CN110618229B - 一种蛋白的非还原肽图分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种蛋白的非还原肽图分析方法，该方法首先利用变性剂对蛋白进行变性处理，然后酶解，酸终止反应后通过反向高效液相色谱进行检测。本发明的非还原肽图分析方法使得蛋白在酶解时更彻底，反向高效液相色谱检测中色谱峰均匀分布，出峰数目多，分离度好，且色谱图基线平稳，能够最真实反应蛋白酶解后的各肽段情况，对蛋白的质量控制具有重要意义。

Description

一种蛋白的非还原肽图分析方法

技术领域

本发明涉及生物蛋白领域，具体涉及一种蛋白的非还原肽图分析方法。

背景技术

肽图分析(Peptide Mapping)是根据蛋白质、多肽的分子量大小以及氨基酸组成特点，使用专一性较强的蛋白水解酶[一般为肽链内切酶(endopeptidase)]作用于特殊的肽链位点将多肽裂解成小片断，通过一定的分离检测手段形成特征性指纹图谱。肽图分析对多肽结构研究和特性鉴别具有重要意义。利用胰蛋白酶能特异性作用于Arg和Lys羧基端的肽链的性质，通过RP-HPLC法采用C18柱检测蛋白特征性胰肽图谱作为鉴定分析。肽图可以鉴别由于互补DNA读取错误或发生点突变而使单个氨基酸发生改变。肽图是一个比较的过程，因为需要将得到的信息，与参比标准或同样处理过的参比材料相比较来确定蛋白的一级结构，它能够检测到结构是否发生了改变，从而证明过程的一致性和基因的稳定性。此项技术在新药开发中得到广泛应用。

由于肽图能够提供丰富的结构信息，并且在一级结构上具有很多优点，已经逐渐成为抗体、蛋白或多肽类药物的常规指标。目前2015版中国药典四部中明确采用液相肽图对蛋白酶或化学物质裂解后的蛋白机芯分析鉴定蛋白质一级结构的完整性和准确性，然而药典方法对蛋白前处理未做规定，按照该方法进行肽图分析往往存在蛋白裂解不彻底的缺陷，而且药典方法中的梯度洗脱条件较为简短，使得色谱图中的肽段分离度差，往往不适用于结构复杂的蛋白或单抗的肽段分离。

发明内容

本发明为了解决现有技术中蛋白肽图分析存在的酶解不彻底，色谱峰分离度差、出峰数目较少等一系列缺陷，本发明一方面提供了如下肽图分析方法，其步骤包括：

1)样品处理：将蛋白加入变性试剂进行变性后，加入胰蛋白酶进行酶解，酸终止酶解反应；

2)反向高效液相色谱检测：对终止酶解后的样品进行反向高效液相色谱检测，检测条件为：

色谱柱：反向十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

流动相A：0.1％三氟乙酸的水溶液；

流动相B：0.07-0.1％三氟乙酸的含水乙腈溶液，其中水的含量为10-30％；

流速：1ml/min，柱温30-60℃；

检测波长：214nm；

梯度洗脱程序为：

经发明人试验验证，本发明中流动相B中含水乙腈溶液中水含量为10-30％能够使得各肽段尽量多地分离。当水含量低于10％(如采用药典的流动相，其流动相B中不含有水)，各肽段的色谱峰出峰将过于密集，分离度不好；而当水含量超过30％，其洗脱时间将进一步延长，不利于疏水段肽段的完整分离。

经发明人试验验证，本发明的柱温选择在30-60℃色谱峰出峰数目在50个以上，说明在此柱温范围能够洗脱分离50个以上的肽段，且随着温度的升高，色谱峰出峰数目增加。而根据色谱柱的型号和规格，柱温最高不超过60℃。

本发明中使用的变性试剂为本领域常规的能够辅助蛋白酶解，使蛋白变性并舒展的试剂，如RapiGest SF、盐酸胍。

优选地，本发明的变性试剂选择RapiGest SF，浓度为0.1-0.2w/v％，更优选0.2w/v％。

本发明中使用的胰蛋白酶为本领域常规的能够使蛋白水解的丝氨酸蛋白水解酶，如甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮处理的胰蛋白酶、测序级胰蛋白酶或质谱级胰蛋白酶；胰蛋白酶浓度相对于蛋白质量比为25:1～50:1，优选50:1。

