PT107379A

PT107379A - Extração líquido-líquido magnética para a purificação e separação de substâncias

Info

Publication number: PT107379A
Application number: PT107379A
Authority: PT
Inventors: Ana Cecília Afonso Roque; Vijaykumar L Dhadge; Maria Raquel Aires-Barros; Ana Azevedo
Original assignee: Faculdade De Ciências E Tecnologia Da Universidade Nova De Lisboa; Inst Superior Técnico
Priority date: 2013-12-23
Filing date: 2013-12-23
Publication date: 2015-10-13
Also published as: WO2015099550A1

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO DESCREVE UM MÉTODO PARA A PURIFICAÇÃO E SEPARAÇÃO DE SUBSTÂNCIAS, TAIS COMO BIOMOLÉCULAS. O PROCESSO COMPREENDE OS PASSOS DE MISTURAR OS MATERIAIS SUPERPARAMAGNÉTICAS FUNCIONALIZADOS (1) COM OS DOIS COMPONENTES DO SISTEMA DE DUAS FASES AQUOSAS (3) E (5) E COM A MISTURA COMPLEXA EM BRUTO (2) CONTENDO A SUBSTÂNCIA ALVO (6), SENDO A MISTURA DA AMOSTRA A PURIFICAR PRODUZIDA POR FERMENTAÇÃO OU POR CULTURA DE CÉLULAS, OU QUIMICAMENTE SINTETIZADA OU EXTRAIDA DE FONTES NATURAIS.

Description

DESCRIÇÃO " Extração liquido-liquido magnética para a purificação e separação de substâncias"

Campo da Invenção A presente invenção descreve um método para o isolamento e purificação de substâncias , como por exemplo biomoléculas de uma mistura em bruto contendo impurezas de diferentes tipos, incluindo proteínas, ácidos nucleicos, moléculas orgânicas pequenas, vírus, células e fragmentos celulares. 0 processo compreende os passos de misturar os materiais superparamagnéticas funcionalizados com o sistema de duas fases aquosas seleccionado, juntamente com a mistura em bruto produzida por fermentação ou por cultura de células, ou por síntese química ou extraída de fontes naturais.

