JPH01262469A - 糖化アルブミンの分析装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、試料中のアルブミンの分離と、糖化アルブミ
ンと非糖化アルブミンの分離を、クロマトグラフィーの
同一流路内で行う糖化アルブミンの分析装置に関する。

糖尿病のような長期間血糖値が高値を示す疾色では、さ
まざまな生体中の蛋白質が非酵素的に糖化反応を受ける
。血清アルブミンもそれらの蛋白質の一つである。

糖化アルブミンは、その半減期が１７日であり、３ケ月
前の空腹時血糖値とよく相関する指標となると言われる
糖化ヘモグロビンと比較すると、血糖状態に速やかに応
答するし、また、血糖値のように一時的な生理条件の影
響を受けて大きく変動することもない。糖尿病の診断で
は、数週間〜１ケ月程度前の血糖状態の情報が有用であ
るため、キ唐化アルブミンはこの要求に最も応え得る指
標として、最近各方面から注目を浴びている。

例えば、糖化アルブミンは現行の、または新たに変更し
た食餌療法が、その患者に適当か否かを早期に判定する
のに有効である等、その有用性が示唆されている。〔ケ
イ・エフ・マクファーランド、ダイアベンツ（Ｋａｙ　
Ｆ、Ｍｃｆａｒｌａｎｄ　ｅｔａｌ、　ＤＩＡ−ＢＥＴ
Ｓ）、２８．１０１１．１９７９、シー・アール・ガス
ロウ。

ブロク・ナタル・アカド・サイ、ニー・ニス・ニー（Ｃ
，Ｅａｒｌ　Ｇｕｔｈｒｏｗ　ｅｔａｌ、　Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ）、　　７６　Ｎａ９　、　４２５８．　１９７
９）（従来の技術） 従来、糖化アルブミンの分離方法および検出方法として
は、カルポキシメヂル型セルロース等を固定相として用
いるイオン交換クロマトグラフィー〔ジェームス・エフ
・デイ、ジェー・バイオ・ケム（Ｊａｍｅｓ　Ｆ、Ｄａ
ｙ　ｅｔａｌ、　Ｊ、Ｂｉｏ、Ｃｈｅｍ、）、　２５４
　Ｎｏ。

３、５９５，１９７９　）　、セルロース等の軟質ゲル
にジヒドロキシボロニル基を導入し、この官能基とグル
コースとの相互作用を利用するアフィニティークロマト
グラフィー〔エイ・ケイ・マリア、アナリイティカル・
レターズ（Ａ、に、Ｍａｌｌｉａ　ｅｔａｌ、Ａｎａｌ
ｙ−Ｌｉｃａｌ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）、　１４（Ｂ８）、
　６４９〜６６１．１９８１　）等が試みられている。

上記従来技術は、糖化アルブミンと非糖化アルブミンの
分離は可能であるが、それらと血清、血漿など体液中の
他の成分、例えば、免疫グロブリン’Ｆ４　（ＩｇＧ、
ＩｇＭ　等）　、ハプトグロビン、トランスフェリン等
との分離ができず、実質的に体液中の糖化アルブミンと
非糖化アルブミンを定置することはできない。

したがって、従来は試料中からアルブミンを単離した後
、−旦クロマトグラフィーの系外に出し、濃縮後、改め
て糖化アルブミンと非糖化アルブミンを分離できるカラ
ムに導くという方法がとられていた。すなわち、試料中
からアルブミンを分離する操作と、アルブミンを糖化ア
ルブミンと非糖化アルブミンとに分離する操作が、少な
くとも２段階の別個の操作として行われており、煩雑で
長時間を要していた。

これらのことが、迅速性、操作性、再現性および自動化
が要求される臨床検査の場で、現在、糖化アルブミンが
測定されず、また、そのための分析装置もない最大の原
因である。

ここで、これらの問題点を克服した糖化アルブミンの分
析方法として、特開昭６２−２２６９９９号公報に記載
の方法がある。すなわち、第１カラムで試料中からアル
ブミンを分離し、それをクロマトグラフィー〇流路系外
に出すことなく第２カラムに導き、そこでアルブミンを
糖化アルブミンと非糖化アルブミンとに分離することを
特徴とするクロマトグラフィーによる糖化アルブミンの
分離方法である。

