JPH0486554A - 糖化アルブミンの分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、液体クロマトグラフィーを用いて試料中の非
糖化および糖化アルブミンを分析する方法で、特に糖尿
病の診断方法としての用途に関する。

（従来の技術） 糖尿病の際の高血糖は、生体内の種々のタンパク質と非
酵素的に糖付加反応を行なうことが知られている。その
血糖値の指標として、ヘモグロビンとブドウ糖の結合物
である糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ　　　）は、採血前１
〜２ケ月はど過去のＣ 血糖値を反映し、長期的糖尿病管理に適することから急
速に臨床応用されているが、治療効果に対する短期間の
反応性が鈍く、血糖の同時測定が不可欠という欠点があ
る。

一方、血液中のアルブミンとブドウ糖の結合物である糖
化アルブミンは、過去１〜２週間前の血糖値を反映する
ため、短期の血糖値コントロールの指標としての重要性
が注目されるようになってきている。

従来、糖化アルブミンの分離および検出方法としては、
特開昭６２−２２６９９９号公報に記載の方法がある。

すなわち、第一カラムで試料中からアルブミンを分離し
、それをクロマトグラフィーの流路系外に出すことなく
第二カラムに導き、そこでアルブミンを糖化アルブミン
と非糖化アルブミンとに分離する方法である。また、上
記方法において測定時間を短縮した特開平１−２６２４
６９号公報がある。すなわち、第二カラムを複数個用い
て分析時間を短縮する方法である。

（発明か解決すべき課題） 上記従来技術による方法では、カラムを複数個用いてい
るため分析に長時間を要するため、分析サイクルは長く
なり、臨床検査の場で用いるには問題がある。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは、前記の問題点を克服するため鋭意研究の
結果、迅速性、操作性、再現性にすぐれ、さらには自動
化の容易な糖化アルブミンの分析方法を見出し、本発明
を完成するに至った。

すなわち本発明は、糖化アルブミンと非糖化アルブミン
を含む試料を分離用カラムで糖化タンパク質両分と非糖
化タンパク質画分に分離した後、その溶出液をクロマト
グラフィーの流路系外に出すことなく、アルブミンにの
み特異的に反応する試薬と混合反応させ、糖化アルブミ
ンと非糖化アルブミンをそれぞれ検出することによる液
体クロマトグラフィーによる糖化アルブミンと非糖化ア
ルブミンの分析方法を提供するものである。

本発明において、糖化アルブミンとは、グルコースと共
有結合したアルブミン、非糖化アルブミンとは、グルコ
ースと結合していないアルブミンを意味し、アルブミン
とは、糖化アルブミンと非糖化アルブミンの両方を意味
する。

本発明でいう試料とは、少なくとも糖化アルブミンと非
糖化アルブミンのどちらか、もしくはその両方を含有す
るものであれば良く、また、前処理により糖化アルブミ
ンと非糖化アルブミンを他のタンパク質成分から分離し
たものでも、糖化ＩｇＧと非糖化１ｇＧのような他の糖
化タンパク質成分と非糖化タンパク質成分を含んだもの
でもよい。例えば、血液、尿等の体液を挙げることがで
きる。

本発明で用いる分離用カラムは、ジヒドロキシボロン酸
を有するゲルを充填したカラムが挙げられるが、少なく
とも、非糖化アルブミンを含む非糖化タンパク質と糖化
アルブミンを含む糖化タンパク質か分離できればよく特
に限定されるものではない。例えば、カルボキシメチル
型、スルホプロピル型などのイオン交換充填剤を挙げる
ことができる。

又、固定相担体としては、従来、液体クロマトグラフィ
ーに一般的に用いられているセルロース、アガロース、
シリカ、ポリビニールアルコールポリヒドロキシメタク
リレート等が挙げられるが、機械的強度、化学的安定性
にすぐれたものが特に好ましい。

本発明の分離用カラムで糖化アルブミンと非糖化アルブ
ミンを分離するための溶離液としては、２種類の移動相
（Ａ液とＢ液）を用い、Ａ液がらＢ液へステップワイズ
に切り換えるのが好ましい。

例えば、Ａ液としては、２０〜５００ｍＭの緩衝液を有
し、１，２−シスジオールを有する物質を含まないｐ）
（７，０〜９．０の溶離液が好ましい。緩衝液としては
、ｐＨ７，０〜９．０の緩衝能を有するものが好ましい
が、特に酢酸アンモニウム、ＨＥＰＥＳ　（Ｎ−２−ヒ
ドロキシエチルピペラジン−Ｎ−−２−エタンスルホン
酸）等を挙げることができる。また、Ａ液には、緩衝液
以外の塩を含むことができ、特に２価金属イオンの塩、
例えば、塩化マグネシウム等が糖鎖とジヒドロキシボロ
ニル基の結合を強めることができるので好ましい。２価
金属イオンの塩濃度は、好ましくは１０〜１００　ｍ　
Ｍである。

