビーズ上にこのサンプルを通過させる。上記のように、カラムの形状またはデザインはアルブミン低減の効果に影響を及ぼしうる。このため、ＢＳＰマトリックスの効果を最適化するようにカラムの形状およびデザインを選択する。サンプルからのアルブミンがＢＳＰ配位子に結合する。カラムを通過した後にサンプルに残っているものは実質的にアルブミンが低減されている。次に、このアルブミン低減サンプルを収集する。

クロマトグラフィ
ＶＩＳＩＯＮ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎなどのクロマトグラフィを用いた、血液、血清、または血漿からのＨＳＡおよび１種または複数種の他のタンパク質を選択的に除去する本発明の方法を提供する。

一例によれば、ＰＢＳを用いて１：１０（ヒト血清：ＰＢＳ）に希釈したヒト血清サンプル７０μＬを、０．２ｍｌのタンパク質Ａおよび／またはタンパク質Ｇカートリッジに通過させた後、そのフロースルー分画を４００μＬまで希釈する。次に、希釈したタンパク質Ａおよび／またはタンパク質Ｇのフロースルー分画１００μＬを、流量０．５ｍｌ／分で０．２ｍｌの抗ＨＳＡカートリッジ（ＢＳＰ配位子が結合）に加える。

ある実施形態によれば、血液、血清、または血漿のサンプルをタンパク質Ｇカートリッジに通過させてサンプルからＩｇＧを除去した後、該サンプルをＶＩＳＩＯＮ（登録商標） Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎで動作するＢＳＰが結合したカートリッジ上に通過させる。この分離ステップはＶＩＳＩＯＮ（登録商標） Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎなどの自動ワークステーションを用い数分間で別々にあるいは平行して行うことができるほか、シリンジ注入アダプタを用いて手動で実行することももちろんできる。

溶出分画からのタンパク質濃度は、例えば、ブラッドフォード・アッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙ）を用いて決定してよい。タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（ＳＤＳアクリルアミドゲル電気泳動法）によって分析されてよく、このタンパク質はコロイド・クマシー染色（ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｓｔａｉｎ）によって視覚化されてよい。本発明の方法の前後にタンパク質濃度を決定するために、および最初のサンプル、溶出分画、およびフロースルー内のタンパク質濃度を決定するために、２−Ｄゲル分析、ペプチド・マス・フィンガープリント法（ｐｅｐｔｉｄｅ ｍａｓｓ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ）および当業者に知られている他の方法などの、他の形式の分析法を使用してもよい。例えば、市販のＥＬＩＳＡアッセイを用いてアルブミンおよびＩｇＧの除去量を定量化することができる。

アルブミン低減スピンカラム
本発明の装置は図９に示したようなスピンカラムの形態で提供される。図９に示したスピンカラムは標準的な卓上型の小型の遠心分離機用のスピンカラムであるが、他の大きさおよび形状のスピンカラムも本発明によって意図されている。図９に示した装置では、専用のカラム底部（１４）を有する内部カラム（１２）が設けられている。ＢＳＰ（１６）を含んだアルブミン結合樹脂が図７および８に示した形状を有する専用のカラム底部と接触した状態でカラム内に設置されている。この専用のカラム底部は１つまたは複数のフローディレクタ（ｆｌｏｗ ｄｉｒｅｃｔｏｒ）および／または膜アセンブリを有しており、スピン中の樹脂の乾燥を防止し、サンプルの滞留時間を延ばし、および／またはサンプルとの相互作用を高めるために特定の形状に形成される。内部カラムは受取チューブ（１８）に収まるように構成されている。受取チューブは、例えば、図９および１０に示したような蓋（２０）を有してよい。

