JP3023305B2 - アミノ末端修飾ペプチド断片の単離方法 - Google Patents
アミノ末端修飾ペプチド断片の単離方法Info
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- JP3023305B2 JP3023305B2 JP8039710A JP3971096A JP3023305B2 JP 3023305 B2 JP3023305 B2 JP 3023305B2 JP 8039710 A JP8039710 A JP 8039710A JP 3971096 A JP3971096 A JP 3971096A JP 3023305 B2 JP3023305 B2 JP 3023305B2
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、アミノ末端アミノ
酸残基のα−アミノ基がアシル基等で修飾されているポ
リペプチドからそのアミノ末端ペプチドを単離する方
法、ならびに該方法を利用して、アミノ末端アミノ酸残
基のα−アミノ基が修飾されているポリペプチドおよび
そのアミノ末端部を同定する方法に関する。
酸残基のα−アミノ基がアシル基等で修飾されているポ
リペプチドからそのアミノ末端ペプチドを単離する方
法、ならびに該方法を利用して、アミノ末端アミノ酸残
基のα−アミノ基が修飾されているポリペプチドおよび
そのアミノ末端部を同定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】蛋白質は、酵素、ホルモン、受容体、生
体の主要構成成分などとして生体内で様々な役割を演じ
ている。蛋白質は、約２０種のＬ−α−アミノ酸がペプ
チド結合により連結したポリペプチド鎖から成ってお
り、これらのアミノ酸の配列順序を決定することは蛋白
質の構造に関する重要な情報を与える。原理的には、ポ
リペプチド鎖の端から一つずつアミノ酸を遊離させて順
次同定していけば、蛋白質の全アミノ酸配列が決定され
るはずであるが、現実には、１００残基以上のアミノ酸
をこのような方法で同定することは不可能である。その
ため、まず、蛋白質を数十残基以下のペプチドに断片化
してから、それぞれのアミノ酸配列を決定している。
体の主要構成成分などとして生体内で様々な役割を演じ
ている。蛋白質は、約２０種のＬ−α−アミノ酸がペプ
チド結合により連結したポリペプチド鎖から成ってお
り、これらのアミノ酸の配列順序を決定することは蛋白
質の構造に関する重要な情報を与える。原理的には、ポ
リペプチド鎖の端から一つずつアミノ酸を遊離させて順
次同定していけば、蛋白質の全アミノ酸配列が決定され
るはずであるが、現実には、１００残基以上のアミノ酸
をこのような方法で同定することは不可能である。その
ため、まず、蛋白質を数十残基以下のペプチドに断片化
してから、それぞれのアミノ酸配列を決定している。
【０００３】蛋白質の断片化により生じたペプチドのア
ミノ酸配列を決定するための方法として最も一般的なの
は、エドマン法である。この方法は、1950年にエドマン
により開発された、ペプチドのアミノ末端から逐次アミ
ノ酸残基を同定していくアミノ酸配列決定法であり（P.
Edman, Acta Chem. Scand.、4、283、1950）、現在に至
るまでに種々の工夫がなされ、今や、この方法によるペ
プチドのアミノ末端アミノ酸配列の分析は、自動化され
たシーケンサーを用いて、ピコモルのオーダーの極微量
試料で可能となった（日本生化学会編：“新生化学実験
講座、第１巻、II、東京化学同人、153〜218、1990）。
ミノ酸配列を決定するための方法として最も一般的なの
は、エドマン法である。この方法は、1950年にエドマン
により開発された、ペプチドのアミノ末端から逐次アミ
ノ酸残基を同定していくアミノ酸配列決定法であり（P.
Edman, Acta Chem. Scand.、4、283、1950）、現在に至
るまでに種々の工夫がなされ、今や、この方法によるペ
プチドのアミノ末端アミノ酸配列の分析は、自動化され
たシーケンサーを用いて、ピコモルのオーダーの極微量
試料で可能となった（日本生化学会編：“新生化学実験
講座、第１巻、II、東京化学同人、153〜218、1990）。
【０００４】しかし、蛋白質のアミノ末端アミノ酸残基
のα−アミノ基が何らかの置換基で修飾されている場合
には、エドマン試薬と反応しないため、エドマン法によ
ってアミノ酸配列を決定することができず、微量のアミ
ノ末端修飾蛋白質のアミノ末端部のアミノ酸配列に関す
る情報を得ることは困難であった。
のα−アミノ基が何らかの置換基で修飾されている場合
には、エドマン試薬と反応しないため、エドマン法によ
ってアミノ酸配列を決定することができず、微量のアミ
ノ末端修飾蛋白質のアミノ末端部のアミノ酸配列に関す
る情報を得ることは困難であった。
【０００５】現在、アミノ末端が修飾された蛋白質のア
ミノ末端部の分析法としては、陽イオン交換法（Titan
i,K.,Narita,K.,Okunuki,K.：J.Biochem、51、350-35
