KR102093818B1 - 단백질의 ｎ-말단 영역을 수득하는 방법 및 이에 이용되는 키트 - Google Patents

단백질의 ｎ-말단 영역을 수득하는 방법 및 이에 이용되는 키트 Download PDF

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Abstract

단백질의 N-말단 영역을 수득하는 방법, 단백질의 N-말단 영역의 아미노산 서열 분석 방법, 및 이에 이용되는 키트를 제공한다. 이에 의하면, 간단하고, 빠르고, 재현도가 높게 단백질의 N-말단 영역을 수득하고 아미노산 서열을 분석할 수 있다. 또한, 1회에 광범위한 범위(약 10 ng 내지 약 1 mg)의 단백질 양을 처리할 수 있고, 여러 개의 시료를 병렬로 처리할 수 있다.

Description

단백질의 Ｎ-말단 영역을 수득하는 방법 및 이에 이용되는 키트{Method for obtaining N-terminal region of protein and kit used thereon}
단백질의 N-말단 영역을 수득하는 방법, 단백질의 N-말단 영역의 아미노산 서열 분석 방법, 및 이에 이용되는 키트에 관한 것이다.
단백질은 세포에서 생합성될 때 아세틸화되거나, 일부 잘리거나, 프로테아제에 의한 절단 등으로 인해 N 말단의 성상이 변화한다. 단백질의 N-말단 부위에는 단백질 번역 시작 부위, 세포내 수송 및 단백질 수명에 관한 정보가 있다. 단백질의 N-말단을 분석함으로써, 단백질의 N-말단이 길어지거나 짧아진 새로운 이형 단백질을 발견하거나, N-말단이 변형된 변이 단백질의 존재 유무를 밝힐 수 있고, 특히, 'N-말단 법칙(end rule)'과 관련하여, 특정한 단백질의 세포 반감기에 대한 단서를 얻을 수 있다. 그 외에도, 단백질 바이오시밀러나 각종 단백질 제재의 물성을 규명할 수 있다.
단백질의 아미노산 서열을 분석할 경우 일반적으로 샷-건 프로테오믹스(shot-gun proteomics) 방법을 이용한다. 그러나, 샷-건 프로테오믹스 방법은 단백질분해효소 절단 후 펩티드 분석을 수행하기 때문에 서열 분석시 제외되는 부분 발생하며, N-말단의 서열이 확인되지 않을 수 있다. 단백질 N-말단 분석을 위해 널리 이용되는 N-말단 농축 방법은 COFRADIC(combined fractional diagonal chromatography)과 TAILS(Terminal amine isotopic labeling of substrates)이다. 이들 방법은 단백질의 모든 아민기를 인위적으로 표지하고, 단백질을 펩티드화시킨 후 나타나는 N-말단이 아닌 내부 펩티드를 제거하고, N-말단 펩티드를 분리하는 단계를 포함한다. 이들 N-말단 농축 방법 모두 시료를 처리하는 동안 용기를 두번 이상 바꿔야 하고 며칠간의 처리 시간이 요구된다.
따라서, 단일 용기에서 시료를 처리하고, 시료 양을 현저하게 최소화하면서도 더욱 단순하고, 강력하고, 효율적인 단백질 N-말단 영역의 농축 방법을 개발할 필요하다.
단백질의 N-말단 영역을 수득하는 방법을 제공한다.
단백질에서 N-말단 영역의 아미노산 서열을 분석하는 방법을 제공한다.
단백질에서 N-말단 영역을 수득하기 위한 키트를 제공한다.
일 양상은 단백질 시료를 산 무수물 및 촉매와 인큐베이션하여 단백질의 아미노기를 표지하는 단계;
표지된 단백질에 단백질 절단 효소를 가하여 단백질을 절단하는 단계;
절단된 폴리펩티드에 N-히드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide: NHS) 기능기를 갖는 고체 지지체를 가하여 유리 아미노기를 갖는 폴리펩티드를 고갈(depletion)시키는 단계; 및
반응물에 아세토니트릴을 가하여 표지된 폴리펩티드를 용출하는 단계를 포함하는,
단백질의 N-말단 영역을 수득하는 방법을 제공한다.
상기 단백질은 펩티드 결합으로 연결된 아미노산의 긴 사슬을 포함한 생물분자를 말한다. 상기 단백질은 1종 이상의 폴리펩티드를 하나 이상 포함할 수 있다.
상기 단백질의 유리(free) 아미노기를 갖는 말단을 아미노 말단 또는 N-말단(N-terminus)라고 한다. 상기 단백질의 N-말단 영역은 단백질의 N-말단 부위의 아민노산을 포함한 폴리펩티드일 수 있다. 상기 단백질의 N-말단 영역은 단백질의 N-말단으로부터 6개 내지 500개, 8개 내지 450개, 10개 내지 400개, 15개 내지 350개, 20개 내지 300개, 30개 내지 300개, 40개 내지 300개, 50개 내지 300개, 75개 내지 300개, 100개 내지 300개, 100개 내지 275개, 100개 내지 250개, 100개 내지 225개, 또는 100개 내지 200개의 연속 아미노산 서열일 수 있다.