Antecedentes da Invenção 0 desafio promissor de encontrar novas drogas baseadas em tecnologias biológicas, para o tratamento de várias doenças, tais como cancro e doenças auto-imunes tem sido na maior parte das vezes baseada na utilização de anticorpos monoclonais [1, 2], embora outros produtos derivados do bioprocessamento (por exemplo, produtos para terapia génica, células e células estaminais, etc.), bem como drogas químicas também têm contribuído para este efeito. Os métodos tradicionais de purificação utilizados nas indústrias (bio) farmacêutica, (bio) química, alimentar e ambiental são muito caros e complexos para se atingir uma escala de produção suficientemente elevada e fazer face à necessidade crescente de quantidades de produto [2] . As tecnologias disponíveis baseadas em cromatografia para extração e purificação de materiais biológicos e químicos em escala industrial encontram-se perto de atingir a sua capacidade máxima [3] . 0 processo de separação e purificação geralmente compreende quatro fases, a saber, a recuperação, isolamento, purificação e polimento. Com a recuperação, isolamento e polimento representando apenas 20% dos custos totais, as principais limitações do processo encontram-se nos passos de purificação selectivos, actualmente dominados por processos cromatográficos, os quais são responsáveis por mais de70% dos custos a jusante, principalmente devido aos custos dos meios e dos tempos de cada ciclo que são relativamente longos. Além disso, com o aumento a montante da concentração de produto, as técnicas cromatográficas atingiram os seus limites em termos físicos e económicos. Assim, novos métodos não-cromatográficos fáceis de escalar e de custo reduzido para a separação e purificação de materiais biológicos e químicos têm recebido cada vez mais atenção das comunidades académicas e industriais [4]. Entre estes, a extração líquido-líquido, incluindo os sistemas de duas fases aquosas (ATPS) e a separação magnética representam alternativas interessantes aos métodos cromatográficos e que valem a pena explorar. Os ATPS formam-se quando duas soluções de polímeros incompatíveis, ou um polímero e um sal, são misturados acima de determinadas concentrações [5] . A partição de substâncias entre as duas fases aquosas é influenciada por fenómenos complexos que envolvem forças de van der Waals [6], ligações de hidrogénio, interações eletrostáticas, interações hidrofóbicas e efeitos estéricos [7]. Ainda assim, os ATPS representam uma alternativa promissora para a purificação de materiais biológicos e químicos tendo sido já realizados ensaios em ambientes industriais [11]. No entanto, o tempo necessário para a separação de fases e deposição é elevado, a selectividade do processo é baixa e várias operações unitárias podem ser necessárias para se obterem purezas elevadas. Por outro lado, a reciclagem de polímeros e soluções utilizadas em ATPS é complexa, mas necessária, devido aos altos custos envolvidos. Partículas magnéticas (PMs) modificadas com ligandos tipicamente utilizados em cromatografia líquida (por exemplo, permuta iónica ou de afinidade) são adsorventes altamente seletivos para capturar moléculas e materiais biológicos e químicos [8]. Além disso, a natureza magnética das partículas permite a sua manipulação selectiva e separação na presença de outras partículas sólidas em suspensão com aplicações promissoras na integração do processo. A separação magnética foi testada em pequena escala para a captação de imunoglobulina G (IgG) a partir de sobrenadantes de cultura de células, e os rendimentos e purezas obtidos foram muito semelhantes aos geralmente obtidos por técnicas cromatográficas [14]. Além disso, o potencial desta técnica para a recuperação do produto in situ foi também recentemente explorado [26]. 0 custo elevado das partículas magnéticas disponíveis no mercado são os principais desafios na implementação desta tecnologia [10] . No entanto, quer os ATPS quer a separação magnética são tecnologias alternativas à cromatografia, visando a obtenção de rendimentos elevados e integração de processos, e pretendendo evitar as limitações associadas com a maioria dos suportes cromatográficos, tais como, o custo elevado, capacidade limitada e limitações difusionais. A possibilidade de combinar partículas magnéticas com ATPS foi anteriormente abordada. O artigo publicado em [11, 12] apresentou uma técnica de separação de fase acelerada pela utilização de partículas magnéticas não-funcionalizadas. Partículas, como tal, não ligam à sua superfície quaisquer solutos ou materiais. Numa publicação posterior [13] os autores utilizaram partículas magnéticas funcionalizadas com um anticorpo (uma opção extremamente dispendiosa) para melhorar a partição no ATPS, mas foi obtido um grau de pureza muito baixo (49%) partindo de amostras em bruto, e usando solução 3,5 M de tiocianato de potássio como eluente, o que representa condições extremas. Os autores não puderam utilizar um pH baixo para a eluição da proteína, devido à dissolução de partículas. Além disso, neste trabalho foi necessário uma quantidade elevada de partículas para atingir um nível muito baixo de purificação (40 mg de partículas para 8 g do sistema de duas fases aquosas; proporção de 5), com a limitação de particionar as partículas magnéticas para a fase superior, após uma hora de agitação necessária para misturar todos os componentes. Além disso, a quantidade de sal necessária também era elevada. Mais tarde, outro trabalho [14] descreveu a invenção em que foi adicionado um agente tensioactivo ao ATPS juntamente com as partículas magnéticas, o que torna o processo mais complexo e caro, bem como mais dificil na remoção do tensioactivo do produto final, limitando a pureza final do produto [15].

Sumário da Invenção

Um método para a purificação e separação de substâncias, que compreende os passos de: a) preparação de um sistema de duas fases aquosas; b) a adição dos materiais superparamagnéticos, juntamente com a mistura em bruto; c) separação de fases e remoção das partículas por forças magnéticas; d) lavagem e isolamento da substância alvo dos materiais superparamagnéticos. A mistura em bruto consiste em, por exemplo, i) uma cultura de células obtida por fermentação ou cultura de células, ii) homogenato celular / lisado, iii) um extracto de um produto natural; iv) os produtos de uma síntese química; e que é adicionado ao sistema de duas fases, sob agitação constante, juntamente com materiais superparamagnéticos. 0 sistema de duas fases aquosa é composto por misturas de, mas não limitados a, polímeros, sais, açúcares, aminoácidos, tensioactivos.

As substâncias em que o método se aplica incluem, mas não estão limitados a, antibióticos, vitaminas, péptidos, polipéptidos, proteínas, anticorpos, hormonas, ácidos nucleicos, ácidos nucleicos derivados, organelos, vírus, partículas semelhantes a vírus, vesículas ou células.