一方、Ｂ液としては、２０〜５００ｍＭの緩衝液を有す
るｐＨ７，０〜９，０の溶離液で、１゜２−シスジオー
ルを有する物質を含んでいれば良い。緩衝液としては、
Ａ液で使用するものと同じものを使用することが好まし
いが、他のものでも構わない。１，２−シスジオールを
有する物質としては、ソルビトール、マンニトール等の
糖類を挙げることができ、その濃度は、５０〜５００ｍ
Ｍが好ましい。

本発明で用いるアルブミンと特異的に反応する試薬とし
ては、メチルオレンジ、ブロムスルホフタレイン、フェ
ノールレッド、ブロムフェノールブルー　ブロムチモー
ルブルー　ブロムクレゾールグリーン、ブロムクレゾー
ルパープル等が挙げられるが、血清中の他の成分によっ
てほとんど影響を受けない点でブロムクレゾールグリー
ンおよびブロムクレゾールパープルが特に好ましい。

アルブミンと該反応試薬との反応生成物は、吸光光度法
で検出することができる。

吸光光度法により検出する場合には、その測定波長は６
００〜６５０１ｎｍである。

本発明方法を用いた装置の一実施態様例を第一図に示す
。

（発明の効果） 本発明の糖化アルブミンと非糖化アルブミンの分析方法
は、液体クロマトグラフィーにおいて、分離用カラムで
試料中の糖化アルブミンを含む糖化タンパク質画分と非
糖化アルブミンを含む非糖化タンパク質画分を分離し、
それをクロマトグラフィーの流路系外に出すことなく、
アルブミンにのみ特異的に反応する試薬と混合し、糖化
アルブミンと非糖化アルブミンをそれぞれ検出すること
を特徴とする。

本発明の方法によれば、一般の臨床検査室で迅速かつ簡
便に分析可能であり、また自動化も容易である。本発明
は、糖化アルブミンの分析普及に寄与するところ大であ
る。

（実施例） 以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらにのみ
限定されるものではない。

実施例 カラムとしては、ＴＳＫｇｅｌ　　Ｂｏｒｏｎａｔｅ−
５ＰＷ（東ソー（株）製）を内径４．６ｍｍ１長さ１ｃ
ｍのステンレスカラムに充填したものを用いた。クロマ
トグラフィーの詳細な条件を以下に示す。

試料二人血清（５μｍ） 移動相；Ａ液　５０　ｍ　Ｍ酢酸アンモニウム７２０ｍ
ＭＭｇ　ＣＩ　２／　０．　０５９ｃｉＮａＮ３　　　
　（ｐＨ８） Ｂ液　５０ｍＭ酢酸アンモニウム／ ２０ｍＭＭｇ　ＣＩ　２１０．２Ｍソ ルビトール１０．０５％ＮａＮ５ （ｐＨ８） ポンプ；ＣＣＰＭ（東ソー（株）製） 移動相流速；　０．８ｍ　ｌ／ｍ　ｉ　ｎ分離カラム温
度；２５℃ 反応試薬、０．５Ｍコハク酸１０．２ｍＭブロムクレゾ
ールパープル１０．０５％ Ｂｒ　ｉ　ｊ−３５（ｐＨ５，５） 反応試薬流速；１．５ｍｌ／ｍｉｎ 反応コイル；０．６ｍｍＸ３ｍ リアクター；ＲＥ８０１０　（東ソー（株）製）リアク
ター温度；３７℃ 検出器；ＵＶ８０１０　（東ソー（株）製）検出器波長
；　６２０ｎｍ 第二図に示すようなタイムプログラムで移動相を切換え
た。

上記条件で得られたクロマトグラムを第三図に示す。非
糖化アルブミンと糖化アルブミンが短時間（３，５分サ
イクル）で分析できることがわかる。

【図面の簡単な説明】

第一図は本発明方法を用いた装置の一実施態様例を示す
概要図、第二図は移動相のタイムプログラム、第三図は
本発明方法によって健常人血清から非糖化アルブミンと
糖化アルブミンを分離したクロマトグラムである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 糖化アルブミンと非糖化アルブミンを含む試料を分離用
   カラムで糖化タンパク質画分と非糖化タンパク質画分に
   分離した後、その溶出液をクロマトグラフィーの流路系
   外に出すことなく、アルブミンにのみ特異的に反応する
   試薬と混合反応させ、糖化アルブミンと非糖化アルブミ
   ンをそれぞれ検出することを特徴とする液体クロマトグ
   ラフィーによる糖化アルブミンと非糖化アルブミンの分
   析方法。