상기 방법은 1종 이상의 단백질에 대해 수행되어, 1종 이상의 단백질의 N-말단 영역이 수득될 수 있다.
상기 방법은 1종 이상의 단백질의 N-말단 영역을 농축하는 것일 수 있다.
상기 방법은 단백질의 아미노기를 표지하는 단계 전에, 단백질 시료를 단백질 변성제, 이황화물 환원제, 알킬화제, 또는 이들의 조합과 인큐베이션하여 단백질의 시스테인 잔기를 환원 및 알킬화시키는 단계를 포함할 수 있다.
상기 단백질 시료는 세포 용해물, 세포 배양액, 또는 생물학적 시료로부터 유래된 것일 수 있다. 상기 세포 용해물은 세포를 물리 또는 화학적 방법으로 용해시켜 수득된 시료일 수 있다. 상기 세포 배양액은 시험관 내에서(in vitro) 배양된 세포의 배양액으로서 세포를 함유하지 않는 것일 수 있다. 상기 생물학적 시료는 소변, 점액, 타액, 눈물, 혈액, 혈장, 혈청, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 장액, 비뇨생식관액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액, 또는 이들의 조합일 수 있다.
용어 "단백질 변성제(protein denaturation agent)"는 단백질의 입체구조를 상실하게 하는 물질을 말한다. 상기 단백질 변성제는 구아니딘(guanidine), 우레아(urea), 포름아미드(formamide), 소듐 살리실레이트(sodium salicylate), 디메틸 술폭시드(dimethyl sulfoxide: DMSO), 및 프로필렌 글리콜(propylene glycol)로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
용어 "이황화물 환원제(disulfide reducing agent)"는 단백질 중 이황화 결합을 절단하여 티올기를 환원시킬 수 있는 물질을 말한다. 상기 이황화물 환원제는 시스테인의 티올기를 환원시킬 수 있다. 상기 이황화물 환원제는 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(tris(2-carboxyethyl)phosphine: TCEP), 트리스(3-히드록시프로필)포스핀(tris(3-hydroxypropyl)phosphine: THPP), 디티오트레이톨(dithiothreitol: DTT), 2-머캅토에탄올(mercaptoethanol: ME), 및 2-머캅토에틸아민(mercaptoethylamine: MEA)로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
용어 "알킬화제(alkylating agent)"는 단백질의 아미노산 잔기에 알킬기를 전달할 수 있는 물질을 말한다. 상기 알킬화제는 2-클로로아세트아미드(chloroacetamide), 요오드아세트아미드(iodoacetamide), 요오드아세트산(iodoacetic acid), 및 아크릴아미드(acrylamide)로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 알킬화제는 시스테인 잔기의 티올기, 예를 들어 환원된 티올기를 알킬화시킬 수 있다.
상기 단백질 시료를 단백질 변성제, 이황화물 환원제, 알킬화제, 또는 이들의 조합과 인큐베이션하는 단계는 약 20℃ 내지 약 100℃, 약 25℃ 내지 약 100℃, 약 30℃ 내지 약 100℃, 약 40℃ 내지 약 100℃, 약 50℃ 내지 약 100℃, 약 60℃ 내지 약 100℃, 약 70℃ 내지 약 100℃, 약 80℃ 내지 약 100℃, 약 90℃ 내지 약 100℃, 또는 약 95℃ 내지 약 100℃에서 수행될 수 있다. 상기 단계는 약 1 분 내지 약 24 시간, 약 1 분 내지 약 20 시간, 약 1 분 내지 약 16 시간, 약 1 분 내지 약 12 시간, 약 1 분 내지 약 10 시간, 약 1 분 내지 약 8 시간, 약 1 분 내지 약 6 시간, 약 1 분 내지 약 4 시간, 약 1 분 내지 약 2 시간, 약 2 분 내지 약 2 시간, 약 4 분 내지 약 2 시간, 약 6 분 내지 약 2 시간, 약 8 분 내지 약 2 시간, 또는 약 10 분 내지 약 2 시간 동안 수행할 수 있다. 상기 단계는 예를 들어 약 95℃에서 약 10분 동안 또는 실온에서 약 2 시간 동안 수행될 수 있다.
상기 방법은 단백질 시료를 산 무수물 및 촉매와 인큐베이션하여 단백질의 아미노기를 표지하는 단계를 포함한다.
상기 산 무수물(acid anhydride)은 유기산 무수물일 수 있다. 상기 유기산 무수물은 아세트산 무수물(acetic anhydride), 말레산 무수물(Maleic anhydride), N-히드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide: NHS)-접합된 화합물, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 NHS-접합된 화합물은 Tandem Mass Tag(TMT)™ 또는 iTRAQ일 수 있다.
