KR20210002673A - 단백질 정량 분석 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 결합된 프로테아제를 포함하는 수 팽윤된 겔 컬럼 베드 및 완충액 중의 샘플 단백질을 제공하는 단계; 샘플 단백질을 겔 베드와 접촉시켜 폴리펩타이드로 분해하고, 폴리펩타이드를 질량 분광분석 (MS)으로 분석하는 단계를 포함하는, 샘플 단백질의 정성 분석 방법에 관한 것이다. 본 방법은 유익하게는 2회 이상의 반복을 포함한 샘플 단백질의 왕복 유동에 의해 수행되며, 약 30℃ 미만과 같은 약 37℃ 미만의 온도에서 수행될 수 있다. 또한, 본 발명은 프로테아제에 허용되는 조건을 유지하면서 선행 기술에 비해 빠른 속도로 단백질의 질량-기반의 분석을 수행하기 위한 자동화된 방법뿐 아니라 장치 및 키트를 포함한다.
Description
본 발명은 단백질 특정화 및 분석에 관한 것이며, 보다 상세하게는 프로테아제를 이용한 샘플 단백질의 컴포지트 펩타이드로의 효소 절단에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 사용되는 시약에 대해 용인가능한 조건에서 단백질의 식별을 효과적으로 제공한다. 나아가, 본 발명은 본원에 기술된 효소 절단에 기반한 이를 이용한 자동화된 방법, 장치 및 키트를 포함한다.
질량 분광분석 (mass spectrometry)에 의한 단백질 특정화, 식별 및 분석은 단백질을 컴포지트 펩타이드 또는 폴리펩타이드로 효소에 의해 절단함으로써 달성될 수 있다. 폴리펩타이드는 이온 쌍 형성 크로마토그래피 (ion pairing chromatography)에 의해 분리하고, 질량 분광기 장치에 인가할 수 있다. 컴퓨터-기반의 소프트웨어를 사용해, 폴리펩타이드 단편에 대한 질량 정보를 이용하여 오리지널 단백질을 재조립 (reassemble)하여 단백질을 식별한다. 일부 경우에, 단백질은 질량 분광분석에 의해 바로 분석할 수도 있지만, 다수의 경우에는 단백질이 매우 커, 식별하기 위해 구성성분들로 분해하여야 한다. 프로테아제가 이런 목적으로 흔히 이용된다. 프로테아제는 단백질 및 (폴리)펩타이드의 펩타이드 결합을 절단하여 단백질 분해를 수행하는 효소이다.
트립신은 단백질을 절단하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 프로테아제들 중 하나로, 다수의 척추동물의 소화계에서 발견되는 세린 프로테아제이다. 트립신은 주로 아미노산 프롤린이 뒤에 위치한 아미노산 라이신 또는 아르기닌의 카르복시 기 위치에서 펩타이드 체인을 절단한다. 단백질을 절단하는 다른 프로테아제 효소로는 Glu-C, Lys-N, Lys-C, Asp-N, Arg-C 및 키모트립신 등이 있다.
효소에서 중요한 부분은 활성부로 지칭된다. 이 부위는 특정 단백질 분자가 효소와 상호작용하여 체인 절단 반응이 이루어지는 부위이다. 효소는 결합 및 반응시 특이적인 배향성 (orientation) 및 완충 조건에서만 작동한다. 고온, 때때로 최대 60℃가 프로테아제 효소의 분해력을 높인다.
전형적으로, 단백질 샘플은 단백질과 효소를 바이얼 또는 챔버에서 조합하고, 가열하고, 수시간 또는 밤새 혼합함으로써, 프로테아제 효소에 의해 분해한다.
폴리펩타이드와 같은 분해 산물을 분석 및 정량하여야 할 경우, 샘플에서 효소 절단에 의한 높은 수준의 단백질 분해가 요구되거나 또는 필요할 수 있다. 단백질 분해 정도를 나타내는 다른 방식은 높은 커버리지 분해 (high coverage digestion)가 필요하다고 표현하는 것이다. 커버리지는 분해된 단백질에 대한 질량 분광분석에서 식별되는 폴리펩타이드의 개수를 의미한다. 전형적으로, 질량 분광분석에서 임의의 분해된 특정 단백질의 40-60%가 식별되지만, 최대 70%, 80% 및 90%의 커버리지가 바람직하며, 이는 40℃ 이상의 반응 온도를 비롯하여 더 높은 반응 조건에서 달성될 수 있다.
단백질을 트립신 또는 기타 프로테아제 효소를 사용해 40℃ 미만의 온도에서 분해하기는 어렵다. 더 빠른 분해가 필요할 경우에는 분해에 항상 고온을 적용한다. 한가지 이유는 트립신 및 기타 효소가 37℃에서 작동하도록 진화된 포유류 장기에서 수득된 것이기 때문이며, 이는 종종 프로테아제 사용을 위한 최적의 온도로 간주된다. 실무적인 측면에서, 당해 기술 분야의 당업자는 단순히 40℃를 적용한다. 하나의 인자인 고온은, 단백질이 더 높은 온도에서는 변성되는 경향이 있다는 점에서 효과적이다. 이는 단백질 구조 또는 서열을 효소가 부착되도록 노출하는데 도움을 줄 수 있다. 다른 이유는 효소의 반응 속도가 일반적으로 온도에 따라 증가하기 때문이다. 효소는 대개 최소 작동 온도가 40℃이고, 대부분의 효소 분해는 명백하게도 고온에서 이루어진다. 효소가 최고 작동 온도를 가짐에 유념하여야 한다. 샘플의 온도가 상승할수록, 분해 속도는 증가하며, 프로테아제 자체 역시 단백질이므로 (매우 높은 온도에서) 자기-변성으로 인해 프로테아제 활성을 상실하게 될 것이다.
완전한 분해는 효소가 단백질을 절단할 수 있는 모든 가능한 부위에서 단백질을 절단하는 것으로 정의된다. 그러나, 이는 일반적인 조작에서는 어렵다. 단백질 서열은, 아마 여러가지 효소의 효소 접근성을 떨어뜨리는 입체 간섭으로 인해, 더 느린 속도로 반응하는, 단백질 내부에 위치한다. 단백질의 완전한 질량 분광분석 커버리지는 모든 서열 부위들이 분해되지 않는 한 가능하지 않다. 단백질/효소 샘플은 흔들기 또는 교반이 요구된다. 이러한 유인 방법에도 불구하고, 분해는 대개 부분적으로만 이루어진다.
공교롭게도, 완전한 분해가 특정 단백질을 식별하기 위한 질량 분광분석에 필수적인 것은 아니다. 다수의 경우에, 질량 분광분석에서 단백질은 폴리펩타이드 단편 커버리지 40-50%로 식별된다. 이러한 커버리지는 다수의 단백질에는 충분하지만, 일반적으로 50-60%가 바람직하다. 일부 경우에, 최대 70% 및 80%, 및 그 이상도 달성된다. 이러한 이용 목적에서, 충분한 분해는 질량 분광분석에 의해 단백질을 식별하는데 충분한 폴리펩타이드를 생성하는 커버리지 50%로서 정의된다.
프로테아제의 반응 온도를 낮추는 것이 바람직할 수 있지만, 반응 시간이 매우 길어진다. 일부 경우에, 37℃ 미만의 온도에서의 분해는 샘플을 효소로 제압 (즉, 필요하거나 또는 바람직한 효소를 훨씬 많이 첨가)함으로써 달성할 수 있다. 일부 경우에, 더 많은 효소를 반복 첨가하여, 샘플을 "리프레시"하고, 정지될 수 있는 분해를 계속 진행시킨다. 일부 경우에, 분해가 장기간 수행될 수 있다. 어떤 경우에, 이러한 조건에서의 단백질의 일부 분해는 단 장기간 반응시킨 이후에만 달성될 수 있지만, 산물이 불완전하고, 예측 불가하다. 충분한 분해 커버리지가 일부 단백질들에서 달성될 수 있더라도, 시간이 오래 걸리고, 결과 역시 예측할 수 없다. 특정 단백질이 낮은 반응 온도에서 질량 분광분석에 의해 식별될 만큼 충분히 분해될지는 불확실하다.
샘플내 분해할 단백질의 양은 상당한 정도로 예측불가능하게 달라질 수 있으므로, 지정된 시간 내에 단백질 분해를 충분히 완료하기 위해 필요한 조건은 예측하기 어렵다. 적절한 질량 분석 커버리지를 위해 필요한 분해 시간은 분해할 단백질의 양 증가에 따라 길어질 수 있다.
단백질을 모두 분해하고 제조되는 폴리펩타이드의 농도를 높이기 위해서는 충분한 분해 커버리지가 요망된다. 단백질 식별을 위해서는, 가능한 모든 폴리펩타이드가 분해 산물에 존재하여야 한다. 재현가능하고 예측가능한 분해 역시 요망된다.
효소 분해 속도를 높이고자 하는 요구가 존재하고 있다. 샘플의 효소 분해를 완료하는데 소요되는 시간을 낮추고자 하는 요구도 존재한다. 신뢰할 수 있고 예측 가능하게 분해하여 허용되는 커버리지를 달성하고자 하는 요구도 존재한다. 반응 당 사용되는 프로테아제의 양을 줄이고자 하는 요구도 존재한다. 합리적이고 예측가능한 시간내에 신속하게 완전하게 분해를 수행할 수 있는 온도를 낮추고자 하는 요구도 존재한다. 분석을 위해, 모든 샘플들이 특정 (때때로 미정의) 단백질과 무관하게, 짧은 시간 안에 (예, 4시간 미만, 3시간 미만, 2시간 미만, 또는 1시간 미만) 완전히 분해되는, 더 낮은 온도에서, 샘플들을 동시에 분해하고자 하는 요구도 존재한다.