优选的，本发明的胰蛋白酶为测序级胰酶。

本发明中对胰蛋白酶酶解后的蛋白采用加入酸终止反应，优选的，本发明中酸为醋酸或三氟乙酸；醋酸的浓度为50％，三氟乙酸浓度为0.1％。

本发明的反向高效液相色谱检测方法中，流动相B优选为0.085％三氟乙酸的含水乙腈溶液，其中水的含量为20％。

本发明的反向高效液相色谱检测方法中，流速优选为1ml/min；柱温优选60℃。

本发明进一步提供了一种蛋白的肽图分析方法，其样品处理步骤中将蛋白加入变性试剂进行变性的步骤为：取一定量的蛋白，用超纯水超滤换液三次，之后加入RapiGestSF并混匀，将混合液于沸水浴中放置，然后取出并冷却至室温。由于RapiGest SF是一种温和的变性试剂，因此为使得蛋白充分变性，需要在沸水浴中反应。

本发明进一步提供了一种蛋白的肽图分析方法，其样品处理步骤中加入胰蛋白酶进行酶解的步骤为：在变性后的混合液中加入碳酸氢钠和测序级胰蛋白酶，混匀后37℃水浴反应。

本发明进一步提供了一种蛋白的肽图分析方法，其样品处理步骤中的终止酶解过程为：酶解后加入醋酸终止反应，离心，取上清液待测。

本发明进一步提供了一种蛋白的肽图分析方法，其样品处理步骤为：

1)取蛋白样品一定量，用超纯水超滤换液三次；收集超滤后蛋白溶液，加入0.2w/v％RapiGest SF并混匀，将混合液于沸水浴中放置10min，之后取出并冷却至室温；

2)加入0.5M碳酸氢铵溶液和0.1mg/ml测序级胰蛋白酶，混匀后37℃水浴16h～18h，偶尔取出轻摇；

3)37℃水浴完毕后，加入50％醋酸溶液，离心，取上清液待测。

本发明进一步提供了一种蛋白的肽图分析方法，其反向高效液相色谱检测条件为：

色谱柱：反向十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

流动相A：0.1％三氟乙酸的水溶液；

流动相B：0.085％三氟乙酸的含水乙腈溶液，其中水的含量为20％。

流速：1ml/min，柱温60℃；

检测波长：214nm；

梯度洗脱程序为：

。

本发明的蛋白优选为序列1。本发明的蛋白由500多个氨基酸组成，根据蛋白结构经胰蛋白酶酶解后的肽段预计超过50个，因此本发明的肽图分析方法能够检测出50个以上的肽段是理想的。

本发明的优势在于，相对于现有技术中肽图的测定方法，本发明的肽图分析方法使得蛋白在酶解时更彻底，色谱峰均匀分布，出峰数目多，分离度好，且色谱图基线平稳，对蛋白的质量控制具有重要意义。

附图说明

图1为对比实施例1中样品溶液的反向高效液相色谱图；

图2为对比实施例2中样品溶液的反向高效液相色谱图；

图3为对比实施例3中样品溶液的反向高效液相色谱图；

图4为对比实施例4中样品溶液的反向高效液相色谱图；

图5为对比实施例5中样品溶液的反向高效液相色谱图；

图5a为实施例1中蛋白样品溶液的反向高效液相色谱图；

图5b为实施例1中阴性样品溶液的反向高效液相色谱图；

图5c为实施例1中扣除阴性样品溶液的蛋白样品溶液反向高效液相色谱图；

图6为实施例2中样品溶液的反向高效液相色谱图；

图7为实施例3中样品溶液的反向高效液相色谱图；

图8为实施例4中样品溶液的反向高效液相色谱图；

图9为实施例5中样品溶液的反向高效液相色谱图；

图10为实施例6中样品溶液的反向高效液相色谱图；

图11为实施例7中样品溶液的反向高效液相色谱图；

具体实施方式

本发明通过以下实施例对本发明的内容作进一步的详细说明，并不能用于限制本发明的保护范围。

本申请所用仪器及试剂：

三氟乙酸：科密欧，HPLC级

乙腈：Honeywell，AH015，HPLC级

测序级胰酶：Promega V5117

碳酸氢铵：天津致远

超纯水：自制

冰乙酸：科龙化工：64-19-7

RapiGest SF：Waters 1860011861

SunFireC18反相色谱柱：Waters，Part：186002559，5μm，4.6×150mm

高效液相色谱仪：Agilent-1260HPLC

离心机：Sigma 1-14

恒温水浴锅：memmert：WNB 10

对比实施例1

取序列1的蛋白样品0.2mg，按照2015版药典第四部3405的肽图检查法进行检测。

样品处理为：取含有序列1蛋白0.2mg的蛋白缓冲液200μL，用1％碳酸氢铵溶液充分透析，按照1:50(mg/mg)加入Premega测序级胰蛋白酶，加1％碳酸氢铵溶液溶解，制成0.1mg/ml 的蛋白溶液，于37℃保温16h后，按照1:10加入50％醋酸溶液，10000×g离心5min，精密量取上清液100μL，注入色谱仪进行检测。

