CN106370752A - 一种富硒蛋白多糖中硒的形态分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种富硒蛋白多糖中硒的形态分析方法。富硒蛋白多糖中加入XIV型蛋白酶，超声辅助酶解，并应用高效液相色谱电感耦合等离子体质谱（HPLC‑ICP‑MS）分析酶解上清液中的硒化合物：硒代胱氨酸（SeCys2）、硒代半胱氨酸（SeCys）和亚硒酸钠（Na2SeO3）。本发明满足环保、经济要求，无需24小时或更长时间的酶解，回收率高于通常方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种富硒蛋白多糖中硒的形态分析方法。
背景技术
硒元素是许多酶如谷胱甘肽过氧化物酶的活性中心（Jagtap，2016），同时，它有助于抗癌和预防衰老（Axley，1991）。然而，硒中毒量与需要量之间范围很窄，并且硒发挥其生物学功能与其形态密切相关（Suhajda，2000）。无机硒主要有硒酸盐和亚硒酸盐两种形态，有机硒则有硒代氨基酸、硒代小肽以及硒代蛋白质三种形态（Maseko，2013）。有机硒与无机硒相比较，具有较高的生物活性和较低的毒性，更容易被机体吸收（Kieliszek，2013；Kouba，2014）。因此，有必要建立硒的形态分析方法。
为了在前处理过程中不改变硒的形态，选择合适的前处理方法十分重要。比较常见的有热水提取法和酸提取法（Tie，2015）。然而这两种方法适合提取无机硒，而在提取硒代蛋氨酸（SeMet）和硒代半胱氨酸（SeCys）等与蛋白质相连接的有机硒时效率很低（Zembrzuska，2014；Bierla，2008），另外，酸参与的水解过程条件难以控制，常常造成硒代氨基酸被破坏（Tie，2015）。酶解法相对温和，是对水溶性含硒化合物提取的补充，用于消化的酶有蛋白酶K、胃蛋白酶和脂肪酶（Pedrero，2009），蛋白酶中使用较多的是XIV酶（Huerta，2004）。然而，一般酶解过程较长，大多数需要在37℃孵化24小时（Moreno，2001），这种过程往往满足不了快速检测的需要，并且在此过程中硒代化合物之间容易发生结构上的转化（Capelo，2004）。
就硒的形态检测而言，目前较为常用是高效液相色谱法（HPLC），如离子交换色谱法、反相色谱法、离子对色谱法以及体积排阻色谱法（Zheng，2000；Chen，2001；Casiot，1999）。上述色谱与电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）联用这近几年发展起来的十分普遍的技术（Zheng，2000）。HPLC-ICP-MS在硒的形态分析方面具有很高的灵敏度（Zhao，2011；Maneetong，2013；da Silva，2013；Torres，2016），并且样品通常不需要经过浓缩等有可能影响硒代化合物组成的步骤（Tie，2014）。
发明内容
针对现有富硒蛋白多糖中硒形态分析技术的缺乏以及富硒蛋白多糖中硒形态检测的需要，本发明提供了一种富硒蛋白多糖中硒的形态分析方法，快速、环保、简便。
一种富硒蛋白多糖中硒的形态分析方法，在待测富硒蛋白多糖中加入XIV型蛋白酶，以水作为媒介在37℃下水浴超声辅助酶解得酶解液，将酶解液进行离心得上清液，并应用HPLC-ICP-MS对上清液中的硒化合物：硒代胱氨酸（SeCys2）、硒代半胱氨酸（SeCys）和亚硒酸钠（Na2SeO3）进行分析从而得到硒化合物的含量。
所述的HPLC-ICP-MS进行分析通过参照标准曲线得到待测富硒蛋白多糖中硒化合物的含量。
所述的测定方法，具体步骤如下：称取25 mg的富硒蛋白多糖于5 mL离心管中，加入3 mg XIV型蛋白酶，再加入3 mL的水，37℃超声30 min，然后将酶解液离心30 min，转速为10000 rpm/min，收集上清液，并应用HPLC-ICP-MS对酶解上清液中的硒化合物：硒代胱氨酸（SeCys2）、硒代半胱氨酸（SeCys）和亚硒酸钠（Na2SeO3）进行分析。
本发明的有益效果：