상기 촉매는 단백질의 아세틸화를 촉진할 수 있는 물질일 수 있다. 상기 촉매는 피리딘(pyridine), 3차 아민 화합물(예, 트리에틸아민), 또는 이들의 조합일 수 있다.
단백질 시료를 산 무수물 및 촉매와 인큐베이션하는 단계는 약 20℃ 내지 약 50℃, 약 20℃ 내지 약 45℃, 약 20℃ 내지 약 40℃, 약 20℃ 내지 약 35℃, 약 20℃ 내지 약 30℃, 약 20℃ 내지 약 25℃, 또는 실온에서 수행될 수 있다. 상기 단계는 약 1 분 내지 약 24 시간, 약 1 분 내지 약 20 시간, 약 1 분 내지 약 16 시간, 약 1 분 내지 약 12 시간, 약 1 분 내지 약 8 시간, 약 1 분 내지 약 6 시간, 약 1 분 내지 약 4 시간, 약 1 분 내지 약 2 시간, 약 10 분 내지 약 2 시간, 약 20 분 내지 약 2 시간, 약 30 분 내지 약 2 시간, 약 30 분 내지 약 1 시간 40분, 약 40 분 내지 약 1 시간 20분, 또는 약 50 분 내지 약 1 시간 동안 수행될 수 있다. 상기 단계는 예를 들어 실온에서 약 1 시간 동안 수행될 수 있다.
상기 단백질의 아미노기는 단백질의 N-말단의 알파-아미노기(α-amino group), 리신 잔기의 에타-아미노기(ε-amino group), 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 표지하는 단계(labeling)는 단백질의 아미노기를 아세틸화시키는 것일 수 있다.
상기 방법은 단백질을 절단하는 단계 전에 표지된 단백질을 완충액으로 희석하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 완충액은 EPPS(3-[4-(2-히드록시에틸)피페라진-1일]프로판-1-술폰산), HEPES(4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 희석하는 단계는 약 4℃ 내지 약 50℃, 약 4℃ 내지 약 40℃, 약 4℃ 내지 약 30℃, 약 10℃ 내지 약 30℃, 약 15℃ 내지 약 30℃, 약 20℃ 내지 약 30℃, 약 20℃ 내지 약 25℃, 또는 실온에서 수행될 수 있다. 상기 단계는 약 1 분 내지 약 24 시간, 약 5 분 내지 약 20 시간, 약 10 분 내지 약 16 시간, 약 10 분 내지 약 12 시간, 약 10 분 내지 약 8 시간, 약 10 분 내지 약 4 시간, 약 20 분 내지 약 2 시간, 약 30 분 내지 약 2 시간, 약 30 분 내지 약 1 시간 30분, 또는 약 50 분 내지 약 1 시간 동안 수행될 수 있다. 상기 단계는 예를 들어 실온에서 약 1 시간 동안 수행될 수 있다.
상기 방법은 표지된 단백질에 단백질 절단 효소를 가하여 단백질을 절단하는 단계를 포함한다.
용어 "단백질 절단 효소(protease)"는 펩티드 결합의 가수분해를 촉매하는 효소를 말한다. 상기 단백질 절단 효소는 단백질 가수분해효소일 수 있다. 상기 단백질 절단 효소는 예를 들어 트립신(trypsin), Lys-C, Lys-N, Arg-C, Asp-N, Glu-C, 키모트립신(Chymotrypsin), 펩신(Pepsin), 프로테나제(Proteinase) K, 써모리신(Thermolysin), 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 단백질 절단 효소의 절단에 의해 상기 단백질은 특정 부위에서 선택적으로 절단될 수 있다. 예를 들어, 상기 단백질은 트립신에 의해 아르기닌(arginine)이 선택적으로 절단될 수 있다.
상기 방법은 절단된 폴리펩티드에 N-히드록실 숙신이미드(N-hydroxyl succinimide: NHS) 기능기를 갖는 고체 지지체를 가하여 유리 아미노기를 갖는 폴리펩티드를 고갈(depletion)시키는 단계를 포함한다.
상기 고체 지지체는 아가로스(agarose) 비드, 자성(magnetic) 비드, 세파로스(sepharose) 비드, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 아가로스 비드는 건조 아가로스 비드일 수 있다.
상기 NHS 기능기를 갖는 고체 지지체는 유리(free) 아미노기를 갖는 폴리펩티드에 접합되지만, 아세틸화된 단백질의 N-말단의 아미노기에는 접합되지 않을 수 있다.
