JP2009531679A5 - 複合タンパク質混合物中の被分析タンパク質および／または被分析ペプチドを検出および／または濃縮するための方法 - Google Patents

Description

本発明は、タンパク質および／またはペプチドを含むタンパク質混合物中の種々の被分析タンパク質および／または被分析ペプチドを検出および／または濃縮するための方法に関する。

本発明はさらに、種々の被分析ペプチドの末端に対して特異的な結合分子に関し、タンパク質混合物中の種々の被分析タンパク質および／または被分析ペプチドを検出および／または濃縮するための方法におけるその使用に関する。

ＷＯ２００４／０３１７３０には、試料中の標的タンパク質の量を測定するためのフロースルー法が開示されている。抗体のような特異的結合試薬を使用して、複合タンパク質試料のタンパク質分解による消化物中の特異的モニターペプチドと、モニターペプチドと同じ化学構造を有するが標識されている内部標準ペプチドとを捕捉し、濃縮する。質量分析計内への溶出時に、両方のペプチドが定量される。

これにより、たとえば、最初にＮ末端抗体を、続く第２の濃縮工程ではＣ末端抗体を使用し、ある特定のペプチドを濃縮することが可能となる。

本発明によれば、この目的は、冒頭で記載した方法において、
ａ） 試料混合物を提供する工程、および、該混合物に含有されるタンパク質を必要に応じて規定のペプチドに断片化する工程、
ｂ） 前記種々の被分析タンパク質および／または被分析ペプチドのうち少なくとも１種類のペプチドエピトープに特異的な第１の結合分子を提供する工程であって、このペプチドエピトープに含まれるアミノ酸が５個以下、好ましくは２〜３個である工程、
ｃ） 前記第１の結合分子を前記試料混合物とともにインキュベートする工程、ならびに
ｄ） 前記第１の結合分子に結合した種々の被分析タンパク質および／または被分析ペプチドを検出および／または濃縮する工程、
によって達成される。

本発明は、本発明に従って使用される結合分子が、その認識配列が規定のアミノ酸をただ５つ、好ましくは４つ、３つまたは２つの位置にしか有しないにもかかわらず、これによって多数の被分析タンパク質または被分析ペプチドに、すなわちある程度非選択的に結合し、種々の被分析タンパク質および／または被分析ペプチドが複合試料混合物中にある場合にも、それらの検出および／または濃縮に利用できるという、本発明者らによる驚くべき発見に基づいている。

このような結合分子により、複合タンパク質混合物から、きわめて特殊なタンパク質またはペプチドだけでなく、含むアミノ酸が５個以下であるこのエピトープを有する多数の異なるタンパク質またはペプチドもまた捕捉することが可能となる。ここで、サブプロテオームが濃縮されている。

１種類以上のプロテアーゼおよび／または化学的断片化による消化の結果、工程ａ）で提供するペプチド混合物が得られる。工程ｂ）で結合分子を提供した後、ペプチド混合物を該結合分子とともにインキュベートし、その間に、該結合分子はペプチドの適合するエピトープに結合するため、該結合分子と結合した対応する被分析ペプチドが検出／濃縮される。

これらの方法はすべて、当該技術分野の技術水準において十分に知られており、それぞれ固有の利点を有している。これに関して、検出方法の選択は、特に、どの程度正確に、どの、または何種類のタンパク質もしくは被分析ペプチドを、さらに特徴付け、単離、濃縮または検出するか、ならびに工程ｂ）でどのような形態の結合分子を提供するか（すなわち、たとえば、支持体に結合させているか否か、支持体に結合させている場合は、支持体がどのような型か）に依存する。

本発明の方法によるまた別の一実施形態において、第１の結合分子に結合した被分析タンパク質および／または被分析ペプチドの検出および／または濃縮は、第１の結合分子に結合された被分析タンパク質および／または被分析ペプチドを特異的に認識する第２の結合分子によって行われることが好ましい。

これに関して、工程ｄ）の検出および／または濃縮は、第１および第２の結合分子が、被分析タンパク質および／または被分析ペプチドの異なるエピトープに、たとえば、ＦＲＥＴ、近接ライゲーションアッセイなどの方法によって同時に結合することによって行われることが好ましく、第１および第２の結合分子が、溶液状態で試料とともにインキュベートされることがさらに好ましい。