アルブミンを含んだ血清を入手し、平衡緩衝液を用いて希釈し、スピンカラムの受取チューブ内に挿置する。次に、内部カラムを受取チューブ内に置き、受取チューブの蓋を閉じる。サンプル内のアルブミンが内部カラムのＢＳＰと結合するのに十分な時間の間、該サンプルをスピンカラム内に保持する。任意選択的にスピンカラムを遠心分離機内でスピン（例えば、２０００回／分で２分間）してよく、これによってアルブミン低減サンプルが生成し、これを受取チューブ内で収集する。次いで、該サンプルは、受取チューブから回収してよい。続いて、回収して別の清浄なチューブに移す前に、このアルブミン低減サンプルをカラムに再挿入し、スピンカラム内に保持および／または１回もしくは複数回再び遠心分離してもよい。別の実施形態によれば、サンプルを希釈してスピンカラムの内部カラムに置き、受取チューブの蓋を閉めてからサンプル内のアルブミンが内部カラム内のＢＳＰと結合するのに十分な時間の間遠心分離する。

カラムを用いたアルブミン低減の手順
本発明の実施形態に従って、アルブミンが血清または血漿のサンプルから以下のように低減される：
サンプルの希釈
ステップ１：ＰＢＳ中の血清または血漿サンプルを、１：２（血清または血漿：ＰＢＳ）の推奨比率で希釈する。
例：５０μＬのＰＢＳに２５μＬの血清または血漿を添加する。

カラムの平衡化
ステップ２：カラムに４００μＬのＰＢＳを加える。このカラムを収集チューブに入れて２０００回／分で２分間（平均的なロータ半径７ｃｍ、約５００×ｇで）遠心分離する。

ステップ３：収集チューブから緩衝液を捨てる。

ステップ４：ステップ２〜３を繰り返す。

アルブミンの低減
ステップ５：平衡化したカラムに７５μＬの希釈した血清または血漿サンプルを加える。新しい収集チューブにこのカラムを入れて５分間待つ。２０００回転／分で２分間遠心分離する。

ステップ６：収集チューブからフロースルーを回収し、それをカラムに戻す。５分間待ち、２０００回転／分で２分間遠心分離するとフロースルーを分析することができる。
注意：本発明のアルブミン低減カラムを用いて少なくとも２回サンプルを処理する。

カラムの洗浄
ステップ７：カラムに２００μＬのＰＢＳを加える。新しい収集チューブにこのカラムを入れて、２０００回転／分で２分間遠心分離する。

ステップ８：さらに２００μＬのＰＢＳをカラムに加える。同じ収集チューブにこのカラムを入れて、２０００回転／分で２分間遠心分離すると、この洗浄液を分析することができる。
注意：本発明に従って種々の濃度および体積を用いてよい。

本発明のＢＤ（登録商標）アルブミン低減カラムを用いて以下のヒト血清サンプルを処理した：
希釈したヒト血清サンプルＡ：ヒト血清５０μＬ＋ＰＢＳ２５μＬ
希釈したヒト血清サンプルＢ：ヒト血清３５μＬ＋ＰＢＳ４０μＬ
希釈したヒト血清サンプルＣ：ヒト血清２５μＬ＋ＰＢＳ５０μＬ
図１１はアルブミン除去の再現性および効率を示す１−Ｄゲルを示している。図１１の１〜１４の番号を付したカラムは以下のものに相当する：
１−標準
２−希釈したヒト血清サンプルＡ
３−サンプルＡのフロースルー、複製１（ｒｅｐｌｉｃａｔｅ １）
４−希釈したヒト血清サンプルＡ
５−サンプルＡのフロースルー、複製２
６−希釈したヒト血清サンプルＢ
７−サンプルＢのフロースルー、複製１
８−希釈したヒト血清サンプルＢ
９−サンプルＢのフロースルー、複製２
１０−希釈したヒト血清サンプルＣ
１１−サンプルＣのフロースルー、複製１
１２−希釈したヒト血清サンプルＣ
１３−サンプルＣのフロースルー、複製２
１４−標準
図１１は濃度１：２（血清：ＰＢＳ）で希釈したヒト血清サンプルを用いたとき（たとえば、カラム１０および１２を参照）、タンパク質のフロースルー（たとえば、カラム１１および１３を参照）は、サンプル中のアルブミンに対する血清の比がより高い場合よりも少ないことを示している。