또한, 분해 과정을 자동화하고자 하는 요구도 존재한다. 하지만, 분해는 샘플을 준비하기 위해 여러가지 화학적 과정들이 연속적으로 수행되는 다단계 샘플 준비 과정 중 일부일 수 있다. 예를 들어, 분해 후 탈염이 필요할 수도 있다. 탈염 처리된 샘플을 질량 분광분석으로 분석할 수 있다. 이는 각 단계에서 완료되는 시간을 예측할 수 있어야 한다. 각 단계를 완료하기 위한 예측가능한 시간에 대한 요건은, 임의의 특정 과정의 완료가 온도 또는 시간 의존적이고 완료 시간이 미정일 경우, 자동화된 로봇 시스템으로 공정을 수행하는 데에도 해당된다.
본 발명의 일 측면은 샘플 단백질의 정성 분석 방법에 관한 것으로서, 이 방법은
a)
하나 이상의 결합된 프로테아제를 포함하는 수 팽윤된 겔 컬럼 베드 (water swollen gel column bed)를 제공하는 단계;
b)
완충액 (liquid buffer) 중에 하나 이상의 샘플 단백질을 제공하는 단계;
c)
샘플 단백질을 단계 a)의 겔 베드와 접촉시켜 분해함으로써, 단백질(들)을 폴리펩타이드로 절단하는 단계; 및
d)
단계 c)에서 수득한 폴리펩타이드를 질량 분광분석 (MS)으로 분석하여, 이와 관련된 질량 정보를 입수하는 단계를 포함하며,
단계 c)는 약 37℃ 미만의 온도에서의 왕복 유동 (back and forth flow)을 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 단백질을 폴리펩타이드로 절단하고 폴리펩타이드 산물을 회수하는 자동화된 방법에 관한 것으로서, 이 방법은
a)
트립신; Glu-C; Lys-N; Lys-C; Asp-N; Arg-C; 및 키모트립신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 결합된 프로테아제를 각각 포함하는 복수의 수 팽윤된 겔 컬럼 베드를 포함하는 로봇 액체 핸들러 (robotic liquid handler)를 제공하는 단계;
b)
완충액 중에 하나 이상의 선택적으로 변성된 단백질을 제공하는 단계;
c)
단백질을 단계 a)의 겔 베드들과 접촉시키는 단계로서, 각각의 겔 베드는 겔 베드와의 접촉시 용매를 홀딩하고 상기 베드를 관통하는 용매의 왕복 사이클 동안에 상기 용매가 상기 베드를 통과하여 흐르도록 구성되는, 단계;
d)
단백질을 왕복 유동으로 분해하여, 4시간 미만의 시간 동안 단백질을 폴리펩타이드로 절단하고, 선택적으로 샘플을 희석하는 단계;
e)
상기 샘플에 이온 쌍 형성제 (ion pairing reagent)를 첨가하는 단계;
f)
리버스 파이펫 팁 컬럼 (reverse pipette tip column)을 제공하고, 선택적으로 상기 컬럼을 컨디셔닝화 (conditioning)하는 단계;
g)
폴리펩타이드를 왕복 유동시켜 파이펫 팁 컬럼에 흡착시키고, 선택적으로 컬럼으로부터 오염물질을 세척 (washing)하는 단계; 및
h)
상기 폴리펩타이드를 용출시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 측면은, 장치가 겔 베드를 포함하는 파이펫 팁을 포함하고; 파이펫 팁이 샘플 단백질을 샘플의 왕복 유동에 의해 절단하도록 구성되고; 파이펫 팁이 2-100 범위의 BSA-트립신 절단 성능 계수 (BSA-Trypsin Cleavage Performance Factor)를 가지는, 단백질 절단 장치에 관한 것이다.
본 발명의 부가적인 측면은, 키트가 프로테아제-탑재된 파이펫 팁 컬럼 (protease-loaded pipette tip column), 하나 이상의 변성 시약, 하나 이상의 완충제 및 샘플 단백질의 단편을 질량-기반으로 분석하기 위한 설명서를 포함하는, 샘플 단백질의 정성 분석용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 추가적인 상세 내용, 이점 및 구현예들은 종속항뿐 아니라 첨부된 실험 섹션 및 도면과 더불어 본 발명의 상세한 내용으로부터 명확해질 것이다. 본 출원에서, 한가지 측면과 관련하여 기술 또는 설명된 모든 상세한 또는 기술적인 특징은 다른 임의의 측면에도 동일하게 적용되는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 본 발명에 따라 달성될 수 있는 단백질의 변성 및 분해 방법을 예시한 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 단백질 분해 및 펩타이드 탈염의 구체적인 작업흐름도를 예시한 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 단백질 분해 및 펩타이드 탈염의 구체적인 작업흐름도를 예시한 것이다.
이에, 본 발명은, 단백질을 효소와 인큐베이션하지 않는, 샘플 단백질의 신속한, 저온, 효소 분해를 위한 컬럼 방법 및 장치를 포함한다. 본 발명의 한가지 이점은, 수 중에 팽윤할 수 있는 아가로스, 세파로스, 셀룰로스 또는 덱스트란 기질과 같이, 수 팽윤된 비드 수지 (water swollen bead resin)를 포함하는 겔 컬럼 베드에 고정 또는 결합된 효소에, 미-분해 또는 부분 분해된 샘플을 반복적으로 접촉시키는 것으로, 이때 효소 분자는 겔 컬럼 베드 전체에 또는 실질적으로 전체에 제공된다. 수지 비드 기질의 안팎으로 샘플 단백질과 이의 폴리펩타이드 형태의 절단 산물의 이동은 빠르게 이루어지며, 단백질의 포획은 발생하지 않는다. 기질에 결합된 효소는 비드 표면 위, 그리고 비드의 내부에 위치한다. 아래에서 보다 상세히 기술된 바와 같이, 효소(들)는 트립신, 키모트립신, Glu-C, Lys-N, Lys-C, Asp-N 또는 Arg-C일 수 있다.
수지 기질은 수 팽윤하며, 수계 완충제 (water based buffer)를 이용해 작동되도록 설계된다. 그러나, 본 발명의 일부 구현예에서, 완충제에 아세토니트릴 및 기타 수 혼화성 유기 용매 등의 변성 시약이 첨가된다. 본 발명의 일부 구현예에서, 변성 시약은 우레아, 구아니딘 HCl 및 유사 시약을 포함한다. 본 발명의 일부 구현예에서, 변성 시약은 산을 포함한다. 컬럼 베드를 관통하는 흐름은 파이펫 또는 시린지 타입의 펌프와 같은 저압 펌핑으로도 여전히 가능하다.
본 발명의 한가지 이점은 하나 이상의 파이펫 컬럼에서 왕복 유동을 포함하는 컬럼과 방법을 이용한다는 것이다. 컬럼에 장착된 수지 비드는 임의의 샘플 단백질을 포획할 수 없으며, 오히려 샘플 단백질과 반응 산물 폴리펩타이드가 컬럼 내 샘플 및 완충제의 왕복 흐름을 따라 컬럼의 안팎으로 확산하도록 선택된다. 놀랍게도, 변성 시약은 컬럼을 통과하는 왕복 흐름을 방지하지 않는다. 수 팽윤된 비드는 컬럼 베드를 통과하여 흐를 수 있도록 비드들 사이에 간극 공간을 유지한다. 수 팽윤된 기질의 기공은, 비드 기질 주위에서 흐름이 형성되었을 때, 시약, 반응물 및 산물의 비드 기질의 안팎으로의 확산을 허용한다.
분해 과정은 신속하게 이루어지며, 본 발명의 컬럼 및 방법을 이용한 경우 질량 분광분석의 폴리펩타이드 커버리지는 약 50%보다 높으며, 이는 약 37℃ 미만 또는 약 30℃ 미만의 온도에서 수행될 수 있다. 분해 온도는 전형적으로는 약 30℃ 미만, 일반적으로 약 20℃ 또는 약 25℃이다.
본 발명에 따른 효소에 의한 단백질 분해 반응은 실온 또는 주위 온도에서 수행할 수도 있다. 이러한 과정은 수지 기질과 확산 특징에 손상 또는 교체없이, 그리고 수지 베드의 흐름 특징에 손상 또는 교체없이, 아세토니트릴 등의 변성 시약의 존재 하에 수행할 수 있다.
이러한 과정은 다른 과정과 병행하여 수행될 수 있으며, 자동화될 수 있다. 이러한 과정은 액체 크로마토그래피, 질량 분광분석 및/또는 기타 분석 방법으로 분석하기 위한 샘플을 준비하는 다른 샘플 준비 공정과 연속적으로 운영할 수 있다. 이러한 공정으로는 자동화된 왕복 유동 컬럼을 이용한 단백질의 포획, 단백질의 용출 및 회수를 포함한다. 그런 후, 단백질을 프로테아제 결합된 기질에서 왕복 유동 분해로 분해한다. 수득되는 펩타이드 산물은 겔 여과 또는 이온 쌍 형성 역상 화학법에 기반한 제3 컬럼에서 탈염 처리하고, 마지막으로 샘플을 질량 분광기에 투입하여 분석한다. 이러한 단계들은 질량 분광분석에 투입되기 전까지 연속적으로 수행되고 자동화된다.
