CN105085606B

CN105085606B - 一种利用铜螯合磁珠分离铜蛋白质组的方法

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Publication number: CN105085606B
Application number: CN201510636111.6A
Authority: CN
Inventors: 张红晓; 王发园; 侯典云
Original assignee: Henan University of Science and Technology
Current assignee: Henan University of Science and Technology
Priority date: 2015-09-30
Filing date: 2015-09-30
Publication date: 2018-05-29
Anticipated expiration: 2035-09-30
Also published as: CN105085606A

Abstract

一种利用铜螯合磁珠分离铜蛋白质组的方法，涉及蛋白质化学领域技术领域；取生物组织或细胞用液氮充分研磨后，加入蛋白提取液，混合均匀后，低温离心，获得变性的蛋白溶液；将铜螯合磁珠与变性的蛋白溶液进行混合，孵育，得到磁珠蛋白混合溶液；在磁珠蛋白混合溶液中加入其体积1倍的缓冲液1混悬，在外加磁场下倒去一半的上清液；重复4‑5次，得到混合液A；在混合液A中加入其体积1倍的缓冲液2，将所有的特异性铜结合蛋白，即铜蛋白质组分离出来，外加磁场下收集铜蛋白质组；本发明利用磁珠‑IDA来分离变性条件下的金属蛋白质组，大大简化了程序，提高了金属蛋白的获得效率，建立了一套适合于过量重金属处理条件下组织或细胞中金属蛋白质组的分离方法。

Description

一种利用铜螯合磁珠分离铜蛋白质组的方法

技术领域

本发明涉及蛋白质化学领域技术领域，具体的说是一种利用铜螯合磁珠分离铜蛋白质组的方法。

背景技术

全国污染状况调查公报显示，全国土壤污染总超标率为16.1%，其中重金属污染占80%以上。土壤中的重金属大多数容易在植物体内积累，并通过食物链危害人类的健康。另一方面，由于蛋白质的半胱氨酸、甲硫氨酸和组氨酸残基对二价金属离子有很高的亲和力，因此细胞内的过量的重金属可能干扰必需金属元素与蛋白的结合，造成蛋白变性或酶失活，干扰正常的代谢过程。

蛋白质组学技术目前已经成为功能基因组领域一个重要的研究手段。一个蛋白质组（一个基因组或一个细胞、组织内所表达的所有蛋白质）中所有具有金属结合位点的蛋白称为金属蛋白质组（Metalloproteome）。从生物组织或细胞的全套蛋白质中找到的金属位点会保留生物学的关联性，这对于了解细胞内金属元素的动态平衡具有重要意义。

固定化金属亲和层析（IMAC）与质谱偶联是鉴定金属结合蛋白的重要技术。IMAC是利用蛋白中的一些氨基酸，如半胱氨酸、组氨酸和色氨酸等，能与固体柱上吸附的金属阳离子（如Zn²⁺, Cu²⁺, Ni²⁺和Co²⁺等）发生结合的特性，来分离具有该金属结合位点的蛋白质。但IMAC需要进行装柱、洗脱等多个过程，试验程序麻烦。

磁珠是今年来发展起来并已广泛应用于医学生物学领域的一种多功能试剂，它由磁性内核和核外包裹的高分子外壳两部分组成，利用磁核对外磁场的响应，可以将磁珠从周围介质中迅速分离出来。Li等（2007）以纳米粒子为基质，用氮川三乙酸（NTA）包覆纳米粒子作为亲和络合剂，来提纯带有组氨酸标签的蛋白质，发现纯化效果显著优于IMAC，并且这种方法可省去装柱的繁琐程序。但该方法的不足之处是，NTA毒性很大，且价格不便宜，使用范围受到限制。亚氨基二乙酸（IDA）是一种比NTA螯合能力更强、应用更为广泛的金属螯合剂，并且IDA价格便宜，不同基质偶联的 IDA-Ni在天然或变性条件下都能较好地纯化HIS标签重组蛋白。

