CN114437170A - 一种从蜂王浆提取纯化的王浆主蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从蜂王浆提取纯化的王浆主蛋白的方法；包括有以下方法步骤：S1、配置缓冲液实现对蜂王浆进行震荡处理；S2、将溶液一进行过滤处理；S3、将溶液二进行离心处理；S4、对离心上层液进行蛋白沉淀；S5、对获得的王浆主蛋白进行提纯处理；本发明通过缓冲液的设定实现对蜂王浆进行缓和，并且保持蜂王浆中的主蛋白活性，不会造成失活，并且截留分子量为100kDa的超滤膜实现对蜂王浆中的杂质进行有效的过滤，然后再通过离心设备和截留分子量为49kDa的超滤膜实现对蜂王浆主蛋白进行有效的粗提取，保持蜂王浆主蛋白中的杂质较少，然后再通过离子交换色谱实现对蜂王浆主蛋白进行提纯，使得蜂王浆主蛋白能够纯度较高。
Description
技术领域
本发明属于蛋白提取纯化技术领域，具体涉及一种从蜂王浆提取纯化的王浆主蛋白的方法。
背景技术
蜂王浆，又名蜂皇浆、蜂皇乳、蜂王乳、蜂乳，是蜜蜂巢中培育幼虫的青年工蜂咽头腺的分泌物，是供给将要变成蜂王的幼虫的食物，也是蜂王终生的食物，蜂王浆的蛋白组分主要由蜂王浆主蛋白1、2、3组成，蜂王浆主蛋白1、2、3各具有独特的生理功能，均有益于人类健康。但是传统的蜂王浆主蛋白1、2、3的纯化方法主要有透析、多种层析分离方法叠加组合等，然而市面上各种的提取纯化仍存在各种各样的问题。
如授权公告号为CN103772497A所公开的蜂王浆中得到王浆主蛋白和活性滤后液的超滤膜分离方法，其虽然实现了MRJPs的提取率达到82.63％，经冷冻干燥成为蛋白含量大于70％的冻干粉；滤后液用于制备饮料，实现王浆的综合利用，但是并未解决现有蜂王浆主蛋白提取纯化存在的不能够保持蛋白的活性，以及不能够实现对主蛋白进行粗提纯和细提纯，提高主蛋白的纯度等的问题，为此我们提出一种从蜂王浆提取纯化的王浆主蛋白的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从蜂王浆提取纯化的王浆主蛋白的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种从蜂王浆提取纯化的王浆主蛋白的方法，包括有以下方法步骤：
S1、配置缓冲液实现对蜂王浆进行震荡处理：通过氢氧化钠实现对缓冲液进行调配，然后再将蜂王浆添加进入到缓冲液中进行震荡处理，然后将蜂王浆进行静置，得到溶液一；
S2、将溶液一进行过滤处理：将S1中得到的溶液一进行过滤处理，除去溶液中的大颗粒杂质，得到过滤后的溶液二；
S3、将溶液二进行离心处理：将S2中得到的溶液二进行离心处理，并且在进行离心处理的时候，保持离心设备的处理低温环境下进行运行，然后过滤处理离心溶液的上层液；
S4、对离心上层液进行蛋白沉淀：将S3中得到的离心上层液通过PEG和防冻剂沉淀出王浆主蛋白，且在通过PEG和防冻剂处理沉淀的过程中，时刻对溶液进行搅拌处理；
S5、对获得的王浆主蛋白进行提纯处理：将S4中的得到的王浆主蛋白通过离子交换色谱进行提纯处理，通过王浆主蛋白与离子交换树脂间的相互电荷作用，实现对王浆主蛋白进行纯化与浓缩，获得纯化的王浆主蛋白。
较佳的，所述S1中的缓冲液采用的是Tris-HCl缓冲液，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为0.05mol/L，pH＝7.6。
较佳的，所述Tris-HCl缓冲液的配制过程如下：
先以300～500mL的重蒸水溶解60.57g Tris；
然后加入HCl后，用1N的HCl或1N的NaOH将pH调至7.6；
然后再加重蒸水至1000mL，得储备液，于4℃冰箱中保存；用时取储备液稀释10倍，再通过氢氧化钠或者盐酸调节PH值在7.1-7.6。