본 발명의 컬럼 및 방법에 사용되는 로봇 액체 핸들링 시스템 (robotic liquid handling system)은 특정 이벤트에 대한 컴퓨터 제어를 포함하며, 이의 순서는 지정된 시간 및 파라미터로 수행되어야 한다. 로봇 하드웨어는 컬럼을 프로세싱하거나 또는 액체를 수송하기 위한 단일 채널 또는 다체널 파이펫 헤드로 구성될 수 있다. 이것은 플레이트 또는 기구 (fixture)를 지정된 데크 포지션 (deck)으로 이동하기 위한 그리퍼 (gripper)를 가질 수 있다. 데크는 컬럼 또는 파이펫 팁 및 기구를 포함할 수 있다. 다수의 경우에, 로봇은 96웰 구성을 사용한다. 로봇 액체 핸들러는 공간 및 크기를 위해 SBS 플레이트 포맷을 통합할 수 있다. SBS는 로봇 플레이트의 표준 정의를 구축하기 위한 계획을 시작한 생물분자 과학 협회학회 (Society for Biomolecular Sciences)이다.
사용 프로테아제와 관련하여, 트립신은 단백질을 분해하기 위한 일반적인 프로테아제로서, 라이신 (Lys) 및 아르기닌 (Arg) 잔기 다음에 프롤린 (Pro), 아스파르트산 (Asp) 또는 글루탐산 (Glu)이 존재하는 경우를 제외하고는, 양으로 하전된 라이신 (Lys) 및 아르기닌 (Arg) 잔기의 카르복실기에서 절단하는 것으로 알려져 있다. Glu-C, Lys-N, Lys-C, Asp-N, Arg-C 또는 키모트립신 등의 다른 선택성을 가지는 다른 프로테아제 역시, 단백질을 분해하는데 이용할 수 있다. 이러한 프로테아제에 의한 분해는 개별 단백질 서열 커버리지를 개선할 수 있거나, 또는 질량 분광분석에 이용하기 위한 독특한 펩타이드 서열을 만들 수 있다. 복수의 프로테아제를 이용한 분해는, 각각 분리하여 수행하거나 또는 함께 수행하거나, 또는 순차적으로 수행할 수 있다.
그러나, 트립신 및 기타 프로테아제는 예측 불가능할 수 있다. 자가분해성 분해 (autolytic digestion)가 문제가 될 수 있다. 트립신은, 이질적으로 폴리펩타이드를 생성할 수 있는 트립신의 자가분해 반응을 낮추기 위해, N-p-토실-L- 페닐알라닌 클로로메틸 케톤 (TPCK) 및/또는 포름알데하이드와 반응시킬 수 있다. 그러나, 효소의 용액은, 저온 저장되지 않고 방치되었거나 및/또는 높은 온도에 노출된 것일 수 있는 효소는 활성을 알지 못하거나 또는 활성 효소의 농도를 알지 못하므로, 활성을 알지 못한다. 분해 속도는 임의의 특정 단백질 및 농도에 따라 달라질 것이다.
일부 경우에, 단백질의 효소 반응 속도는 단백질의 형태 또는 내부 결합에 의해 저해 또는 억제된다. 단백질 폴딩은 물과의 상호작용에 의해 구동된다. 열 및 화학적 수단을 통한 단백질의 비-폴딩이 변성이다. 이들 단백질은 단백질의 충분한 분해 커버리지를 확보하기 위해 분해 전 변성이 필요할 수도 있다. 미정의 단백질에 변성이 필요한지는 알려져 있지 않다. 변성은 분해 속도를 개선할 수 있거나, 또는 심지어 충분한 분해 커버리지를 위해 필수적일 수도 있다. 변성은 단백질에 효소가 접근하여 단백질을 절단 또는 분해할 수 있도록 단백질의 폴리펩타이드 체인을 노출시킨다. 그러나, 변성 화학제의 존재가 분해 속도에 영향을 미칠 수 있으며, 속도를 가변적이고 알 수 없게 만든다. 아세토니트릴, 우레아, 구아니딘 클로라이드 및 기타 등의 변성제는, 변성 조건에서, 프로테아제 공정을 저해하거나, 또는 분해 속도를 변경시켜, 충분한 분해 커버리지를 위해 필요한 시간을 예측하기 어렵게 만들거나 또는 불가능하게 만들 수 있다. 변성제는 컬럼을 통과하는 흐름에 영향을 미칠 수 있다. 변성제는 수 팽윤된 비드의 안팎으로의 반응물, 시약 및 산물의 확산에 영향을 미칠 수 있다. 변성제는 수 팽윤된 비드의 안팎으로의 반응물, 시약 및 산물의 확산에 영향을 미칠 수 있다. 기공 크기 축소는 단백질 반응과 더불어 수지 기질에 지지된 프로테아제와 단백질의 반응 속도를 늦출 수 있을 것이다. 이는, 변성제가 수 팽윤된 비드가 완전히 물에 팽윤되는 정도에 영향을 미칠 수 있기 때문이다. 변성제는 수 팽윤된 비드를 통과하는 반응물, 시약 및 산물의 흐름에 영향을 줄 수 있다. 베드가 변성제로 인해 수축되면, 수 팽윤된 베드의 배압 (backpressure)은 증가할 것이다.
절단 과정은 여러 단계로 이루어진 과정이다: 반응물 및/효소가 확산, 이동하여 상호 흡착되어야 한다. 반응물에 효소 흡착은 절단 발생을 위해 올바른 배향성으로 이루어져야 한다. 분해 산물은 효소로부터 이동하여, 벗어나야 한다.
샘플 내 단백질의 농도 또는 단백질의 양이 미정일 수 있는데, 이는 분해 속도 또는 충분한 분해 커버리지를 위해 필요한 시간을 예측하기 어렵게 하거나 불가능하게 만들 수 있다. 단백질의 높은 농도는 더 많은 효소 및/또는 더 고농도의 효소를 요구할 수 있다. 다량의 단백질은 더 많은 효소 및/또는 더 고농도의 효소를 필요로 할 수 있다.
임상 진단 어플리케이션은 질량 분광분석과 액체 크로마토그래피 질량 크로마토그래피를 이용한다. 질량 분광분석은 펩타이드들로부터 단백질을 식별할 수 있으며, 액체 크로마토그래피는 단백질을 식별 및 정량할 수 있다. 이들 2가지 툴 모두 출발 단백질의 예측가능하고 충분한 분해 커버리지가 필수적이다. 병렬적인 샘플 준비 및 자동화는 바람직하게는 저온에서 신속하고 예측가능한 분해가 필수적이다. 아울러, 단백질의 분해시, 종종 병렬 조작 및 자동화에 더 많은 장벽 및 장애를 야기하는 매트릭스 물질을, 탈염을 통해 제거하여야 할 것이다. 컬럼 분해 및 컬럼 겔 완충제 교환 또는 컬럼 분해 및 컬럼 이온 쌍 역상 탈염과 같이, 샘플 준비 화학법들을 조합하는 것은 어렵지만, 병렬적이고 자동화된 조작을 위해서는 필수적이다.
샘플로부터 물질을 포획하는 다른 파이펫 팁 친화성 컬럼과는 다르게, 효소 파이펫 팁 컬럼은 물질을 포획하지 않는다. 효소는 컬럼내 수용된 수지에 부착되어 있다. 단백질이 컬럼을 통과하여 흐르고, 효소와 접촉된다. 효소와의 접촉이 충분한 시간, 올바른 배양성 및 충분한 온도 등의 측면에서 적합하다면, 효소는 단백질을 절단할 것이다. 절단에 따른 단백질 반응물과 폴리펩타이드 산물은 수지 상의 관능기에 의해 머무르지 않는다. 정제시 어떤 것도 포획되지 않는다. 효소가 용액 중에 존재하는 다른 고전적인 효소 상호작용과는 다르게, 효소는 기질 비드에 결합되어 있고, 고상 내에서의 이동은 엄격하게 억제된다.
본 발명의 컬럼은 적어도 부분적으로 수 팽윤된 수지의 비드를 포함한다. 효소 반응이 발생하기 위해 반응물이 비드의 안팎으로 확산 또는 이동하여야 함에도 불구하고, 수 팽윤된 비드는 효소 능력을 개선할 수 있다. 그러나, 단백질 및 폴리펩타이드 확산은 기질이 없는 경우의 이동과 비교해 수지 비드를 통과하여 상대적으로 느리게 이루어진다. 비드 매트릭스가 존재하면, 반응물의 필요한 배향성을 달성하는데 입체 장애가 존재할 수 있다. 온도 상승은 느린 속도를 보상하기 위한 한가지 방법이다. 또 다른 방법은 반응이 수지 매질의 내부가 아닌 표면에서 발생하도록, 단백질의 양에 비해 비드의 수를 증가시키는 것이다. 반응 산물은 수 팽윤된 비드 수지 매트릭스의 외부로 확산하여야 한다.
본 발명의 일 구현예에서, 효소 트립신은, 헤드 양압 및 음압을 적용하는 펌프 또는 시린지 펌프 또는 파이펫에 의해 제어되는 왕복 유동성 컬럼 안에 수용된 수지의 고상에 결합된다. 본 발명의 다른 구현예에서, 펌핑은 로봇 액체 핸들링 시스템의 일부이다. 샘플은 한번에 1개, 한번에 1-9개, 한번에 1-12개, 한번에 1-96개 또는 한번에 1-384개, 또는 그 이상을 처리할 수 있다.