8、1962）、酵素法（日本生化学会編：“新生化学実験
講座、第１巻、II、東京化学同人、198-206、1990）、D
ITCグラス／アビジンカラム法（光永研一・宮城大・石
水毅・加藤郁之進・綱沢進：第44回蛋白質構造討論会要
旨集、1993）、CNBrビーズ法（秋山知子、笹川立：蛋白
質・核酸・酵素、39、80、1994）が用いられている。
ミノ末端部の分析法としては、陽イオン交換法（Titan
i,K.,Narita,K.,Okunuki,K.：J.Biochem、51、350-35
8、1962）、酵素法（日本生化学会編：“新生化学実験
講座、第１巻、II、東京化学同人、198-206、1990）、D
ITCグラス／アビジンカラム法（光永研一・宮城大・石
水毅・加藤郁之進・綱沢進：第44回蛋白質構造討論会要
旨集、1993）、CNBrビーズ法（秋山知子、笹川立：蛋白
質・核酸・酵素、39、80、1994）が用いられている。
【０００６】このうち、陽イオン交換法は、アミノ末端
が修飾された蛋白質を、キモトリプシンなどの基質特異
性の低いプロテアーゼで消化し、生成したペプチド断片
混合物を陽イオン交換カラムにかけたとき、正の電荷を
もたないアミノ末端ブロックペプチドのみが、陽イオン
交換樹脂に吸着されずに回収されることを利用した方法
であるが、アミノ末端修飾ペプチド内に塩基性アミノ酸
が含まれている場合には、適用することができず、ま
た、酸性アミノ酸が含まれている場合には、陽イオン交
換カラムに完全に吸着せず、一部非吸着画分に溶出され
てしまうという欠点がある。
が修飾された蛋白質を、キモトリプシンなどの基質特異
性の低いプロテアーゼで消化し、生成したペプチド断片
混合物を陽イオン交換カラムにかけたとき、正の電荷を
もたないアミノ末端ブロックペプチドのみが、陽イオン
交換樹脂に吸着されずに回収されることを利用した方法
であるが、アミノ末端修飾ペプチド内に塩基性アミノ酸
が含まれている場合には、適用することができず、ま
た、酸性アミノ酸が含まれている場合には、陽イオン交
換カラムに完全に吸着せず、一部非吸着画分に溶出され
てしまうという欠点がある。
【０００７】酵素法は、アミノ末端が修飾された蛋白質
を断片化した後、ロイシンアミノペプチダーゼを作用さ
せると、α−アミノ基を有するアミノ末端修飾ペプチド
以外のペプチドは、アミノ末端から逐次的にアミノ酸を
遊離するため、酵素処理前後で逆相クロマトグラム上の
溶出位置が変化するが、アミノ末端が修飾されたペプチ
ドはこの酵素により消化を受けないので、溶出位置が変
化しないことを利用した方法である。しかし、この酵素
は、X−Proの配列を切断しない等、ペプチドの酵素消化
が完全に行われずに、途中で止まってしまうことがある
ため、アミノ末端修飾ペプチドが絞りきれないという欠
点を持っている。
を断片化した後、ロイシンアミノペプチダーゼを作用さ
せると、α−アミノ基を有するアミノ末端修飾ペプチド
以外のペプチドは、アミノ末端から逐次的にアミノ酸を
遊離するため、酵素処理前後で逆相クロマトグラム上の
溶出位置が変化するが、アミノ末端が修飾されたペプチ
ドはこの酵素により消化を受けないので、溶出位置が変
化しないことを利用した方法である。しかし、この酵素
は、X−Proの配列を切断しない等、ペプチドの酵素消化
が完全に行われずに、途中で止まってしまうことがある
ため、アミノ末端修飾ペプチドが絞りきれないという欠
点を持っている。
【０００８】DITCグラス／アビジンカラム法は、アミノ
末端が修飾された蛋白質を、アクロモバクタープロテア
ーゼＩなどのリジン残基のカルボキシル基側を断片化す
るプロテアーゼで一旦消化し、さらに生成したペプチド
断片のカルボキシ末端リジン残基を、カルボキシペプチ
ダーゼＢで消化し、得られたペプチド断片混合物をDITC
グラスとアビジンカラムの２種類のカラムにかけること
により、アミノ基をもたないアミノ末端ブロックペプチ
ドのみが、カラムに固定化されずに回収されることを利
用した方法である。しかし、最終的にアミノ末端ブロッ
クペプチドを得るまでのステップ数が多く、特に微量の
アミノ末端が修飾された蛋白質を用いて操作を行った場
合、回収率が非常に低いという欠点を有している。
末端が修飾された蛋白質を、アクロモバクタープロテア
ーゼＩなどのリジン残基のカルボキシル基側を断片化す
るプロテアーゼで一旦消化し、さらに生成したペプチド
断片のカルボキシ末端リジン残基を、カルボキシペプチ
ダーゼＢで消化し、得られたペプチド断片混合物をDITC
グラスとアビジンカラムの２種類のカラムにかけること
により、アミノ基をもたないアミノ末端ブロックペプチ
ドのみが、カラムに固定化されずに回収されることを利
用した方法である。しかし、最終的にアミノ末端ブロッ
クペプチドを得るまでのステップ数が多く、特に微量の
アミノ末端が修飾された蛋白質を用いて操作を行った場
合、回収率が非常に低いという欠点を有している。
【０００９】CNBrビーズ法は、アミノ末端が修飾された
蛋白質のリジン残基のε−アミノ基を、まず無水コハク