図１２はＰＢＳと組み合わせたヒト血清サンプルが本発明のアルブミン低減カラムを通過した後のフロースルー中のアルブミンおよびタンパク質の結果を示している。グラフ化した各サンプルの総体積は０．０７５ｍｌ（７５μＬ）であるが、サンプルの濃度はグラフ上で左から右へ上昇している。例えば、グラフのもっとも左側の２点は、ヒト血清２５μＬおよびＰＢＳ５０μＬがアルブミン低減カラムを通過した後のタンパク質およびアルブミンの濃度を示している。次の２つの点は、ヒト血清３５μＬおよびＰＢＳ４０μＬのサンプルがカラムを通過した後のタンパク質およびアルブミンの濃度を示している。一番右側の点はヒト血清２５μＬとＰＢＳ２５μＬのサンプルに関する。図１２はＰＢＳに対するヒト血清の比が約１：２のサンプルをアルブミン低減カラムに加えた場合、カラムを通過するアルブミンおよび総タンパク質の量は、ＰＢＳに対するヒト血清のより高い比のサンプルをカラムに加えた場合に比べて低減されていることを示す。これはユーザの実験の目的に応じてシステムに汎用性があることを示している。図１２の左側はサンプル濃度を上昇させながらシステム内でより少ない量のアルブミンを得るための条件を示し、図の右側に行くほど、タンパク質の濃度はより大きい増加を達成できることを示している。

図１３は、ＰＢＳに対するヒト血清の濃度比を１：２に保ったときに、サンプルの体積が増大すると本発明のカラムを通過するアルブミンおよび総タンパク質の量がどのように上昇するかを示すグラフである。図１３に示すように、サンプル量が０．０７５ｍｌ〜０．１１０ｍｌ〜０．１５０ｍｌへと上昇するに従って、カラムを通過するアルブミンおよび総タンパク質の両方の量が上昇している。これはユーザの実験の目的に応じてシステムに汎用性があることを示している。図１３の左側はサンプル濃度を上昇させながらシステム内でより少ない量のアルブミンを得るための条件を示し、図の右側に行くほど、アルブミン濃度よりもタンパク質濃度が大きく増加する条件を示している。

本発明の一態様に従ってセファロースビーズの不溶性担体にＢＳＰ配位子を結合させる方法を示す。 種々のカラムを通過したサンプル中の総タンパク質に対するアルブミンの相対比を示すグラフである。 本発明のアセンブリおよび方法を用いていくつかのカラムから得たゲルを示す写真である。このゲルは血清、フロースルー、溶出液、および洗浄液中にタンパク質があることを示す。 本発明（ＢＤ）のアセンブリおよび方法を用いた血清、フロースルー、溶出液、および洗浄液中のタンパク質を示す。 本発明（ＢＤ）の方法にしたがったフロースルー、洗浄液、および溶出液サンプル中の実際のタンパク質濃度を示す。 本発明（ＢＤ）の方法にしたがったフロースルー、洗浄液、および溶出液サンプル中の実際のアルブミン濃度を示す。 本発明の実施形態によるカラム底部を示す上面図を示す。 本発明の実施形態によるカラム底部を示す底面図を示す。 本発明の実施形態によるスピンカラムおよび内部カラムを示す。 本発明の実施形態によるスピンカラムおよび該スピンカラム内に挿入された内部カラムを示す。 リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対するヒト血清の比が異なる濃度である３つのサンプルからのアルブミン除去の再現性および効率性を示すゲルを示す。 本発明のカラムを通過した後に得られた総タンパク質およびアルブミンの低減量の変化をＰＢＳに対する血清の濃度の比の関数で示したグラフを示す。 サンプルの体積が、本発明によるカラムを通過するアルブミンおよび総タンパク質の量を如何に増大させるかを示す。

符号の説明

２ ＢＳＰ
４ 水酸化ナトリウム
６ ＢＳＰアニオン
８ エポキシ活性化セファロースビーズ
１０ ＢＳＰ結合セファロースビーズ不溶性担体
１２ 内部カラム
１４ カラム底部
１６ ＢＳＰ
１８ 受取チューブ
２０ 蓋
２２ アルブミン低減サンプル

Claims (14)