较佳的，所述S1中的震荡处理时长为18-22h，且静置处理时长为1-2h，使得蜂王浆能够充分的和缓冲液进行混合，以及混合后能够实现充分的沉淀处理。
较佳的，所述S2中的过滤处理采用的是截留分子量为100kDa的超滤膜，用于实现对溶液一中的大颗粒杂质进行过滤处理，提高溶液一的纯度。
较佳的，所述S3中的离心设备在运行使用的时候，离心速度控制在6000rpm至25000rpm，且保持在4℃的低温环境下，且对于过滤处理离心溶液的上层液采用的是截留分子量为49kDa的超滤膜进行过滤处理。
较佳的，所述S4中的PEG和防冻剂沉淀出王浆主蛋白的过程中通过伺服电机实现对溶液进行缓慢的搅拌处理，且搅拌速度在100r/min，然后再通过截留分子量为49kDa的超滤膜进行过滤处理，获得王浆主蛋白的沉淀物。
较佳的，所述S5中的离子交换色谱在使用的时候，先将沉淀出来的王浆主蛋白加入到缓冲液中进行溶解混合，且对于王浆主蛋白的溶液过程采用低速震荡处理，保持王浆主蛋白的完整性和活性。
较佳的，所述离子交换色谱采用的是阴离子交换柱纯化，并且通过盐浓度梯度的改变去洗脱离子交换柱，获得王浆主蛋白。
较佳的，所述离子交换色谱在使用的时候，为了实现对盐浓度进行控制调节，利用泵的辅助使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升，当离子强度能够中和蛋白的电荷时，王浆主蛋白就被从柱上洗脱下来；或者采用分步洗脱连续升高盐梯度。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明通过缓冲液的设定实现对蜂王浆进行缓和，并且保持蜂王浆中的主蛋白活性，不会造成失活，并且截留分子量为100kDa的超滤膜实现对蜂王浆中的杂质进行有效的过滤，然后再通过离心设备和截留分子量为49kDa的超滤膜实现对蜂王浆主蛋白进行有效的粗提取，保持蜂王浆主蛋白中的杂质较少，然后再通过离子交换色谱实现对蜂王浆主蛋白进行提纯，使得蜂王浆主蛋白能够纯度较高。
附图说明
图1为本发明的方法步骤流程示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1，本发明提供一种技术方案：一种从蜂王浆提取纯化的王浆主蛋白的方法，包括有以下方法步骤：
S1、配置缓冲液实现对蜂王浆进行震荡处理：通过氢氧化钠实现对缓冲液进行调配，然后再将蜂王浆添加进入到缓冲液中进行震荡处理，然后将蜂王浆进行静置，得到溶液一；
S2、将溶液一进行过滤处理：将S1中得到的溶液一进行过滤处理，除去溶液中的大颗粒杂质，得到过滤后的溶液二；
S3、将溶液二进行离心处理：将S2中得到的溶液二进行离心处理，并且在进行离心处理的时候，保持离心设备的处理低温环境下进行运行，然后过滤处理离心溶液的上层液；
S4、对离心上层液进行蛋白沉淀：将S3中得到的离心上层液通过PEG和防冻剂沉淀出王浆主蛋白，且在通过PEG和防冻剂处理沉淀的过程中，时刻对溶液进行搅拌处理；
S5、对获得的王浆主蛋白进行提纯处理：将S4中的得到的王浆主蛋白通过离子交换色谱进行提纯处理，通过王浆主蛋白与离子交换树脂间的相互电荷作用，实现对王浆主蛋白进行纯化与浓缩，获得纯化的王浆主蛋白。
为了实现对蜂王浆进行活性保持和混合处理，本实施例中，优选的，所述S1中的缓冲液采用的是Tris-HCl缓冲液，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为0.05mol/L，pH＝7.6。
为了实现对缓冲液进行配置处理，本实施例中，优选的，所述Tris-HCl缓冲液的配制过程如下：
先以300～500mL的重蒸水溶解60.57g Tris；
然后加入HCl后，用1N的HCl或1N的NaOH将pH调至7.6；