本发明先对富硒蛋白多糖用XIV型酶进行酶解，使结合在蛋白质上的硒水解成为水溶性的硒代氨基酸，用离心的方法对水溶性的含硒物质与其他杂质进行分离；XIV型酶价格较其它酶低廉并且效率更高；用水作为媒介，避免使用Tris-HCl等试剂，满足环保、经济要求；无需24小时或更长时间的酶解，使用实验室常见和超声波清洗机辅助酶解，整个酶解时间大大缩短，30分钟内可以完成；该方法回收率高于通常方法，回收率在78.19%~87.10%之间。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明进一步详细的说明；
图1是 SeCys2的HPLC-ICP-MS色谱图、标准曲线及线性方程；
图2是 SeCys的HPLC-ICP-MS色谱图、标准曲线及线性方程；
图3是Na2SeO3的HPLC-ICP-MS色谱图、标准曲线及线性方程。
具体实施方式
本申请公开富硒蛋白多糖（Se-EPS）中硒的形态分析方法，该方法采用XIV酶在水作为媒介，在超声波辅助作用下前处理Se-EPS，并应用HPLC-ICP-MS对酶解产物中的硒化合物：SeCys2、SeCys和Na2SeO3进行分析。
方法原理
富硒蛋白多糖中的部分硒结合在蛋白质上，在蛋白酶的作用下含硒蛋白质转变为水溶性硒化合物，通过标样比对，应用HPLC-ICP-MS对富硒蛋白多糖中的硒化合物进行定性，并应用外标法对其进行定量。
操作步骤
精确称取25 mg左右的富硒蛋白多糖于5 mL离心管中，加入3 mg XIV型蛋白酶，再加入3 mL的水，37℃超声30 min，然后离心30 min，转速设为10000 rpm/min，收集上清液，并应用HPLC-ICP-MS对酶解上清液中的硒化合物：SeCys2、SeCys和Na2SeO3进行分析。
仪器与试剂
Nexion 300 电感耦合等离子体质谱仪（美国PerkinElmer公司），高效液相色谱仪（美国PerkinElmer公司），PRP X100阴离子交换色谱柱（美国Hamilton公司），参数见表1.
高速冷冻离心机（美国Thermo公司），KQ-500E（昆山市超声波仪器有限公司），纯水仪（日本Yamato公司）。
XIV型蛋白酶（stretomyces griseus，sigma公司）、色谱级亚硒酸钠以及硒代胱氨酸从sigma公司购买，硒代半胱氨酸来自浙江八达通有限公司。一水合柠檬酸钠和氨水等为分析纯，来自国药集团化学试剂有限公司。
富硒蛋白多糖由本实验室发酵（Xu，2009；Wang，2016）。
实施例1 标准曲线的绘制
准确称取20.0 mg SeCys2，加入含稀酸的水中，配成200 ug/mL的标准储备液，再逐步稀释成0.50，0.30，0.20，0.10以及0.05 ug/mL的SeCys2标准工作液。准确称取20.0 mgSeCys，加入含稀酸的水中，配成200 ug/mL的标准储备液，再逐步稀释成5.0，4.0，2.5，1.0，0.8，以及0.5 ug/mL的SeCys标准工作液。准确称取25.0 mg Na2SeO3溶解在水中，配成100ug/mL的Na2SeO3标准储备液，再逐步稀释成0.50，0.30，0.20，0.05以及0.025 ug/mLNa2SeO3标准工作液。按表1条件，应用HPLC-IPC-MS分析，制作标准曲线。
实施例2 SeCys2、SeCys和Na2SeO3含量测定
准确称取5份25 mg的富硒蛋白多糖于5 mL离心管中，加入3 mg XIV型蛋白酶，再加入3mL的水，37℃超声30 min，然后离心30 min，转速设为10000 rpm/min，收集上清液，并经过0.45 μm的水相滤膜过滤，再应用HPLC-ICP-MS对酶解上清液中的硒化合物：SeCys2、SeCys和Na2SeO3进行分析并分别按照标准曲线计算SeCys2、SeCys和Na2SeO3的含量。
实施例3 富硒蛋白多糖中SeCys2、SeCys和Na2SeO3的回收率测定
准确称取3份25 mg的富硒蛋白多糖于5 mL离心管中，加入3 mg XIV型蛋白酶，再分别加入1.5 mL的0.30 ug/mL的SeCys2，8.0 ug/mL的SeCys以及0.50 ug/mL的Na2SeO3并用水补充至3 mL，37℃超声30 min，然后离心30 min，转速设为10000 rpm/min，收集上清液，并应用HPLC-ICP-MS对酶解上清液中的硒化合物：SeCys2、SeCys和Na2SeO3进行分析并分别按照标准曲线计算SeCys2、SeCys和Na2SeO3的含量，结合实施例2，计算SeCys2、SeCys和Na2SeO3的回收率。
