CN108088727B - 一种离体体液中蛋白质的预处理方法 - Google Patents

一种离体体液中蛋白质的预处理方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种离体体液中蛋白质的预处理方法，通过一定比例的高分子聚合物溶液在低温条件下从离体体液(血液和尿液等)中提取出蛋白质，加入一定浓度的表面活性剂和蛋白质还原剂在高温条件下使蛋白质快速变性，加入可与蛋白质巯基快速反应的固相烷基化试剂，该试剂可选择性与蛋白质上的巯基反应，离心后，反复清洗固相颗粒表面去除其它干扰小分子(如糖、盐、表面活性剂、脂类等)，获得高纯度的蛋白质，最后加入蛋白酶将体液蛋白质酶解成肽段后，离心后获得的产物可直接采用液相色谱‑质谱系统进行分析。与传统的体液蛋白质预处理方法相比，该方法具有操作简单、重复性好、预处理通量高等优点。

Description

一种离体体液中蛋白质的预处理方法
技术领域
本发明涉及一种外体泌蛋白质快速预处理方法，是一种集体液分离，蛋白质提取，纯化及酶解的方法。
背景技术
体液通常携带和传递着重要的信号分子。例如，研究显示，尿液中的蛋白质主要来源于肾小球、肾小管、前列腺以及膀胱细胞，因此，对体液中超低含量的蛋白质进行高效提取，并对其蛋白质组进行分析可以直接反映人体组织、器官的生理和病理状态。现有的体液蛋白质处理方法通常需要繁琐的操作，多步的样品转移，不仅费时费力，而且损失严重，难以实现低丰度蛋白质的高效处理。这些问题严重影响了体液蛋白质组分析的准确度、灵敏度和通量。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种集体液蛋白质提取，纯化及酶解的方法，整个过程可在同一个离心管中完成，避免了样品在处理过程中转移造成的丢失和污染。该方法可以直接处理细胞培养液和体液中的体液蛋白质，不需要复杂和繁琐的操作，同时整个处理过程保持高度的连续性和高通量性。
为了实现该目的，本发明的技术方案是：
1、加入高分子聚合物溶液在低温条件下提取体液中的蛋白质，其中高分子聚合物为聚合度500-10000的聚乙二醇、聚醚酰亚胺和聚乙烯醇中的一种或两种以上，高分子聚合物溶液的质量浓度为1％-50％；高分子聚合物溶液与离体血液和/或尿液的体积比1：1-10；分离温度范围为-20-10℃；
2、加入表面活性剂溶液和蛋白质还原剂在高温条件下使体液蛋白质变性；其中表面活性剂的种类可为阴离子表面活性剂(具体为十二烷基醇聚氧乙烯醚硫酸钠,十二烷基苯磺酸,十二烷基硫酸钠,脂肪醇羟乙基磺酸钠,十二烷基硫酸铵中的一种或两种以上)、阳离子表面活性剂(具体为十八烷基三甲基氯化铵,十六烷基三甲基氯化铵,二硬脂基羟乙基甲基硫酸甲脂铵中的一种或两种以上)、两性离子表面活性剂(具体为十二烷基甜菜碱,椰油基咪唑啉脂肪醇,聚氧乙烯醚,磺基琥珀酸二钠盐中的一种或两种以上)和非离子表面活性剂(具体为椰油脂肪酸二乙醇酰胺,壬基酚聚氧乙烯醚羟基合成醇,聚氧乙烯醚,C12-14烷基糖苷中的一种或两种以上)中的一种或两种以上，浓度为4％-10％(质量g体积ml比)；表面活性剂溶液与步骤1)获得溶液的体积比1：1-10；蛋白质还原剂为二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦中一种或两种，还原剂终浓度为10mM-100mM；蛋白质提取温度范围为80-95℃，蛋白质还原剂为二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦中一种或两种，还原剂终浓度为10mM-100mM；蛋白质提取温度范围为80-95℃；
3、加入可与蛋白质巯基快速反应的固相烷基化试剂使体液蛋白质得到分离，获得体液蛋白质，其中固相烷基化试剂为表面共价键合碘乙酸-N-琥珀酰胺酯的聚合物微球或表面共价键合碘乙酸-N-琥珀酰胺酯硅球，蛋白质与固相烷基化试剂的质量比为1/1-1/5；聚合物微球基质材料为聚丙烯酸酯,聚苯乙烯中的一种或两种以上；