（発明が解決しようとする課題） 上記特開昭６２−２２６９９９号に記載の実施例によれ
ば、非糖化アルブミンと糖化アルブミンは、３０分以内
で分離される。しがし、分析が終了して、次の分析を開
始するまでに、第１カラムと第２カラムを再生するため
の時間を要するため、分析サイクルは長くなり、そのた
め、臨床検査の場で用いるには、特に迅速性の点で、ま
だ、問題が残っていた。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは、前記の問題点を克服するため鋭意研究の
結果、迅速性、操作性、再現性にすぐれ、しかも、自動
化された糖化アルブミンと非糖化アルブミンの分析装置
を開発し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、液体クロマトグラフィーにより、
試料中の糖化アルブミンと非糖化アルブミンを分離分析
する装置において、■試料中からアルブミンを分離する
第１カラム、■第１カラムの下流に存在する二つの流路
切換手段の間に、該流路切換手段を介して流路に並列に
連結されて存在する、（１）で分離されたアルブミンを
糖化アルブミンと非糖化アルブミンに分離する複数の第
２カラムを有することを特徴とする糖化アルブミンの分
析装置を提供する。

本発明において、糖化アルブミンとは、グルコースと共
有結合したアルブミン、非糖化アルブミンとはグルコー
スと結合していないアルブミンを言う。

また、本発明で言うアルブミンとは、糖化アルブミンと
非糖化アルブミンの両方を指す。

本発明で言う試料とは、少なくとも糖化アルブミンと非
糖化アルブミンのどちらか、もしくはその両方を含有す
るもので、例えば、血清、血漿、溶血液、尿等の体液を
挙げることかできる。

本発明で用いる第１カラムは、アルブミンと体液中のそ
の他の成分を分離できるカラムであればよく、特に限定
されない。好ましい例として、アルブミンと親和性の高
い色素シバクロン・ブルーＦ　３　Ｇ−Ａ等を結合させ
たゲルを充填したカラム、血清中の大量成分であるＩｇ
Ｇ　（分子量：約１５万）とアルブミン（分子量：約６
．６万）とを分離できるゲル濾適用充填カラム、アミノ
基を有するイオン交換ゲル充填カラム等が挙げられる。

ただし、シバクロン・ブルー等のアルブミンと親和性の
高い物質を導入する担体およびゲル濾適用固定相担体と
しては、機械的強度、化学的安定性にすぐれ、タンパク
質の非特異吸着が少ないという理由で、架橋共重合体重
量当たりアルコール性水酸基１．　０〜１４．　　Ｏｍ
ｅｑ／ｇ　、比表面積５〜１０００イ／ｇ、保持し得る
水の量が０．　５〜６゜０　ｇ／ｇである硬質の親水性
架橋共重合体が好ましい。最も好ましい例として、特開
昭５７−３０９４５号公報記載のビニルアルコール単位
由来のアルコール性水酸基を有する架橋共重合体を挙げ
ることができる。あるいは特開昭５６−６４６５７号お
よび特開昭５９−１４５０３６号公報記載の架橋共重合
体も好ましい。

該親木性架橋共重合体にアミノ基を導入する方法として
は、例えば、次の方法を挙げることができる。すなわち
、上記の親水性架橋共重合体とエピハロヒドリンビスエ
ポキシド等を反応させ、エポキシ基含有架橋共重合体を
得、ついで、アンモニア、エチルアミン等の一級アミン
、ジエチルアミン等の二級アミンを反応させることによ
って得ることができる。

アミノ基としては、置換基を有しないアミノ基、エチル
アミノ基等の一置換アミノ基、ジエチルアミノ基等の二
置換アミノ基を挙げることができる。

アミノ基の量は、架橋共重合体重量当たりｏ、０２〜５
．０＋＋ｅｑ／ｇであり、好ましくは０．０５〜２　、
　　Ｏｍｅｑ／ｇであり、さらに好ましくは０．２〜１
　、　０　ｔａｅｑ／ｇである。