然后再加重蒸水至1000mL，得储备液，于4℃冰箱中保存；用时取储备液稀释10倍，再通过氢氧化钠或者盐酸调节PH值在7.1-7.6。
为了实现对蜂王浆和缓冲液进行混合处理，本实施例中，优选的，所述S1中的震荡处理时长为18-22h，且静置处理时长为1-2h，使得蜂王浆能够充分的和缓冲液进行混合，以及混合后能够实现充分的沉淀处理。
为了实现对沉淀后的大颗粒杂质进行过滤处理，本实施例中，优选的，所述S2中的过滤处理采用的是截留分子量为100kDa的超滤膜，用于实现对溶液一中的大颗粒杂质进行过滤处理，提高溶液一的纯度。
为了实现对蜂王浆进行离心处理，并且再对离心后的溶液进行过滤处理，获得蜂王浆主蛋白，本实施例中，优选的，所述S3中的离心设备在运行使用的时候，离心速度控制在6000rpm至25000rpm，且保持在4℃的低温环境下，且对于过滤处理离心溶液的上层液采用的是截留分子量为49kDa的超滤膜进行过滤处理。
为了实现对上层液中的蜂王浆主蛋白进行沉淀析出，并且保持蜂王浆主蛋白的活性，本实施例中，优选的，所述S4中的PEG和防冻剂沉淀出王浆主蛋白的过程中通过伺服电机实现对溶液进行缓慢的搅拌处理，且搅拌速度在100r/min，然后再通过截留分子量为49kDa的超滤膜进行过滤处理，获得王浆主蛋白的沉淀物。
为了实现对蜂王浆主蛋白进行有效的提纯处理，并且为了保持王浆主蛋白溶液的完成性和活性，采用缓慢震荡溶解，本实施例中，优选的，所述S5中的离子交换色谱在使用的时候，先将沉淀出来的王浆主蛋白加入到缓冲液中进行溶解混合，且对于王浆主蛋白的溶液过程采用低速震荡处理，保持王浆主蛋白的完整性和活性。
因为蛋白在生理pH(pH6～8)下带负电荷，需用阴离子交换柱纯化，且为了方便操作，通过改变盐浓度进行洗脱离子交换柱，本实施例中，优选的，所述离子交换色谱采用的是阴离子交换柱纯化，并且通过盐浓度梯度的改变去洗脱离子交换柱，获得王浆主蛋白。
为了提高离子交换色谱的使用步骤和要求，并且有效的实现简化操作，本实施例中，优选的，所述离子交换色谱在使用的时候，为了实现对盐浓度进行控制调节，利用泵的辅助使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升，当离子强度能够中和蛋白的电荷时，王浆主蛋白就被从柱上洗脱下来；或者采用分步洗脱连续升高盐梯度。
本发明的工作原理及使用流程：
第一步、配置缓冲液实现对蜂王浆进行震荡处理：通过氢氧化钠实现对缓冲液进行调配，然后再将蜂王浆添加进入到缓冲液中进行震荡处理，然后将蜂王浆进行静置，得到溶液一；
第二步、将溶液一进行过滤处理：将S1中得到的溶液一进行过滤处理，除去溶液中的大颗粒杂质，得到过滤后的溶液二；
第三步、将溶液二进行离心处理：将S2中得到的溶液二进行离心处理，并且在进行离心处理的时候，保持离心设备的处理低温环境下进行运行，然后过滤处理离心溶液的上层液；
第四步、对离心上层液进行蛋白沉淀：将S3中得到的离心上层液通过PEG和防冻剂沉淀出王浆主蛋白，且在通过PEG和防冻剂处理沉淀的过程中，时刻对溶液进行搅拌处理；
第五步、对获得的王浆主蛋白进行提纯处理：将S4中的得到的王浆主蛋白通过离子交换色谱进行提纯处理，通过王浆主蛋白与离子交换树脂间的相互电荷作用，实现对王浆主蛋白进行纯化与浓缩，获得纯化的王浆主蛋白。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种从蜂王浆提取纯化的王浆主蛋白的方法，其特征在于：包括有以下方法步骤：
S1、配置缓冲液实现对蜂王浆进行震荡处理：通过氢氧化钠实现对缓冲液进行调配，然后再将蜂王浆添加进入到缓冲液中进行震荡处理，然后将蜂王浆进行静置，得到溶液一；
S2、将溶液一进行过滤处理：将S1中得到的溶液一进行过滤处理，除去溶液中的大颗粒杂质，得到过滤后的溶液二；