4、加入蛋白酶，并与固载体液蛋白质的微球在一定温度下孵育，采用的蛋白质酶可为胰蛋白酶、赖氨酸蛋白酶和蛋白酶V8中的一种或两种或三种；体液蛋白质与酶加入质量比为1/1-1/5，酶解温度为25-37℃，酶解时间为0.5-4小时；
5、得到的酶解产物直接进行液相色谱-质谱分析；
6、所发展的体液蛋白质快速预处理方法用于临床诊断、蛋白质质组学研究和肿瘤标志物筛选中的外体泌蛋白质快速预处理方法
本发明具有如下优点：
1、采用高分子聚合物在低温下提取体液蛋白质，提高了中低丰度体液蛋白质的提取效率；
2、采用固相烷基化试剂共价结合体液蛋白，简化了体液蛋白质纯化的步骤，提高体液蛋白质的回收率和预处理通量；
3、蛋白质酶解产物可直接进行液相色谱-质谱分析，为实现高通量的临床体液蛋白质组分析提供技术支撑。
附图说明
图1、体液蛋白质样品预处理示意图。
图2、尿液蛋白质样品预处理的色谱-质谱分析图。
图3、血液蛋白质样品预处理的色谱-质谱分析图。
具体实施方式
实施例1
体液蛋白质预处理方法示意图如图1所示，在5mL人尿液中加入10％的聚乙二醇溶液,在0℃下静置1小时，16000rpm离心30min获得尿液中的体液，加入4％阴离子表面活性剂SDS和50mM三(2-羧乙基)膦95℃水浴锅反应30min,加入表面共价键合碘乙酸-N-琥珀酰胺酯的硅球振荡反应1.5小时，离心弃上清，分别加入50％甲醇和50mM碳酸氢铵溶液清洗硅球表面，最后加入胰蛋白酶37℃孵育30min，离心取上清后，进行液相色谱-质谱分析，分析结果如图2所示。
实施例2
在1mL人尿液中加入10％的聚乙二醇和20％聚醚酰亚胺混合溶液,在4℃下静置0.5小时，16000rpm离心30min获得尿液中的体液，加入4％阳离子表面活性剂CTAB和50mM三(2-羧乙基)膦95℃水浴锅反应30min,加入表面共价键合碘乙酸-N-琥珀酰胺酯的聚合物微球振荡反应1.5小时，离心弃上清，分别加入50％甲醇和50mM碳酸氢铵溶液清洗硅球表面，最后加入胰蛋白酶和赖氨酸蛋白酶37℃孵育1min，离心取上清后，进行液相色谱-质谱分析，分析结果如图3所示。
实施例3
在1mL人血液中加入50％的聚乙二醇和20％聚醚酰亚胺混合溶液,在-20℃下静置0.5小时，16000rpm离心30min获得尿液中的体液，加入10％非离子表面活性剂脂肪醇聚氧乙烯醚和100mM三(2-羧乙基)膦95℃水浴锅反应30min,加入表面共价键合碘乙酸-N-琥珀酰胺酯的聚合物微球振荡反应1.5小时，离心弃上清，分别加入50％甲醇和50mM碳酸氢铵溶液清洗硅球表面，最后加入胰蛋白酶和赖氨酸蛋白酶37℃孵育1min，离心取上清后，进行液相色谱-质谱分析，获得较好分析结果。
实施例4
在50mL人尿液中加入50％的聚乙二醇和20％聚醚酰亚胺混合溶液,在0℃下静置0.5小时，16000rpm离心30min获得尿液中的体液，加入10％非离子表面活性剂脂肪醇聚氧乙烯醚和100mM三(2-羧乙基)膦95℃水浴锅反应30min,加入表面共价键合碘乙酸-N-琥珀酰胺酯的聚合物微球振荡反应1.5小时，离心弃上清，分别加入50％甲醇和50mM碳酸氢铵溶液清洗硅球表面，最后加入胰蛋白酶和赖氨酸蛋白酶37℃孵育1min，离心取上清后，进行液相色谱-质谱分析，获得较好分析结果。
实施例5
在50mL尿液中加入10％的聚乙二醇和10％聚乙烯醇和20％聚醚酰亚胺混合溶液,在-5℃下静置1小时，16000rpm离心30min获得体液，加入10％SDS和50mM二硫苏糖醇80℃水浴锅反应30min,加入表面共价键合碘乙酸-N-琥珀酰胺酯的硅球振荡反应1.5小时，离心弃上清，分别加入50％甲醇和0.1％甲酸清洗硅球表面，最后加入蛋白酶V8 37℃孵育30min，离心取上清后，进行液相色谱-质谱分析，获得了较好分析结果。