酸を用いサクシニル化し、キモトリプシンなどの基質特
異性の低いプロテアーゼで消化し、生成したペプチド断
片混合物をCNBr活性化セファロースカラムにかけたと
き、アミノ基をもたないアミノ末端ブロックペプチドの
みが、CNBr活性化セファロースカラムに固定化されずに
回収されることを利用した方法である。しかし、数種の
アミノ末端フラグメント及びアミノ末端がPyr 化したも
のが回収されてしまうという欠点を有している。また、
上記のいずれの方法もナノモル以上の試料が必要である
等の共通の欠点がある。
蛋白質のリジン残基のε−アミノ基を、まず無水コハク
酸を用いサクシニル化し、キモトリプシンなどの基質特
異性の低いプロテアーゼで消化し、生成したペプチド断
片混合物をCNBr活性化セファロースカラムにかけたと
き、アミノ基をもたないアミノ末端ブロックペプチドの
みが、CNBr活性化セファロースカラムに固定化されずに
回収されることを利用した方法である。しかし、数種の
アミノ末端フラグメント及びアミノ末端がPyr 化したも
のが回収されてしまうという欠点を有している。また、
上記のいずれの方法もナノモル以上の試料が必要である
等の共通の欠点がある。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、上
記の従来技術の欠点を克服した、アミノ末端修飾ポリペ
プチドの同定方法、アミノ末端修飾ポリペプチドのアミ
ノ末端部の同定方法、およびそれらに利用可能なアミノ
末端修飾ペプチド断片の単離方法を提供することを目的
とする。
記の従来技術の欠点を克服した、アミノ末端修飾ポリペ
プチドの同定方法、アミノ末端修飾ポリペプチドのアミ
ノ末端部の同定方法、およびそれらに利用可能なアミノ
末端修飾ペプチド断片の単離方法を提供することを目的
とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するた
め、本発明者らは、アミノ末端がアシル化されているポ
リペプチドにマイタケのメタロエンドペプチダーゼを作
用させて、ポリペプチド中のリジン残基のアミノ末端側
のペプチド結合を特異的に切断することによってポリペ
プチドを断片化し、得られたペプチド断片混合物をＤＩ
ＴＣ−樹脂と反応させて遊離のアミノ基を有するペプチ
ド断片をＤＩＴＣ−樹脂に結合させ、遊離のアミノ基を
有さない未結合のペプチド断片を回収し、このペプチド
断片を分析したところ、期待されたアミノ末端ペプチド
断片であることを確認して、本発明を完成するに至っ
た。すなわち、本発明は、アミノ末端アミノ酸残基のα
−アミノ基が修飾されているポリペプチドにおけるリジ
ン残基のアミノ末端側のペプチド結合を特異的に切断す
ることによって前記ポリペプチドを断片化し、得られる
ペプチド断片混合物を遊離のアミノ基と結合しうる固体
と反応させ、そして、遊離のアミノ基を有さない未結合
のペプチド断片を回収することを含んでなる、アミノ末
端アミノ酸残基のα−アミノ基が修飾されているペプチ
ド断片を単離する方法を提供する。また、本発明は、ア
ミノ末端アミノ酸残基のα−アミノ基が修飾されている
ポリペプチドにおけるリジン残基のアミノ末端側のペプ
チド結合を特異的に切断することによって前記ポリペプ
チドを断片化し、得られるペプチド断片混合物を遊離の
アミノ基と結合しうる固体と反応させ、遊離のアミノ基
を有さない未結合のペプチド断片を回収し、そして、回
収されたアミノ末端アミノ酸残基のα−アミノ基が修飾
されているペプチド断片を同定することを含んでなる、
アミノ末端アミノ酸残基のα−アミノ基が修飾されてい
るポリペプチドのアミノ末端部を同定する方法を提供す
る。さらに、本発明は、アミノ末端アミノ酸残基のα−
アミノ基が修飾されているポリペプチドにおけるリジン
残基のアミノ末端側のペプチド結合を特異的に切断する
ことによって前記ポリペプチドを断片化し、得られるペ
プチド断片混合物を遊離のアミノ基と結合しうる固体と
反応させ、遊離のアミノ基を有さない未結合のペプチド
断片を回収し、そして、回収されたアミノ末端アミノ酸
残基のα−アミノ基が修飾されているペプチド断片およ
び前記ポリペプチドの断片化により得られた残りのペプ
チド断片を同定することを含んでなる、アミノ末端アミ
ノ酸残基のα−アミノ基が修飾されているポリペプチド
を同定する方法を提供する。
め、本発明者らは、アミノ末端がアシル化されているポ
リペプチドにマイタケのメタロエンドペプチダーゼを作
用させて、ポリペプチド中のリジン残基のアミノ末端側
のペプチド結合を特異的に切断することによってポリペ
プチドを断片化し、得られたペプチド断片混合物をＤＩ
ＴＣ−樹脂と反応させて遊離のアミノ基を有するペプチ
ド断片をＤＩＴＣ−樹脂に結合させ、遊離のアミノ基を
有さない未結合のペプチド断片を回収し、このペプチド
断片を分析したところ、期待されたアミノ末端ペプチド
断片であることを確認して、本発明を完成するに至っ
た。すなわち、本発明は、アミノ末端アミノ酸残基のα
−アミノ基が修飾されているポリペプチドにおけるリジ
ン残基のアミノ末端側のペプチド結合を特異的に切断す
