CN109608516A - 蜂王浆主蛋白1、2、3的快速纯化方法 - Google Patents

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Abstract

蜂王浆主蛋白1、2、3的快速纯化方法，包括步骤：将蜂王浆溶于pH7的缓冲液A中，震荡过夜；取混合液进行低温离心，取上清用滤膜过滤；将上清上样到用缓冲液A平衡过的预装弱阳离子层析柱；以缓冲液A按照预定流速冲洗柱子，得蜂王浆主蛋白1；通过层析仪的梯度混合器将缓冲液A和缓冲液B按比例混合，并逐渐提高缓冲液B的比例，对柱子进行梯度洗脱，依次将结合在柱子上的蜂王浆主蛋白2和3洗脱下来。本发明的蜂王浆主蛋白1、2、3的快速纯化方法重复性好，产量高，操作简单、方便快捷，可级联放大，充分满足科研和规模化生产的需要，克服了传统分离方法存在的耗时费力、成本高、收率低等缺陷，优化了蜂王浆主蛋白的提取工艺。

Description

蜂王浆主蛋白1、2、3的快速纯化方法
技术领域
本发明涉及化学提取、分离，具体涉及蜂王浆主蛋白1、2、3的快速纯化方法。
背景技术
蜂王浆的蛋白组分主要由蜂王浆主蛋白1、2、3组成，蜂王浆主蛋白1、2、3各具有独特的生理功能，均有益于人类健康。传统的蜂王浆主蛋白1、2、3的纯化方法主要有透析、多种层析分离方法叠加组合等，不仅耗时、费力而且成本高、收率低，难以满足生物学研究所需，也不适合规模化生产。因此，开发一种简单快速的蜂王浆主蛋白纯化方法是必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蜂王浆主蛋白1、2、3的快速纯化方法，以克服传统分离方法存在的耗时费力、成本高、收率低等缺陷。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案具体如下：
蜂王浆主蛋白1、2、3的快速纯化方法，包括步骤：
S1：将蜂王浆溶于pH7的缓冲液A中，震荡过夜；
S2：取步骤S1中的蜂王浆与缓冲液A的混合液进行低温离心，之后取上清用滤膜过滤；
S3：将步骤S2中过滤后的上清上样到用缓冲液A平衡过的预装弱阳离子层析柱；
S4：以5-10倍柱体积的缓冲液A按照1ml/min的流速冲洗柱子，得蜂王浆主蛋白1；
S5：通过层析仪的梯度混合器将缓冲液A和pH7.5的缓冲液B按比例混合，以缓冲液A和缓冲液B的混合液按照1ml/min的流速对柱子进行梯度洗脱，并逐渐提高缓冲液B的比例，依次将结合在柱子上的蜂王浆主蛋白2和3洗脱下来。
作为本发明进一步改进的技术方案，所述步骤S1中的蜂王浆与缓冲液A的重量体积比为1：5。
作为本发明进一步改进的技术方案，所述步骤S2具体包括：取步骤S1中的蜂王浆与缓冲液A的混合液，于4℃，20000g条件下离心20分钟后，取上清，上清用0.2微米孔径的滤膜过滤。
作为本发明进一步改进的技术方案，所述步骤S5具体包括：通过层析仪的梯度混合器将缓冲液A和pH7.5的缓冲液B按比例混合，以缓冲液A和缓冲液B的混合液按照1ml/min的流速对柱子进行梯度洗脱，且混合液中的缓冲液B的比例在20分钟内从0提高到100％，依次将结合在柱子上的蜂王浆主蛋白2和3洗脱下来。
作为本发明进一步改进的技术方案，所述步骤S5之后还包括步骤S6：将分离纯化的蜂王浆主蛋白1、2、3浓缩后，-80℃分装保存。
作为本发明进一步改进的技术方案，在所述步骤S4和S5的蛋白洗脱过程中，用280纳米的紫外检测器进行检测，出现蛋白峰即进行收集。
作为本发明进一步改进的技术方案，所述缓冲液A的组成为22mM NaH2PO4，3mMNa2HPO4，2mM二硫苏糖醇，0.05％NaN3。
作为本发明进一步改进的技术方案，所述缓冲液B的组成为2M NaCl，84mMNa2HPO4，16mM NaH2PO4，2mM二硫苏糖醇，0.05％NaN3。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明的蜂王浆主蛋白1、2、3的快速纯化方法重复性好，产量高，可级联放大，如采用大体积层析填料，可大量生产蜂王浆主蛋白1、2、3，可充分满足科研和规模化生产的需要。操作简单、方便快捷，可在半小时内将蜂王浆主蛋白1、2、3分离纯化出来，克服了传统分离方法存在的耗时费力、成本高、收率低等缺陷，优化了制备蜂王浆主蛋白的提取工艺，为规模分离纯化蜂王浆主蛋白奠定了基础。