チバクロンブルーＦ　３　Ｇ−Ａを導入する方法として
は、例えば、該親水性架橋共重合′体の水酸基にブロム
シアンを反応させ、ついで、チバクロンブルーＦ　３　
Ｇ−Ａを反応させる方法を挙げることができる。

チバクロンブルーＦ３Ｇ−Ａの量は、架橋共重合体重量
当たり０．　　ＯＯ２〜１．　　Ｏｍｅｑ／ｇであり、
好ましくは０．　００５〜０．　０５ｍｅｑ／ｇである
。

これらのゲルのうち、親水性架橋共重合体にアミノ基を
導入したゲルが特に好ましい。

本発明で用いる最も好ましい例として、特開昭６０−１
５０８３９号公報記載のビニルアルコール単位由来のア
ルコール性水酸基とジエチルアミノ基を有する架橋共重
合体を挙げることができる。

この架橋共重合体は、特願昭６０−１２２２号記載の方
法により、アルブミンと体液中の他の成分を迅速に分離
することが可能である。

本発明で用いる第２カラムは、イオン交換ゲルまたはジ
ヒドロキシボロニル基を有するゲルを充填したカラム等
が挙げられるが、少なくとも糖化アルブミンと非糖化ア
ルブミンが分離できればよく、特に限定されない。

イオン交換ゲルを用いる場合、言うまでもなく、糖化ア
ルブミンと非糖化アルブミンのわずかな等電点の差を利
用するわけであるが、イオン交換基は陽イオン交換基の
方が好ましく、中でもカルボキシル基、スルホン酸基等
が特に好ましい。

また、ジヒドロキシボロニル基は、１．２−シスジオー
ルを有する化合物と特異的に結合するため、この官能基
を有するゲルを固定相としたアフィニティークロマトグ
ラフィーも、糖化アルブミンと非糖化アルブミンの分離
に有効である。

これらの官能基を導入する固定相担体としては、従来液
体クロマトグラフィー用固定相担体として一般的に用い
られているセルロース、アガロース等の多Ｉ！類の軟質
ゲル、シリカゲル、スチレン−ジビニルベンゼン系共重
合体等が挙げられるが、機械的強度、化学的安定性にす
ぐれ、タンパク質の非特異吸着が少ないという点で、架
橋共重合体重量当たりアルコール性水酸基１，０〜１４
．Ｏｍｅｑ／ｇ　、比表面積５〜１０００ｒｒｆ／ｇ、
保持し得ろ水の量が０．５〜６．０ｇ／ｇである硬質の
親水性架橋共重合体が好ましい。最も好ましい例として
、特開昭５７−３０９４５号、特開昭５６−６４６５７
号および特開昭５４−１４５０３６号公報記載の架橋共
重合体を挙げることができる。

上記の親水性架橋共重合体にジヒドロキシボロニル基を
導入する方法としては、次の方法を挙げることができる
。すなわち、上記の親水性架橋共１ｉ合体とエビハロヒ
ドリン、ビスエポキシド等を反応させ、エポキシ基含有
架橋共重合体を得、ついで、メタアミノフェニルボロン
酸を反応させることによって得ることができる。

また、カルボキシル基を導入する方法としては、例えば
、モノクロロ酢酸やモノブロモ酢酸等のハロゲン化酢酸
を、該親水性架橋共重合体の水酸基と反応させる方法を
挙げることができる。

さらに、スルホン酸基を導入する方法としては、例えば
、プロパンスルトンを該親水性架橋共重合体の水酸基と
反応させる方法を挙げることができる。

ジヒドロキシボロニル基の量は、架橋共重合体重量当た
り０．０５〜５．０ｍｅｑ／ｇであり、好ましくは０．
　０５〜３．　０ｍｅｑ／ｇ　、さらに好ましくは０．
　１〜２．　０ｍｅｑ／ｇである。