したがって、冒頭で触れたＷＯ２００４／０３１７３０に記載の方法とは異なり、本発明の概念は、被分析タンパク質または被分析ペプチドに対して同時に結合し、それにより被分析タンパク質／ペプチドの特異的濃縮および／または分析を可能にする、自体は非特異的な２つの結合分子を使用することにある。

本発明の方法の別の実施形態において、検出および／または濃縮のために、第１の結合分子に結合した被分析タンパク質／被分析ペプチドを特異的に認識する第２の結合分子が使用され、該第２の結合分子はペプチドの内部エピトープに特異的であることが好ましい。

Claims (14)

1. タンパク質および／またはペプチドを含む試料混合物中から種々の被分析タンパク質および／または被分析ペプチドを検出および／または濃縮するための方法であって、
   ａ）試料混合物を提供する工程および、該混合物中に含有されるタンパク質を規定のペプチドに断片化する工程、
   ｂ）前記種々の被分析タンパク質および／または被分析ペプチドの少なくとも１種類のペプチドエピトープに特異的な第１の結合分子を提供する工程であって、該ペプチドエピトープに含まれるアミノ酸が５個以下である工程、
   ｃ）前記第１の結合分子を前記試料混合物とともにインキュベートする工程、ならびに
   ｄ）種々の被分析タンパク質および／または被分析ペプチドのペプチドエピトープに特異的であり、前記第１の結合分子に結合された被分析タンパク質および／または被分析ペプチドを特異的に認識する第２の結合分子を使用して、前記第１の結合分子に結合された被分析タンパク質および／または被分析ペプチドを検出および／または濃縮する工程であって、前記ペプチドエピトープに含まれるアミノ酸が５個以下である工程、
   を含む方法。
2. 前記工程ａ）において、変性被分析タンパク質および／または被分析ペプチドを含む試料混合物を提供することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 前記工程ａ）において、前記試料混合物中に存在するタンパク質および／またはペプチドを、少なくとも１種類の特異的プロテアーゼおよび／または化学的断片化によって切断し、規定のペプチドとすることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記工程ｂ）において、前記ペプチドエピトープの１つ以上の位置でアミノ酸群特異的認識を示す第１の結合分子を提供することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
5. 前記工程ｂ）において、前記被分析タンパク質および／または被分析ペプチドの２つの末端ペプチドエピトープの一方に特異的な第１の結合分子を提供し、該末端ペプチドエピトープが、遊離ＮＨ_２基または遊離ＣＯＯＨ基および各場合において５個以下のアミノ酸を含むことを特徴とする、請求項２〜４のいずれかに記載の方法。
6. 前記第１の結合分子が支持体上に固定化されていることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
7. 前記支持体が、マイクロアレイ、アフィニティカラム用支持体材料、クロマトグラフィ材料、マイクロチャネル構造物、キャピラリー表面、センサー表面、高分子多孔質海綿状構造物、ビーズを含む群から選択されることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
8. 前記工程ｄ）における検出および／または濃縮を、ＦＲＥＴ及び近接ライゲーションアッセイからなる群から選ばれる方法による前記被分析タンパク質および／または被分析ペプチドの異なるエピトープに対する２つの異なる結合分子の同時結合によって行うことを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
9. 前記第１および第２の結合分子を溶液状態で試料とともにインキュベートすることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
10. 前記第２の結合分子が、それぞれの他方の末端ペプチドエピトープに特異的であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
11. 前記それぞれの他方の末端ペプチドエピトープが、遊離ＮＨ_２基または遊離ＣＯＯＨ基および各場合において５個以下のアミノ酸を含むことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
12. 前記工程ｂ）において使用される前記第１の結合分子が前記被分析ペプチドの２つの末端ペプチドエピトープの一方に特異的であり、該末端ペプチドエピトープが遊離ＮＨ_２基または遊離ＣＯＯＨ基および３〜５個のアミノ酸を含むこと、ならびに前記第２の結合分子が前記被分析ペプチドの他方の末端ペプチドエピトープに特異的であり、該他方の末端ペプチドエピトープが遊離ＮＨ_２基または遊離ＣＯＯＨ基および３〜５個のアミノ酸を含むことを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
13. 抗体、抗体断片、アプタマー、組換え結合分子が第１および／または第２の結合分子として使用されることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
14. 前記ペプチドエピトープに含まれるアミノ酸が２又は３個であることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。