色谱条件为：

色谱柱：SunFireC18反相色谱柱：Waters，Part：186002559，5μm，4.6×150mm；

流动相A：0.1％三氟乙酸的水溶液；

流动相B：0.1％三氟乙酸的乙腈溶液；

流速：1ml/min，柱温30℃；

检测波长：214nm；

梯度洗脱程序为：梯度洗脱时间70min，流动相A从100％～30％，流动相B从0％～70％。

检测结果：

检测图谱如图1和表1所示，从图1和表1中可以看出，按照药典方法的肽图基线不平稳，且各肽段的色谱峰出峰过于密集，分离度很差，色谱峰分布也不均匀，难以完整反映蛋白的一级结构，不适于作为蛋白的质量控制手段。

表1蛋白肽图检测结果

对比实施例2

样品处理为：取含有序列1蛋白样品0.2mg，用超纯水每次400μl，14000g，5min超滤换液三次，用移液器收集超滤后蛋白溶液，若溶液体积不足50μl用超纯水补足，之后加入50μl 0.2％w/vRapiGest SF并混匀，将混合液于沸水浴中放置10min，之后取出并冷却至室温；加入20μl的0.5M碳酸氢铵溶液和100μl 0.1mg/ml Promega测序级胰蛋白酶，混匀后37℃水浴16h～18h，偶尔取出轻摇；37℃水浴完毕后，加入22μl 50％醋酸溶液，10000×g离心5min，取上清液待测。

色谱条件为：同对比实施例1。

检测结果：

检测图谱如表2和图2所示，从表2和图2中可以看出，经过RapiGest SF变性剂的处理，蛋白酶切更为彻底，色谱峰数目较药典方法更多。但是仍然存在肽图基线不平稳，各肽段的色谱峰出峰过于密集，分离度很差，色谱峰分布不均匀的问题。

表2蛋白肽图检测结果

对比实施例3

样品处理：同对比实施例2

色谱条件为：

色谱柱：SunFireC18反相色谱柱：Waters，Part：186002559，5μm，4.6×150mm；

流动相A：0.1％三氟乙酸的水溶液；

流动相B：0.085％三氟乙酸的乙腈溶液，其中乙腈溶液含20％的水；

流速：1ml/min，柱温60℃；

检测波长：214nm；

梯度洗脱程序为：

时间/min	流动相A	流动相B
			0.00	100	0
5.00	100	0
			70.00	55	45
70.01	0	100
			80.00	0	100
80.01	100	0
			95.00	100	0

检测结果：

检测结果如图3和表3所示，从图3和表3中可以看出，在该梯度条件下，总出峰数目较少(51个色谱峰)，尤其是亲水肽段及55-60min左右肽段出峰数目较少，整个肽段出峰位置分布不够均匀，且分离度较差，不能真实反应蛋白中的肽段情况。

表3蛋白肽图检测结果

对比实施例4

样品处理：同对比实施例2

色谱条件为：

色谱柱：SunFireC18反相色谱柱：Waters，Part：186002559，5μm，4.6×150mm；

流动相A：0.1％三氟乙酸的水溶液；

流动相B：0.085％三氟乙酸的乙腈溶液，其中乙腈溶液含20％的水；

流速：1ml/min，柱温60℃；

检测波长：214nm；

梯度洗脱程序为：

检测结果：

检测结果如图4和表4所示，从图4和表4中可以看出，同对比实施例3类似，在该梯度条件下，出峰数目仍然较少(44个色谱峰)，尤其是前半程亲水肽段及60-65min左右疏水肽段出峰位置较少，各肽段出峰位置分布不够均匀，分离度较差，不能真实反应蛋白中的肽段情况。

表4蛋白肽图检测结果

实施例1

蛋白样品处理为：取含有序列1蛋白样品0.2mg，用超纯水每次400μl，14000g，5min超滤换液三次，用移液器收集超滤后蛋白溶液，若溶液体积不足50μl用超纯水补足，之后加入50μl 0.2w/v％RapiGest SF并混匀，将混合液于沸水浴中放置10min，之后取出并冷却至室温；加入20μl的0.5M碳酸氢铵溶液和100μl 0.1mg/ml Promega测序级胰蛋白酶，混匀后37℃水浴16h～18h，偶尔取出轻摇；37℃水浴完毕后，加入22μl 50％醋酸溶液，10000×g离心5min，取上清液待测。