Neste método, a recuperação da substância alvo é realizada por meios químicos ou físicos, tais como, mas não se limitando a uma solução aquosa contendo compostos tampão como Tris-HCl e glicina-NaOH, ou a acção de temperatura ou pressão. A referida lavagem na etapa d) pode ser realizada utilizando, por exemplo, tampão de ligação antes da eluição. A concentração de solução de lavagem e solução de eluição está entre 10 mM a 200 mM e 0,2 M para 2 M, respectivaxnente, e o pH da solução de lavagem e a solução de eluição entre 2 e 12.

Adicionalmente, o método pode compreender um passo de recuperação dos materiais superparamagnéticos da mistura através do uso de uma força magnética em que iman permanente ou electroiman é usado no processo de separação, seguido por lavagem, até à remoção dos materiais não ligados, e a eluição, em que a solução de lavagem é uma solução aquosa.

Além disso, o método da presente invenção satisfaz os requisitos rigorosos e exigentes para a produção industrial em larga escala de anticorpos monoclonais terapêuticos.

Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção baseia-se na integração do ATPS com a separação magnética. A invenção consiste no uso do sistema de duas fases aquosas formado por polietileno-glicol (PEG) e Dextrano, juntamente com a adição de partículas superparamagnéticas funcionalizados com ligandos exibindo afinidade e selectividade relativamente a moléculas de anticorpo, tal como o ácido borónico (APBA) ou (2- (3- aminofenol) -6- (4-amino-l-naftol) -4-cloro-s-triazina (ligando 22/8). A invenção refere-se a um método para o isolamento de anticorpos a partir de uma mistura em bruto, compreendendo os passos de (a) mistura do anticorpo com uma solução de duas fases aquosas de PEG e Dextrano; (b) adição de materiais superparamagnéticos funcionalizados ao sistema; (c) a remoção de materiais superparamagnéticos do sistema duas fases aquosas;(d) separação e eluição de anticorpos das partículas superparamagnéticas. De acordo com a presente invenção, as concentrações adequadas de PEG e Dextrano, assim como de qualquer outro aditivo como o sal, têm um papel determinante na partição do anticorpo e na obtenção de processos eficientes e com rendimentos e purezas elevadas. Além disso, é para ser entendido que a mesma eficiência do processo pode ser alcançada utilizando alternativas ao PEG ou Dextrano utilizando materiais superparamagnéticos funcionalizados e não está limitados limitada à descrita na presente invenção. A presente tecnologia pode ser aplicada a qualquer situação em que a partição de um soluto entre duas fases liquidas imisciveis ocorre. Isso envolve o campo da extração e purificação, detecção, diagnóstico, terapêutica e estudos de partição, entre outros. Esta tecnologia pode ser aplicada nas indústrias, química, bioquímica, biotecnologia, farmacêutica, biofarmacêutica, ambiental, alimentar, têxtil, mineração, indústrias de segurança ou em qualquer outra aplicação em que a partição de solutos entre duas fases líquidas imisciveis ocorre e pode ser útil para esse fim.

Breve descrição das figuras

Para uma compreensão mais fácil desta invenção anexam-se as seguintes figuras, que representam formas preferenciais de como implementar o procedimento que, no entanto, não têm a intenção de limitar o âmbito da presente invenção. FIG.l. Esquema do método, em que: 1- Materiais superparamagnéticos 2- Mistura bruta 3- Fase inferior 4- íman 5- Fase Superior 6- Biomolécula

Partição do IgG humano puro em sistemas híbridos PEG/ Dextrano com a adição de Partículas magnéticas - (A) GA-PM, (B) GA-APBA-PM para concentrações cresentes de sal. FIG.2. Partição de IgG humana pura em sistemas híbridos de PEG/dextrano com a adição de partículas magnéticas revestidas com goma-arábica e contendo o ligando ácido borónico, para concentrações crescentes de sal , em que: 1- IgG na fase superior 2- IgG ligada 3- IgG na fase inferior FIG.3. Extração de IgG pura em sistemas de PEG / dextrano, para concentrações crescentes de sal, para PMs revestidas por EPS-22/8, em que: 1- IgG na fase superior 2- IgG ligada 3- IgG na fase inferior