カルボキシル基またはスルホン酸基の量は、架橋共重合
体重量当たり０．０２〜５　、　０　ｍｅｑ／ｇであり
、好ましくは０．０５−２．０ｍｅｑ／ｇであり、さら
に好ましくは０．２〜１　、　　Ｏｍｅｑ／ｇである。

これらのゲルのうち、親水性架橋共重合体にジヒドロキ
シボロニル基を導入したゲルが特に好ましい。本発明で
用いる最も好ましい例として、特開昭６２−１９２４０
５号記載のアルコール性水酸基とジヒドロキシボロニル
基を有するホウ素含有架橋共重合体を挙げることができ
る。

本発明において用いられる官能基を固定化し７たゲルの
形状は、球状、破砕状等種々挙げることができるが、好
ましくは球状である。その場合、重量平均粒径は１〜５
００μｍであり、好ましくは１〜２０μｍ、さらに好ま
しくは１〜１０μｍである。

本発明の装置の一例のフローダイアグラムを第１図に示
す。

第１図において、移動相のＡ液と、Ｂ液がそれぞれ送液
ポンプ１により送液され、試料注入部より注入された試
料は、移動相とともに第１カラムに送入され、試料中の
アルブミンと他の成分が分離される。アルブミン以外の
成分が溶出される間、第１カラムからの溶出液は、流路
切換手段２を介して流路系外に排出され、また、送液ポ
ンプ２から送液される移動相Ａ液は、流路切換手段ｌを
介して１木目の第２カラムに送られ、該カラムを平衡化
しておく。次いで、第１カラムからアルブミンが溶出さ
れると、流路切換手段１の作動により、アルブミンのみ
が１木目の第２カラムに導入される。移動相をＡ液から
Ｂ液に切り換えることにより、１木目の第２カラムで糖
化アルブミンと非糖化アルブミンは分離され、検出器に
送入される。

その間、送液ポンプ２により、移動相Ａ液が流路切換手
段ｌを介して２木目の第２カラムに送られ、流路切換手
段２を介して流路系外に排出されつつ、２木目の第２カ
ラムは再生、平衡化される。１木目の第２カラムでの分
析が終了すると、次の分析のための試料が注入され、第
１カラムで分離されたアルブミンは、流路切換手段１お
よび２の作動により２木目の第２カラムに導入される。

なお、第１カラムでのアルブミンの分離の確認のために
、第１カラムの出口と流路切換手段１０間にモニター用
の検出器を備えることができる。

次に、本発明で用いる移動相について述べる。

糖化アルブミンと非糖化アルブミンを分離するため、あ
るいは糖化タンパク質と非糖化タンパク質を分離するた
めの充填剤として、ジヒドロキシボロニル基が固定化さ
れたゲルを用い、アルブミンとその他の成分を分離する
ための充填剤として、アミノ基が固定化されたゲルを用
いる場合は、少なくとも２種類の移動相（Ａ液とＢ液）
を用意し、途中でＡ液からＢ液に切り換える方法を好ま
しい方法として挙げることができる。Ａ液からＢ′ｅ、
への切り換えは、ステップワイズに行うこともできるし
、連続的に比率を変える、いわゆるグラジエシト法で行
うこともできる。

ここで言うＡ液は、１０〜５００ｍＭの緩衝用基剤を存
し、１．２−シスジオールを有する物質を含有しないｐ
Ｈ７，５〜９．５の水溶液が好ましい６緩衝用基剤とし
ては、ｐＨ７，５〜９．５において緩衝能を有する基剤
が好ましいが、特に好ましい基剤としては、酢酸アンモ
ニウム等のアンモニウム塩、モルフォリン、Ｎ−２−ヒ
ドロキシエチルピペラジンＮ°　−２−エタンスルホン
酸等を・子げることができる。これらの緩衝用基剤は、
ジヒドロキシボロ、−ル基と糖化アルフ゛ミンなどの糖
化タンパク質の糖の部分の結合を強めることができるた
め、糖化アルブミンなどの糖化タンパク質と、非糖化タ
ンパク質を高度に分離するのに有効である。ｐ　Ｈが７
，５より低いと、ジヒドロキシボロニル基と糖の結合が
弱くなり好ましくない。