일부 구현예에서, 효소는 부분적으로 또는 완전히 수 팽윤된 수지 매트릭스에 결합되거나 또는 함유된다. 이는 수 팽윤된 아가로스, 셀룰로스, 덱스트란 및 세파로스를 포함한다.
결합된 고상 트립신 또는 프로테아제 효소를 수용하고 있는 컬럼을 사용해, 단백질 함유 용액을 처리함으로써, 단백질을 폴리펩타이드 단편으로 절단한다. 마지막 사이클에서, 폴리펩타이드 단편을 회수하고, 이때 트립신 또는 프로테아제는 컬럼에 결합된 채 유지된다.
단백질-프로테아제 성능 계수 설명: 프로테아제가 결합된 매질이 구비된 파이펫 또는 액체 핸들러와 같이, 본원에 기술된 분해 장치의 성능을, "단백질-프로테아제 성능 계수"로 특정할 수 있다. 이 인자는 다음과 같이 정의된다:
단백질-프로테아제 성능 계수 = N
여기서, N은 표준 단백질 20 ㎍을 지정된 조건에서 50% 이상의 절단 커버리지를 달성하기 위해 필요한 왕복 사이클의 최소 횟수이다. 왕복 유동 사이클 1회는 컬럼 베드를 통한 1회 흡인 (aspiration) 및 배출 (expulsion)로 구성된다. 샘플 중량/컬럼 베드 부피 비: (㎍/㎕)는 4 이상이며, 온도는 20 - 25℃ 범위이다. 일부 구현예에서, 단백질은 BSA이고, 프로테아제는 비드에 결합된 트립신이고, BSA-트립신 절단 성능 계수를 결정할 수 있다. 일부 구현예에서, BSA-트립신 절단 성능 계수는 5-200, 10-100, 20-50 또는 10-30이다. 일부 구현예에서, BSA-트립신 절단 성능 계수는 30이다. 일부 구현예에서, BSA-트립신 절단 성능 계수는 20이다. 일부 구현예에서, BSA-트립신 절단 성능 계수는 10이다. 특정 구현예에서, N은 40 미만, 30 미만, 20 미만, 10 미만 또는 5 미만이다.
이를 입증하는 한가지 실험에서, 50 ㎍ BSA 단백질 용액 혼합물에 대해, 트립신 함유 컬럼 베드 5 ㎕를 사용해 20분, 30분 또는 40분간 왕복 흐름 사이클 20회를 실시한다. 분리된 실험으로, 50 ㎍ BSA 단백질 용액 혼합물에 대해 4분간 왕복 사이클을 2회 실시한다. 그런 후, 혼합물을 컬럼에서 10분, 20분, 30분 또는 1시간 둔다. 분리된 실험으로, 50 ㎍ BSA 단백질 용액 혼합물에 대해 5분간 왕복 사이클을 5회 수행한 다음, 컬럼에서 10분, 20분, 30분 또는 1시간 방치한다. 모든 실험은 실온에서 수행한다. 혼합물에서 겔 분리에 의해 분해 완료를 확인한다. 왕복 사이클 20회를 수행한 실험에서만 단백질의 충분한 분해 커버리지가 확인되었다. 왕복 사이클 5회 실시한 실험에서는 분해된 단백질의 양이 그 다음으로 많았으며, 왕복 사이클 2회 실험에서는 분해된 단백질의 양이 가장 적었다. 컬럼에 단백질 용액을 두어도 어떠한 추가적인 단백질 분해는 발생하지 않았다.
파이펫 팁 컬럼 고상-결합된 트립신은 트립신 효소의 양에 비해 단백질을 높은 중량 함량으로 포함하는 광범위한 농도에서 단백질의 50% 이상을 분해하는 신속한 방법을 제공해준다 (표 1 및 2 참조). 분해는 4시간 미만, 3시간 미만, 2시간 미만, 1시간 미만, 30분 미만, 15분 미만 또는 5분 미만의 시간내에 완료할 수 있다. 분해되는 단백질의 중량 함량이 높을수록, 유동성 단백질 용액이 컬럼과 접촉하는 체류 시간도 증가할 수 있다. 벌크 용액에서의 단백질의 분해는 유체가 컬럼을 통과하여 흐를 경우에만 발생한다. 접촉 시간은 유체가 컬럼을 통해 왕복으로 흐르는 시간이다. 유체가 컬럼을 통과하여 흐르는 것이 중단되면, 분해도 중단된다. (컬럼 베드의 안팎으로 확산하기 위한) 컬럼의 비드들 사이의 간질액에 함유된 단백질에서만 여전히 분해가 발생하며, 이는 샘플의 최소 일부이다. 이러한 샘플의 최소 일부는 샘플 총 부피로 나눈 틈새 용적 (interstitial volume)이다. 본 발명의 방법에서, 샘플 총 부피로 나눈 틈새 용적은 샘플의 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 8% 미만, 6% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 또는 1% 미만이다. 단백질의 충분한 분해 커버리지는 샘플을 컬럼내 수지와 함께 인큐베이션함으로써 달성되진 않는다. 오히려, 분해는 샘플을 수지 베드를 통과하여 유동시키는 중에 달성된다. 셰이킹 또는 수조는 이용하지 않는다. 반응 온도는 효소 활성을 높이기 위해 높일 순 있지만, 정상적으로는 본 공정은 실온에서 이루어진다. 실온은 18-28℃, 전형적으로 20-25℃로 간주된다. 본 발명의 컬럼은 40℃ 및 그 이상에서, 심지어 변성 시약의 존재 하에 작동할 수도 있다.
질량 분광분석법으로 단백질을 식별하기 위해서는, 분해 단백질 커버리지는, 출발 단백질의 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상이 펩타이드 단편으로 분해된 것으로 간주된다. 충분한 분해 커버리지를 제공하는데 필요한 시간은 4시간 미만, 3시간 미만, 2시간 미만 또는 1시간 미만이다. 분 단위로서, 충분한 분해 커버리지를 위한 필수 시간은 90분 미만, 80분 미만, 60분 미만, 50분 미만, 40분 미만, 30분 미만, 20분 미만, 15분 미만, 10분 미만, 5분 미만, 4분 미만, 3분 미만, 3분 미만, 또는 1분 미만이다. 범위로서, 충분한 분해 커버리지를 위한 필수 시간은 0.25시간 - 4시간, 0.5시간 - 3시간, 0.5시간 - 2시간 또는 0.5 - 1시간 범위일 수 있다.
분해 정도는, 컬럼 공정 후, 남아있는 비-분해된 단백질의 양을 단백질의 오리지널 (출발) 양과 비교함으로써, 결정할 수 있다. 그러나, 분해된 단백질의 보다 큰 펩타이드 단편은 또한 비-분해된 서열을 함유할 수도 있다. 즉, 분해 또는 절단처리된 비-분해된 오리지널 단백질의 양이 적어질수록, 적어도 일부 펩타이드 서열들은 최종 산물에 존재하게 된다. 그러나, 이는, 일부 분해 서열들이 분해된 처음 서열과 동일한 온도에서 분해되는 것으로 가정한 것이다. 이는, 분해 또는 효소적 절단을 수행하기 전에 변성이 필요할 수 있는 서열에는 해당되지 않는다.
보다 낮은 온도를 이용함으로써, 부분적인 분해의 정도를 재현가능하게 제어할 수 있다. 이러한 경우에, 분해의 정도는 단백질을 컬럼과 접촉시키는 체류 시간에 의해 제어한다. 프로테이나제 K와 같은 유니버셜 프로테아제에 의한 부분 분해를 이용해, 유속, 샘플 크기 및 사이클 횟수를 조절함으로써 절단을 제어할 수 있다. 체류 시간은 샘플 부피를 유속으로 나눈 다음 하프 사이클 (half cycles)의 수로 곱하여 계산한다. 산물의 분석은 단백질 또는 단백질 복합체의 구조에 대한 정보를 제공할 수 있다.
본 기술을 적용해, 단백질-핵산 복합체에서 단백질을 분해하고 염색질 구조를 연구할 수 있다.
공정의 단계
1. 고상에 효소 부착
2. 단계 1의 고상 효소를 파이펫 팁 또는 왕복 유동 컬럼에 충진
3. 완충제 또는 액체에 용해된 단백질 샘플 제공
4. 선택적으로, 단백질 샘플의 변성
5. 단백질을 고상 효소와 함께 인큐베이션하지 않고, 왕복 유동을 이용해 단백질을 컬럼에서 반복적으로 통과시킴
6. 분해된 샘플을 바이얼 또는 웰로 배출
7. 분석 또는 하위 공정 수행
본 발명의 결과 및 이점
단백질에서 폴리펩타이드로의 충분한 분해 커버리지는, 샘플과 고상 효소 수지의 인큐베이션없이, 실온에서 달성된다.
효소 및 단백질은 효소적 절단이 실온에서 이루어지기 위해 올바른 배향성 및 근접성으로 왕복 유동으로 효율적으로 이동하고, 그래서 단백질이 완전히 분해될 수 있다.
효소와 단백질의 근접성 및 올바른 배향성 상태는, 효소적 절단이 완료되고 단백질이 적어도 50%의 커버리지를 달성하도록 충분히 분해되고자, 실온에서 충분히 오래 왕복 유동 상태로 유지된다.