S3、将溶液二进行离心处理：将S2中得到的溶液二进行离心处理，并且在进行离心处理的时候，保持离心设备的处理低温环境下进行运行，然后过滤处理离心溶液的上层液；
S4、对离心上层液进行蛋白沉淀：将S3中得到的离心上层液通过PEG和防冻剂沉淀出王浆主蛋白，且在通过PEG和防冻剂处理沉淀的过程中，时刻对溶液进行搅拌处理；
S5、对获得的王浆主蛋白进行提纯处理：将S4中的得到的王浆主蛋白通过离子交换色谱进行提纯处理，通过王浆主蛋白与离子交换树脂间的相互电荷作用，实现对王浆主蛋白进行纯化与浓缩，获得纯化的王浆主蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种从蜂王浆提取纯化的王浆主蛋白的方法，其特征在于：所述S1中的缓冲液采用的是Tris-HCl缓冲液，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为0.05mol/L，pH＝7.6。
3.根据权利要求2所述的一种从蜂王浆提取纯化的王浆主蛋白的方法，其特征在于：所述Tris-HCl缓冲液的配制过程如下：
先以300～500mL的重蒸水溶解60.57g Tris；
然后加入HCl后，用1N的HCl或1N的NaOH将pH调至7.6；
然后再加重蒸水至1000mL，得储备液，于4℃冰箱中保存；用时取储备液稀释10倍，再通过氢氧化钠或者盐酸调节PH值在7.1-7.6。
4.根据权利要求1所述的一种从蜂王浆提取纯化的王浆主蛋白的方法，其特征在于：所述S1中的震荡处理时长为18-22h，且静置处理时长为1-2h，使得蜂王浆能够充分的和缓冲液进行混合，以及混合后能够实现充分的沉淀处理。
5.根据权利要求1所述的一种从蜂王浆提取纯化的王浆主蛋白的方法，其特征在于：所述S2中的过滤处理采用的是截留分子量为100kDa的超滤膜，用于实现对溶液一中的大颗粒杂质进行过滤处理，提高溶液一的纯度。
6.根据权利要求1所述的一种从蜂王浆提取纯化的王浆主蛋白的方法，其特征在于：所述S3中的离心设备在运行使用的时候，离心速度控制在6000rpm至25000rpm，且保持在4℃的低温环境下，且对于过滤处理离心溶液的上层液采用的是截留分子量为49kDa的超滤膜进行过滤处理。
7.根据权利要求1所述的一种从蜂王浆提取纯化的王浆主蛋白的方法，其特征在于：所述S4中的PEG和防冻剂沉淀出王浆主蛋白的过程中通过伺服电机实现对溶液进行缓慢的搅拌处理，且搅拌速度在100r/min，然后再通过截留分子量为49kDa的超滤膜进行过滤处理，获得王浆主蛋白的沉淀物。
8.根据权利要求1所述的一种从蜂王浆提取纯化的王浆主蛋白的方法，其特征在于：所述S5中的离子交换色谱在使用的时候，先将沉淀出来的王浆主蛋白加入到缓冲液中进行溶解混合，且对于王浆主蛋白的溶液过程采用低速震荡处理，保持王浆主蛋白的完整性和活性。
9.根据权利要求8所述的一种从蜂王浆提取纯化的王浆主蛋白的方法，其特征在于：所述离子交换色谱采用的是阴离子交换柱纯化，并且通过盐浓度梯度的改变去洗脱离子交换柱，获得王浆主蛋白。
10.根据权利要求9所述的一种从蜂王浆提取纯化的王浆主蛋白的方法，其特征在于：所述离子交换色谱在使用的时候，为了实现对盐浓度进行控制调节，利用泵的辅助使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升，当离子强度能够中和蛋白的电荷时，王浆主蛋白就被从柱上洗脱下来；或者采用分步洗脱连续升高盐梯度。
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- 2022-03-01 CN CN202210193313.8A patent/CN114437170A/zh active Pending
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