Claims (6)

1.一种离体体液中蛋白质的预处理方法，其特征在于：
1）在离体血液和/或尿液中加入高分子聚合物溶液在-20-10℃下提取体液蛋白质；
2）加入表面活性剂和蛋白质还原剂在80-95℃下使蛋白质快速变性；
3）再加入可与蛋白质巯基反应的固相烷基化试剂使体液蛋白质得到分离，获得体液蛋白质，最后加入蛋白酶将体液蛋白质酶解成肽段；
所述固相烷基化试剂为表面共价键合碘乙酸-N-琥珀酰胺酯的聚合物微球或表面共价键合碘乙酸-N-琥珀酰胺酯硅球。
2.按照权利要求1所述的预处理方法，其特征在于：加入高分子聚合物溶液在低温条件下提取体液中的蛋白质，其中高分子聚合物为聚合度500-10000的聚乙二醇、聚醚酰亚胺和聚乙烯醇中的一种或两种以上，高分子聚合物溶液的质量浓度为1%-50%；高分子聚合物溶液与离体血液和/或尿液的体积比1：1-10。
3.按照权利要求1所述的预处理方法，其特征在于：加入表面活性剂溶液和蛋白质还原剂在80-95℃下使体液蛋白质变性；其中表面活性剂的种类为阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性离子表面活性剂和非离子表面活性剂中的一种或两种以上，浓度为4%-10%，浓度单位为g/mL；表面活性剂溶液与步骤1）获得溶液的体积比1：1-10；蛋白质还原剂为二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦中一种或两种，还原剂终浓度为10 mM-100 mM; 步骤3）中的蛋白质提取温度范围为80-95℃。
4.按照权利要求3所述的预处理方法，其特征在于：加入表面活性剂溶液和蛋白质还原剂在80-95℃下使体液蛋白质变性；其中表面活性剂为十二烷基醇聚氧乙烯醚硫酸钠, 十二烷基苯磺酸, 十二烷基硫酸钠, 脂肪醇羟乙基磺酸钠, 十二烷基硫酸铵中的一种或两种以上；或者为十八烷基三甲基氯化铵,十六烷基三甲基氯化铵,二硬脂基羟乙基甲基硫酸甲脂铵中的一种或两种以上；或者为十二烷基甜菜碱,椰油基咪唑啉脂肪醇,聚氧乙烯醚,磺基琥珀酸二钠盐中的一种或两种以上；或者为椰油脂肪酸二乙醇酰胺, 壬基酚聚氧乙烯醚羟基合成醇,聚氧乙烯醚, C12-14烷基糖苷中的一种或两种以上。
5.按照权利要求1所述的预处理方法，其特征在于：加入可与蛋白质巯基快速反应的固相烷基化试剂使体液蛋白质得到分离，获得体液蛋白质，其中固相烷基化试剂为表面共价键合碘乙酸-N-琥珀酰胺酯的聚合物微球或表面共价键合碘乙酸-N-琥珀酰胺酯硅球，蛋白质与固相烷基化试剂的质量比为1/1-1/5；聚合物微球基质材料为聚丙烯酸酯, 聚苯乙烯中的一种或两种以上。
6.按照权利要求1所述的预处理方法，其特征在于：所采用的蛋白质酶可为胰蛋白酶、赖氨酸蛋白酶和蛋白酶V8中的一种或两种或三种；体液蛋白质与酶加入质量比为1/1-1/5，酶解温度为25-37℃，酶解时间为0.5-4小时。
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