상기 방법은 폴리펩티드를 용출하는 단계 전에 반응물에 포름산(formic acid)을 가하여 탈염(desalting)하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 포름산의 농도는 약 0.01%(v/v) 내지 약 10%(v/v), 약 0.02%(v/v) 내지 약 5%(v/v), 약 0.05%(v/v) 내지 약 1%(v/v), 약 0.07%(v/v) 내지 약 0.5%(v/v), 약 0.1%(v/v) 내지 약 0.5%(v/v), 또는 약 0.1%(v/v) 내지 약 0.2%(v/v)일 수 있다.
상기 방법은 반응물에 아세토니트릴(acetonitrile: ACN)을 가하여 표지된 폴리펩티드를 용출하는 단계를 포함한다.
상기 아세토니트릴의 농도는 약 1%(v/v) 내지 약 99%(v/v), 약 5%(v/v) 내지 약 90%(v/v), 약 10%(v/v) 내지 약 80%(v/v), 약 20%(v/v) 내지 약 70%(v/v), 약 30%(v/v) 내지 약 60%(v/v), 또는 약 40%(v/v) 내지 약 50%(v/v)일 수 있다.
상기 폴리펩티드를 용출하는 단계는 아세토니트릴, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 포름산, 또는 이들의 조합을 가하여 수행될 수 있다. 상기 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 또는 포름산의 농도는 약 0.01%(v/v) 내지 약 10%(v/v), 약 0.02%(v/v) 내지 약 5%(v/v), 약 0.05%(v/v) 내지 약 1%(v/v), 약 0.07%(v/v) 내지 약 0.5%(v/v), 약 0.1%(v/v) 내지 약 0.5%(v/v), 또는 약 0.1%(v/v) 내지 약 0.2%(v/v)일 수 있다.
상기 폴리펩티드를 용출하는 단계는 pH 구배, 염 농도, 또는 이들의 조합에 따라 순차 분획될 수 있다. 상기 폴리펩티드를 용출하는 단계는 pH 11, pH 8, pH 6, 및 pH 4의 용출 완충액에서 순차로 분획될 수 있다.
상기 방법은 용출된 폴리펩티드를 건조하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 건조는 진공 하에서 수행될 수 있다.
다른 양상은 일 양상에 따라 용출된 폴리펩티드에 대해 액체 크로마토그래피를 수행하는 단계; 및 액체 크로마토 그래피 분획물을 질량 분석하는 단계를 포함하는, 단백질에서 N-말단 영역의 아미노산 서열을 분석하는 방법을 제공한다.
상기 액체 크로마토그래피는 고성능 액체 크로마토그래피(High-performance liquid chromatography: HPLC)일 수 있다.
상기 방법은 액체 크로마토그래피 탠뎀-질량 분석 방법(Liquid chromatography tandem-mass spectrometry: LC-MS/MS)으로 수행될 수 있다.
다른 양상은 산 무수물 및 촉매를 포함하는 단백질의 아미노기 표지용 조성물; 단백질 절단 효소; N-히드록실 숙신이미드(N-hydroxyl succinimide: NHS) 기능기를 갖는 고체 지지체; 아세토니트릴; 및 반응 용기를 포함하는, 단백질의 N-말단 영역을 수득하기 위한 키트를 제공한다.
상기 산 무수물, 촉매, 단백질 절단 효소, 고체 지지체, 아세토니트릴, 단백질, 및 단백질의 N-말단 영역은 전술한 바와 같다.
상기 키트는 단백질 변성제, 이황화물 환원제, 알킬화제, 또는 이들의 조합을 포함한 단백질의 시스테인 잔기를 환원 및 알킬화용 조성물을 더 포함할 수 있다.
상기 키트는 포름산을 더 포함할 수 있다.
상기 반응 용기는 고체상 추출(solid phase extraction: SPE) 튜브 또는 스테이지 팁(Stage tip)일 수 있다. 상기 스테이지 팁은 200 ㎕ 피펫 팁에 직접 고정상을 설치하여 사용하는 것일 수 있다. 고정상은 PTFE 매트릭스 기반 Empore™를 사용할 수 있다. 고체상 추출을 위한 기능기로서, SDB-RPS(styrenedivinylbenzene- reverse phase sulfonate), C8, C18, 또는 이들의 조합을 사용할 수 있다. 상기 반응 용기는 하나 이상의 루어(luer) 팁을 갖는 것일 수 있다. 상기 반응 용기는 루어(Luer) 플러그를 더 포함할 수 있다.
일 양상에 따른 단백질의 N-말단 영역을 수득하는 방법, 단백질의 N-말단 영역의 아미노산 서열 분석 방법, 및 이에 이용되는 키트에 의하면, 간단하고, 빠르고, 재현도가 높게 단백질의 N-말단 영역을 수득하고 아미노산 서열을 분석할 수 있다. 또한, 1회에 광범위한 범위(약 10 ng 내지 약 1 mg)의 단백질 양을 처리할 수 있고, 여러 개의 시료를 병렬로 처리할 수 있다.