결합된 효소 분자는, 반복적으로 역류에 노출되고 반복적으로 신선한 샘플에 노출되면서, 실온에서 유동 스트림 (flowing stream)에서 활성을 유지할 수 있다.
충분한 분해 커버리지를 달성하기 위한 분해는, 변성 조건 하에, 심지어 아세토니트릴, 우레아, 구아니딘 또는 기타 변성 시약을 고농도로 사용하여, 수 팽윤된 비드에서 왕복 유동 하에 이루어질 수 있다.
아세토니트릴 변성 조건은 단백질 변성 및 단백질의 효소적 절단시 유지될 수 있으며, 이후 시약은 희석될 수 있다. 이는, 폴리펩타이드 단편은 유지하고 샘플을 탈염 처리하기 위해, 이온 쌍 형성제가 혼합물에 첨가되고 역상 파이펫 팁 컬럼에 적용되어야 하는 정도로 수행된다. 아세토니트릴 농도가 매우 높다면, 단편은 이온 쌍 형성 역상 컬럼 조건에서 컬럼 매질에 흡착되지 않을 것이다.
결합된 효소 : 단백질의 비율은 정지상 분해와 비교해 낮지만, 분해 공정은 충분한 펩타이드 커버리지로 진행된다.
왕복 유동 컬럼 내 고상에 함유된 트립신 효소의 질 또는 활성은 충분한 분해 커버리지를 달성하기 위해 높아야 하는 것은 아니다. 활성이 낮은 효소의 경우에는 왕복 흐름 사이클 수를 늘릴 수 있다.
부분적으로 수 팽윤된 수지의 배압이 저온 또는 고온에서 변성 시약의 도입시 컬럼 베드를 통한 흐름을 제한하거나 또는 변형시키지 않는다.
파이펫 펌핑 기전은 변성 시약의 컬럼 내 도입으로 작동한다.
컬럼 배압은 변성 시약이 수 팽윤된 수지가 수용된 컬럼으로 1 mL/min으로 도입되는 경우에 3 psi 미만이다.
본원에 기술된 구현예들의 예를 제공하는 도를 참조한다.
컬럼 베드 부피는 효소 활성을 높이도록 조정할 수 있다. 놀랍게도, 단백질 샘플의 충분한 분해 커버리지를 제공하기 위해서는, 수지에 결합되고 작은 컬럼 베드 부피에 수용된 효소가 매우 소량 필요할 뿐이다. 파이펫 팁 컬럼 베드 부피는 100 ㎕ 미만, 90 ㎕ 미만, 80 ㎕ 미만, 70 ㎕ 미만, 60 ㎕ 미만, 50 ㎕ 미만, 40 ㎕ 미만, 30 ㎕ 미만, 20 ㎕ 미만, 15 ㎕ 미만, 10 ㎕ 미만, 5 ㎕ 미만, 4 ㎕ 미만, 3 ㎕ 미만, 2 ㎕ 미만, 1 ㎕ 미만, 0.5 ㎕ 미만 또는 0.1 ㎕ 미만일 수 있다.
컬럼에 의해 분해될 수 있는 단백질의 중량 함량은 단백질 0.1 ㎍ - 5 mg, 1 ㎍ - 2 mg, 2 ㎍ - 1 mg, 5 ㎍ - 500 ㎍, 10 ㎍ - 500 ㎍ 또는 20 ㎍ - 200 ㎍ 범위이다. 대개 범위는 단백질 10 - 500 ㎍이다.
단백질을 변성, 환원 또는 알킬화한 다음 파이펫 팁 왕복 유동 컬럼을 이용해 분해할 수 있다.
컬럼 베드 부피 ㎕에 대한 왕복 유동 공정에서 완전히 분해되는 단백질 ㎍의 비율은 2 이상, 5 이상, 10 이상, 15 이상, 20 이상, 25 이상, 30 이상, 40 이상, 50 이상, 60 이상, 70 이상, 80 이상, 90 이상, 100 이상 또는 200 이상이다.
다른 측면은, 선택적으로 샘플과 시약이 장치 내 또는 벤치 상에 미정의 가변적인 시간 동안 존재하는 다른 방법 또는 자동화 방법 대비, 방법의 안정성이다. 샘플 및 시약 및 컬럼이 장치 내 또는 벤치 상에 8, 7, 6, 5 4, 3, 2, 1, 0.8, 0.7 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2 또는 0.1시간 동안 비-사용된 채 방치되든 간에 결과는 동일하다.
표 1. 다양한 함량의 단백질을 성공적으로 분해하는
컬럼
베드
부피
표 2. 다양한 함량의 단백질을 성공적으로 분해하는
컬럼
베드
부피
단백질 준비는 변성, 환원 및 알킬화를 포함할 수 있다. 단백질은 표준적인 실험 프로토콜을 이용해 변성, 환원 또는 알킬화할 수 있다. 변성 프로토콜은 샘플 소스 또는 단백질 각각에 대해 최적화되어야 한다. 단백질을 변성한 다음 보다 효율적인 효소 분해를 위해 희석할 수도 있다.
일부 구현예에서, 단백질은 충분한 분해 커버리지 또는 보다 완전한 폴리펩타이드 서열 커버리지를 위해 효율적인 용해화, 변성 및 이황화 결합 환원이 요구된다. 후술한 선택 단계는 프로테아제 분해를 촉진하기 위해 이용할 수 있다.
이황화 결합의 환원: 단백질 용액에 다이티오트레이톨 (DTT)을 최종 농도 5 mM 또는 TCEP (트리스(2-카르복시에틸)포스핀)를 최종 농도 5 mM로 첨가하여, 10-20분간 50-60℃에서 가열한다.
알킬화: 환원된 단백질 용액에 요오도아세트아미드를 실온에서 최종 농도 15 mM로 첨가하고, 실온에서 15분간 암 조건에서 인큐베이션한다.
용해/변성: 단백질을 최대 50mM 암모늄 바이카보네이트, pH 7.5에 용해한다. 용해하기 어렵거나 또는 효율적인 분해를 위해 변성이 필요한 단백질은, 분해하기 전, 6 - 8 M 우레아 또는 6 M 구아니딘 HCl과 같은 변성제에서 실온에서 용해하거나, 또는 최대 37℃에서 최대 1시간 동안 가열할 수 있다. 일부 경우에, 샘플을 60℃ 또는 심지어 최대 95℃에서 단시간 가열해야 할 수도 있다.
일부 구현예에서, 아세토니트릴 (ACN)을 사용해 효소 분해 전에 단백질을 변성 처리한다. 최대 65, 60, 50, 40, 30 또는 20% 농도의 아세토니트릴 또는 기타 변성 용매를 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, 40% 아세토니트릴을 사용해, 단백질을 변성하거나 또는 변성된 상태로 유지시킬 수 있다.
분해 후, 이온 쌍 형성 역상 컬럼을 이용해 펩타이드를 탈염 처리할 수 있다. 일부 구현예에서, 펩타이드 및 ACN을 함유한 분해된 단백질을 사용해 역상 컬럼을 컨디셔닝하거나 또는 적실 수 있다. 혼합물을 컬럼에 도입하고, 왕복 유동시킨다. 컨디셔닝화 후, 샘플을 희석하여 ACN의 농도를 낮추고, 흔히 10% 미만으로 낮춘다. 트리플루오로아세트산 (TFA)과 같은 이온 쌍 형성 시약을 희석한 혼합물에 첨가한다. TFA가 일반적으로 사용되지만, 펜타플루오로프로피온산 (PFPA) 및 헵타플루오로부티르산 (HFBA) 및 유사 물질도 사용된다. 리버스 컬럼으로 폴리펩타이드를 포획하고, 임의의 다른 물질들은 제거한다. 그런 후, 유기 용매 (흔히 ACN)의 농도를 높여, 컬럼으로부터 폴리펩타이드를 함유한 이온 쌍을 제거하여, 폴리펩타이드를 용출시키고, 분석할 준비를 완료한다.
왕복 유동하는 분해 컬럼은 실온에서 사용할 수 있다. 실온은 20-25℃로 정의된다. 본 발명의 일부 구현예에서, 분해는 25-30℃ 또는 30-35℃ 또는 35-40℃의 온도 범위에서 수행한다. 왕복 유동 컬럼의 분해 온도를, 특히 로봇 시스템에서, 높여 및 유지하기 어려울 수도 있다.
본 발명에 기술된 탈염 컬럼은 2가지 타입일 수 있다. 한가지 타입은 한방향으로 통과하여 흐르는 겔 여과 컬럼 (unidirectional flow-through gel filtration column)이다. 다른 타입은 파이펫 팁에 수용된 역상 수지에 기반한 파이펫 팁, 왕복 유동 컬럼이다. 역상 컬럼은 컬럼에 포착하기 전 샘플에 이온 쌍 형성제를 첨가하여야 한다. 일반적인 이온 쌍 형성제로는 트리플루오로아세트산 (TFA), 펜타플루오로프로피온산 (PFPA) 및 헵타플루오로부티르산 (HFBA) 등이 있다. 포획은 유기 용매의 농도가 낮은 수성 완충제 조건에서 이루어진다. 폴리펩타이드는 이온 쌍 형성제와 비-극성 이온 쌍을 형성하고, 이러한 컴비네이션은 역상 파이펫 팁 컬럼에 의해 포획된다. 본 발명의 자동화된 장치 및 방법에서, 컬럼의 베드 크기는 1 ㎕ 내지 100 ㎕ 또는 5 ㎕ 내지 20 ㎕ 범위이며, 파이펫 팁 부피는 50 내지 2000 ㎕ 또는 200 내지 1200 ㎕ 범위이다.