附图说明
图1为本发明实施例中的蜂王浆主蛋白1、2、3的层析洗脱图谱；
图2为本发明实施例中的各个蛋白峰的SDS-PAGE电泳图；
图3为本发明实施例中的蜂王浆主蛋白1、2、3的Western印迹，从左往右依次为蜂王浆主蛋白1、2、3。
具体实施方式：
实施例：
一种蜂王浆主蛋白1、2、3的快速纯化方法，包括：蜂王浆按照1：5(w/v)溶于缓冲液A(22mM NaH2PO4，3mM Na2HPO4，2mM二硫苏糖醇，0.05％NaN3(0.05g/100mL)，pH7)里，震荡过夜，以便于蜂王浆蛋白彻底溶解于缓冲溶液中。在4℃，20000g条件下离心20分钟后，取上清。上清用0.2微米孔径的滤膜过滤后，上样到用缓冲液A平衡过的预装弱阳离子层析柱HiTrap Capto MMC column(GE Healthcare Life Science，Piscataway，NJ，USA)。以5-10倍柱体积的缓冲液A按照1ml/min的流速冲洗柱子，此时，未结合在柱子上的蜂王浆主蛋白1作为透过洗下来。随后，通过层析仪的梯度混合器将缓冲液A和B按比例混合，逐渐提高缓冲液B(2M NaCl，84mM Na2HPO4，16mM NaH2PO4，2mM二硫苏糖醇，0.05％NaN3(0.05g/100mL)，pH7.5)的比例(20分钟内，缓冲液B的比例从0提高到100％，即缓冲液A的比例从100％降到0)，对柱子进行梯度洗脱。仍然按照1ml/min的流速，在20分钟内，可依次将结合在柱子上的蜂王浆主蛋白2和3洗脱下来。与柱子结合较弱的蜂王浆主蛋白2首先被洗脱下来，其次与柱子结合较强的蜂王浆主蛋白3被洗脱下来。整个蛋白洗脱过程用280纳米的紫外检测器进行检测，每出现蛋白峰即可收集。蜂王浆主蛋白1、2、3的层析洗脱图谱如图1所示。
每个蛋白峰组成可以用SDS-PAGE电泳系统检测，蛋白纯度也可以用SDS-PAGE电泳系统检测，检测除了目的蛋白外，是否有杂蛋白带。蛋白浓度可通过Bradford方法，用酶标仪检测。分离纯化的蛋白浓缩后，-80℃分装保存。所有的SDS-PAGE电泳采用Laemmli系统，选用10％的分离胶和5％积层胶。跑完胶后用考马斯亮蓝R250染色(0.25克考马斯亮蓝R250溶解于100毫升的45％甲醇、10％冰醋酸混合液)2-4小时，随后用30％甲醇，10％冰醋酸脱色。各蛋白峰的SDS-PAGE检测结果如图2所示，蜂王浆主蛋白1、2、3的Western印迹如图3所示，SDS-PAGE电泳上的蛋白带的质谱鉴定结果如下表1所示。
表1SDS-PAGE电泳上的蛋白带的质谱鉴定结果
其中，序列号Accession number是NCBI(National Center for BiotechnologyInformation，美国国立生物技术信息中心)数据库中每个蛋白唯一的识别标志，蛋白数据库是2016年2月8日下载。质谱数据采用PEAKS软件8.5(Bioinformatics SolutionsInc.waterloo，Canada)进行搜库。-10lgP值由P值转换过来的，代表蛋白鉴定的确定性、显著性。Peptides是鉴定出来的蛋白的肽段数。Unique peptide是鉴定出来的蛋白所特有的肽段数目。Sequencecoverage是鉴定出来的肽段氨基酸序列长度占蛋白序列总长度的比率。MRJP为蜂王浆主蛋白(major royal jelly protein)。
采用上述方法可快速高效的分离纯化蜂王浆主蛋白1、2、3，采用1毫升的小型预装柱，每次上样5毫克蜂王浆蛋白，即可在30分钟内同时得到1.17±0.11毫克蜂王浆主蛋白1,0.41±0.05mg蜂王浆主蛋白2,以及0.75±0.08mg蜂王浆主蛋白3。如采用大体积层析填料，可大量生产蜂王浆主蛋白1、2、3，能充分满足科研和规模化生产的需要。从而克服了传统分离方法存在的耗时费力、成本高、收率低等缺陷，优化了制备蜂王浆主蛋白的提取工艺，为规模分离纯化蜂王浆主蛋白奠定了基础。

