CN110684075A

CN110684075A - 磁珠沉淀法分离化合物效应蛋白及其方法

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Publication number: CN110684075A
Application number: CN201910975829.6A
Authority: CN
Inventors: 奇日迈励图; 李可昕; 陈佳敏
Original assignee: Tianjin Ruirkang Pharmaceutical Technology Co Ltd
Current assignee: Tianjin Ruirkang Pharmaceutical Technology Co Ltd
Priority date: 2019-10-15
Filing date: 2019-10-15
Publication date: 2020-01-14

Abstract

本发明提供磁珠沉淀法分离化合物效应蛋白及其方法，步骤为：首先根据化合物中活性基团选择合适的磁珠将化合物偶联到磁珠上获得磁珠‑化合物，再进行总蛋白的提取，接着利用BCA法对蛋白定量，利用磁珠法进行蛋白分离，进行蛋白电泳，最后进行考马斯亮蓝染色并且确认化合物是否分离获得与其结合的蛋白。本发明不需要离心，显著提高了微量的蛋白复合物的纯化效果，减少样品损耗，此外，磁珠分离蛋白复合物的步骤少，从上清液中的分离蛋白容易，可以减少非特异性结合和背景信号，得到一致性相当高的数据。

Description

磁珠沉淀法分离化合物效应蛋白及其方法

技术领域

本发明属于沉淀法分离化合物效应蛋白领域，尤其涉及磁珠沉淀法分离化合物效应蛋白及其方法。

背景技术

磁珠是一种通过一定方法将磁性无机粒子与有机高分子结合形成的具有一定磁性及特殊结构的体积在几纳米到几十微米之间的载体微球。载体微球的核心为金属小颗粒，常为铁的氧化物或铁的硫化物，核心外包裹一层高分子材料，最外层是功能基团，载体微球表面可根据需婴赋予不同的功能基团(如一0H、一COOH、一CHO、一NH2、一SH、一CONO2、一CONH2、一SO3H、一SiH3、一环氧基、一CHCl等)，使其表现具有疏水亲水、非极性一极性、带正电荷带负电荷等不同物理性质,同时具有磁响应性,在外磁场作用下具有磁导向性。由于载体微球表现的物理性质同，可结合不同的免疫配毕，如抗体、抗原、DNA、RNA等。

磁珠分离技术是一种分子生物学分离技术，它利用其表面修饰的磁性颗粒对生物分子或细胞的亲和结合而进行分离，能对待分离或待检测的靶标进行高效富集，是一种方便、快速、回收率高、选择性强的方法。磁珠分离技术在生物学方面的应用始于20世纪70年代后期，目前已经在分子生物学、细胞学、免疫学、微生物学、生物化学等领域取得些令人时讨的研究成果。

应用于磁分离技术的磁性载体微球应具备以下特点:粒径比较小，比表面积较大，具有较大的吸附容量；物理和化学性能稳定，具有较高的机械强度，使用寿命长；其有可活化的反应基团，以用于亲和配基的固定化；粒径均一，能形成单分散体系:悬浮性好，便于反应的有效进行。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供磁珠沉淀法分离化合物效应蛋白及其方法，步骤为：

S1:根据化合物中活性基团选择合适的磁珠将化合物偶联到磁珠上获得磁珠-化合物：

s1.1根据化合物的结构取出磁珠，将瓶内磁珠混合均匀，取适量磁珠，置于磁性分离架上，待上清与沉淀完全分离后吸取并丢弃上清液；

s1.2向磁珠中加入两倍体积的洗涤缓冲液A，重悬15s，置于磁性分离架上，待上清与沉淀完全分离后吸取并丢弃上清液；

s1.3向磁珠中加入与磁珠等体积的待偶联蛋白，重悬30s，室温放置1h，若观察到磁珠沉淀，再次手摇重悬，放置结束后，置于磁性分离架上，待上清与沉淀完全分离后，收集上清液做好标记，在4℃环境下保存上清液；

s1.4向磁珠中加入两倍体积的封闭缓冲液，重悬30s，置于磁性分离架上，待上清与沉淀完全分离后吸取并丢弃上清液，此步骤重复4次；

s1.5向磁珠中加入两倍体积的封闭缓冲液，重悬30s，室温放置2h，室温放置结束后，置于磁性分离架上，待上清与沉淀完全分离后吸取并丢弃上清液；

s1.6向磁珠中加入两倍体积的水，充分混合，置于磁性分离架上，待上清与沉淀完全分离后吸取并丢弃上清液；

s1.7向磁珠中加入两倍体积的10mm的磷酸盐缓冲液，充分混合，置于磁性分离架上，待上清与沉淀完全分离后吸取并丢弃上清液；

s1.8向磁珠中加入与磁珠等体积的10mm的磷酸盐缓冲液，充分混合，放入4℃冰箱保存，4℃保存过夜后的磁珠可在后续试验中使用。

S2:总蛋白提取:

s2.1组织蛋白提取，按1ml磷酸缓冲盐溶液/100mg组织比例加入磷酸缓冲盐溶液，同时加入蛋白酶抑制剂,通过匀浆器将标本匀浆充分，冰上孵育30分钟后2000转/分离心20分钟收集上清置于-20℃或-70℃保存或直接进行后续实验；

s2.2细胞蛋白提取：按1ml磷酸缓冲盐溶液/107个细胞比例加入磷酸缓冲盐溶液，同时加入蛋白酶抑制剂，重悬细胞与缓冲液重复接触，冰上孵育30分钟后2000转/分离心20分钟收集上清置于-20℃或-70℃保存或直接进行后续实验。

S3：BCA法蛋白定量：

s3.1准备BCA工作液A液：B液＝50:1；

s3.2每孔加入50ul牛血清白蛋白标准品，浓度分别为2000、1000、500、250、125、62.5、31.3、0ug/ml；

s3.3加样：样品用磷酸缓冲盐溶液进行稀释5-10倍，每孔50ul；

s3.4所有检测孔加入150ul BCA工作液，混匀后37℃孵育50min；

s3.5在酶标仪570nm波长下读取OD值；

s3.6通过标准品浓度和OD值，软件自动计算样品中总蛋白浓度。

S4:蛋白分离：

s4.1将Vul总蛋白提取液与化合物-磁珠按等体积充分混匀，4℃孵育30min；

s4.2通过磁力架分离磁珠1分钟，收集上清；

s4.3用磷酸缓冲盐溶液洗涤2次，每次磁力架分离磁珠1分钟；

s4.4丢弃磷酸缓冲盐溶液洗涤液，加入1/3V体积的磷酸缓冲盐溶液备用。

S5:蛋白电泳：

s5.1上样缓冲液制备：根据样品体积加入4×LDS缓冲液和10×RA缓冲液使LDS缓冲液和RA缓冲液始终浓度为1×，沸水浴变性5min；

s5.2待检测蛋白样品上样量:10μl/孔，上样顺序为：Marker、总蛋白、磁珠分离后蛋白、磁珠分离后上清；

S6:考马斯亮蓝染色:

s6.1取出电泳凝胶，用超纯水漂洗；

s6.2加入适量考马斯亮蓝染色液，充分覆盖凝胶，染色1-4个小时；

s6.3染色结束后移除染色液，加入等体积的脱色液，脱色1-8个小时，可根据条带调整时间；

s6.4脱色结束后用纯水浸泡凝胶，拍照或扫描保存图片，确认化合物是否分离获得与其结合的蛋白。

优选的，所述磁珠包括羧基磁珠、氨基磁珠、羟基磁珠、NHS磁珠，所述羧基磁珠结合氨基、取代氨基、脒基、胍基、吡啶基、嘌呤基、嘧啶基，所述氨基磁珠结合羧基，酰氯、异氰酸酯、酸酐、卤代烃，所述羟基磁珠结合羧基、酰氯、异氰酸酯、酸酐、卤代烃，所述NHS磁珠结合伯氨基。

优选的，所述羧基磁珠需要经过EDC活化，所述氨基磁珠需要经过戊二醛活化，活化处理后才可偶联。

优选的，所述总蛋白提取液与化合物-磁珠按等体积充分混匀，总蛋白提取浓度需4mg/ml以上。

优选的，所述蛋白电泳的条件是根据所检测蛋白大小选择电泳缓冲液，当蛋白大小>25KD时，选择MOPS缓冲体系，当蛋白大小<25KD时，选择MES缓冲体系，且恒压90V，约20min后变为恒压120V，通过预染蛋白marker来确定电泳停止时间。

优选的，所述确认化合物是否分离获得与其结合的蛋白的方法有质谱鉴定分析和免疫学法。

本发明的有益效果：磁珠分离不需要离心即可聚合在一起，显著提高了微量的蛋白复合物的纯化效果，减少样品损耗，此外，磁珠分离蛋白复合物的步骤少，从上清液中的分离蛋白容易，可以减少非特异性结合和背景信号，得到一致性相当高的数据。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下对本发明做进一步描述：

实施例：

磁珠沉淀法分离化合物效应蛋白及其方法，步骤为：

S2:总蛋白提取:

S3：BCA法蛋白定量：

s3.1准备BCA工作液A液：B液＝50:1；

s3.3加样：样品用磷酸缓冲盐溶液进行稀释5-10倍，每孔50ul；

s3.4所有检测孔加入150ul BCA工作液，混匀后37℃孵育50min；

s3.5在酶标仪570nm波长下读取OD值；

S4:蛋白分离：

s4.2通过磁力架分离磁珠1分钟，收集上清；

s4.3用磷酸缓冲盐溶液洗涤2次，每次磁力架分离磁珠1分钟；

S5:蛋白电泳：

S6:考马斯亮蓝染色:

s6.1取出电泳凝胶，用超纯水漂洗；

具体的，所述磁珠包括羧基磁珠、氨基磁珠、羟基磁珠、NHS磁珠，所述羧基磁珠结合氨基、取代氨基、脒基、胍基、吡啶基、嘌呤基、嘧啶基，所述氨基磁珠结合羧基，酰氯、异氰酸酯、酸酐、卤代烃，所述羟基磁珠结合羧基、酰氯、异氰酸酯、酸酐、卤代烃，所述NHS磁珠结合伯氨基。

具体的，所述羧基磁珠需要经过EDC活化，所述氨基磁珠需要经过戊二醛活化，活化处理后才可偶联。

具体的，所述总蛋白提取液与化合物-磁珠按等体积充分混匀，总蛋白提取浓度需4mg/ml以上。

具体的，所述蛋白电泳的条件是根据所检测蛋白大小选择电泳缓冲液，当蛋白大小>25KD时，选择MOPS缓冲体系，当蛋白大小<25KD时，选择MES缓冲体系，且恒压90V，约20min后变为恒压120V，通过预染蛋白marker来确定电泳停止时间。

具体的，所述确认化合物是否分离获得与其结合的蛋白的方法有质谱鉴定分析和免疫学法。

实施例1

磁珠沉淀法分离化合物效应蛋白及其方法，步骤为：

S2:总蛋白提取:

S3：BCA法蛋白定量：

s3.1准备BCA工作液A液：B液＝50:1；

s3.3加样：样品用磷酸缓冲盐溶液进行稀释5-10倍，每孔50ul；

s3.4所有检测孔加入150ul BCA工作液，混匀后37℃孵育50min；

s3.5在酶标仪570nm波长下读取OD值；

S4:蛋白分离：

s4.2通过磁力架分离磁珠1分钟，收集上清；

s4.3用磷酸缓冲盐溶液洗涤2次，每次磁力架分离磁珠1分钟；

S5:蛋白电泳：

S6:考马斯亮蓝染色:

s6.1取出电泳凝胶，用超纯水漂洗；

s6.4脱色结束后用纯水浸泡凝胶，拍照或扫描保存图片，利用质谱鉴定分析和免疫学法确认化合物是否分离获得与其结合的蛋白。

需要说明的是，在本文中，而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims

1.磁珠沉淀法分离化合物效应蛋白及其方法，其特征在于，步骤为：

S2:总蛋白提取:

S3：BCA法蛋白定量：

s3.1准备BCA工作液A液：B液＝50:1；

s3.3加样：样品用磷酸缓冲盐溶液进行稀释5-10倍，每孔50ul；

s3.4所有检测孔加入150ul BCA工作液，混匀后37℃孵育50min；

s3.5在酶标仪570nm波长下读取OD值；

S4:蛋白分离：

s4.2通过磁力架分离磁珠1分钟，收集上清；

s4.3用磷酸缓冲盐溶液洗涤2次，每次磁力架分离磁珠1分钟；

S5:蛋白电泳：

S6:考马斯亮蓝染色:

s6.1取出电泳凝胶，用超纯水漂洗；

2.根据权利要求1所述的磁珠沉淀法分离化合物效应蛋白及其方法，其特征在于，所述磁珠包括羧基磁珠、氨基磁珠、羟基磁珠、NHS磁珠，所述羧基磁珠结合氨基、取代氨基、脒基、胍基、吡啶基、嘌呤基、嘧啶基，所述氨基磁珠结合羧基，酰氯、异氰酸酯、酸酐、卤代烃，所述羟基磁珠结合羧基、酰氯、异氰酸酯、酸酐、卤代烃，所述NHS磁珠结合伯氨基。

3.根据权利要求1所述的磁珠沉淀法分离化合物效应蛋白及其方法，其特征在于，所述羧基磁珠需要经过EDC活化，所述氨基磁珠需要经过戊二醛活化，活化处理后才可偶联。

4.根据权利要求1所述的磁珠沉淀法分离化合物效应蛋白及其方法，其特征在于，所述总蛋白提取液与化合物-磁珠按等体积充分混匀，总蛋白提取浓度需4mg/ml以上。

5.根据权利要求1所述的磁珠沉淀法分离化合物效应蛋白及其方法，其特征在于，所述蛋白电泳的条件是根据所检测蛋白大小选择电泳缓冲液，当蛋白大小>25KD时，选择MOPS缓冲体系，当蛋白大小<25KD时，选择MES缓冲体系，且恒压90V，约20min后变为恒压120V，通过预染蛋白marker来确定电泳停止时间。

6.根据权利要求1所述的磁珠沉淀法分离化合物效应蛋白及其方法，其特征在于，所述确认化合物是否分离获得与其结合的蛋白的方法有质谱鉴定分析和免疫学法。