키트를 조립할 수 있으며, 본 발명의 장치 및 방법에 적용할 수 있다. 일 예로, 키트는 트립신-파이펫 팁 컬럼(들), 변성 시약, 완충제 및 설명서를 포함한다. 다른 예로, 키트는 트립신-파이펫 팁 컬럼(들), 변성 시약, 역상 탈염 파이펫 팁 컬럼(들), 이온 쌍 형성제, 완충제 및 설명서를 포함한다.
도면에 대한 상세한 설명
도 1은 파이펫 팁 왕복 유동 컬럼을 이용한, 단백질의 변성 및 분해를 본 발명에 따라 달성하는 방법에 대한 일 예를 보여준다. 보다 구체적으로, 도 1은 단백질 샘플의 제공 방법을 단계 1a에, 선택적으로 변성 시약을 첨가하는 방법을 단계 1b에, 왕복 유동을 실온에서 효소 컬럼에 적용하여 샘플을 폴리펩타이드/펩타이드로 변환하는 방법을 단계 1c에 도시한다.
도 2는 단백질 분해 및 펩타이드 탈염을 포함한 본 발명에 따른 구체적인 작업흐름도의 일 예이다. 보다 구체적으로, 도 2는 단백질 샘플을 제공하는 방법을 단계 2a에, 선택적으로 변성시, 왕복 유동을 컬럼에 적용하여 실온에서 샘플 단백질을 폴리펩타이드로 변환하는 방법을 단계 2b에, 샘플을 선택적으로 희석하는 방법을 단계 2c에, 이온 쌍 형성제를 첨가하고, 왕복 유동을 역상 탈염 컬럼에 적용하여 펩타이드를 정제하고 불순물을 세척하는 방법을 단계 2d에, 그리고 폴리펩타이드를 비롯하여 처리된 샘플을 용출시키는 방법을 단계 2e에 도시한다. 이로써 농축된 탈염 샘플은 분석할 준비가 완료된다. 이러한 작업 흐름은 96웰 포맷 또는 플레이트 포맷에 적용할 수 있으며, 로봇 조건 하에 LC-MS 또는 MS로 도입될 수 있다.
실험
파트
본 출원에서 제공되는 모든 실시예들은 단지 예시 목적으로 제공되는 것일 뿐 첨부된 청구항에 의해 정의되는 본 발명을 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명에서 아래 또는 도처에서 제공된 모든 참조문헌들은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
실시예
여러가지 활용에 대한 작업 흐름 예들. 왕복 유동하는 파이펫 팁 컬럼을 각 작업 흐름 단계에 사용한다. 실시예들에 기술된 단계들은 자동화될 수 있다.
1.
단백질 분석 - 생물제제 특징 분석 (biologics characterization)
2.
진단
3.
펩타이드 맵핑
4.
마커 개발을 위한 질량 변이 분석 (mass variant analysis)
5.
질병 마커 개발
실시예
1. 단백질 분석을 위한 작업
흐름예
- 생물제제 특징 분석
1. 단백질을 친화성 크로마토그래피로 정제한다.
2. 겔 여과에 의해 완충제를 교환한다.
3. 선택적으로, 변성, 환원, 알킬화 후 희석한다.
4. 고상 효소에 의해 프로테아제 분해를 수행한 후 희석한다.
5. 이온 쌍 형성 역상을 이용해 탈염 처리한다.
6. 크로마토그래피에 의한 질량 분광분석을 수행한다.
단백질 약물 및 단백질 약물 후보물질은, 화학적으로 합성된 것이 아니라는 점에서 통상적인 소분자 약물과는 다르다. 대신, 생물제제로 지칭되는 단백질 약물은 살아있는 포유류 세포의 세포 기전을 이용하여 합성된 재조합 단백질이다. 그래서, 번역 후 수정, 단백질 분자량, 전하 동종성 (charge homogeneity) 및 기타 물리적 특징을 유지하는 것이 생물제제를 제조하는데 주요 과제이다. 요컨대, 이러한 분석 측정은 특히 질량 분광분석 프로파일링에 있어 고 성능, 작은 부피의 처리가 요구된다. 대량 신속 처리 (high throughput) 용도의 경우, 기본 단계인 트립신 분해가 신속하고, 확실하여야 하며, 자가분해는 없어야 한다.
생물제제는 세포 배양으로부터 재조합 단백질로 만들어진다. 단백질은 친화성 공정으로 정제한다. 다수의 샘플들을 한번에 96개를 처리하는 로봇 공학 및 친화성 수지가 충전된 파이펫 팁 컬럼을 사용해 동시에 처리할 수 있다. 고 성능 정제를 위한 왕복 유동을 이용하여, 96개 샘플 세트가 완충제 교환을 위해 플레이트에 전달된다. 단백질 플레이트는 한번에 96개가 겔 여과 매질이 충전된 파이펫 팁 컬럼을 사용해 완충제 교환된다. 완충제 교환된 샘플은 이제 트립신 분해에 최적인 완충제 내에 놓이게 된다. 이 단계는 트립신 접근성을 위해 단백질 언-폴딩을 촉진하기 위한 변성제를 포함할 수 있다. 96-채널 로봇 공학을 이용해, 트립신-고정된 비드가 충천된 파이펫 팁 컬럼으로 샘플을 동시에 분해한다. 액체 핸들링 시스템은 단백질이 트립신 수지를 왕복 통과하여 흐르게 실온에서 계속적으로 펌핑한다. 10-50회의 왕복 유동 사이클로 구성된 사이클을 30분간 진행하면, 단백질이 펩타이드로 분해된다. 펩타이드는 96-채널 로봇 공학 및 C18 역상 매질이 충전된 파이펫 팁 컬럼을 이용해 추가적으로 처리된다. 탈염 처리된 샘플은 이온 억제 (ion suppression)를 저해하게 될 임의의 완충제 성분을 제거함으로써 질량 분광분석할 준비를 완료하게 된다.
실시예
2. 단백질
복합체 질환
마커
개발 및 진단을 위한 작업 흐름 예
1. His-태그 재조합 단백질을 샘플에 첨가한다.
2. 네이티브 단백질을 태깅된 재조합 단백질로 교환한다.
3. 친화성 크로마토그래피로 단백질을 정제한다.
4. 겔 여과에 의해 완충제를 교체한다.
5. 선택적으로, 변성, 환원, 알킬화한 후 희석한다.
6. 고상 효소에 의해 프로테아제 분해를 수행한 후 희석한다.
7. 이온 쌍 형성 역상으로 탈염 처리한다.
8. 크로마토그래피 질량 분광 분석을 수행한다.
단백질은 기능성 세포 측면에서 개별 단백질로서 거의 작용하지 않는다. 대신 단백질들은 여러개의 다양한 단백질들과 조합하여, 단백질 복합체를 형성한다. 때때로, 이들 복합체는 일시적으로 상호작용하여, 검출하기 매우 어려울 수 있다. 단백질 복합체는 질환 정보에 대한 실현가능한 소스이며, 단백질 복합체의 구성성분들이 잠재적인 질환 마커이다. 최근 질환 마커 개발 분야에서의 진보로, 복합체에서 특정 단백질들의 비율이 질환과 상호 연관있다는 것이 부각되었다. 질환 마커 개발의 도전 과제는 적은 양을 이용한 대량 신속 처리에 의한 단백질 복합체의 정제를 질량 분광분석을 위한 고성능의 샘플 준비와 결합하여 수행할 수 있는 작업 흐름이다.
단백질 복합체는 여러가지 전략들 중 한가지를 사용해 친화성 정제를 통해 복합적인 생물 샘플로부터 정제한다. 특정 단백질 성분에 대해 생성된 항체를 사용해, 전체 복합체를 추출할 수 있다. 다른 전략은 단백질 복합체의 단백질 구성성분들의 동역학적 특성을 이용하는 것이다. 일부 경우에, 단백질의 재조합, 태깅된 버전을 인큐베이션하여, 재조합 단백질에 대한 네이티브 단백질의 교체를 달성할 수 있다. 그런 후, 이 단백질 복합체를 태그를 이용해 정제할 수 있다.
많은 샘플은 한번에 96개를 처리하는 로봇 공학과 복합체의 단백질 성분에 대한 항체로 충전된 파이펫 팁 컬럼을 이용하거나, 또는 네이티브 단백질로 교체된 재조합 단백질 상의 태그를 이용함으로써, 동시에 처리할 수 있다. 고 성능 정제를 위한 왕복 유동을 이용해, 96개 샘플 세트가 트립신-고정된 비드로 충전된 파이펫 팁 컬럼을 이용해 샘플들을 동시에 분해하기 위해 플레이트로 이송한다. 액체 핸들링 시스템은 단백질이 트립신 수지 베드를 왕복 통과하여 흐르도록 실온에서 계속적으로 펌핑한다. 20분간 사이클을 진행하면, 단백질이 펩타이드로 완전히 분해된다. 펩타이드는 96-채널 로봇 공학 및 C18 역상 매질이 충전된 파이펫 팁 컬럼을 이용해 추가적으로 처리된다. 탈염 처리된 샘플은 이온 억제를 저해하게 될 임의의 완충제 성분을 제거함으로써 질량 분광분석할 준비를 완료하게 된다.
실시예
3. 펩타이드
맵핑
작업 흐름 예
1. 샘플을 공급한다.