Exemplo 1: A sistemas de duas fases aquosas (ATPS), compostos por polietileno-glicol (PEG) e dextrano foram adicionadas várias partículas superparamagnéticas modificadas à superfície, e para diferentes concentrações de sal. A partição de IgG humana pura (hlgG) nas fases superior e inferior, bem como a quantidade adsorvida na superfície de MPs foi investigada, indicando que para partículas magnéticas revestidas com dextrano e goma arábica a quantidade de interações não específicas é menor. Foi observado que a capacidade de ligação de partículas revestidas com goma arábica e modificadas com ácido aminofenil borónico (GA-APBA-MP) em combinação com o ATPS, conduziu a resultados excelentes, obtendo-se rendimentos elevados (92%) e purezas (98%) para a recuperação do anticorpo a partir de sobrenadantes de cultura de células. A presença de partículas magnéticas em ATPS permitiu acelerar a separação de fases (de 40 para 25 min) , uma diminuição do consumo de partículas magnéticas (metade da quantidade necessária para separação magnética) e aumentar o rendimento e pureza do anticorpo monoclonal a partir de sobrenadantes de cultura de células, quando comparado com processos envolvendo só ATPS ou separação magnética.

Materiais superparamagnéticos

As partículas de óxido de ferro foram preparadas como descrito em [16]. As partículas foram, revestidas com duas camadas de sílica (uma camada fina de Si02 e TEOS por um processo sol-gel) para conferir resistência ao pH. As partículas foram então revestidas com vários polímeros incluindo goma Arábica (GA), activada com GLY;0 para introdução de grupos epóxido reactivos, para a reacção com APBA obtendo-se partículas de GA-APBA-PM.

Estudos Extração magnéticos

Os estudos de purificação de anticorpos foram efectuados por partição de IgG humana pura em sistemas híbridos PEG/dextrano com a adição de GA-PM e GA-APBA-PM para concentrações crescentes de sal (Figura 2) . Os ATPSs foram preparados através da pesagem das correspondentes soluções iniciais de polímeros de PEG e dextrano, juntamente com o sal, de forma a atingir a composição final desejada de cada sistema. Os estudos de extração com hlgG puro foram efetuados por adição de 1 ml de 1 g/L hlgG de solução inicial dissolvida em tampão fostato. Em estudos de extracção de hlgG de culturas de células animais (1,16 g/L hlgG), a quantidade de sobrenadante adicionado variou de 1 a 1,5 ml. Todos os sistemas foram preparados em tubos de ensaio graduados de 15 ml para um peso final total de 5 g por adição de água desionizada, PEG de peso molecular 3350 Da de uma solução inicial de 40% (final de 5% p/p), dextrano 500.000 Da de uma solução inicial de 20% (final de 8% p/p), partículas magnéticas a uma concentração final de 0,02% (p/p) e NaCl numa gama de concentrações de 100-500 mM. Os estudos de extração de hlgG foram efetuados misturando cuidadosamente os componentes de cada sistema num agitador de vórtice durante 15 minutos, seguido pela separação de fases à temperatura ambiente. Após a separação de fases, os tubos de ensaio foram mantidos num separador magnético e foram recolhidas as amostras de cada uma das fases, juntamente com partículas superparamagnéticas. As partículas foram lavadas cinco vezes, a primeira vez com água desionizada e em seguida, quatro lavagens consecutivas com tampão HEPES 20 mM a pH 8.5 (5 fracções de eluição cada uma com um volume de 0,5 ml). A eluição de hlgG adsorvido foi iniciada usando 1,5M de tampão Tris-HCl a pH 8.5 (5 fracções de eluição cada uma com 0,5 ml). A proteína total foi quantificada utilizando o método de Bradford. A quantidade de hlgG em ambas as fases superior e inferior e adsorvida às partículas magnéticas foi quantificada por HPLC numa coluna de afinidade de proteína A. A pureza das fases superior e inferior foi avaliada por SDS-PAGE. Os respectivos géis foram preparados de acordo com um protocolo padronizado [16].

