DE602004008242T2 - Nanopartikel für bioaffinitätsassays - Google Patents
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Description
- GEBIET DER ERFINDUNG
- Die vorliegende Erfindung betrifft Nanopartikel für Bioaffinitätsassays. Spezifischer betrifft diese Erfindung Ferritinpartikel für Bioaffinitätsassays.
- HINTERGRUND DER ERFINDUNG
- Ferritin ist ein Protein, das zum Beispiel durch Bakterien, Pflanzen und Säuger, einschließlich Menschen, produziert wird. Es ist ein spezielles und hohles Protein, bestehend aus mehrfachen Untereinheiten, die von verschiedenem oder ähnlichem Typ sein können. Typischerweise besteht ein Ferritinmolekül aus 24 Untereinheiten, die sich selbst zu einer sphärischen Struktur anordnen. Zum Beispiel besteht das Ferritin aus humaner Leber, aus schweren Untereinheiten (21 kDa Molekulargewicht) und leichten Untereinheiten (19 kDa) [Boyd D, Vecoli C, et al. (1985) Journal of Biological Chemistry 260:11755-61]. Es hat einen Durchmesser von 12 nm und eine innengelegene Kavität bzw. einen inneren Hohlraum mit einem Durchmesser von 8 nm. Der innere Hohlraum ist dazu fähig, etwa 4.500 Eisenionen als wasserhaltiges Eisen(III)-oxid zu speichern [Chasteen ND, Harrison PM. (1999) Journal of Structural Biology 126:182–94].
- Zusätzlich sind Ferritin-ähnliche sphärische Proteine mit kleinerer Größe in Bakterien gefunden worden. Beispiele sind das durch Streptococci produzierte Dpr-Protein [Haataja S, Penttinen A, et al. Acta Crystallographica D (2002) 58:1851–1853], das durch Listeria produzierte Dps-Protein [Bozzi M. Mignogna G, et al. (1997) Journal of Biological Chemistry 272:3259–3265], das durch Helicobacteria produzierte Dps-Protein [Tonello F, Dundon WG, et al. (1999) Molecular Micro biology 34:238–246] und das durch Escherichia produzierte Dps-Protein [Ilari A, Ceci P, et al (2002) Journal of Biological Chemistry 277:37619–37623].
- Der Eisenkern ist bei Elektronenmikroskopie sichtbar und ist in der Elektronenmikroskopie als eine Markierung verwendet worden [Anderson KL. (1998) Biotechnic and Histochemistry 73:278–88].
- Ferritin ist mit weiteren Molekülen chemisch [Hsu KC. (1981) Scanning electron microscopy 4:17–26] oder mittels Proteinfusionen [Lofdahl, S, Uhlen, M et al.,
US-Pat. 5,100,788 ] konjugiert worden. - Die Expression fremder Proteine oder Peptide auf der Oberfläche von Viren als Virusoberflächenproteinfusionen ist in weitem Umfang studiert worden. Die Präsentation („display") von Proteinen und Peptiden an bzw. auf der Oberfläche der Bakteriophagen T4, T7 und λ ist ebenfalls studiert worden [Sternberg, N. & Hoess, R. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 1609–1613; Ren, Z. & Black, L. (1998), Gene 215, 439–444; Danner, S. & Belasco, J. (2001), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 12954–12959]. In diesen Beispielen verbinden die Phagen die Bindungsaktivität, die auf der Oberfläche eines Partikels lokalisiert ist, mit genetischer Information, die im Inneren des Partikels lokalisiert ist. Darüber hinaus gab es Untersuchungen zur Expression fremder Proteine auf der Oberfläche von Viren mit dem Ziel der Verwendung dieser modifizierten Viren als Vakzine, Immunogene und Beschichtungsmittel (
US 5,008,373 ;US 5,041,385 ;US 5,463,024 ;US 5,736,368 ;US 5,804,196 undUS 6,051,410 ). Ferner ist die Verwendung von virus- und phagenbasierten Capsiden als funktionelle Partikel in Bioaffinitätsassays vorgeschlagen worden (US 2002/0025515 ). - Vorteile von Phagen- und Viruscapsiden sind, dass sie sich selbständig zu partikelähnlichen Strukturen anordnen. Sie weisen jedoch Nachteile auf: Sie sind in ihren jeweiligen Wirten replikativ. Sie können ihre Wirte zufällig infizieren und demgemäß in einem unkontrollierten Ausbruch von Viren oder Phagen resultieren. Sie können Nucleinsäuremoleküle enthalten, die in zufälliger Produktion unerwünschter Proteine in unvorhergesehnen Situationen resultieren können. Die Größe selbst des kleinsten Bakteriophagen ist größer als es für eine optimale kolloidale Stabilität der Partikel optimal ist.