また、ｐＨが９．５より高くなると、アルブミン等のタ
ンパク質が変成し、沈澱を生ずるおそれがあり好ましく
ない。また、Ａｅｉ、は緩衝用基剤以外の塩を含むこと
ができる。特に、二価金属イオンの塩、例えば、塩化マ
グネシウム等を含むことにより、糖鎖とジヒドロキシボ
ロニル基の結合を強めることができ好ましい。二価金属
イオンの塩の濃度は、好ましくは５ｍＭ〜１００ｍＭで
ある。１価金属イオンの塩、例えば、塩化ナトリウム等
も含むことができ、その濃度は、好ましくは５００１以
下である。

一方、Ｂ液は１０〜５００ｍＭの緩衝用基剤を有するｐ
　Ｈ２〜６．５の水溶液が好ましく、ｐＨ７゜５以上で
も１，２−シスジオールを有する物質を含んでいればよ
い。その場合もｐＨ９゜５以下が好ましい。この条件を
用いると、ジヒドロキシボロニル基と糖鎖の結合を弱め
ることができ、ジヒドロキシボロニル基に結合した糖化
アルブミン等の糖化タンパク質を溶出させることができ
る。

緩衝用基剤としては、使用ｐＨにおいて緩衝能を有する
緩衝用基剤が好ましいが、特に好ましい例として、トリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トリエタノール
アミン等を挙げることができる。これらの緩衝用基剤は
、ジヒドロキシボロニル基と糖鎖の結合を弱めることが
でき、ジヒドロキシボロニル基と結合した糖化タンパク
質の溶出を容易にする。

■、２−シスジオールを有する物質としては、例エバ、
ソルビトール、マンニトール等の糖類ヲ挙げることがで
きる。１，２−シスジオールを有する物質の濃度は、５
０〜２０００ｍＭが好ましい。

さらに、Ａ液が二価金属イオンの塩を含有する場合は、
Ｂ液にエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等の金属キ
レート剤を添加することが好ましい。その場合、金属キ
レート剤の濃度は５〜１００ｍＭが好ましい。Ａ、Ｂ両
液共に、例えば、エタノール、メタノール、アセトニト
リル、エチレングリコール等の水溶性の有機溶媒を少量
含有している方が好ましい場合がある。

本発明で用いるカラムの形状は特に限定はされないが、
好ましくは内径１０Ｍ以下、長さ３０１以下カ好マしく
、内径２〜８ＩＩＩＩ１１、長さ１〜１０ｃｍが特に好
ましい。移動相の流量も特に限定はないが、０．１〜１
０ｍ／ｒｓｉｎが好ましく、特に好ましくは０　、　３
〜５　ｍｆｌ／１ｌｌｉｎである。

本発明における流路切換手段は、流路を切り換えること
ができるものであれば、特に限定されないが、六方切換
バルブ等の流路切換手段が好ましい。

本発明においては、流路切換手段２の下流に、例えば、
紫外吸光検出器、蛍光検出器等を接続することにより、
糖化アルブミン、非糖化アルブミンをそれぞれ検出、定
量することができる。

（発明の効果） 本発明の糖化アルブミン分析装置は、１回の試料注入操
作のみで、試料中の糖化アルブミンと非糖化アルブミン
を分離、定量する方法を実施する際に、従来は、長時間
を要した１回の分析時間を大幅に短縮した。。

本発明では、第１カラムには一定組成の移動相が流れて
いるため、また、分析後の第２カラム再生のための移動
相は、第１カラムを経由せずに短い流路を通って第２カ
ラムに達するために、分析が終了して次の分析の開始ま
での時間が大幅に短縮された。