Purificação do anticorpo a partir de uma mistura em bruto de células animais

Foi avaliada a partição de um anticorpo monocolonal, contra a interleucina-8, e das impurezas proteicas a partir de um sobrenadante de células animais, usando ATPS de PEG / dextrano adicionando-se AG-PM-APBA. A quantidade de anticorpo presente nas fases superior e inferior não foi significativa. Os coeficientes de partição do hlgG em ATPS variaram entre 0,18-0,55 com a concentração de NaCl (0-500 mM) . A percentagem de IgG humana eluída de GA-APBA-PM foi testada para diferentes tampões e condições de pH, e os melhores valores foram obtidos com 1,5 M Tris-HCl e pH 8.5. verificando-se mais do que 90% do anticorpo monoclonal ligado às partículas. A pureza de ambas as fases superior e inferior, bem como os sobrenadantes resultantes da eluição das partículas superparamagnéticas foram analisadas por SDS-PAGE, revelando a pureza elevada do anticorpo eluído das partículas, e a presença de contaminantes nas fases superior e inferior. A partir dos resultados de HPLC, foi possível concluir que cerca de 92% de hlgG total ligada é eluída do suporte com um grau de pureza superior a 98%., para uma concentração de sal de 200 mM. As partículas foram reutilizadas várias vezes, verificando-se uma manutenção da sua eficiência foi mantida.

Exemplo 2: A capacidade das PMs revestidas com EPS (exopolisacáridos) formarem ligações covalentes com ligandos de afinidade sintéticos torna estas partículas particularmente interessantes para serem utilizadas na recuperação de anticorpos. Partículas magnéticas revestidas com EPS poderão também ser utilizadas na purificação de anticorpos humanos, através da utilização de um processo integrado combinando a separação magnética com extração com sistemas de extração em duas fases aquosas. A utilização de ATPS com 8% PEG e 5% dextrano juntamente com partículas magnéticas revestidas com EPS-22/8 permitiu obter rendimentos elevados. Os suportes magnéticos podem ser utilizados eficazmente por cinco vezes com redução parcial da capacidade de ligação. Com vários passos de extração, 92% da IgG ficou adsorvida às partículas magnéticas e obteve-se uma pureza final de 98,5%.

Materiais superparamagnétícos funcionalizados com o ligando 22/8

As partículas magnéticas de óxido de ferro foram revestidas com duas camadas de sílica seguida de EPS. As partículas foram aminadas e depois procedeu-se à síntese in situ do ligando 22/8, usando o protocolo descrito em [17].

Estudos de Extração Magnética 0 sistema de extracção de duas fases aquosas de 8% (p/p) PEG (3350) e 5% (p / p) Dextrano (500.000) foi utilizado para investigar o desempenho de partículas magnéticas revestidas por biopolímeros.

Para a preparação de APTS (5 g), PEG-3350 e Dextrano-500000 foram pesados num tubo de vidro graduado de 15 ml. As partículas superparamagnéticas foram adicionadas a cada sistema, a uma concentração final de 0,02% (p/p). Para os estudos de extração de hlgG pura, foi adicionado 1 mL de uma solução inicial de hlgG 1 g/L , enquanto que em estudos de extração de mAbs sobrenadante, a quantidade de sobrenadante variou entre 1 a 1,5 ml de um meio de cultura celular contendo hlgG a 1,35 g/L. . Para todos os sistemas variou-se a concentração de sais entre 100 e 500 mM. 0 peso final de 5 g foi obtido através da adição de água desionizada. Todos os componentes foram em seguida, cuidadosamente misturados num agitador de vórtice, para posterior separação de fases que ocorreu à temperatura ambiente, durante 2 a 4 horas. Após separação das fases, os tubos de ensaio foram colocados num separador magnético para a recuperação das partículas superparamagnéticas. As duas fases foram cuidadosamente removidas e foram recolhidas amostras de cada uma das fases para análises posteriores. As partículas magnéticas foram posteriormente lavadas com água desionizada e em seguida com tampão fosfato (50 mM) a pH 8. A hlgG adsorvida às partículas magnéticas foi depois eluída utilizando tampão glicina-NaOH (50mM) a pH 11. A quantidade de hlgG libertada das partículas magnéticas foi adicionalmente determinada por HPLC numa coluna de afinidade de Proteína A.