阴性样品处理为：取50μl超纯水，50μl的0.2％RapiGest SF，混匀后于沸水浴中放置10min 之后取出并冷却至室温；加入20μl的0.5M碳酸氢铵溶液和100μl 0.1mg/mlPromega测序级胰蛋白酶，混匀后37℃水浴16h～18h，偶尔取出轻摇；37℃水浴完毕后，加入22μl 50％醋酸溶液，10000×g离心5min，取上清液待测。

色谱条件为：

色谱柱：SunFireC18反相色谱柱：Waters，Part：186002559，5μm，4.6×150mm；

流动相A：0.1％三氟乙酸的水溶液；

流动相B：0.085％三氟乙酸的乙腈溶液，其中乙腈溶液含20％的水；

流速：1ml/min，柱温60℃；

检测波长：214nm；

梯度洗脱程序为：

时间/min	流动相A	流动相B
			0.00	100	0
5.00	100	0
			95.00	55	45
95.01	0	100
			105.00	0	100
105.01	100	0
			120.00	100	0

检测结果：

蛋白样品和阴性样品检测结果如图5a和5b所示，扣除阴性背景后的蛋白样品检测结果如图5c和表5所示。从图5a和5b可以看出，10min左右的宽峰主要是由阴性样品带来，扣除阴性样品的图5c显示在该位置不再出现宽的色谱峰。且从图5c和表5中可以看出，洗脱色谱图出峰数目较多(62个色谱峰)，前半程主要为亲水肽段色谱峰，后半程主要为疏水肽段色谱峰，图5c显示亲水和疏水各肽段色谱峰分布较为均匀，且能够较好地分离，基线也较为平稳，最能够真实反应各肽段的分离情况。

表5蛋白肽图检测结果

实施例2

除流动相B为：0.085％三氟乙酸的乙腈溶液，其中乙腈溶液含10％的水，其它条件同实施例1。

检测结果：

检测结果如图6和表6所示，从图6和表6中可以看出，当流动相B中水的含量为10％，洗脱色谱图出峰数目较多(75个色谱峰)，各肽段色谱峰分布较为均匀，基线也较为平稳。

表6蛋白肽图检测结果

实施例3

除流动相B为：0.085％三氟乙酸的乙腈溶液，其中乙腈溶液含30％的水，其它条件同实施例1。

检测结果：

蛋白样品检测结果如图7和表7所示，从图7和表7中可以看出，洗脱色谱图出峰数目较多(56个色谱峰)，各肽段色谱峰分布较为均匀，且能够较好地分离，基线也较为平稳。

表7蛋白肽图检测结果

实施例4

除柱温为30℃外，其它条件同实施例1。

检测结果：

检测结果如图8和表8所示，从图8和表8中可以看出，在30℃条件下进行检测，出峰个数较多(56个色谱峰)，各色谱峰能够较好地分离，且分布较为均匀。

表8蛋白肽图检测结果

实施例5

除柱温为45℃外，其它条件同实施例1。

检测结果：

蛋白样品检测结果如图9和表9所示，从图9和表9所中可以看出，洗脱色谱图出峰数目较多(57个色谱峰)，各肽段色谱峰分布较为均匀，且能够较好地分离，基线也较为平稳。

表9蛋白肽图检测结果

实施例6

除流动相B：0.07％三氟乙酸的乙腈溶液，其中乙腈溶液含20％的水外，其他条件同实施例1。

检测结果：

检测结果如图10和表10所示，从图10和表10中可以看出，当流动相B中三氟乙酸的含量为0.07％，各色谱峰出峰数目较多(59个色谱峰)，能够较好地分离，且分布较为均匀。

表10蛋白肽图检测结果

实施例7

除流动相B：0.1％三氟乙酸的乙腈溶液，其中乙腈溶液含20％的水之外，其它所有条件同实施例1。

检测结果：

检测结果如图11和表11所示，从图11和表11中可以看出，当流动相B中三氟乙酸的含量为0.1％，各色谱峰出峰数目较多(63个色谱峰)，能够较好地分离，且分布较为均匀。

