JP2021522530A - タンパク質の定性分析 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、タンパク質の特徴づけおよび分析、特に、プロテアーゼを使用して試料タンパク質を酵素切断して複合ペプチドにすることに関する。本発明に係る方法は、使用する試薬に許容される条件下においてタンパク質の同定を効率よく提供する。さらに、本発明はまた、本明細書中において記載される酵素切断に基づく、かつこれを利用する、自動式の方法、デバイス、およびキットをも含む。
質量分析によるタンパク質の特徴づけ、同定、および分析は、タンパク質を酵素切断して複合ペプチドまたはポリペプチドにすることによって実施できる。こうしたポリペプチドは、イオン対クロマトグラフィーによって分離でき、質量分析機器中に移すことができる。コンピュータに基づくソフトウェアの使用により、ポリペプチド断片についての質量情報を使用して元のタンパク質を「再度組み立」て、このタンパク質を同定する。場合によってはタンパク質を直接、質量分析によって分析できるが、多くの場合にはタンパク質が大き過ぎるため、同定するためには、各成分に分解しなければならない。この目的のために、プロテアーゼがよく使用される。プロテアーゼは、タンパク質および(ポリ)ペプチドのペプチド結合を切断することによってタンパク質を分解する酵素である。
本発明の一態様は、試料タンパク質の定性分析をするための方法であって、
a)少なくとも1種の結合したプロテアーゼを含む水膨潤ゲルカラム層を提供する工程と、
b)液体バッファー中の少なくとも1種の試料タンパク質を提供する工程と、
c)工程a)のゲル層と接触させて試料タンパク質を切断してポリペプチドにすることによって、試料タンパク質を消化する工程と、
d)工程c)から得られるポリペプチドを質量分析(MS)に供して、ポリペプチドに関する質量情報を得る工程とを含み、
工程c)は、約37℃未満の温度における往復流を含む、方法である。
a)トリプシン;Glu−C;Lys−N;Lys−C;Asp−N;Arg−C;およびキモトリプシンからなる群より選択される少なくとも1種の結合したプロテアーゼを各々含む複数の水膨潤ゲルカラム層を備えるロボット型液体取扱器を提供する工程と、
b)液体バッファー中の、少なくとも1種の任意に変性させたタンパク質を提供する工程と、
c)タンパク質を工程a)のゲル層と接触させる工程であって、各ゲル層は、溶媒をゲル層と接触した状態で保持して、溶媒が層を通る往復サイクルの間、溶媒が層を通って流れるように構成される、工程と、
d)タンパク質を往復流によって4時間未満で切断してポリペプチドにすることによってタンパク質を消化し、任意に、試料を希釈する工程と、
e)試料にイオン対試薬を添加する工程と、
f)逆相ピペットチップカラムを提供し、任意に、カラムを条件付けする工程と、
g)往復流によってポリペプチドをピペットチップカラムに吸着させ、任意に、カラムから混入物を洗浄する工程と、
h)ポリペプチドを溶出させる工程とを含む、方法である。
よって、本発明は、酵素とタンパク質とを一緒にインキュベートすることなしに、試料タンパク質を迅速かつ低温で酵素消化するための、カラム方法および装置を含む。本発明のひとつの利点は、未消化または一部消化された試料を、水膨潤したビーズ樹脂(水中で膨潤し得るアガロース、セファロース、セルロース、またはデキストラン基材など)を含むゲルカラム層に固定または結合した酵素に、繰り返し接触させることであって、ここで、酵素分子は、ゲルカラム層の全体または実質的に全体にわたって提供されている。試料タンパク質、およびポリペプチドの形態であるその切断産物が、樹脂ビーズ基材中に入ったり出たりする移動は、迅速であり、タンパク質の捕獲は生じない。基材に結合した酵素は、ビーズ表面およびビーズ内側に位置する。以下にさらに詳細に説明されるように、酵素は、トリプシン、キモトリプシン、Glu−C、Lys−N、Lys−C、Asp−N、またはArg−Cであってよい。
タンパク質−プロテアーゼ性能係数=N