本発明の装置は、自動化が可能であり、その結果、迅速
、簡便に、かつ再現性よく、糖化アルブミンと非糖化ア
ルブミンの分析ができる。

（実施例） 本発明の一実施例を第２図に示す構成説明図に基づいて
説明する。

第２図において、（１）は移動相Ａ法用容器、（２）は
移動相Ｂ液層容器で、その流路は、移動相切換バルブ（
３）、送液ポンプＡ（４）および試料注入部（５）を介
して第１カラム（６）に連結し、第１カラム（６）に連
結した蛍光検出器Ａ（７）の下流に、二つの流路切換バ
ルブＡ（８）および流路切換バルブＢ０１）が配設され
、この二つの流路切換バルブの間に、第２カラムＡ（９
）および第２カラムＢＯｆｆｌが並列に連結されている
。

また、流路切換バルブＡ（８）には、移動相Ａ法用容器
θりの流路が送液ポン１８面を介して連結され、流路切
換バルブＢ（ＩＩ）には、蛍光検出器Ｂ０４）が連結さ
れている。０５１はデーター処理機、０ωは試料冷却機
、０７）はカラム用恒温槽、０８）は自動制御システム
である。

第１カラムは、特開昭６０−１５０８３９号公報の実施
例１に記載のゲル（重量平均粒径９．０ｇｍ、水酸基密
度４．９ｍｅｑ／ｇ　、保持できる水の量が１．９ｇ／
ｇ、ジエチルアミノ基が０．５ｍｅｑ／ｇ　）を内径７
．５ｓａ、長さ１００ｍｍのステンレス製カラムに充填
したものを用いた。

第２カラムは、次のようにしで作成したものを用いた。

特開昭５７−３０９４５号公報の実施例１に記載のビニ
ルアルコールコポリマーゲル（Ｘ；０゜３、水酸基量；
　７．　８ｍｅｑ／ｇ　、保持し得る水の量；１，７８
ｇ／ｇ、比表面積；７８ボ／ｇ、粒径；９．０μｍ）２
５ｇに、エピクロルヒドリン１１６．８ｇ、ジメチルス
ルフオキシド２５０ｍｆ。

１ＯＮ水酸化ナトリウム水溶液１２゜５　ｍｌを加え、
３０°Ｃで２００時間反応せた。エポキシ基の導入量は
１　、　　Ｏｍｅｑ／ｇであった。なお、エポキシ基の
定量法は、特開昭５７−１９０００３号公報に記載の方
法で行った。

次に、ｍ−アミノフェニルボロン酸ヘミ硫酸塩１３ｇを
２５０ｄの水に溶解し、ＰＨＩＩとしたものに先のエポ
キシ基導入ポリマー２０ｇを加え、６０°Ｃで２００時
間反応行った。次に、残存エポキシ基を保護するために
２５ＩＩＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを
加え、５０°Ｃで５時間反応を行った。ボロン酸の導入
量は０．２８ｍｅｑ／ｇであった。ボロン酸の定量は以
下の方法によった。

上記のｍ−アミノフェニルボロン酸を導入したポリマー
１ｇに３０％過酸化水素水１０−を加え、５時間反応さ
せることによって、ホウ素−炭素結合を切断した０次に
、ポリマーを遠沈し、その上清を採取した。これを脱炭
酸後、糖を加えることによってホウ酸エステルを形成さ
せ、強酸化し、水酸化ナトリウムで滴定することによっ
てホウ酸を定量した。

なお、この分析に用いた器具は、すべて石英製である。

ｍ−アミノフェニルボロン酸を導入した共重合体の水酸
基密度は９．　２ｍｅｑ／ｇ　　（ジヒドロキシボロニ
ル基切断後〕、保持し得る水の量は１．　７０ｇ／ｇで
あった。また、粒径、比表面積は導入前と同じであった
。