根据以上实施例1-3得到的结果与讨论：
1、标准曲线的绘制
对SeCys2、SeCys和Na2SeO3制作标准曲线，SeCys2线性回归方程为：y=126167.15x-4899.31（R2=0.9999)，SeCys线性回归方程为：y=40155.87x-2968.58（R2=0.9987)，Na2SeO3的线性回归方程分别为y=167993.58x+2364.94（R2=0.9994)。SeCys2在0.05～1.0 ug/mL的浓度范围，SeCys在0.25～5.0 ug/mL的浓度范围，Na2SeO3在0.01～0.50 ug/mL的浓度范围内，浓度与面积均呈现良好的线性关系（图1-3）。
、SeCys2、SeCys和Na2SeO3含量测定结果
3次测得富硒蛋白多糖中SeCys2、SeCys和Na2SeO3含量分别为22.43 ± 0.02 ug/g、219.78 ± 8.85 ug/g和24.34 ± 0.88 ug/g，向样品中添加0.30 ug/mL SeCys2，8.0 ug/mL SeCys，0.50 ug/mL Na2SeO3，计算回收率。结果如表2所示。
。
Claims (3)
1.一种富硒蛋白多糖中硒的形态分析方法，其特征是：在待测富硒蛋白多糖中加入XIV型蛋白酶，以水作为媒介在37℃下水浴超声辅助酶解得酶解液，将酶解液进行离心得上清液，并应用HPLC-ICP-MS对上清液中的硒化合物：硒代胱氨酸（SeCys2）、硒代半胱氨酸（SeCys）和亚硒酸钠（Na2SeO3）进行分析从而得到硒化合物的含量。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征是：所述的HPLC-ICP-MS进行分析通过参照标准曲线得到待测富硒蛋白多糖中硒化合物的含量。
3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征是：具体步骤如下：
称取25 mg的富硒蛋白多糖于5 mL离心管中，加入3 mg XIV型蛋白酶，再加入3 mL的水，37℃超声30 min，然后将酶解液离心30 min，转速为10000 rpm/min，收集上清液，并应用HPLC-ICP-MS对酶解上清液中的硒化合物：硒代胱氨酸（SeCys2）、硒代半胱氨酸（SeCys）和亚硒酸钠（Na2SeO3）进行分析。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109991336A (zh) * | 2019-04-30 | 2019-07-09 | 黑龙江飞鹤乳业有限公司 | 一种乳粉中硒元素形态的分析方法 |
| CN112630316A (zh) * | 2020-11-19 | 2021-04-09 | 浙江大学 | 基于hplc-icp-ms分析富硒蛋白多糖硒形态的方法 |
| CN114705767A (zh) * | 2022-03-01 | 2022-07-05 | 海南省食品检验检测中心(海南省实验动物中心) | 一种大米中硒形态的分析检测方法 |
-
2016
- 2016-10-21 CN CN201610916434.5A patent/CN106370752A/zh not_active Withdrawn
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109991336A (zh) * | 2019-04-30 | 2019-07-09 | 黑龙江飞鹤乳业有限公司 | 一种乳粉中硒元素形态的分析方法 |
| CN112630316A (zh) * | 2020-11-19 | 2021-04-09 | 浙江大学 | 基于hplc-icp-ms分析富硒蛋白多糖硒形态的方法 |
| CN114705767A (zh) * | 2022-03-01 | 2022-07-05 | 海南省食品检验检测中心(海南省实验动物中心) | 一种大米中硒形态的分析检测方法 |
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