ることによって前記ポリペプチドを断片化し、得られる
ペプチド断片混合物を遊離のアミノ基と結合しうる固体
と反応させ、そして、遊離のアミノ基を有さない未結合
のペプチド断片を回収することを含んでなる、アミノ末
端アミノ酸残基のα−アミノ基が修飾されているペプチ
ド断片を単離する方法を提供する。また、本発明は、ア
ミノ末端アミノ酸残基のα−アミノ基が修飾されている
ポリペプチドにおけるリジン残基のアミノ末端側のペプ
チド結合を特異的に切断することによって前記ポリペプ
チドを断片化し、得られるペプチド断片混合物を遊離の
アミノ基と結合しうる固体と反応させ、遊離のアミノ基
を有さない未結合のペプチド断片を回収し、そして、回
収されたアミノ末端アミノ酸残基のα−アミノ基が修飾
されているペプチド断片を同定することを含んでなる、
アミノ末端アミノ酸残基のα−アミノ基が修飾されてい
るポリペプチドのアミノ末端部を同定する方法を提供す
る。さらに、本発明は、アミノ末端アミノ酸残基のα−
アミノ基が修飾されているポリペプチドにおけるリジン
残基のアミノ末端側のペプチド結合を特異的に切断する
ことによって前記ポリペプチドを断片化し、得られるペ
プチド断片混合物を遊離のアミノ基と結合しうる固体と
反応させ、遊離のアミノ基を有さない未結合のペプチド
断片を回収し、そして、回収されたアミノ末端アミノ酸
残基のα−アミノ基が修飾されているペプチド断片およ
び前記ポリペプチドの断片化により得られた残りのペプ
チド断片を同定することを含んでなる、アミノ末端アミ
ノ酸残基のα−アミノ基が修飾されているポリペプチド
を同定する方法を提供する。
【００１２】特定の理論に拘泥するわけではないが、本
発明の方法は、アミノ末端アミノ酸残基のα−アミノ基
が修飾されたペプチド断片以外のペプチド断片は、その
アミノ末端アミノ酸のα−アミノ基及びリジン残基のε
−アミノ基を介して、遊離のアミノ基と結合しうる固体
と結合するのに対し、アミノ末端アミノ酸残基のα−ア
ミノ基が修飾されたペプチド断片は、分子内に遊離のア
ミノ基を有していないため、前記の固体と結合すること
が出来ず、反応溶液中に遊離することを利用するもので
ある。
発明の方法は、アミノ末端アミノ酸残基のα−アミノ基
が修飾されたペプチド断片以外のペプチド断片は、その
アミノ末端アミノ酸のα−アミノ基及びリジン残基のε
−アミノ基を介して、遊離のアミノ基と結合しうる固体
と結合するのに対し、アミノ末端アミノ酸残基のα−ア
ミノ基が修飾されたペプチド断片は、分子内に遊離のア
ミノ基を有していないため、前記の固体と結合すること
が出来ず、反応溶液中に遊離することを利用するもので
ある。
【００１３】以下、本発明を詳細に説明する。本明細書
中、「アミノ末端修飾ペプチド（断片）」とは、アミノ
末端アミノ酸残基のα−アミノ基が修飾されているペプ
チド（断片）をいうものとする。
中、「アミノ末端修飾ペプチド（断片）」とは、アミノ
末端アミノ酸残基のα−アミノ基が修飾されているペプ
チド（断片）をいうものとする。
【００１４】まず、アミノ末端アミノ酸残基のα−アミ
ノ基が修飾されているポリペプチドにおけるリジン残基
のアミノ末端側のペプチド結合を特異的に切断して、前
記ポリペプチドを断片化する。このような切断の方法
は、いかなる化学的または酵素的分解法であってもよい
が、最も有用な方法は、マイタケのメタロエンドペプチ
ダーゼ（EC3.4.99.32、以下、Lys-Nと略す。）を作用さ
せることである。本酵素は、X−Lys 結合（Xはアミノ酸
残基を表わす。）の切断にきわめて特異的であり、非特
異的な切断例は非常に少ない（橋本洋一：蛋白質・核酸
・酵素 28：1220〜1225、1983）ので、本発明への適用
において特に好適である。Lys-Nは熱安定性の高い酵素
であるので、切断反応の条件に対する制約は少なく、pH
3〜10、好ましくはpH9〜10、温度4〜60℃、好ましくは2
0〜45℃の反応条件下で、切断すべきポリペプチドに対
し、1／20〜1／2000好ましくは1／200〜1／600のモル比
で添加して、1〜50時間、好ましくは12〜18時間、緩衝
液中で作用させればよい。緩衝液としては、生化学実験
で汎用される種々の緩衝液が使用可能であるが、後続の
操作へ及ぼす影響を考慮すると、遊離のアミノ基を有さ
ない緩衝液が好ましく、ホウ酸ナトリウム緩衝液は好適
である。断片化に用いる酵素としては、マイタケから精
製されるメタロエンドペプチダーゼ（生化学工業社）の
他に、ナラタケより精製されるメタロエンドペプチダー
ゼ等、リシンのアミノ末端を特異的に切断する酵素も用
いることが出来る。これらの酵素による切断反応の条件
は、上記のマイタケのメタロエンドペプチダーゼの場合
に準じる。
ノ基が修飾されているポリペプチドにおけるリジン残基
のアミノ末端側のペプチド結合を特異的に切断して、前
記ポリペプチドを断片化する。このような切断の方法
は、いかなる化学的または酵素的分解法であってもよい
が、最も有用な方法は、マイタケのメタロエンドペプチ
ダーゼ（EC3.4.99.32、以下、Lys-Nと略す。）を作用さ