なお、保持し得る水の量および比表面積は、特開昭５７
−３０９４５号公報に記載の方法で求めた。

上記のアミノフェニルボロン酸導入共重合体を内径６Ｉ
ＩＩＩ１１．長さ１００ｍｍのステンレス製カラムに充
填し、第２カラムとした。

この分析装置の作動について説明すると、流路切換によ
り以下に示すステップに分かれて作動する。

ステップＩ（試料注入から第１カラムでのフルアミノ分
離まで） まず、カラム用恒温槽ａ′７）により、第１カラム（６
）、第２カラムＡ（９）および第２カラムＢＱωを２０
〜６０℃に保持しておく。試料は試料冷却機θωにより
０〜ｌＯ°Ｃに保持される。次いで、移動゛相切換パル
プ（３）、流路切換バルブＡ（８）および流路切換バル
ブＢ（ＩＩ）を実線流路にしておき、移動相Ａ法用容器
（＋）中の移動相Ａ液を送液ポンプ（４）により送液し
、試料注入部（５）から試料を注入する。注入された試
料は、第１カラム（６）に導入され、分離された後に蛍
光検出器Ａ（７）に送られる。分離されたアルブミンが
蛍光検出器Ａ（７）から出るまでの間、第１カラム（６
）からの溶出液は、流路切換バルブＡ（８）から流路切
換バルブＢ（Ｉりを経て、流路系外に排出される。

この間、移動相Ａ法用容器０２）中の移動相Ａ液が送液
ポンプＢＯ３）により、流路切換バルブＡ（８）を経て
第２カラムＡ（９）に送液され、第２カラムＡ（９）を
平衡化しておく。

ステップ■（試料中のアルブミンの第２カラムＡへの導
入） 第１カラム（６）により分離された試料中のアルブミン
が蛍光検出器Ａ（７）を通過した後、流路切換バルブＡ
（８）は破線流路に切り換えられ、その結果、蛍光検出
器Ａ（７）からの溶出液は、流路切換バルブＡ　（８）
　ヲ経て第２カラムＡ（９）に送られる。このステップ
では、送液ポンプＢ（１３）から送液される移動相Ａ法
用容器０の中の移動相Ａ液は、流路切換バルブＡ（８）
を経て第２カラムＢＯωに送られ、第２カラムＢＯωを
再生する。第２カラムＢＯωからの溶出液は、流路切換
バルブＢ（１０を経て流路切換バルブＡ（８）を通り、
再度、流路切換バルブＢ０１）を経て流路系外に排出さ
れる。

ステップ■（第２カラムＡによる糖化アルブミンと非糖
化アルブミンの分離のス テップ） 次に、移動相切換バルブ（３）が破線流路に切り換えら
れ、移動相Ｂ法用容器（２）中の移動相Ｂ液が送液ポン
プ（４）により、上記ステップ■の流路を通って第２カ
ラムＡ（９）に送られる。第２カラムＡ（９）で分離さ
れた糖化アルブミンおよび非糖化アルブミンは、流路切
換バルブＢ（ＩＩ）を経て蛍光検出器Ｂ０４）に送られ
、その検出結果は、蛍光検出器Ａ（７）の検出結果とと
もにデータ処理機０ωにより処理される。

この間、ステップ■と同様にして、第２カラムＢ０■は
送液ポンプＢ（１３）からの送液により再生される。

ステップ■（次の試料注入から第１カラムでのアルブミ
ン分離まで） 流路、移動相等はすべてステップＩと同様にして、ステ
ップ■と同様の作動を行う。

ステップＶ（試料中のアルブミンの第２カラムＢへの導
入） 第１カラム（６）により分離された試料中のアルブミン
が蛍光検出器Ａ（７）を通過した後、流路切換バルブＢ
（１１）は破線流路に切り換えられる。その結果、蛍光
検出器Ａ（７）からの溶出液は、流路切換バルブＡ（８
）、流路切換バルブＢ（ＩＩ）、流路切換バルブＡ（８
）の順に流れて、第２カラムＢ００）に送入される。こ
のステップでは、送液ポンプＢＱ３）から送液される、
移動相Ａ法用容器０２）中の移動相Ａ液は、流路切換バ
ルブＡ（８）を経て第２カラムＡ（９）に送られ、第２
カラムＡ（９）を再生する。第２カラムＡ（９）からの
溶出液は、流路切換バルブＢ（ＩＩ）を経て流路系外に
排出される。