由于自然状态下绝大多数蛋白的金属结合位点存在于分子内部，因此我们很难通过固定金属法来分离到完整的金属蛋白组，但是之前对金属结合蛋白的研究文献中均未对此加以考虑。

发明内容

本发明目的是为解决上述技术问题的不足，提供一种利用铜螯合磁珠分离铜蛋白质组的方法，利用铜螯合磁珠来分离变性条件下的金属蛋白质组，大大简化了程序，提高了金属蛋白的获得效率，建立了一套适合于过量重金属处理条件下组织或细胞中金属蛋白质组的分离方法。

一种利用铜螯合磁珠分离铜蛋白质组的方法，包括以下步骤：

（1）、取生物组织或细胞用液氮充分研磨后，加入蛋白提取液，混合均匀后，低温离心，获得变性的蛋白溶液；研磨后生物组织或细胞与蛋白提取液的固液比为：1:4；所述蛋白提取液的组成成份为：每升蛋白溶液中含50 mmol/L磷酸钠, pH 7.8，300mmol/L 氯化钠,质量百分比为0.1-1% 的Triton X-100, 8mol/L尿素，余量为水；

（2）、按照铜螯合磁珠与变性的蛋白溶液体积比为1:1的比例，将铜螯合磁珠（浓度为10 mg/ml）与（1）获得的变性的蛋白溶液进行混合，置于25℃-37下孵育15-30min，得到磁珠蛋白混合溶液；

（3）、在低温条件下，在磁珠蛋白混合溶液中加入其体积1倍的缓冲液1混悬5分钟后，在外加磁场下倒去一半的上清液；然后再添加缓冲液1，在外加磁场下倒去一半的上清液；重复4-5次，去除变性条件及非特异性的铜结合蛋白，得到混合液A；在混合液A中加入其体积1倍的缓冲液2，将所有的特异性铜结合蛋白，即铜蛋白质组分离出来，外加磁场下收集铜蛋白质组；

所述缓冲液1的组成成分为：每升缓冲液1中含50 mmol/L磷酸钠, pH 6.5, 300mmol/L 氯化钠和5-20 m mol/L 咪唑，余量为水；

所述缓冲液2的组成成分为：每升缓冲液2中含50 mmol/L磷酸钠, pH 5.8, 300mmol/L氯化钠l和30-60 m mol/L 咪唑，余量为水。

步骤（1）中所述低温离心，4℃低温下，15000g离心30min。

步骤（2）所述铜螯合磁珠与（1）获得的变性的蛋白溶液进行混合，置于37℃下孵育30min。

所述步骤（3）分5次加入缓冲液1，即每次加入1倍体积的缓冲液1，混悬5分钟后，在外加磁场下倒去1半的上清液，逐步去除变性条件，让结合到磁珠表面的铜结合蛋白缓慢复性，同时将非特异性的铜结合蛋白去除。

步骤（3）所述低温条件，为 4-5℃。

有益效果是：

本发明提供的铜结合蛋白的分离方法，程序简单，大大提高了铜结合蛋白的获得效率，建立了一套适合于过量重金属处理条件下生物组织或细胞中金属蛋白质组的分离技术。本发明中的变性条件能够使蛋白多肽链处于伸展状态，更利于与固定金属离子的亲和吸附作用，而在去除变性条件的蛋白质复性过程由于在磁珠表面进行，避免了变性蛋白的聚集沉淀，而且形成的配合物更稳定，保证分离到尽可能多的铜结合蛋白。

附图说明

图1是水稻铜结合蛋白的对照2-DE图谱;

图2是水稻铜结合蛋白的2-DE图谱;

图3是鉴定到铜结合蛋白（蛋白二硫键异构酶）的质谱图；

图中标记：con为对照；cu为铜。

具体实施方式

（1）、取生物组织或细胞用液氮充分研磨后，加入蛋白提取液，混合均匀后，低温离心，获得变性的蛋白溶液；蛋白提取液的加入量为，研磨后生物组织或细胞与蛋白提取液的固液比为：1:4；所述蛋白提取液的组成成份为：每升蛋白溶液中含50 mmol/L磷酸钠, pH7.8，300mmol/L 氯化钠, 质量百分比为0.1-1% 的Triton X-100, 8mol/L尿素，余量为水；

（2）、按照浓度为10 mg/ml的铜螯合磁珠与变性的蛋白溶液体积比为1:1的比例，将浓度为10 mg/ml的铜螯合磁珠与（1）获得的变性的蛋白溶液进行混合，置于25℃-37下孵育15-30min，得到磁珠蛋白混合溶液；