2. 겔 여과에 의해 완충제를 교체한다.
3. 변성, 환원 및 알킬화를 수행한다.
4. 완충제로 희석한다.
5. 고상 트립신, Glu-C, Lys-N, Lys-C, Asp-N, Arg-C 및/또는 키모트립신 분해 효소에 의한 프로테아제 분해를 수행한다.
6. 희석한다.
7. 이온 쌍 형성제를 첨가하고, 이온 쌍 형성 역상으로 탈염 처리한다.
8. 크로마토그래피 질량 분광 분석을 수행한다.
단백질 약물 후보물질은 약물-가능한 타겟 (drug-able target)에 대한 라이브러리를 스크리닝함으로써 발굴한다. 긍정적인 상호작용이 확인되면, 약물 후보물질을 결합 효과에 대해 최적화한다. 이는, 먼저 약물 후보물질이 결합하는 타겟에서 특이적인 펩타이드를 식별하는 것으로, 에피토프 맵핑으로 지칭되는 과정이다. 에피토프 맵핑에서 주요 도전 과제는 확실하고, 재현가능하며 완벽한 방법을 확립하는 것이다.
약물 타겟은 살아있는 포유류 세포의 세포 기전을 이용해 합성된 재조합 단백질이다. 단백질은 한번에 96개를 처리하는 로봇 공학 및 친화성 수지가 충전된 파이펫 팁 컬럼을 사용해 친화성 공정을 통해 정제한다. 한번에 96개를 처리하는 로봇 공학 및 친화성 수지가 충전된 파이펫 팁 컬럼을 사용해 많은 샘플을 동시에 처리할 수 있다. 고 성능 정제를 위한 왕복 유동을 이용하여, 96개 샘플 세트가 완충제 교환을 위해 플레이트로 이송한다. 단백질 플레이트는 한번에 96개가 겔 여과 매질이 충전된 파이펫 팁 컬럼을 사용해 완충제 교환한다. 완충제 교환된 샘플은 이제 트립신 분해에 최적인 완충제 내에 놓이게 된다. 이는 프로테아제 접근성을 위해 단백질 언-폴딩을 촉진하기 위한 변성제를 포함할 수 있다. 샘플은 3개의 분액으로 분할되고, 각각의 분액은 96-채널 로봇 공학을 이용해 분해한다. 이를 이용해 트립신, 키모트립신 또는 Glu-C-고정된 비드가 충천된 파이펫 팁 컬럼으로 샘플을 분해한다. 액체 핸들링 시스템은 단백질이 프로테아제 수지 베드를 왕복 통과하여 흐르게 실온에서 계속적으로 펌핑한다. 20분간 사이클을 진행하면, 단백질이 펩타이드로 완전하게 분해된다. 펩타이드는 96-채널 로봇 공학 및 C18 역상 매질이 충전된 파이펫 팁 컬럼을 이용해 추가적으로 처리된다. 탈염 처리된 샘플은 이온 억제를 저해하게 될 임의의 완충제 성분을 제거함으로써 질량 분광분석할 준비를 완료하게 된다.
실시예
4.
마커
개발을 위한 질량 변이 분석용 작업 흐름 예
1. 공유 유도체화 (covalent derivatization)를 위한 활성화된 수지 또는 스트렙타비딘이 수용된 파이펫 팁 컬럼을 제공한다.
2. 친화성 컬럼을 준비한다.
3. 샘플을 제공한다.
4. 겔 여과에 의해 완충제를 교체한다.
5. 선택적으로, 변성, 환원 및 알킬화를 수행한 후 희석한다.
6. 고상 키모트립신, Glu-C, Lys-N, Lys-C, Asp-N, Arg-C, 키모트립신 Glu-C 및/또는 트립신에 의한 프로테아제 분해를 수행한다.
7. 효소를 분해한 다음, 선택적으로 희석한다.
8. 이온 쌍 형성 역상으로 탈염 처리한다.
9. 크로마토그래피 질량 분광 분석을 수행한다.
최근 연구 결과, 일부 단백질의 펩타이드 서열에 질환과 관련있는 질량 변이가 존재하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 잠재적인 질환 마커는 중요하지만, 정량하기 매우 어렵다. 즉, 질환 마커는 매우 드물게 존재한다. 해결책은, 소량을 이용한 고속 신속 처리 및 질량 분광분석을 위한 고 성능 샘플 준비가 결합된 자동화에서 변이를 정제하는 것을 포함하는 작업 흐름의 일환으로서 질량 변이를 농화 (enrichment)하는 것이다.
친화성 정제는 단백질 질량 변동을 농화하는 효과적인 해법을 제공해준다. 특정 단백질 성분에 대해 생성된 항체를 이용해 단백질의 여러가지 형태들을 추출할 수 있다. 이 항체를 컬럼 수지에 가교를 옵션으로 커플링할 수 있다. 친화성 수지를 제조하기 위한 다른 전략은 항체를 바이오틴으로 표지하여 스트렙타비딘 비드에 항체를 고정하는 것이다. 3번째 다른 전략은 항체를 활성화된 수지에 공유 결합시키는 것이다. 전략과 상관없이, 기술된 수지가 충전된 파이펫 팁 컬럼의 형태로 이들 비드를 이용할 수 있다.
고 성능 정제를 위한 왕복 유동을 이용하여, 96개 샘플 세트를 플레이트로 이송하여, 트립신-고정된 비드로 충전된 파이펫 팁 컬럼을 사용해 샘플을 동시에 분해한다. 액체 핸들링 시스템은 단백질이 트립신 수지 베드를 왕복 통과하여 흐르게 실온에서 계속적으로 펌핑한다. 20분간 사이클을 진행하면, 단백질이 펩타이드로 완전하게 분해된다. 펩타이드는 96-채널 로봇 공학 및 C18 역상 매질이 충전된 파이펫 팁 컬럼을 이용해 추가적으로 처리된다. 탈염 처리된 샘플은 이온 억제를 저해하게 될 임의의 완충제 성분을 제거함으로써 질량 분광분석할 준비를 완료하게 된다.
실시예
5. 조합된
타겟
및 질환
마커
개발을 위한 작업 흐름 예
1. 질환 세포주를 구축한다.
2. 마우스에 접종한다.
3. 단백질 A 또는 단백질 G 파이펫 팁 컬럼을 사용해 항체를 정제한다.
4. 막 조제물 (membrane preps)을 풀 다운 (Pull down)한다.
5. 겔 여과에 의해 완충제를 교체한다.
6. 선택적으로, 변성, 환원, 알킬화한 후 희석한다.
7. 고상 Glu-C, Lys-N, Lys-C, Asp-N, Arg-C, 키모트립신 및/또는 트립신에 의한 프로테아제 분해를 수행한다. 효소 분해한 다음, 선택적으로 희석한다.
8. 이온 쌍 형성 역상으로 탈염 처리한다.
9. 크로마토그래피 질량 분광 분석을 수행한다.
암 세포주 모델은 질환 타겟 발굴 및 치료학적 리드 개발 둘다를 위한 훌륭한 툴이 될 가능성이 있다. 질환 세포주가 확립되면, 이를 이용해 숙주 마우스에서 면역 반응을 유발할 수 있다. 마우스로부터 유래된 항체는 잠재적인 리드 라이브러리로서 이용하며, 또한 질환 세포주의 세포 표면 단백질에 대한 특이성을 부여할 수 있다. 이런 방식으로, 타겟 발굴과 리드 개발을 결합하여, 타임라인을 훨씬 단축할 수 있다.
질환 세포를 사용해 마우스에 접종하고, 면역 반응을 유발한다. 한번에 96개를 처리하는 로봇 공학 및 단백질 A 수지가 충전된 파이펫 팁 컬럼을 사용해 동물로부터 항체를 정제한다. 질환 세포주는, 일부 세포를 세포용해하고, 막 분획을 제조하여, 처리한다. 그런 후, 정제한 항체를 파이펫 팁 컬럼에 고정하여, 이를 막 분획을 친화성 정제하는데 사용한다. 형성된 항체-막 분획 복합체를 트립신 분해를 위한 최적의 완충제로 완충제 교체한다. 이는 프로테아제 접근성을 위해 단백질 언-폴딩을 촉진하기 위한 변성제를 포함할 수 있다. 샘플을 트립신이 충전된 파이펫 팁 컬럼을 이용하여 96-채널 로봇 공학을 이용해 분해한다. 액체 핸들링 시스템은 단백질이 프로테아제 수지 베드를 왕복 통과하여 흐르게 실온에서 계속적으로 펌핑한다. 20분간 사이클을 진행하면, 단백질이 펩타이드로 완전하게 분해된다. 펩타이드는 96-채널 로봇 공학 및 C18 역상 매질이 충전된 파이펫 팁 컬럼을 이용해 추가적으로 처리된다. 탈염 처리된 샘플은 이온 억제를 저해하게 될 임의의 완충제 성분을 제거함으로써 질량 분광분석할 준비를 완료하게 된다.
실시예
6.
보바인
혈청 알부민 단편 분석을 위한 작업 흐름 예
1. BSA를 변성 처리한다.
2. BSA에 트립신을 처리하여 분해하여, 펩타이드를 수득한다.
3. 이온 쌍 형성 C19 역상을 이용한 펩타이드를 탈염 처리한다.