として定義され、式中、Nは、定義された条件下において標準タンパク質20μgについて少なくとも50%切断カバー度を達成するために必要な往復サイクルの最小数である。1回の往復流サイクルは、カラム層を通る1回の吸引および放出からなる。試料重量/カラム層体積の比率(μg/μL)は4以上であり、温度は20〜25℃の範囲である。いくつかの実施形態において、タンパク質はBSAであり、プロテアーゼはビーズに結合したトリプシンであり、BSA−トリプシン切断性能係数が決定され得る。いくつかの実施形態において、BSA−トリプシン切断性能係数は、5〜200、10〜100、20〜50、または10〜30である。いくつかの実施形態において、BSA−トリプシン切断性能係数は30である。いくつかの実施形態において、BSA−トリプシン切断性能係数は20である。いくつかの実施形態において、BSA−トリプシン切断性能係数は10である。特定の実施形態において、Nは、40未満、30未満、20未満、10未満、または5未満である。
1.酵素を固相に付着させる
2.工程1の固相酵素をピペットチップまたは往復流カラム中に詰める
3.バッファーまたは液体中にタンパク質が溶解している試料を提供する
4.任意に、タンパク質試料を変性させる
5.タンパク質を固相酵素と共にインキュベートすることなく、往復流を使用して、タンパク質をカラムに繰り返し流す。
7.分析または下流の処理を行なう
本発明の結果および利点
試料と固相酵素樹脂とを共にインキュベートすることなしに、タンパク質のポリペプチドへの十分な消化カバー度が室温で達成される。
カラム背圧は、水膨潤した樹脂の入ったカラム中に変性試薬を導入した場合に、1mL/分において3psi未満である。
酵素活性を増大させるために、カラム層体積を調節してもよい。驚くことに、タンパク質試料の十分な消化カバー度を得るためには、樹脂に結合させて小体積のカラム層中に入れる酵素は非常に少量でよい。ピペットチップカラム層の体積は、100μL未満、90μL未満、80μL未満、70μL未満、60μL未満、50μL未満、40μL未満、30μL未満、20μL未満、15μL未満、10μL未満、5μL未満、4μL未満、3μL未満、2μL未満、1μL未満、0.5μL未満、または0.1μL未満であってよい。
図1は、タンパク質の変性および消化が本発明に従ってピペットチップ往復流カラムの使用によりどのように達成されるかを例証する。より具体的には、図1は、工程1aにおいて、タンパク質試料がどのように提供されるか、工程1bにおいて、変性試薬がどのように任意に添加されるか、および工程1cにおいて、往復流が室温で酵素カラムにどのように適用されて試料をポリペプチド/ペプチドに変換するかを示す。
本出願中において提供されるすべての実施例は、例示目的でのみ提供されるものであり、付属の請求項によって定義される本発明を限定するものとは解釈されない。以下または本出願中の他の箇所において提供されるすべての参考資料は、引用により本明細書に援用して含まれる。
異なる用途を目的とした作業の流れの例。往復流を有するピペットチップカラムを、当該作業の流れの各工程において使用する。実施例中に記載される工程は、自動式であってもよい。
2.診断
3.ペプチドマッピング
4.マーカーを発見するための質量バリアント分析
5.疾患マーカーの発見
実施例1.タンパク質分析−生物製剤特徴づけを目的とした例示的な作業の流れ
1.アフィニティクロマトグラフィーによるタンパク質の精製
2.ゲルろ過によるバッファー交換
3.任意の変性、還元、アルキル化、次いで希釈
4.固相酵素によるプロテアーゼ消化、次いで希釈
5.イオン対逆相による脱塩
6.クロマトグラフィーによる質量分析
タンパク質薬およびタンパク質薬の候補は、化学的に合成されたものではないという点で、従来の小分子薬とは異なる。むしろ、生物製剤とよばれるタンパク質薬は、哺乳類生細胞の細胞機構を使用して合成される組換えタンパク質である。よって、生物製剤の製造における主な課題は、翻訳後修飾、タンパク質分子量、電荷均一性、および他の物理的な特質を維持することである。総合的に、こうした分析測定においては、特に質量分析プロファイリングを目的とする場合に、高性能かつ小体積での処理が必要とされる。ハイスループット用途においては、トリプシン消化という基本工程が、迅速で、頑強で、かつ自己消化のないものでなければならない。
1.His標識組換えタンパク質の試料への添加