Claims (8)

1.蜂王浆主蛋白1、2、3的快速纯化方法，其特征在于，包括步骤：
S1：将蜂王浆溶于pH7的缓冲液A中，震荡过夜；
S2：取步骤S1中的蜂王浆与缓冲液A的混合液进行低温离心，之后取上清用滤膜过滤；
S3：将步骤S2中过滤后的上清上样到用缓冲液A平衡过的预装弱阳离子层析柱；
S4：以5-10倍柱体积的缓冲液A按照1ml/min的流速冲洗柱子，得蜂王浆主蛋白1；
S5：通过层析仪的梯度混合器将缓冲液A和pH7.5的缓冲液B按比例混合，以缓冲液A和缓冲液B的混合液按照1ml/min的流速对柱子进行梯度洗脱，并逐渐提高缓冲液B的比例，依次将结合在柱子上的蜂王浆主蛋白2和3洗脱下来。
2.根据权利要求1所述的蜂王浆主蛋白1、2、3的快速纯化方法，其特征在于，所述步骤S1中的蜂王浆与缓冲液A的重量体积比为1：5。
3.根据权利要求1所述的蜂王浆主蛋白1、2、3的快速纯化方法，其特征在于，所述步骤S2具体包括：取步骤S1中的蜂王浆与缓冲液A的混合液，于4℃，20000g条件下离心20分钟后，取上清，上清用0.2微米孔径的滤膜过滤。
4.根据权利要求1所述的蜂王浆主蛋白1、2、3的快速纯化方法，其特征在于，所述步骤S5具体包括：通过层析仪的梯度混合器将缓冲液A和pH7.5的缓冲液B按比例混合，以缓冲液A和缓冲液B的混合液按照1ml/min的流速对柱子进行梯度洗脱，且混合液中的缓冲液B的比例在20分钟内从0提高到100％，依次将结合在柱子上的蜂王浆主蛋白2和3洗脱下来。
5.根据权利要求1所述的蜂王浆主蛋白1、2、3的快速纯化方法，其特征在于，所述步骤S5之后还包括步骤S6：将分离纯化的蜂王浆主蛋白1、2、3浓缩后，-80℃分装保存。
6.根据权利要求1所述的蜂王浆主蛋白1、2、3的快速纯化方法，其特征在于，在所述步骤S4和S5的蛋白洗脱过程中，用280纳米的紫外检测器进行检测，出现蛋白峰即进行收集。
7.根据权利要求1所述的蜂王浆主蛋白1、2、3的快速纯化方法，其特征在于，所述缓冲液A的组成为22mM NaH2PO4，3mM Na2HPO4，2mM二硫苏糖醇，0.05％NaN3。
8.根据权利要求1所述的蜂王浆主蛋白1、2、3的快速纯化方法，其特征在于，所述缓冲液B的组成为2M NaCl，84mM Na2HPO4，16mM NaH2PO4，2mM二硫苏糖醇，0.05％NaN3。
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