所述缓冲液1的组成成分为：每升缓冲液1中含50 mmol/L磷酸钠, pH 6.5, 300mmol/L氯化钠和5-20 m mol/L 咪唑，余量为水；

所述缓冲液2的组成成分为：每升缓冲液2中含50 mmol/L磷酸钠, pH 5.8, 300mmol/L 氯化钠和30-60 m mol/L 咪唑，余量为水。

步骤（1）中所述低温离心，4℃低温下，15000g离心30min。

步骤（3）所述低温条件，为 4-5℃。

本发明中提到的铜螯合磁珠中Cu²⁺也可以替换为Co²⁺\Zn²⁺\Cd²⁺等其他二价金属离子，从而获得相应的金属结合蛋白。以下实施例用于解释说明本发明，并不对本发明的保护范围有任何形式的限定。

实施例1

一、表面螯合金属铜的磁珠的制备

（1）羟基磁珠的活化：将羟基磁珠（洛阳，惠儿纳米）中加入5M氢氧化钠溶液，使pH值达到12-14，反应后得到活化充分的磁珠（浓度为10 mg/ml）。

（2）环氧化：（1）得到的活化羟基磁珠中加入二甲亚砜、环氧氯丙烷和5M氢氧化钠溶液（磁珠、环氧氯丙烷和氢氧化钠溶液体积比为1:2:1:4），于60℃下缓慢搅拌过夜后洗至中性，使其连接上环氧基，得到环氧化磁珠。

（3）螯合基IDA偶联：（2）得到的环氧化磁珠（10 mg/ml），每毫升中加入1倍体积的IDA（10%，用1M 氢氧化钠调至pH 8），缓慢搅拌10小时，洗至中性后吸干，得到金属螯合磁珠（磁珠-IDA）。

（4）表面铜离子的螯合：将制备的磁珠-IDA（10 mg/ml）与0.5mol/L 硫酸铜溶液1：1，室温下孵育30min后，用蒸馏水清洗三次，得到表面螯合铜的磁珠（磁珠-IDA-Cu）。该方法制得的铜螯合磁珠在0.5mol/L 硫酸铜溶液中每毫升能吸收1mmol Cu²⁺。

二、植物蛋白的提取

用100 μmol L^-1硫酸铜处理的萌发的水稻种胚，铜处理5天后取新鲜的水稻种胚，用液氮充分研磨，然后加入蛋白提取液；充分混匀后放在4℃下提取30 min，在4℃下、15,000×g离心30 min，收集上清。用修改的Bradford法（Ramagli，1999）对变性蛋白进行定量，以鸡卵清蛋白作为标准蛋白。研磨后生物组织或细胞与蛋白提取液的固液比为：1:4；所述蛋白提取液的组成成份为：每升蛋白溶液中含50 mmol/L磷酸钠, pH 7.8，300mmol/L 氯化钠, 质量百分比为0.2% 的Triton X-100, 8mol/L尿素，余量为水；

三、铜螯合磁珠对铜蛋白质组的分离

（1）、按照浓度为10 mg/ml的铜螯合磁珠与变性的蛋白溶液体积比为1:1的比例，将浓度为10 mg/ml的铜螯合磁珠与（1）获得的变性的蛋白溶液进行混合，置于25℃-37下孵育15-30min，得到磁珠蛋白混合溶液；

（2）、在低温条件下，在磁珠蛋白混合溶液中加入其体积1倍的缓冲液1混悬5分钟后，在外加磁场下倒去一半的上清液；然后再添加缓冲液1，在外加磁场下倒去一半的上清液；重复4次，去除变性条件及非特异性的铜结合蛋白，得到混合液A；在混合液A中加入其体积1倍的缓冲液2，将所有的特异性铜结合蛋白，即铜蛋白质组分离出来，外加磁场下收集铜蛋白质组；