4. MALDI-TOF 분석을 수행한다.
보바인 혈청 알부민 (BSA)은 607개의 잔기로 구성된 단백질이며 분자량은 69kDa이다. 동결건조된 단백질 표준물질을 Sigma-Aldrich (P/N A4612) 사에서 구입하고, PBS 완충제를 사용해 1 mg/mL 용액으로 준비한다. 6M 우레아 용액에 50 ㎍을 첨가하여 변성시키고, 실온에서 1시간 인큐베이션한다. 요오도아세트아미드를 최종 농도 15 mM로 첨가하여 BSA를 알킬화하고, 15분간 암 조건에서 인큐베이션한다. BSA에서 겔 여과 매질이 충전된 파이펫 팁 컬럼을 사용해 완충제 교체한다. BSA를 2 mL 딥 웰 플레이트로 옮기고, 암모늄 바이카보네이트 pH 7.5를 사용해 샘플의 부피를 120 ㎕로 만든다. BSA에 100% 아세토니트릴 80 ㎕를 첨가하여, 최종적으로 40% 아세토니트릴 용액으로 만든다. 5 ㎕ 트립신-고정된 비드가 충전된 200 ㎕ 파이펫 팁 컬럼을 사용한다. 샘플을 실온에서 20분간 유속 250 ㎕/min으로 수지 비드를 왕복 통과시킨다. 샘플을 웰에 주입하고, 파이펫 팁 컬럼은 폐기한다. BSA 펩타이드에 1% TFA 수용액 600 ㎕를 첨가하여, 아세토니트릴을 최종 농도 10%로 희석한다. C19 역상 수지 10 ㎕가 충전된 1 mL 파이펫 팁 컬럼을 사용해, 펩타이드를 탈염 처리한다. 컬럼을 80% 아세토니트릴 250 ㎕로 적신 다음 1% TFA 수용액 분액 2개로 컨디셔닝화한다. 펩타이드를 유속 250 ㎕/min으로 4번의 사이클로 로딩한다. 컬럼을 1% TFA 1 mL을 유속 500 ㎕/min으로 사용해 사이클 1회로 세척한다. 40% TFA 30 ㎕를 유속 500 ㎕/min으로 사용해 사이클 4회로 용출 단계를 수행한다. 탈염된 샘플은 이제 소수성 펩타이드 등의 모든 펩타이드의 존재 및 충분한 분해 커버리지를 확인하기 위한 MALDI-TOF 분석할 준비가 완료된다.
실시예
7.
200 ㎕
파이펫
팁
컬럼에
대한 BSA-트립신 절단 성능 계수 측정
BSA: Sigma-Aldrich (P/N A4612)
BSA는 실시예 6의 방법으로 준비한다.
BSA 양: 50 ㎍
컬럼 겔 베드 부피: 트립신-고정된 비드 5 ㎕
왕복 사이클의 매질 유속: 250 ㎕/min
온도: 23℃
고정된 트립신이 수용된 파이펫 팁 컬럼에 BSA를 적용한다. 왕복 사이클을 다양하게 수회 수행한 후 실시예 6에 기술된 바와 같이 산물을 분석한다. 적어도 50%의 커버리지를 달성하기 위해 필요한 사이클의 최소 횟수로서 BSA-트립신 절단 성능 계수를 결정하고, 20임을 확인한다.
Claims (24)
- 샘플 단백질의 정성 분석 방법으로서,
a) 하나 이상의 결합된 프로테아제를 포함하는 수 팽윤된 겔 컬럼 베드 (water swollen gel column bed)를 제공하는 단계;
b) 완충액 중의 하나 이상의 샘플 단백질을 제공하는 단계;
c) 상기 샘플 단백질을 단계 a)의 겔 베드와 접촉시켜 분해함으로써, 상기 단백질(들)을 폴리펩타이드로 절단하는 단계; 및
d) 단계 c)에서 수득한 폴리펩타이드를 질량 분광분석 (MS)으로 분석하여, 이와 관련된 질량 정보를 입수하는 단계를 포함하며,
단계 c)가 약 37℃ 미만의 온도에서 왕복 유동 (back and forth flow)을 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서,
적어도 단계 c)에서, 상기 온도가 약 30℃ 미만인, 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
단계 c)에서, 상기 샘플 단백질을 4-6회 겔 베드 통과와 같이 겔 베드를 2회 이상 왕복 통과시키는, 방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 c)의 지속 시간이 약 4시간 미만인, 방법. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 하나 이상의 결합된 프로테아제가 트립신; Glu-C; Lys-N; Lys-C; Asp-N; Arg-C; 및 키모트립신으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 d)에서, 폴리펩타이드의 개수는 50%보다 많게 식별되는, 방법. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 d)에서, 상기 질량 정보는 단계 b)의 상기 샘플 단백질의 정체를 파악하기 위한 컴퓨터 기반의 소프트웨어에 의해 이용되는, 방법 - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 d)에서, 폴리펩타이드의 개수는 50%보다 많게 식별되는, 방법 - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
제공되는 상기 컬럼은 베드 부피가 베드 약 5 ㎕ - 약 20 ㎕ 범위이고, 최대 약 150 ㎍의 샘플 단백질을 처리할 수 있는, 방법. - 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 b)에서, 상기 단백질이 실온에서 변성 완충제 중에 제공되는, 방법. - 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 b)에서, 상기 변성 시약이 아세토니트릴; 우레아 및 구아니딘 하이드로클로라이드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법. - 단백질을 폴리펩타이드로 절단하고 폴리펩타이드 산물을 회수하는 자동화된 방법으로서,
a) 트립신; Glu-C; Lys-N; Lys-C; Asp-N; Arg-C; 및 키모트립신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 결합된 프로테아제를 각각 포함하는 복수의 수 팽윤된 겔 컬럼 베드를 포함하는 로봇 액체 핸들러 (robotic liquid handler)를 제공하는 단계;
b) 완충액 중에 하나 이상의 선택적으로 변성된 단백질을 제공하는 단계;
c) 상기 단백질을 단계 a)의 겔 베드들과 접촉시키는 단계로서, 각각의 겔 베드는 겔 베드와의 접촉시 용매를 홀딩하고 상기 베드를 통한 상기 용매의 왕복 사이클 동안에 상기 용매가 상기 베드를 통과하여 흐르도록 구성되는, 단계;
d) 단백질을 왕복 유동으로 분해하여, 4시간 미만의 시간 동안 단백질을 폴리펩타이드로 절단하고, 선택적으로 상기 샘플을 희석하는 단계;
e) 상기 샘플에 이온 쌍 형성제 (ion pairing reagent)를 첨가하는 단계;
f) 리버스 파이펫 팁 컬럼 (reverse pipette tip column)을 제공하고, 선택적으로 상기 컬럼을 컨디셔닝화 (conditioning)하는 단계;
g) 폴리펩타이드를 왕복 유동시켜 상기 파이펫 팁 컬럼에 흡착시키고, 선택적으로 상기 컬럼으로부터 오염물질을 세척 (washing)하는 단계; 및
h) 상기 폴리펩타이드를 용출시키는 단계
를 포함하는, 방법. - 제12항에 있어서,
상기 용출된 폴리펩타이드를 단백질의 정성 분석을 제공하기 위해 질량 분광분석을 실시하고, 상기 폴리펩타이드의 커버리지 (coverage)가 50%보다 높은, 방법. - 제12항 또는 제13항에 있어서,
상기 겔 베드 부피가 베드 약 5 ㎕ - 약 20 ㎕ 범위이고, 최대 약 150 ㎍의 샘플 단백질을 처리할 수 있는, 방법. - 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제공된 파이펫 팁 컬럼이 고상 트립신 20 ㎕ 이하를 수용하는, 방법. - 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 d)에서, 단백질 분해가 약 30℃ 미만과 같은 약 37℃ 미만의 온도에서 수행되는, 방법. - 단백질 절단 장치로서,
상기 장치는 겔 베드를 포함하는 파이펫 팁을 포함하며,
상기 파이펫 팁은 샘플 단백질이 왕복 샘플 유동에 의해 절단되도록 구성되고,
상기 파이펫 팁은 2-100 범위의 BSA-트립신 절단 성능 계수 (BSA-Trypsin Cleavage Performance Factor)를 가지는, 장치. - 제17항에 있어서,
상기 BSA-트립신 절단 성능 계수가 20인, 장치 - 제17항 또는 제18항에 있어서,
샘플 단백질을 분석하기 위한 자동화된 시스템으로 배열된, 장치 - 제19항에 있어서,
상기 자동화된 시스템은 하나 이상의 탈염 파이펫 팁 탈염 컬럼 (desalting pipette tip desalting column)을 하나 이상의 분해 컬럼과 연속적으로 (desalting pipette tip desalting column) 통합하는, 장치. - 샘플 단백질의 정성 분석용 키트로서,
상기 키트는 프로테아제-탑재된 파이펫 팁 컬럼 (protease-loaded pipette tip column), 하나 이상의 변성 시약, 하나 이상의 완충제 및 샘플 단백질의 단편을 질량-기반으로 분석하기 위한 설명서를 포함하는, 키트. - 제21항에 있어서,
상기 프로테아제가 팽윤된 겔 베드에 결합되어 제공되고, 트립신; Glu-C; Lys-N; Lys-C; Asp-N; Arg-C; 및 키모트립신으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 키트. - 제21항 또는 제22항에 있어서,
트립신-탑재된 파이펫 팁, 변성 시약, 역상 탈염 파이펫 팁 컬럼 및 이온 쌍 형성제를 포함하는, 키트. - 제23항에 있어서,
상기 설명서가 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 자동화된 방법에 관한 것인, 키트.
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