せることである。本酵素は、X−Lys 結合（Xはアミノ酸
残基を表わす。）の切断にきわめて特異的であり、非特
異的な切断例は非常に少ない（橋本洋一：蛋白質・核酸
・酵素 28：1220〜1225、1983）ので、本発明への適用
において特に好適である。Lys-Nは熱安定性の高い酵素
であるので、切断反応の条件に対する制約は少なく、pH
3〜10、好ましくはpH9〜10、温度4〜60℃、好ましくは2
0〜45℃の反応条件下で、切断すべきポリペプチドに対
し、1／20〜1／2000好ましくは1／200〜1／600のモル比
で添加して、1〜50時間、好ましくは12〜18時間、緩衝
液中で作用させればよい。緩衝液としては、生化学実験
で汎用される種々の緩衝液が使用可能であるが、後続の
操作へ及ぼす影響を考慮すると、遊離のアミノ基を有さ
ない緩衝液が好ましく、ホウ酸ナトリウム緩衝液は好適
である。断片化に用いる酵素としては、マイタケから精
製されるメタロエンドペプチダーゼ（生化学工業社）の
他に、ナラタケより精製されるメタロエンドペプチダー
ゼ等、リシンのアミノ末端を特異的に切断する酵素も用
いることが出来る。これらの酵素による切断反応の条件
は、上記のマイタケのメタロエンドペプチダーゼの場合
に準じる。
【００１５】アミノ末端アミノ酸残基のα−アミノ基が
修飾されているポリペプチドとしては、アミノ末端アミ
ノ酸残基のα−アミノ基がアセチル化、ホルミル化、ミ
リスチル化、ピルボイル化、α−ケトブチル化、グルク
ロニル化、α−アミノアシル化、ピログルタミル化、ム
レイニル化などを含むアシル化、また、ジメチル化、ト
リメチル化などのアルキル化されているポリペプチドな
どが挙げられる。このようなポリペプチドの例として
は、アミノ末端のセリン残基のα−アミノ基がアセチル
化しているウシ赤血球カーボニックアンヒドラーゼ、ア
ミノ末端のメチオニン残基のα−アミノ基がアセチル化
しているヒト水晶体α−クリスタリンＡ２鎖およびＢ２
鎖、アミノ末端残基がピログルタミン酸であるヒト血清
高密度リポ蛋白質Ａ−ＩＩ（ＨＤＬ−ａｐｏＡ−ＩＩ）
などがある。
修飾されているポリペプチドとしては、アミノ末端アミ
ノ酸残基のα−アミノ基がアセチル化、ホルミル化、ミ
リスチル化、ピルボイル化、α−ケトブチル化、グルク
ロニル化、α−アミノアシル化、ピログルタミル化、ム
レイニル化などを含むアシル化、また、ジメチル化、ト
リメチル化などのアルキル化されているポリペプチドな
どが挙げられる。このようなポリペプチドの例として
は、アミノ末端のセリン残基のα−アミノ基がアセチル
化しているウシ赤血球カーボニックアンヒドラーゼ、ア
ミノ末端のメチオニン残基のα−アミノ基がアセチル化
しているヒト水晶体α−クリスタリンＡ２鎖およびＢ２
鎖、アミノ末端残基がピログルタミン酸であるヒト血清
高密度リポ蛋白質Ａ−ＩＩ（ＨＤＬ−ａｐｏＡ−ＩＩ）
などがある。
【００１６】次に、上記のようにしてポリペプチドを断
片化して得られるペプチド断片混合物を遊離のアミノ基
と結合しうる固体と反応させる。遊離のアミノ基と結合
しうる固体としては、遊離のアミノ基と反応として結合
を形成しうる官能基を表面に有する固体担体を挙げるこ
とができる。遊離のアミノ基と官能基との結合は、共有
結合や塩結合など、本発明の目的を達成できる限りにお
いて、いかなるものであってもよい。遊離のアミノ基と
反応して結合を形成しうる官能基としては、イミド基、
イソ尿素、アルデヒド基、シアノ基、アセチル基、サク
シニル基、マレイル基、アセトアセチル基、ジニトロフ
ェニル基、トリニトリベンゼンスルホン酸基、イソチオ
シアネート基等、数多く挙げることができるが、アミノ
基のみと反応し、又、エドマン分解を行うことで、一
旦、固体に固定化させたペプチド断片を回収することが
可能であるイソチオシアネート基が本発明には好適であ
る。イソチオシアネート基を表面に有する固体担体を用
いれば、アミノ末端修飾ペプチド断片を取得後、その他
のペプチド断片が固定化されている固体担体をトリフル
オロ酢酸等で酸処理することにより、それらのペプチド
断片を回収することをも可能となるのである。イソチオ
シアネート基等の官能基を有する固体担体の調整は、例
えば、“Sequencing of proteins and peptides”G.All
en, P.208、1981、North-Holland Publishing Compan
y、Amsterdam；New York・Oxford”に記載の方法に準じ
て行うことができる。固体担体としては多孔性ガラス、
シリカゲル、ポリスチレン樹脂等が挙げられる。細孔径
の揃った多孔性ガラスは、反応が制御しやすく、又、親
水性であることから特に好ましいが、疎水性担体である
ポリスチレンの場合も、イソチオシアネート基にさら
に、グルコサミノール基を導入するなどして親水性を高
め（岩永ら：蛋白質・核酸・酵素 15、 1052、197
0）、使いやすくすることも出来る。遊離のアミノ基と
結合しうる固体とペプチド断片混合物とのカップリング
反応は、pH7〜12、好ましくは9〜11、更に好ましくは9.