2.天然タンパク質の、標識組換えタンパク質での交換
3.アフィニティクロマトグラフィーによるタンパク質の精製
4.ゲルろ過によるバッファー交換
5.任意の変性、還元、アルキル化、次いで希釈
6.固相酵素によるプロテアーゼ消化、次いで希釈
7.イオン対逆相による脱塩
8.クロマトグラフィーによる質量分析
機能細胞のコンテクストにおいて、タンパク質がひとつひとつのタンパク質として作用することは稀である。むしろ、タンパク質は、複数の異なるタンパク質と結合してタンパク質複合体を形成している。こうした複合体は、時に一過性で相互に作用するため、検出が非常に困難であり得る。タンパク質複合体は有効な疾患情報源であり、タンパク質複合体の各成分は疾患マーカーである可能性がある。疾患マーカー(market)発見の分野における最近の進展によって、複合体中における特定タンパク質の比率が疾患と相関していることが強調されている。疾患マーカーの発見における課題は、小体積と自動化と質量分析のための高性能試料調製とを組み合わせて使用して、ハイスループットでタンパク質複合体を精製できる作業の流れであり得る。
1.試料の提供
2.ゲルろ過によるバッファー交換
3.変性、還元、アルキル化
4.バッファーでの希釈
5.固相トリプシン、Glu−C、Lys−N、Lys−C、Asp−N、Arg−C、および/またはキモトリプシン消化酵素によるプロテアーゼ消化
6.希釈
7.イオン対試薬の添加、イオン対逆相による脱塩
8.クロマトグラフィーによる質量分析
薬となり得る標的に対するスクリーニングライブラリを用いて、タンパク質薬候補を発見する。正の相互作用が見つかった場合には、その薬候補の結合効果を最適化する。このプロセスでは、まず、薬候補が結合している標的上の特定ペプチドを同定すること、すなわちエピトープマッピングとよばれるプロセスが必要になる。エピトープマッピングにおける主な課題は、頑強で、再現性があり、かつそれ自体で完結している方法を得ることである。
1.ストレプトアビジンまたは共有結合性の誘導体化のための活性化された樹脂を入れたピペットチップカラムの提供
2.アフィニティカラムの作製
3.試料の提供
4.ゲルろ過によるバッファー交換
5.任意の変性、還元、アルキル化、次いで希釈
6.固相キモトリプシン、Glu−C、Lys−N、Lys−C、Asp−N、Arg−C、キモトリプシンGlu−C、および/またはトリプシンによるプロテアーゼ消化。
8.イオン対逆相による脱塩
9.クロマトグラフィーによる質量分析
最近の研究によって、いくつかのタンパク質のペプチド配列には疾患と相関のある質量バリアントが存在することが示されている。疾患マーカーになり得るので重要であるが、定量するのは非常に難しい。というのは、こうした疾患マーカーは含有量が非常に少ないためである。その解決策は、作業の流れの一部として、質量バリアントを濃縮することであったが、これは、小体積と自動化と質量分析のための高性能試料調製とを組み合わせて使用してハイスループットでバリアントを精製することを含む。
1.疾患細胞株の作製
2.マウスへの接種
3.タンパク質Aまたはタンパク質Gピペットチップカラムを用いる抗体精製
4.膜プレップの破壊
5.ゲルろ過によるバッファー交換
6.任意の変性、還元、アルキル化、次いで希釈
7.固相Glu−C、Lys−N、Lys−C、Asp−N、Arg−C、キモトリプシン、および/またはトリプシンによるプロテアーゼ消化。酵素消化、次いで任意の希釈
8.イオン対逆相による脱塩
9.クロマトグラフィーによる質量分析
がん細胞株モデルは、疾患標的の発見と治療の手がかりの発見とにとって優れた手段である可能性がある。疾患細胞株を作製できれば、これを使用することにより、宿主マウスにおいて免疫応答を誘発できる。マウス由来の抗体は、手がかりとなり得るもののライブラリとしての役割を果たし、また、疾患細胞株の細胞表面タンパク質に対する特異性を与え得る。このようにして、標的の発見と手がかりの発見とを組み合わせることができ、その結果、時間を大幅に短縮できる。
1.BSAの変性
2.トリプシンでのBSA消化によるペプチドの生成
3.イオン対C18逆相を使用するペプチドの脱塩
4.MALDI−TOF分析