도 1은 N-말단 분석방법인 iNrich 방법의 모식도 및 사용된 컬럼의 이미지(좌측 아래)이다.
도 2a 내지 도 2e는 iNrich 방법의 순서를 나타낸 이미지로서, 도 2a는 초기 반응기로 NMR 튜브 뚜껑을 이용하는 것을 나타낸 사진이고, 도 2b는 iNrich 반응기 사진이고, 도 2c는 iNrich 반응기에 NHS-활성화된 비드를 가하는 단계를 나타낸 사진이고, 도 2d는 iNrich 반응기에 NHS-활성화된 비드를 가한 후의 사진이고, 및 도 2e는 튜브 회전기에서 반응기를 인큐베이션하는 사진이다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. N-말단 펩티드 농축 방법
1. 세포 용해 및 단백질 추출
HCT116, HEK293T, A172, T98G, 및 HS683 세포는 10%(v/v) FBS (Gibco) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco)을 보충한 DMEM(Gibco, Rockville, MD, USA) 배지에서 배양하였다. 세포는 5% CO2의 대기 하에서 37℃의 온도인 배양기에서 배양하였다. 세포는 약 >90% 컨플루언스까지 배양하였다. 세포를 수득하기 전에, 세포를 얼음처럼 찬 인산염 완충 염수(PBS, Gibco)으로 2회 세척하였다. 세척된 세포를 원심분리하여 수득하고, 얼음처럼 찬 용해 완충액[0.2 M EPPS(3-[4-(2-히드록시에틸)피페라진-1일]프로판-1-술폰산)(pH 8.0), 6 M 구아니딘, 10 mM 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(tris(2-carboxyethyl)phosphine: TCEP), 및 40 mM 2-클로로아세트아미드(chloroacetamide)]에 현탁하였다. 약 95℃에서 약 10분 동안 인큐베이션하여 단백질에서 시스테인 잔기의 환원과 알킬화를 동시에 수행하였다(Kulak et al., Nature Methods, vol.11, no.3, pp.319-324 (2014)).
그 후, 반응물을 BranSonic 400B로 초음파처리(ultrasonication)하여 용해시켰다. 세포 용해물을 12,000 xg의 속도로 약 10분 동안 약 4℃에서 원심분리한 후 상층액을 분리하여 단백질을 수집하였다. 수집한 상층액의 단백질 농도를 BCA(bicinchoninic acid) 단백질 분석법(Thermo Fisher Scientific)으로 결정하였다. 상층액에 용해 완충액을 가하여 4 ㎍/㎕의 농도로 희석하였다.
2. 캡슐화된 SPE 컬럼(iNrich)에서 N-말단의 농축
폴리프로필렌 NMR 튜브 뚜껑(5 mm 크기, Z153281, Sigma-aldrich)를 받침대에 올려두었다(도 2a).
실시예 1.1에 기재된 바와 같이 용해 완충액 중 4 ㎍/㎕의 농도로 희석된 단백질을 폴리프로필렌 NMR 튜브 뚜껑의 안쪽면으로 적재하였다. 20 ㎍ 내지 400 ㎍의 단백질에 200 mM D6-아세트산 무수물(Sigma-aldrich) 및 200 mM 피리딘(Sigma-aldrich)을 가하고 실온에서 약 1 시간 동안 인큐베이션하여, 단백질의 N-말단 또는 리신 잔기를 라벨링하였다(라벨링 단계). 리신 잔기에 표지가 접합된 Nε-아세틸리신이 더이상 트립신에 의해 절단되지 않고, 트립신은 아르기닌만 선택적으로 절단하게 된다.
고체상 추출(solid phase extraction: SPE) 재료로 Oasis HLB 흡착제 카트리지(Waters) 또는 MAX SPE(Solid Phase Extraction) 카트리지(Waters)를 준비하였다. 준비된 카트리지를 아세토니트릴(HPLC 등급, J.T.Baker)로 미리 활성화시키고, 카트리지의 컬럼을 1 mL의 0.2 M EPPS(pH 8.0)로 3회 평형화시켰다(iNrich 반응기, 도 2b). 루어-플러그가 있는 카트리지의 출수구를 물에 연결하였다. 반응 혼합물을 0.2 M EPPS(pH 8)을 포함한 라벨링 혼합물을 10배 희석하고 카트리지에 가하였다. 카트리지에 NMR 튜브 뚜껑을 연결하였다. 실온에서 약 1시간 동안 50 rpm의 튜브 회전기(SLRM-2M, SeouLin Bioscience)에서 인큐베이션하여 반응되지 않은 아세트산 무수물을 ?치(quench)하였다(희석 단계).
카트리지의 반응물에 1 mM HCl 중 0.1 ㎎/㎖의 트립신을 1:50의 효소/기질의 비율로 가하였다. 약 37℃에서 약 4 시간 동안 약 50 rpm의 튜브 회전기에서 인큐베이션하여, 단백질을 절단하였다(절단 단계).