三、特异性铜结合蛋白的2-DE分析和质谱鉴定

将以上收集的特异性铜结合蛋白中加入4倍体积冰丙酮（含10% TCA），在-20℃下沉淀过夜，然后用80%冰丙酮洗沉淀2~3遍，真空冻干后，加入裂解液充分溶解，裂解液的组成为：8 mol/L尿素, 4% CHAPS, 65 mmol/L DTT 和0.2% (w/v)两性电解质，4℃下12000×g离心15 min。随后用修改的Bradford法（Ramagli，1999）对变性蛋白进行定量。取100 μg总蛋白，用裂解液稀释至300 μl，采用PROTEAN IEF CELL（Bio-Rad, USA）等电聚焦系统，17cm pH 4-7 线性IPG胶条（Bio-Rad, USA）。等电聚焦参数：20℃下主动水化12 h；20℃等电聚焦，最大电流50mA/strip聚焦总V∙h为60,000。第二向SDS-PAGE在Protean Plus Dodecacell apparatus（Bio-Rad, USA）垂直板电泳槽中进行。用胶体考马斯亮蓝染色方法对胶进行染色。考染后的胶用UMAX Powerlook III（UMAX Technologies, USA）扫描仪进行透射扫面，分辨率为300 dpi，随后取差异蛋白点进行脱色、酶解及脱盐等程序后，用MALDI-TOF-TOP（Reflex III, Bruker-Daltonics）质谱仪进行鉴定。

对2-DE图谱（图1和图2）分析后发现，在对照（Con）和铜处理（Cu）的2-DE图谱上分别鉴定到561±6.23和543±4.46个铜结合蛋白点，比非变性条件下鉴定的铜结合蛋白增加了45.8%和47.7%（sepharose-IDA在非变性条件下，对照和铜处理的2-DE图谱上分别鉴定到304±5.35和284±4.71个铜结合蛋白点）。对照和铜处理之间达到2倍的差异点有69个，差异蛋白点比非变性条件下鉴定的铜结合蛋白增加了45.6%（sepharose-IDA在非变性条件下，对照和铜处理之间达到2倍的差异点有33个）。这说明本发明方法用于分离植物铜蛋白质组是行之有效的。通过本试验获得的铜结合蛋白（蛋白二硫键异构酶）的质谱图见图3。因此，该本发明用于分离金属结合蛋白的效率高，所需时间短，可进行通量化。

实施例2

（1）、取生物组织或细胞用液氮充分研磨后，加入蛋白提取液，混合均匀后，低温离心，获得变性的蛋白溶液；研磨后生物组织或细胞与蛋白提取液的固液比为：1:4；所述蛋白提取液的组成成份为：每升蛋白溶液中含50 mmol/L磷酸钠, pH 7.8，300mmol/L 氯化钠,质量百分比为0.1% 的Triton X-100, 8mol/L尿素，余量为水；

（3）、在低温条件下，在磁珠蛋白混合溶液中加入其体积1倍的缓冲液1混悬5分钟后，在外加磁场下倒去一半的上清液；然后再添加缓冲液1，在外加磁场条件下倒去一半的上清液；重复5次，去除变性条件及非特异性的铜结合蛋白，得到混合液A；在混合液A中加入其体积1倍的缓冲液2，将所有的特异性铜结合蛋白，即铜蛋白质组分离出来，外加磁场下收集铜蛋白质组；

所述缓冲液1的组成成分为：每升缓冲液1中含50 mmol/L磷酸钠, pH 6.5, 300mmol/L 氯化钠和5 m mol/L 咪唑，余量为水；

所述缓冲液2的组成成分为：每升缓冲液2中含50 mmol/L磷酸钠, pH 5.8, 300mmol/L 氯化钠和30 m mol/L 咪唑，余量为水。

步骤（3）所述低温条件，为 4-5℃。

实施例3

（1）、取生物组织或细胞用液氮充分研磨后，加入蛋白提取液，混合均匀后，4℃低温下，15000g离心30min，获得变性的蛋白溶液；研磨后生物组织或细胞与蛋白提取液的固液比为：1:4；所述蛋白提取液的组成成份为：每升蛋白溶液中含50 mmol/L磷酸钠, pH7.8，300mmol/L 氯化钠, 质量百分比为1% 的Triton X-100, 8mol/L尿素，余量为水；

（3）、在5℃下，在磁珠蛋白混合溶液中加入其体积1倍的缓冲液1混悬5分钟后，在外加磁场下倒去一半的上清液；然后再添加缓冲液1，在外加磁场下倒去一半的上清液；重复4次，去除变性条件及非特异性的铜结合蛋白，得到混合液A；在混合液A中加入其体积1倍的缓冲液2，将所有的特异性铜结合蛋白，即铜蛋白质组分离出来，外加磁场下收集铜蛋白质组；