ウシ血清アルブミン(BSA)は607残基のタンパク質であり、分子量は69kDaである。凍結乾燥させたタンパク質標準をSigma−Aldrichから購入し(P/N A4612)、PBSバッファーを使用して1mg/mL溶液とする。50μgを6M尿素溶液中で変性させて、室温で1時間インキュベートする。ヨードアセトアミドを最終濃度15mMで添加してBSAをアルキル化し、暗所で15分間インキュベートする。ゲルろ過媒体を詰めたピペットチップカラムを使用して、BSAのバッファー交換を行なう。BSAを深さ2mLのウェルプレートに移し、pH7.5の重炭酸アンモニウムを用いて試料の体積を120μLに調整する。100%アセトニトリル80μLをBSAに添加して、最終的に40%アセトニトリル溶液とする。トリプシン固定ビーズ5μLを詰めた200μLのピペットチップカラムを使用する。室温において、流速250μL/分で20分間、樹脂層を通して試料を往復圧送する。試料をウェル中に吹き出して、ピペットチップカラムを廃棄する。1%TFA水溶液600μLをBSAペプチドに添加して、アセトニトリルを最終濃度10%に希釈する。C18逆相樹脂10μLを詰めた1mLのピペットチップカラムを使用して、ペプチドを脱塩する。250μLの80%アセトニトリルでカラムを湿潤させ、続いて1%TFA水溶液を2回使って条件付けする。ペプチドを載せて、流速250μL/分を用いて4サイクル行なう。1mLの1%TFA中で流速500μL/分にて1サイクル行なって、カラムを洗浄する。30μLの40%TFA中で流速500μL/分にて4サイクル行なって、溶出する。そして、脱塩された試料は、MALDI−TOF分析に供する準備が整い、十分な消化カバー度と、疎水性ペプチドを含むすべてのペプチドが存在していることを示す。
BSA:Sigma−Aldrich(P/N A4612)
実施例6の方法を使用してBSAを調製する。
カラムゲル層体積:5μLトリプシン固定ビーズ
往復サイクル中の媒体の流速:250μL/分
温度:23℃
固定トリプシンの入ったピペットチップカラムに、BSAを適用する。多様な数の往復サイクルを行なった後、実施例6中に記載されるとおりに産物を分析する。BSA−トリプシン切断性能係数を、少なくとも50%の切断を達成するのに必要な最小のサイクル数として決定し、これが20であることが観察される。
Claims (24)
- 試料タンパク質の定性分析をするための方法であって、
a)少なくとも1種の結合したプロテアーゼを含む水膨潤ゲルカラム層を提供する工程と、液体バッファー中の少なくとも1種の試料タンパク質を提供する工程と、
b)前記工程a)のゲル層と接触させて前記試料タンパク質を切断してポリペプチドにすることによって、前記試料タンパク質を消化する工程と、
c)前記工程c)から得られるポリペプチドを質量分析(MS)に供して、前記ポリペプチドに関する質量情報を得る工程とを含み、
前記工程c)は、約37℃未満の温度における往復流を含む、方法。 - 少なくとも前記工程c)において、前記温度は約30℃未満である、請求項1に記載の方法。
- 前記工程c)において、前記試料タンパク質が、前記ゲル層に、往復で少なくとも2回、たとえば4〜6回通される、請求項1または2に記載の方法。
- 前記工程c)の継続時間は約4時間未満である、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも1種の結合したプロテアーゼは、トリプシン;Glu−C;Lys−N;Lys−C;Asp−N;Arg−C;およびキモトリプシンからなる群より選択される、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記工程d)において、同定されるポリペプチドの種類の数は50%より多い、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記工程d)において、前記質量情報が、コンピュータに基づくソフトウェアによって使用されて、前記工程b)の試料タンパク質が何であるかが判断される、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記工程d)において、同定されるポリペプチドの種類の数は50%より多い、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 