5〜10.5、温度4〜80℃、好ましくは10〜60℃で、５分〜
３時間行うが、この際、反応液を窒素もしくはアルゴン
で置換して、酸素を除いておくことが好ましい。遊離の
アミノ基を有さないアミノ末端修飾ペプチド断片は上記
の固体と結合しないので、カップリング反応終了後、精
製水などの適切な溶媒で固体を洗浄し、固体を除去する
ことにより、所望のアミノ末端修飾ペプチド断片のみを
液相中に分取することができる。
片化して得られるペプチド断片混合物を遊離のアミノ基
と結合しうる固体と反応させる。遊離のアミノ基と結合
しうる固体としては、遊離のアミノ基と反応として結合
を形成しうる官能基を表面に有する固体担体を挙げるこ
とができる。遊離のアミノ基と官能基との結合は、共有
結合や塩結合など、本発明の目的を達成できる限りにお
いて、いかなるものであってもよい。遊離のアミノ基と
反応して結合を形成しうる官能基としては、イミド基、
イソ尿素、アルデヒド基、シアノ基、アセチル基、サク
シニル基、マレイル基、アセトアセチル基、ジニトロフ
ェニル基、トリニトリベンゼンスルホン酸基、イソチオ
シアネート基等、数多く挙げることができるが、アミノ
基のみと反応し、又、エドマン分解を行うことで、一
旦、固体に固定化させたペプチド断片を回収することが
可能であるイソチオシアネート基が本発明には好適であ
る。イソチオシアネート基を表面に有する固体担体を用
いれば、アミノ末端修飾ペプチド断片を取得後、その他
のペプチド断片が固定化されている固体担体をトリフル
オロ酢酸等で酸処理することにより、それらのペプチド
断片を回収することをも可能となるのである。イソチオ
シアネート基等の官能基を有する固体担体の調整は、例
えば、“Sequencing of proteins and peptides”G.All
en, P.208、1981、North-Holland Publishing Compan
y、Amsterdam；New York・Oxford”に記載の方法に準じ
て行うことができる。固体担体としては多孔性ガラス、
シリカゲル、ポリスチレン樹脂等が挙げられる。細孔径
の揃った多孔性ガラスは、反応が制御しやすく、又、親
水性であることから特に好ましいが、疎水性担体である
ポリスチレンの場合も、イソチオシアネート基にさら
に、グルコサミノール基を導入するなどして親水性を高
め（岩永ら：蛋白質・核酸・酵素 15、 1052、197
0）、使いやすくすることも出来る。遊離のアミノ基と
結合しうる固体とペプチド断片混合物とのカップリング
反応は、pH7〜12、好ましくは9〜11、更に好ましくは9.
5〜10.5、温度4〜80℃、好ましくは10〜60℃で、５分〜
３時間行うが、この際、反応液を窒素もしくはアルゴン
で置換して、酸素を除いておくことが好ましい。遊離の
アミノ基を有さないアミノ末端修飾ペプチド断片は上記
の固体と結合しないので、カップリング反応終了後、精
製水などの適切な溶媒で固体を洗浄し、固体を除去する
ことにより、所望のアミノ末端修飾ペプチド断片のみを
液相中に分取することができる。
【００１７】かくして単離されたアミノ末端修飾ペプチ
ド断片は、常法にしたがい、アミノ酸組成分析、質量分
析を行うことや、修飾基がアシル基である場合には、ア
ミノ末端アシル化アミノ酸残基をアシルアミノ酸遊離酵
素で消化後、エドマン反応等で分析することによりアミ
ノ酸配列を決定できる。アシルアミノ酸遊離酵素として
は、Ｎ−α−アセチル基をアミノ末端アミノ酸とともに
脱離させるアセチルアミノ酸遊離酵素（EC.3.1.19.1)を
挙げることができる。
ド断片は、常法にしたがい、アミノ酸組成分析、質量分
析を行うことや、修飾基がアシル基である場合には、ア
ミノ末端アシル化アミノ酸残基をアシルアミノ酸遊離酵
素で消化後、エドマン反応等で分析することによりアミ
ノ酸配列を決定できる。アシルアミノ酸遊離酵素として
は、Ｎ−α−アセチル基をアミノ末端アミノ酸とともに
脱離させるアセチルアミノ酸遊離酵素（EC.3.1.19.1)を
挙げることができる。
【００１８】さらに、アミノ末端アミノ酸残基のα−ア
ミノ基が修飾されているポリペプチドの断片化により得
られた、アミノ末端修飾ペプチド断片以外のペプチド断
片を常法により回収および同定すれば、前記ポリペプチ
ドの全アミノ酸配列を決定することができる。
ミノ基が修飾されているポリペプチドの断片化により得
られた、アミノ末端修飾ペプチド断片以外のペプチド断
片を常法により回収および同定すれば、前記ポリペプチ
ドの全アミノ酸配列を決定することができる。
【００１９】
【発明の実施の形態】以下、実施例を挙げて本発明をさ
らに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例
に限定されるものでない。
らに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例
に限定されるものでない。
【００２０】
〔実施例１〕ヒトアセチルβエンドルフィン（フナコ
シ）50ピコモルを、20ミリモル濃度のホウ酸ナトリウム
緩衝液（pH9.0）５０μｌ程度に溶解し、1ピコモルのLy
s-N（生化学工業）を添加して、37℃で15時間反応させ
た。反応終了後、２モル濃度のグアニジンを含む20ミリ
モル濃度のホウ酸緩衝液（pH11.0）を等量添加して、反
応溶液中のグアニジンが１モル濃度、pHが約10になるよ
うに調整した。これに10mgのDITC−樹脂（ポリスチレン
系樹脂にフェニレンジイソチオシアネートを結合させた
もの、島津社製）を添加し、反応系をアルゴン置換し
て、50℃で１時間、カップリング反応を行なった。反応
終了後、反応液に残ったアミノ末端修飾ペプチド断片を
逆相高速液体クロマトグラフィーにより分析した。2.0m
mφ×150mmの和光純薬工業社Wakosil-II 5C18 ARカラム
を使用し、0.1％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリ
ル−イソプロパノール（３：７、v／v）水溶液を溶離液
として、アセトニトリル−イソプロパノール（３：７、