그 후, Pierce 히드록시숙신이미드(hydroxysuccinimide: NHS)-활성화된 아가로스 건조 레진(Thermo Fisher Scientific)을 130 ㎍/㎖의 농도로 카트리지에 바로 가하였다(도 2c 및 도 2d). 실온에서 약 2 시간 동안 약 50 rpm의 튜브 회전기에서 인큐베이션하여, 고갈(depletion)시켰다(도 2e)(고갈 단계).
3. 고체상 추출(SPE) 용출 또는 분획
실시예 1.2에 기재된 바와 같이 준비된 카트리지를 추출 매니폴드(waters)에 두었다. 카트리지의 뚜껑을 열고, 뚜껑에 50 ㎕의 0.2 M EPPS(pH 8)를 가하고 피펫으로 남은 용액을 모은 후 카트리지로 옮겼다. 2초 내지 3초 당 1방울의 유속으로 진공을 유지하였다. 카트리지를 0.5 ㎕의 50 mM EPPS(pH 8.0) 및 0.15 M NaCl로 세척하고, 1 ㎖의 0.1%(v/v) 트리플루오로아세트산(물 중)(Merck)으로 3회 세척하였다. 1.5-㎖의 에펜도르프 튜브 1개에 0.5 ㎖의 50%(v/v) 아세토니트릴 및 0.1%(v/v) 포름산 용액으로 2회 용출하였다. 용출된 용액을 진공 원심분리기로 시료를 건조시켰다(탈염 과정).
선택적 과정으로 MAX 분획을 하는 경우, 실시예 1.2에 기재된 바와 같이 준비된 카트리지를 추출 매니폴드(waters)에 두었다. 카트리지의 뚜껑을 열고, 뚜껑에 50 ㎕의 0.2 M EPPS(pH 8)를 가하고 피펫으로 남은 용액을 모은 후 카트리지로 옮겼다. 2초 내지 3초 당 1방울의 유속으로 진공을 유지하였다. 카트리지를 0.5 ㎕의 50 mM EPPS(pH 8.0) 및 0.15 M NaCl로 세척하고, 물로 1/1000배 희석한 MAX pH 11 완충액 1 ㎖로 3회 세척하였다. 1.5-㎖ 에펜도르프 튜브 각각에 0.5 ㎖의 MAX pH 11 용출 완충액[50%(v/v) 아세토니트릴 중 0.023 M NH4HCO3], MAX pH 8 용출 완충액[50%(v/v) 아세토니트릴 중 0.1 M NH4HCO3], MAX pH 6 용출 완충액[50%(v/v) 아세토니트릴 중 0.1 M NH4HCO3 및 70 mM CH3COOH], 및 MAX pH 4 용출 완충액[50%(v/v) 아세토니트릴 중 0.1 M NH4CH3CO2]으로 순차적으로 분획하였다(분획 1 내지 4). 마지막으로, 1.5-㎖ 에펜도르프 튜브에 0.5 ㎖의 50%(v/v) 아세토니트릴 중 1%(v/v) 트리플루오로아세트산으로 용출하였다(분획 5). 용출된 용액을 진공 원심분리기로 시료를 건조시켰다.
4. 액체 크로마토그래피 - 탠덤 질량 분석
실시예 1.3에 기재된 바와 같이 용출 또는 분획된 펩티드 시료를 10 ㎕의 0.1%(v/v) 포름산 용액에 재현탁하고, 10분 동안 초음파 처리하고, 벤치탑 원심분리기에서 약 30초 동안 원심분리하였다. 2 ㎕의 상층액을 오토샘플러 바이알로 옮겼다.
포름산에 재현탁된 펩티드 시료를 약 10℃로 냉각된 오토샘플러에서 Eksigent nanoLC-ultra 1D plus 시스템 상의 역상 Reprosil-Pur C18-AQ 3 ㎛ 레진 (Dr. Maisch GmbH) 컬럼(20 cm×75 ㎛, 직접 패킹함)으로 300 nL/분의 유속으로 주입하였다. 사용하기 전, 컬럼은 95% 완충액 A(물 중 0.1%(v/v) 포름산) 및 5% 완충액 B(아세토니트릴 중 0.1%(v/v) 포름산)으로 평형화시켰다. 펩티드는 5% 내지 30% 완충액 B로 90분 이상 및 30% 내지 50% 완충액 B로 10 분 이상 선형의 농도구배로 용출한 후, 총 실행시간 120분으로 300 nL/분의 유속으로 유기 세척(organic wash) 및 수성-재평형화하였다. 컬럼 온도는 컬럼 히터(PST Phoenix Engineering)를 사용하여 약 50℃를 유지하였다. HPLC 시스템은 데이터-의존적 획득(data-dependent acquisition: DDA) 모드로 작동된 Q-Exactive 질량 분석기(Thermo Fisher Scientific)에 연결하였다. 서베이 전체-스캔 MS 스펙트럼(400-1500 m/z)을 70,000의 해상도로 수득하였다. 소스 이온화 파라미터는 하기와 같다: 스프레이 전압 2.5 kV; 모세관 온도 275℃; S-렌즈 수준 50.0.