Purificação do extrato bruto de anticorpos

Para a extração em duas fases aquosas, as partículas magnéticas (PM-ES-22/8) foram incubadas durante 40 minutos à temperatura ambiente nas APTS. Após a incubação, as partículas magnéticas foram separadas e o sobrenadante foi cuidadosamente recolhido. As partículas separadas foram em seguida lavadas cinco vezes com 500 μΐ de tampão de ligação (fosfato 50 mM, pH 8) . Após a lavagem, a hlgG ligada foi eluida utilizando o tampão de eluição (glicina-NaOH (50mM) a pH 11). A fim de estudar as melhores condições de eluição foram utilizados vários tampões de eluição como Tris-HCl a pH 8.5 e com uma concentração de 0,1 M; 0,2 M; 0,5 Μ; 1 M e 1,5 M, Sorbitol com uma concentração de 0,5 M e tampão citrato com concentrações de 1M e 100 mM, bem como com pH 3 e pH 8.5. Todas as amostras foram quantificadas por HPLC utilizando uma coluna porosa de afinidade de proteína A. Os métodos BCA e SDS-PAGE (12,5% de acrilamida/bisacrilamida) em condições de desnaturação foram também utilizados para determinação da pureza. Os géis de SDS-PAGE foram preparados de acordo com um protocolo padronizado.

Desempenho das partículas magnéticas no processo de Purificação

Foi avaliada a separação de hlgG pura em ATPS PEG/dextrano completado com partículas magnéticas revestidas por EPS. De acordo com o resultado adição de sal afetou a separação de hlgG juntamente com partículas magnéticas. Na presença de elevadas concentrações de NaCl verificou-se uma maior concentração de hlgG na fase superior. A concentração de sal foi estudada na gama de 100a 500 mM de NaCl. Observou-se que aumentando a concentração de sal, há uma diminuição na concentração de hlgG na fase inferior enriquecida em dextrano e um aumento simultâneo da concentração de hlgG na fase superior enriquecida em PEG (Figura 3) . Após o passo de extracção em duas fases aquosas, as partículas foram lavadas com tampão de lavagem (fosfato 50 mM a pH 8), enquanto que a hlgG ligada foi libertada com um tampão de eluição de glicina-NaOH 50 mM a um pH de 11. As impurezas foram distribuídas ao longo da fase superior e inferior, enquanto que se observou a presença do anticorpo puro (com pureza superior a 95%) na amostra de eluição das partículas magnéticas.

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Lisboa, 19 de Dezembro de 2014

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Método para a purificação e separação de substâncias, que compreende os passos de: a) preparação de um sistema de duas fases aquosas; b) adição de materiais superparamagnéticos, juntamente com a amostra a purificar; c) separação de fases e remoção de materiais superparamagnéticos por força magnética; d) lavagem e isolamento da substância alvo.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelas substâncias compreenderem, mas não estarem limitadas a, antibióticos, vitaminas, péptidos, polipéptidos, proteínas, anticorpos, hormonas, ácidos nucleicos, derivados de ácidos nucleicos, vírus, organelos, partículas semelhantes a vírus, vesículas ou células.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelos materiais superparamagnéticos usados serem partículas magnéticas funcionalizadas com um ligando adequado à purificação incluindo mas não se limitando a enzimas, anticorpos e estruturas derivadas, peptídeos, proteínas, ácidos nucleicos, ligandos de troca iónica, ligandos de interação hidrofóbica, ligandos de modo misto.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela sistema de duas fases aquosas ser composto por misturas de, mas não limitado a, polímeros, sais, açúcares, aminoácidos, tensioactivos.
5. 0 método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela amostra a purificar consistir em, mas não se encontrar limitada a, i) sobrenadante obtido através de fermentação ou de cultura de células, ii) homogenato celular / lisado, iii) um extrato de um produto natural; iv) produtos de uma síntese química.
6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser adicionada, juntamente com as partículas superparamagnéticas, uma amostra contendo contaminantes e a substância a separar, ao sistema de duas fases aquosas, sob agitação constante.
7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender um passo adicional de recuperação dos materiais superparamagnéticos utilizando força magnética em que íman permanente ou eletroíman é usado no processo de separação.
8. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto dos materiais superparamagnéticas separados serem lavados até à remoção dos materiais não ligados.
9. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto da solução de lavagem ser uma solução aquosa.
10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto da recuperação da substância alvo ser realizada por meios químicos ou físicos, tais como, mas não se limitando a, uma solução aquosa contendo compostos tampão, ou pela ação de temperatura ou pressão. Lisboa, 19 de Dezembro de 2014