v／v）1％から50％への直線濃度勾配溶出を0.25ml／min
の流速で行った。得られたクロマトグラムは図１の(B)
に示すとおりであり、ピークa を質量分析及びアミノ酸
組成分析（Accq・Tag法）で分析した結果（表１）、こ
のピークが期待されたアミノ末端ペプチド断片であるこ
とが確認された。図１の(A) は、Lys-N 消化後のペプチ
ド断片混合液のクロマトグラムである。図１中のスケー
ルは、紫外吸収の吸光単位を示す。
シ）50ピコモルを、20ミリモル濃度のホウ酸ナトリウム
緩衝液（pH9.0）５０μｌ程度に溶解し、1ピコモルのLy
s-N（生化学工業）を添加して、37℃で15時間反応させ
た。反応終了後、２モル濃度のグアニジンを含む20ミリ
モル濃度のホウ酸緩衝液（pH11.0）を等量添加して、反
応溶液中のグアニジンが１モル濃度、pHが約10になるよ
うに調整した。これに10mgのDITC−樹脂（ポリスチレン
系樹脂にフェニレンジイソチオシアネートを結合させた
もの、島津社製）を添加し、反応系をアルゴン置換し
て、50℃で１時間、カップリング反応を行なった。反応
終了後、反応液に残ったアミノ末端修飾ペプチド断片を
逆相高速液体クロマトグラフィーにより分析した。2.0m
mφ×150mmの和光純薬工業社Wakosil-II 5C18 ARカラム
を使用し、0.1％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリ
ル−イソプロパノール（３：７、v／v）水溶液を溶離液
として、アセトニトリル−イソプロパノール（３：７、
v／v）1％から50％への直線濃度勾配溶出を0.25ml／min
の流速で行った。得られたクロマトグラムは図１の(B)
に示すとおりであり、ピークa を質量分析及びアミノ酸
組成分析（Accq・Tag法）で分析した結果（表１）、こ
のピークが期待されたアミノ末端ペプチド断片であるこ
とが確認された。図１の(A) は、Lys-N 消化後のペプチ
ド断片混合液のクロマトグラムである。図１中のスケー
ルは、紫外吸収の吸光単位を示す。
【００２１】
【表１】
【００２２】〔実施例２〕ウシ赤血球カーボニックアン
ヒドラーゼ（シグマ）50ピコモルを、SDS−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法で分画後、ポリビニルジフロリ
ド膜（パーキンエルマー）へエレクトロブロティング法
により転写した。その後、岩松の既法（生化学、６3、
2、139-143、1991）に従い、膜処理を行った。以後、実
施例１と同様にしてLys-N 消化を行い、アミノ末端修飾
ペプチド断片を分取した。分取ペプチド断片の分析も実
施例１と同様にして行った。得られたクロマトグラム
は、図２の(B）に示すとおりであり、ピークa を質量分
析及びアミノ酸組成分析（Accq・Tag法）で分析した結
果（表２）、このピークが期待されたアミノ末端ペプチ
ド断片であることが確認された。図２の(A) は、Lys-N
消化後のペプチド断片混合液のクロマトグラムである。
ヒドラーゼ（シグマ）50ピコモルを、SDS−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法で分画後、ポリビニルジフロリ
ド膜（パーキンエルマー）へエレクトロブロティング法
により転写した。その後、岩松の既法（生化学、６3、
2、139-143、1991）に従い、膜処理を行った。以後、実
施例１と同様にしてLys-N 消化を行い、アミノ末端修飾
ペプチド断片を分取した。分取ペプチド断片の分析も実
施例１と同様にして行った。得られたクロマトグラム
は、図２の(B）に示すとおりであり、ピークa を質量分
析及びアミノ酸組成分析（Accq・Tag法）で分析した結
果（表２）、このピークが期待されたアミノ末端ペプチ
ド断片であることが確認された。図２の(A) は、Lys-N
消化後のペプチド断片混合液のクロマトグラムである。
【００２３】
【表２】
【００２４】
【発明の効果】本発明によれば、アミノ末端アミノ酸残
基のα−アミノ基が修飾されているポリペプチドからそ
のアミノ末端修飾ペプチド断片を簡便に単離することが
でき、そのポリペプチドのアミノ末端部の構造解析、さ
らには、そのポリペプチド全体の構造解析を容易に行う
ことができる。
基のα−アミノ基が修飾されているポリペプチドからそ
のアミノ末端修飾ペプチド断片を簡便に単離することが
でき、そのポリペプチドのアミノ末端部の構造解析、さ
らには、そのポリペプチド全体の構造解析を容易に行う
ことができる。
【００２５】本発明の方法により、アミノ末端が修飾さ
れていない蛋白質のアミノ酸配列分析と同程度の極微量
（ピコモルのオーダー）のアミノ末端修飾蛋白質試料か
ら、多くの確実なアミノ酸配列情報を得ることができ
る。
れていない蛋白質のアミノ酸配列分析と同程度の極微量
（ピコモルのオーダー）のアミノ末端修飾蛋白質試料か
ら、多くの確実なアミノ酸配列情報を得ることができ
る。
【図１】図１は、ヒトアセチルβエンドルフィンをLys-
Nで断片化して得られたペプチド断片混合物(A) および
該ペプチド断片混合物のうちDITC-樹脂に吸着しなかっ
たペプチド断片(B) の逆相高速液体クロマトグラムであ
る。
Nで断片化して得られたペプチド断片混合物(A) および
該ペプチド断片混合物のうちDITC-樹脂に吸着しなかっ
たペプチド断片(B) の逆相高速液体クロマトグラムであ
る。
【図２】図２は、ウシ赤血球カーボニックアンヒドラー
ゼをLys-Nで断片化して得られたペプチド断片混合物(A)
および該ペプチド断片混合物のうちDITC-樹脂に吸着し
なかったペプチド断片(B) の逆相高速液体クロマトグラ
ムである。
ゼをLys-Nで断片化して得られたペプチド断片混合物(A)
および該ペプチド断片混合物のうちDITC-樹脂に吸着し
なかったペプチド断片(B) の逆相高速液体クロマトグラ