각 전체 MS 스캔에서 10 종까지의 가장 강한(intense) 이온을 분획하고 분석하였다. MS/MS 파라미터는 하기와 간다: 해상도 17,500; 자동 이득 제어 표적(automatic gain control target) 5E4; 분리창 2.0 m/z; 최대 주사 시간 50 ms; 정규화된 충돌 에너지 27; 전하 상태 허용(charge state acceptance) 1-5; 동적 차단 시간(dynamic exclusion duration) 30초; 강도 역치 1.0E4.
5. 데이터베이스 조사
Q-Exactive의 RAW 파일을 픽/피킹(pick picking) 옵션을 갖는 ProteoWizard 소프트웨어 세트의 MSConvert 소프웨어를 이용하여 mzXML 파일로 변환하였다. 모든 스펙트럼은 우선 MS-GF+ (v2016.12.12) 서치 엔진을 이용하여 SwissProt 인간 데이터베이스 (2016. 4 배포)의 펩티드 서열에 매칭하였다. 서치 엔진 세팅은 하기와 같다:
허용가능한(tolerable) 말단의 숫자로 1; MS1 허용(tolerance)의 경우 20 p.p.m; 동위원소 오류 범위(IsotopeErrorRanges)로서 0, 2; 디코이(decoy) 데이터베이스 서치 허용; 가변적인 변형: N-말단의 메티오닌 (+15.9949 Da), 아세틸l (+42.0106 Da) 또는 D3-아세틸 (45.029395 Da) 산화; 고정적인 변형: 시스테인의 카르바미도메틸(carbamidomethyl)(+57.021464 Da) 및 리신의 D3-아세틸; Arg-C 효소.
MS-GF+의 서치 결과는 펩티드 동정을 위한 PSM(peptide spectrum match) 수준 오류 발견 확률(false discovery rate)의 예측을 위해 Percolator v3.1에 전달하였다. 오류 발견 확률은 PSM 수준에서 1%로 설정하였다.
6. N-말단 분석법의 비교
알려진 N-말단 분석법과 iNrich 분석법을 비교하기 위해 Saccharomyces cerevisiae를 배양하고, 배양된 균주를 용해하여 단백질을 수득하였다. 수득된 단백질은 PTAG(phospho tagging), ChaFRADIC(charge-based fractional diagonal chromatograph), COFRADIC(combined fractional diagonal chromatography), HYTANE(hydrophobic tagging-assisted N-termini enrichment), 및 실시예 1.1 내지 6에 기재된 iNrich 분석법을 이용하여 분석하였다.
분석에 소요된 시간 및 분석된 N-말단 부위의 수를 하기 표 1에 나타내었다.
분석법 시작단백질의 양
(㎍)		 질량분석시간
(분 × 분획수)		 질량분석기 N-말단 부위의 수 3반복간 겹치는 부위의 비율
PTAG 100 160 × 6 LTQ-Orbitrap XL 379 N. A.
ChaFRADIC 100 127 × 5 Q-Exactive 496 N. A.
COFRADIC 1000 35 × 120 LTQ-Orbitrap XL 733 N. A.
HYTANE 100 85 × 7 Q-Exactive 879 63%
iNrich 100 120 × 5 Q-Exactive 989 78%
(N. A.: 검출되지 않음)
표 1에 나타난 바와 같이, iNrich 분석법은 100 ㎍의 단백질을 5개의 분획에 대해 질량 분석 시간은 약 120분으로 빠르게 분석하였고, 989개의 N-말단 부위를 식별하여 많은 부위의 N-말단이 확인되었다. 분석에 소요된 총 시간은 9 시간 정도에 불과하였다.
또한, 모든 실험은 단일 SPE 컬럼 용기에서 수행되기 때문에, 진공 매니폴드의 채널 개수만큼 여러 시료를 동시에 처리가능하였다. 따라서, iNrich 분석법은 다중 병렬 시료 처리에 적합한 것을 확인하였다.
iNrich 분석법을 HCT116, T98G, HS683, A172, HCT8 및 HEK293의 세포의 단백질에 대해 3회 반복 실험하여 총 18개의 시료를 분석한 경우, 동일한 세포주에서 유사한 결과를 나타내었다. 따라서, 여러개의 시료를 동시에 처리하더라도 iNrich 분석법의 재현성이 우수함을 확인하였다.