ステップ■（第２カラムＢによる糖化アルブミンと非糖
化アルブミンの分離のス テップ） 次に、移動相切換パルプ（３）が破線流路に切り換えら
れ、移動相Ｂ法用容器（２）中の移動相Ｂ液が送液ポン
プ（４）により、上記ステップ■の流路を通って第２カ
ラムＢθ口）に送られる。第２カラムＢＯωで分離され
た糖化アルブミンおよび非糖化アルブミンは、流路切換
バルブＢ（ＩＩ）を経て蛍光検出器Ｂ０４）に送られ、
その検出結果は、蛍光検出器Ａ（７）の検出結果ととも
にデータ処理機０つにより処理される。

この間、ステップＶと同様にして、第２カラムＡ（９）
は送液ポンプＢＯ３）からの送液により再生される。

ステップ■の終了後は、ステップＩに戻り分析が繰り返
される。なお、以上の作動は、自動制御システム側で制
御される。

上記装置を用いて、糖化アルブミンおよび非糖化アルブ
ミンを含む試料の分析を行った一例を示す。分析条件は
以下の通りである。

試　料：健常者血清（５μり 移動相：　（Ａ液）　２５０ｍＭ酢酸７７モ、：−ラム
、５０ｍＭ塩化マグネシウムおよび２００ｍＭ 塩化ナトリウムを含む水溶液（ｐ Ｈ８，５）／エタノール＝９５１５ （Ｂ液）　１００ｍＭ　　ｌ−リス（ヒドロキシメチル
）アミノメタン、１００ａ＋Ｍソル ビトールおよび　５０ｍＭ　ＥＤＴ＾ ２Ｎａを含む水溶液（ｐＨ８，５） 流量：１．Ｏａｅ／分 温度：　３０　’Ｃ 検　出：蛍光検出器Ａおよび蛍光検出器Ｂともに励起波
長：　２８５　ｎｍ、蛍光波長：　３４０　ｎｍこの結
果を第３図および第４図に示す。第３図は第１カラムに
よる試料中のアルブミン分離の結果を、第４図は第２カ
ラムによる糖化アルブミンと非糖化アルブミンの分離の
結果を示すものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の糖化アルブミン分析装置の一例を示す
フローダイアダラム、第２図は本発明の装置の一実施例
を示す構成説明図、第３図および第４図は本発明の装置
を用いて試料の分析を行って得られたクロマトグラムで
ある。 ■・・移動相Ａ成用容器　　２・・移動相Ｂ成用容器　
　３・・移動相切換バルブ　　４・・送液ポンプＡ　　
５・・試料注入部　　６・・第１カラム　　７・・蛍光
検出器Ａ　　８・・流路切換バルブＡ　　９・・第２カ
ラムＡ　　　１０・・第２カラムＢ　　　１１・・流路
切換バルブＢ　　　１２・・移動相Ａ成用容器　　Ｉ３
・・送液ポンプＢ１４・・蛍光検出器Ｂ　　　１５・・
データ処理機１６・・試料冷却機　　１７・・カラム用
恒温槽１８・・自動制御システム 柩３図 （分） 幣４図 手続補正書 昭和６３年６月１３日 特許庁長官　小　川　邦　夫　殿 ｌ　事件の表示 特願昭６３−８９３０３号 ２　発明の名称 糖化アルブミンの分析装置 ３　補正をする者 事件との関係・特許出願人 （００３）旭化成工業株式会社 ４代理人 東京都港区虎ノ門−丁目２番２９号虎ノ門産業ビル５階
６　補正の内容 明細書第１８頁１６〜１９行の「第１カラムは・・・・
達するために」を下記のとおり補正する。 ［１本口の第２カラムを分離に用いている間に、２木目
の第２カラムに第２カラム再生のための移動相を流すた
めに」 （ばか１名）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 液体クロマトグラフィーにより、試料中の糖化アルブミ
   ンと非糖化アルブミンを分離分析する装置において、（
   １）試料中からアルブミンを分離する第１カラム、（２
   ）第１カラムの下流に存在する二つの流路切換手段の間
   に、該流路切換手段を介して流路に並列に連結されて存
   在する、（１）で分離されたアルブミンを糖化アルブミ
   ンと非糖化アルブミンに分離する複数の第２カラムを有
   することを特徴とする糖化アルブミンの分析装置。