提供される前記カラムは、約5μL〜約20μLの範囲の層体積を有し、試料タンパク質を上限約150μgまで処理できる、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記工程b)において、前記タンパク質は、室温の変性バッファー中にて提供される、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記工程b)において、変性試薬は、アセトニトリル;尿素、およびグアニジン塩酸塩からなる群より選択される、先行する請求項のいずれか1項に記載の方法。
- タンパク質を切断してポリペプチドにし、ポリペプチド産物を回収するための自動式の方法であって、
a)トリプシン;Glu−C;Lys−N;Lys−C;Asp−N;Arg−C;およびキモトリプシンからなる群より選択される少なくとも1種の結合したプロテアーゼを各々含む複数の水膨潤ゲルカラム層を備えるロボット型液体取扱器を提供する工程と、
b)液体バッファー中の、少なくとも1種の任意に変性させたタンパク質を提供する工程と、
c)前記タンパク質を前記工程a)のゲル層と接触させる工程であって、各ゲル層は、溶媒を前記ゲル層と接触した状態で保持して、前記溶媒が前記層を通る往復サイクルの間、前記溶媒が前記層を通って流れるように構成される、工程と、
d)前記タンパク質を往復流によって4時間未満で切断してポリペプチドにすることによって前記タンパク質を消化し、任意に、前記試料を希釈する工程と、
e)前記試料にイオン対試薬を添加する工程と、
f)逆相ピペットチップカラムを提供し、任意に、前記カラムを条件付けする工程と、
g)往復流によってポリペプチドを前記ピペットチップカラムに吸着させ、任意に、前記カラムから混入物を洗浄する工程と、
h)ポリペプチドを溶出させる工程とを含む、方法。 - 溶出させた前記ポリペプチドが質量分析に供され、ポリペプチドカバー度が50%より大きく、前記タンパク質の定性分析が提供される、請求項12に記載の方法。
- 前記ゲル層の体積は約5μL〜約20μLの範囲であり、試料タンパク質を上限約150μgまで処理できる、請求項12または13に記載の方法。
- 提供される前記ピペットチップカラムは、固相トリプシンを20μL以下含有する、請求項12〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記工程d)において、タンパク質消化は、約30℃未満などの、約37℃未満の温度において行なわれる、請求項12〜14のいずれか1項に記載の方法。
- タンパク質を切断するためのデバイスであって、前記デバイスはゲル層を備えるピペットチップを備え、前記ピペットチップは、試料タンパク質を往復試料流によって切断するように構成され、前記ピペットチップは、BSA−トリプシン切断性能係数が2〜100の範囲である、デバイス。
- BSA−トリプシン切断性能係数が20である、請求項17に記載のデバイス。
- 試料タンパク質分析のための自動式システムの中に配置されている、請求項17または18に記載のデバイス。
- 前記自動式システムは、少なくとも1つの脱塩ピペットチップ脱塩カラムを、少なくとも1つの消化カラムと直列に組み込んでいる、請求項19に記載のデバイス。
- プロテアーゼの入ったピペットチップカラムと、1種以上の変性試薬と、1種以上のバッファーと、試料タンパク質の断片についての質量に基づく分析を行なうための説明とを含む、試料タンパク質の定性分析のためのキット。
- 前記プロテアーゼは、膨潤ゲル層に結合して提供され、トリプシン;Glu−C;Lys−N;Lys−C;Asp−N;Arg−C;およびキモトリプシンからなる群より選択される、請求項21に記載のキット。
- トリプシンの入ったピペットチップと、変性試薬と、逆相脱塩ピペットチップカラムと、イオン対試薬とを含む、請求項21または22に記載のキット。
- 前記説明は、請求項12〜17のいずれか1項に記載の自動式の方法に関する、請求項23に記載のキット。
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