ムである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭63−305253（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−94697（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−235600（ＪＰ，Ａ) 特表 平３−502284（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/37 C12P 21/00
Claims (9)
- 【請求項１】 アミノ末端アミノ酸残基のα−アミノ基
が修飾されているポリペプチドにおけるリジン残基のア
ミノ末端側のペプチド結合を特異的に切断することによ
って前記ポリペプチドを断片化し、得られるペプチド断
片混合物を遊離のアミノ基と結合しうる固体と反応さ
せ、そして、遊離のアミノ基を有さない未結合のペプチ
ド断片を回収することを含んでなる、アミノ末端アミノ
酸残基のα−アミノ基が修飾されているペプチド断片を
単離する方法。 - 【請求項２】 アミノ末端アミノ酸残基のα−アミノ基
が修飾されているポリペプチドが、アミノ末端アミノ酸
残基のα−アミノ基がアシル化されているポリペプチド
である、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 アミノ末端アミノ酸残基のα−アミノ基
が修飾されているポリペプチドにおけるリジン残基のア
ミノ末端側のペプチド結合の特異的な切断をメタロエン
ドペプチダーゼにより行う、請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 メタロエンドペプチダーゼがマイタケに
由来するものである、請求項３記載の方法。 - 【請求項５】 遊離のアミノ基と結合しうる固体が、遊
離のアミノ基と反応して結合を形成しうる官能基を表面
に有する固体担体である、請求項１記載の方法。 - 【請求項６】 遊離のアミノ基と反応して結合を形成し
うる官能基が、イミド基、イソ尿素、アルデヒド基、シ
アノ基、アセチル基、サクシニル基、マレイル基、アセ
トアセチル基、ジニトロフェニル基、トリニトリベンゼ
ンスルホン酸基およびイソチオシアネート基から成る群
より選択される、請求項５記載の方法。 - 【請求項７】 固体担体が、多孔性ガラス、シリカゲル
およびポリスチレン樹脂から成る群より選択される材料
で構成されるものである、請求項５記載の方法。 - 【請求項８】 アミノ末端アミノ酸残基のα−アミノ基
が修飾されているポリペプチドにおけるリジン残基のア
ミノ末端側のペプチド結合を特異的に切断することによ
って前記ポリペプチドを断片化し、得られるペプチド断
片混合物を遊離のアミノ基と結合しうる固体と反応さ
せ、遊離のアミノ基を有さない未結合のペプチド断片を
回収し、そして、回収されたアミノ末端アミノ酸残基の
α−アミノ基が修飾されているペプチド断片を同定する
ことを含んでなる、アミノ末端アミノ酸残基のα−アミ
ノ基が修飾されているポリペプチドのアミノ末端部を同
定する方法。 - 【請求項９】 アミノ末端アミノ酸残基のα−アミノ基
が修飾されているポリペプチドにおけるリジン残基のア
ミノ末端側のペプチド結合を特異的に切断することによ
って前記ポリペプチドを断片化し、得られるペプチド断
片混合物を遊離のアミノ基と結合しうる固体と反応さ
せ、遊離のアミノ基を有さない未結合のペプチド断片を
回収し、そして、回収されたアミノ末端アミノ酸残基の
α−アミノ基が修飾されているペプチド断片および前記
ポリペプチドの断片化により得られた残りのペプチド断
片を同定することを含んでなる、アミノ末端アミノ酸残
基のα−アミノ基が修飾されているポリペプチドを同定
する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8039710A JP3023305B2 (ja) | 1996-02-27 | 1996-02-27 | アミノ末端修飾ペプチド断片の単離方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8039710A JP3023305B2 (ja) | 1996-02-27 | 1996-02-27 | アミノ末端修飾ペプチド断片の単離方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09224698A JPH09224698A (ja) | 1997-09-02 |
| JP3023305B2 true JP3023305B2 (ja) | 2000-03-21 |
Family
ID=12560556
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8039710A Expired - Fee Related JP3023305B2 (ja) | 1996-02-27 | 1996-02-27 | アミノ末端修飾ペプチド断片の単離方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3023305B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5239319B2 (ja) * | 2007-11-30 | 2013-07-17 | 株式会社島津製作所 | タンパク質のｃ末端ペプチドを選択的に回収する方法及びそれを用いたタンパク質のｃ末端ペプチドのアミノ酸配列決定法 |
| KR102093818B1 (ko) * | 2018-08-16 | 2020-03-26 | 한국과학기술연구원 | 단백질의 ｎ-말단 영역을 수득하는 방법 및 이에 이용되는 키트 |
-
1996
- 1996-02-27 JP JP8039710A patent/JP3023305B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH09224698A (ja) | 1997-09-02 |
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