1. アルブミン低減サンプルを生成する方法であって、
   アルブミン及びリン酸緩衝生理食塩水を含むサンプルを提供するステップ、
   配位子が結合した不溶性担体上に前記サンプルを通過させるステップであって、該配位子はブロモスルホフタレインからなり、該配位子が結合した不溶性担体は、アルカリ性条件下でブロモスルホフタレインまたはその塩もしくはエステルをエポキシ活性化不溶性担体と接触させブロモスルホフタレインアニオンを生成させ、そして前記ブロモスルホフタレインが前記不溶性担体に結合するように、前記ブロモスルホフタレインアニオンを前記エポキシと反応させることによって得ることができるものであるステップと、
   および前記サンプルからのアルブミンを前記配位子に結合させることによって、前記アルブミン低減サンプルを提供することができるようにするステップ
   を含むことを特徴とするアルブミン低減サンプルを生成する方法。
2. 前記アルカリ性条件は、０．１Ｍ水酸化ナトリウムを用いた条件であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記アルブミン低減サンプルを収集するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
4. 前記不溶性担体上に前記アルブミン低減サンプルを１回または複数回通過させるステップ、
   および前記アルブミン低減サンプルからのアルブミンを前記配位子に結合させることによって、さらにアルブミンを低減したサンプルを提供することができるようにするステップと
   をさらに含むことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
5. 前記のさらにアルブミンを低減したサンプルを収集するステップをさらに含むことを特徴とする請求項４に記載の方法。
6. 前記サンプルは血清、血漿、および血液からなる群から選択されることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
7. 前記アルブミンはヒト血清アルブミンであることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
8. 前記サンプルはヒト血清であり、ヒト血清：リン酸緩衝生理食塩水の比が１：２であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
9. タンパク質低減サンプルを生成する方法であって、該方法が、
   アルブミン、１種または複数種のさらなるタンパク質及びリン酸緩衝生理食塩水を含んだサンプルを提供するステップ、
   ブロモスルホフタレインからなる配位子が結合した不溶性担体上に前記サンプルを通過させるステップであって、該配位子が結合した不溶性担体は、アルカリ性条件下でブロモスルホフタレインまたはその塩もしくはエステルをエポキシ活性化不溶性担体と接触させブロモスルホフタレインアニオンを生成させ、そして前記ブロモスルホフタレインが前記不溶性担体に結合するように、前記ブロモスルホフタレインアニオンを前記エポキシと反応させることによって得ることができるものであるステップ、
   前記サンプルからのアルブミンが前記配位子に結合することができるようにするステップ、
   前記サンプルから１種または複数種の非アルブミンタンパク質を優先的に除去することができるよう構成された１種または複数種の不溶性担体上に前記サンプルを通過させるステップ、
   および１種または複数種の非アルブミンタンパク質を前記サンプルから除去することによって、タンパク質低減サンプルを提供することができるようにするステップ
   を含むことを特徴とする方法。
10. 前記アルカリ性条件は、０．１Ｍ水酸化ナトリウムを用いた条件であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
11. 前記サンプルはヒト血清であり、ヒト血清：リン酸緩衝生理食塩水の比が１：２であることを特徴とする請求項９または１０に記載の方法。
12. 前記タンパク質低減サンプルを収集するステップをさらに含むことを特徴とする請求項９または１０に記載の方法。
13. １種または複数種の前記不溶性担体上に１回または複数回前記タンパク質低減サンプルを通過させるステップ、
    および前記タンパク質低減サンプルからさらなるタンパク質を除去することによって、さらにタンパク質を低減したサンプルを提供することができるようにするステップ
    をさらに含むことを特徴とする請求項９または１０に記載の方法。
14. 前記サンプルから１種または複数種の非アルブミンタンパク質を優先的に除去することができるよう構成された１種または複数種の他の不溶性担体上に前記サンプルを通過させるステップ、およびアルブミンを優先的に結合することのできる配位子を有する不溶性担体上にサンプルを通過させるステップおよびサンプルからアルブミンを配位子に結合させることができるようにするステップの前に、１種または複数種の非アルブミンタンパク質を前記サンプルから除去することができるようにするステップを実行することを特徴とする請求項９または１０に記載の方法。

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