所述缓冲液1的组成成分为：每升缓冲液1中含50 mmol/L磷酸钠， pH 6.5, 300mmol/L 氯化钠和10 mmol/L 咪唑，余量为水；

所述缓冲液2的组成成分为：每升缓冲液2中含50 mmol/L磷酸钠，pH 5.8, 300mmol/L 氯化钠和50 mmol/L 咪唑，余量为水。

Claims

1.一种利用铜螯合磁珠分离铜蛋白质组的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）、取生物组织或细胞用液氮充分研磨后，加入蛋白提取液，混合均匀后，低温离心，获得变性的蛋白溶液；研磨后生物组织或细胞与蛋白提取液的固液比为：1:4；所述蛋白提取液的组成成份为：每升蛋白溶液中含50mmol/L磷酸钠，pH 7.8，300mmol/L氯化钠，质量百分比为0.1-1%的Triton X-100，8mol/L尿素，余量为水；

（2）、按照浓度为10mg/ml的铜螯合磁珠与变性的蛋白溶液体积比为1:1的比例，将浓度为10mg/ml的铜螯合磁珠与（1）获得的变性的蛋白溶液进行混合，置于25℃-37℃下孵育15-30min，得到磁珠蛋白混合溶液；

（3）、在低温条件下，在磁珠蛋白混合溶液中加入其体积1倍的缓冲液1混悬5分钟后，在外加磁场条件下倒去一半的上清液；然后再添加缓冲液1，在外加磁场下倒去一半的上清液；重复4-5次，去除变性条件及非特异性的铜结合蛋白，得到混合液A；在混合液A中加入其体积1倍的缓冲液2，将所有的特异性铜结合蛋白，即铜蛋白质组分离出来，外加磁场下收集铜蛋白质组；

所述缓冲液1的组成成分为：每升缓冲液1中含50mmol/L磷酸钠，pH 6.5，300mmol/LNaCl和5-20mmol/L咪唑，余量为水；

所述缓冲液2的组成成分为：每升缓冲液2中含50mmol/L磷酸钠，pH 5.8，300mmol/LNaCl和30-60mmol/L咪唑，余量为水。

2.如权利要求1所述利用铜螯合磁珠分离铜蛋白质组的方法，其特征在于：

步骤（1）中所述低温离心，4℃低温下，15000g离心30min。

3.如权利要求1所述利用铜螯合磁珠分离铜蛋白质组的方法，其特征在于：用5mol/L氢氧化钠溶液活化的浓度为10mg/ml羟基磁珠；然后在活化后的羟基磁珠中加入二甲亚砜、环氧氯丙烷和5mol/L氢氧化钠溶液；所述羟基磁珠、二甲亚砜、环氧氯丙烷和氢氧化钠溶液体积比1:2:1:4；然后置于60℃下缓慢搅拌过夜，使其连接上环氧基，最后每毫升磁珠中加入其体积1倍的质量分数为10%的亚氨基二乙酸，用1mol/L氢氧化钠调至pH 8缓慢搅拌10~15小时，得到磁珠-IDA，10mg/ml磁珠-IDA与0.5mol/L硫酸铜溶液1:1室温下孵育30min后，用蒸馏水清洗三次，得到铜螯合磁珠。

4.如权利要求1所述利用铜螯合磁珠分离铜蛋白质组的方法，其特征在于：步骤（2）所述铜螯合磁珠与（1）获得的变性的蛋白溶液进行混合，置于37℃下孵育30min。

5.如权利要求1所述利用铜螯合磁珠分离铜蛋白质组的方法，其特征在于：所述步骤（3）分5次加入缓冲液1，即每次加入1倍体积的缓冲液1，混悬5分钟后，在外加磁场下倒去一半的上清液，逐步去除变性条件，让结合到磁珠表面的铜结合蛋白缓慢复性，同时将非特异性的铜结合蛋白去除。

6.如权利要求1所述利用铜螯合磁珠分离铜蛋白质组的方法，其特征在于：步骤（3）所述低温条件为4-5℃。