表11蛋白肽图检测结果

序列表

<110> 成都康弘生物科技有限公司

<120> 一种蛋白的非还原肽图分析方法

<130> KH20180604

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 526

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His

1 5 10 15

Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro

20 25 30

Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro

35 40 45

Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser

50 55 60

Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val

65 70 75 80

Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn

85 90 95

Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser

100 105 110

Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn

115 120 125

Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His

130 135 140

Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met

145 150 155 160

Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp

165 170 175

Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys

180 185 190

Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Pro Phe Val Ala Phe Gly

195 200 205

Ser Gly Met Glu Ser Leu Val Glu Ala Thr Val Gly Glu Arg Val Arg

210 215 220

Ile Pro Ala Lys Tyr Leu Gly Tyr Pro Pro Pro Glu Ile Lys Trp Tyr

225 230 235 240

Lys Asn Gly Ile Pro Leu Glu Ser Asn His Thr Ile Lys Ala Gly His

245 250 255

Val Leu Thr Ile Met Glu Val Ser Glu Arg Asp Thr Gly Asn Tyr Thr

260 265 270

Val Ile Leu Thr Asn Pro Ile Ser Lys Glu Lys Gln Ser His Val Val

275 280 285

Ser Leu Val Val Tyr Val Pro Pro Gly Pro Gly Asp Lys Thr His Thr

290 295 300

Cys Pro Leu Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

305 310 315 320

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

325 330 335

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

340 345 350

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

355 360 365

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

370 375 380

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

385 390 395 400

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

405 410 415

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

420 425 430

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

435 440 445

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

450 455 460

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Ala Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

465 470 475 480

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

485 490 495

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

500 505 510

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

515 520 525

Claims (11)

1.一种蛋白的非还原肽图分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）样品处理：将蛋白加入变性试剂进行变性后，加入胰蛋白酶进行酶解，然后酸终止酶解反应；

2）反相高效液相色谱检测：对终止酶解后的样品进行反相高效液相色谱检测，检测条件为：

色谱柱：反相十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

流动相A：0.1%三氟乙酸的水溶液；

流动相B：0.07-0.1%三氟乙酸的含水乙腈溶液，其中水的含量为10-30%；

柱温：30-60℃；

检测波长：214nm；

梯度洗脱；

所述的蛋白为序列1；

所述梯度洗脱程序为：

时间/min 流动相A 流动相B 0.00 100 0 5.00 100 0 95.00 55 45 95.01 0 100 105.00 0 100 105.01 100 0 120.00 100 0

所述变性试剂为RapiGest SF；所述RapiGest SF浓度为0.1-0.2w/v%。

2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于所述胰蛋白酶为甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮处理的胰蛋白酶、测序级胰蛋白酶或质谱级胰蛋白酶；胰蛋白酶浓度相对于蛋白质量比为25:1~50:1。

3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于所述RapiGest SF浓度为0.2w/v%。

4.根据权利要求2所述的分析方法，其特征在于所述胰蛋白酶为测序级胰酶。

5.根据权利要求2所述的分析方法，其特征在于所述胰蛋白酶浓度相对于蛋白质量比为50:1。

6.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于所述酸为醋酸或三氟乙酸；醋酸的浓度为50 %，三氟乙酸浓度为0.1 %。

7.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于所述反相高效液相色谱检测方法中，流动相B为0.085%三氟乙酸的含水乙腈溶液，其中水的含量为20%；流速为1ml/min；柱温为60℃。

8.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于所述的样品处理步骤中，将蛋白加入变性试剂进行变性的步骤为：取一定量的蛋白，用超纯水超滤换液三次，之后加入RapiGestSF并混匀，将混合液于沸水浴中放置，然后取出并冷却至室温。

9.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于所述的样品处理中，加入胰蛋白酶进行酶解的步骤为：在变性后的混合液中加入碳酸氢钠和测序级胰蛋白酶，混匀后37℃水浴反应。

10.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于所述的样品处理步骤为：

1）取蛋白样品一定量，用超纯水超滤换液三次；收集超滤后蛋白溶液，加入0.2w/v%RapiGest SF并混匀，将混合液于沸水浴中放置10min，之后取出并冷却至室温；

2）加入0.5M 碳酸氢铵溶液和0.1 mg/ml测序级胰蛋白酶，混匀后37 ℃水浴16h~18h，偶尔取出轻摇；

3）37 ℃水浴完毕后，加入50 %醋酸溶液，离心，取上清液待测。

11.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于反相高效液相色谱检测条件为：

色谱柱：反相十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

流动相A：0.1%三氟乙酸的水溶液；

流动相B：0.085%三氟乙酸的含水乙腈溶液，其中水的含量为20%；

流速：1ml/min，柱温60℃；

检测波长：214nm；

梯度洗脱程序为：

时间/min 流动相A 流动相B 0.00 100 0 5.00 100 0 95.00 55 45 95.01 0 100 105.00 0 100 105.01 100 0 120.00 100 0

所述的蛋白为序列1。

Images