Claims (20)

  1. 단백질 시료를 산 무수물 및 촉매와 인큐베이션하여 단백질의 아미노기를 표지하는 단계로서,
    상기 산 무수물은 아세트산 무수물(acetic anhydride), 말레산 무수물(Maleic anhydride), N-히드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide: NHS)-접합된 화합물, 또는 이들의 조합이고,
    상기 촉매는 피리딘(pyridine)인 것인 단계;
    표지된 단백질에 단백질 절단 효소를 가하여 단백질을 절단하는 단계;
    절단된 폴리펩티드에 N-히드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide: NHS) 기능기를 갖는 고체 지지체를 가하여 유리 아미노기를 갖는 폴리펩티드를 고갈(depletion)시키는 단계; 및
    반응물에 아세토니트릴을 가하여 표지된 폴리펩티드를 용출하는 단계를 포함하는,
    단백질의 N-말단 영역을 수득하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 단백질 시료는 세포 용해물, 세포 배양액, 또는 생물학적 시료로부터 유래된 것인 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 방법은 단백질의 아미노기를 표지하는 단계 전에, 단백질 시료를 단백질 변성제, 이황화물 환원제, 알킬화제, 또는 이들의 조합과 인큐베이션하여 단백질의 시스테인 잔기를 환원 및 알킬화시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 단백질 변성제는 구아니딘(guanidine), 우레아(urea), 포름아미드(formamide), 소듐 살리실레이트(sodium salicylate), 디메틸 술폭시드(dimethyl sulfoxide: DMSO), 및 프로필렌 글리콜(propylene glycol)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  5. 청구항 3에 있어서, 상기 이황화물 환원제는 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(tris(2-carboxyethyl)phosphine: TCEP), 트리스(3-히드록시프로필)포스핀(tris(3-hydroxypropyl)phosphine: THPP), 디티오트레이톨(dithiothreitol: DTT), 2-머캅토에탄올(mercaptoethanol: ME), 및 2-머캅토에틸아민(mercaptoethylamine: MEA)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  6. 청구항 3에 있어서, 상기 알킬화제는 2-클로로아세트아미드(chloroacetamide), 요오드아세트아미드(iodoacetamide), 요오드아세트산(iodoacetic acid), 및 아크릴아미드(acrylamide)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 아세트산 무수물(acetic anhydride)은 듀테로화된(Deuterated) D6-아세트산 무수물인 것인 방법.
  8. 삭제
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 단백질 시료를 산 무수물 및 촉매와 인큐베이션하는 단계는 20℃ 내지 50℃에서 1분 내지 24 시간 동안 수행하는 것인 방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 방법은 단백질을 절단하는 단계 전에 표지된 단백질을 완충액으로 희석하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 단백질 절단 효소는 트립신(trypsin), Lys-C, Lys-N, Arg-C, Asp-N, Glu-C, 키모트립신(Chymotrypsin), 펩신(Pepsin), 프로테나제(Proteinase) K, 써모리신(Thermolysin), 또는 이들의 조합인 것인 방법.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 고체 지지체는 아가로스 비드, 자성 비드, 세파로스 비드, 또는 이들의 조합인 것인 방법.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 방법은 폴리펩티드를 용출하는 단계 전에 반응물에 포름산을 가하여 탈염(desalting)하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  14. 청구항 1에 있어서, 상기 폴리펩티드를 용출하는 단계는 아세토니트릴, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 포름산, 또는 이들의 조합을 가하여 수행하는 것인 방법.
  15. 청구항 1에 있어서, 상기 폴리펩티드를 용출하는 단계는 pH 구배, 염 농도, 또는 이들의 조합에 따라 순차 분획하는 것인 방법.
  16. 청구항 1에 있어서, 용출된 폴리펩티드를 건조하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  17. 청구항 1의 방법에 따라 용출된 폴리펩티드에 대해 액체 크로마토그래피를 수행하는 단계; 및
    액체 크로마토 그래피 분획물을 질량 분석하는 단계를 포함하는,
    단백질에서 N-말단 영역의 아미노산 서열을 분석하는 방법.
  18. 산 무수물 및 촉매를 포함하는 단백질의 아미노기 표지용 조성물로서,
    상기 산 무수물은 아세트산 무수물, 말레산 무수물, N-히드록실 숙신이미드(N-hydroxyl succinimide: NHS)-접합된 화합물, 또는 이들의 조합이고,
    상기 촉매는 피리딘인 것인 조성물;
    단백질 절단 효소;
    NHS 기능기를 갖는 고체 지지체;
    아세토니트릴; 및
    반응 용기를 포함하는,
    단백질의 N-말단 영역을 수득하기 위한 키트.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 키트는 단백질 변성제, 이황화물 환원제, 알킬화제, 또는 이들의 조합을 포함한 단백질의 시스테인 잔기를 환원 및 알킬화용 조성물을 더 포함하는 것인 키트.
  20. 청구항 18에 있어서, 상기 반응 용기는 고체상 추출(solid phase extraction: SPE) 튜브 또는 스테이지 팁(Stage tip)인 것인 키트.
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