- Ein Marker ist ein Molekül, das mittels chemischer oder physikalischer Mittel detektiert werden kann. Marker können eine katalytische Aktivität, die zur Detektion verwendet wird, besitzen. Beispiele dieser Marker sind Nucleinsäuren oder Proteine, die katalytische Aktivität besitzen. Ein zweckdienlicher Weg zum Detektieren eines Markers basiert auf dessen Fluoreszenz-, Lumineszenz-, optischen, elektrischen oder magnetischen Eigenschaften. Markerproteine werden in der biologischen Forschung und insbesondere in Bioaffinitätsassays weithin verwendet. Die folgenden Enzyme sind Beispiele weithin verwendeter Markerproteine: alkalische Phosphatase (EC 3.1.3.1), β-Galactosidase (EC 3.2.1.23), β-Glucuronidase (EC 3.2.1.31), Glucoseoxidase (EC 1.1.3.4), Luciferase (EC 1.13.12.7) und Meerrettichperoxidase (EC 1.11.1.7). Das gemeinsame Merkmal bei allen von diesen ist, dass ihre Detektion bei geringen Konzentrationen durch Verwendung eines einfachen Protokolls möglich ist. Zusätzlich zu Enzymen sind alternative Markerproteine beschrieben worden, wie fluoreszente bzw. fluoreszierende Proteine [Heim R und Tsien RY, (1996), Current Biology 6:178–82] oder farbige Proteine [Lukyanov KA, Fradkov AF, et al. (2000), Journal of Biological Chemistry 275:25879–82].
- Zahlreiche gut definierte Konjugate zwischen einem Bindungsmolekül und einem Markerprotein zur Assayentwicklung sind produziert worden. Ein Konjugat wird traditionell produziert durch in vitro-Markierung des Bindungsmoleküls mit Markerprotein oder -peptid [Kopetzki, E; Lehnert, K; Buckel, P. P. Clin. Chem. (1994), 40:688–704]. Ein alternativer Weg zum Produzieren des Konjugats ist es, Gene, die für ein Bindungsmolekül und ein Reporterprotein codieren, zu fusionieren, was in der Produktion eines Fusionsproteins, das sowohl Bindungs- als auch Markeraktivität besitzt, resultiert [Zenno und Inouye, Biochemical and Biophysical Research Communications (1990), 171:169–74].
- Luzzago et al. [The EMBO Journal 8, 569–576 (1989)] offenbaren die Isolation von Punktmutationen, die die Faltung der H-Kette von humanem Ferritin in E. Coli beeinflussen, wobei ein rekombinantes Hybridmolekül, das das α-Peptid von β-Galactosidase umfasst, verwendet wird. Falls die Mutationen die Faltung nicht beeinflussen, wird die α-Peptiddomäne auf der Innenseite der Apoferritinhülle beim Zusammensetzen abgeschieden bzw. segregiert und ist unfähig, mit dem Substrat wechselzuwirken und seine enzymatische Funktion auszuüben.
- Die
US 5,358,722 offenbart Ferritinanaloga, die eine Apoferritinproteinhülle umfassen, die einen festen Kern mit der Form eines Kügelchens aus anorganischem oder organischem Material umgibt, welches im Wesentlichen frei von Ferrihydrit ist. Das Material kann z.B. Europium sein. - Die
EP 0 354 847 offenbart ein Konjugat zur Verwendung in einem Markierungssystem, umfassend Avidin oder Streptavidin, das mit einem Trägerpartikel, z.B. Apoferritin, verknüpft ist. Das Konjugat ist in der Bildung bzw. Herstellung eines Fluoreszenzreagenzsystems verwendbar. Das fluoreszierende Markierungssystem ist in Bindungsassays besonders nützlich. - Die
WO 03/094849 - AUFGABE UND ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
- Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, alternative Partikel für Bioaffinitätsassays bereitzustellen.
- Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Bioaffinitätsassays bereitzustellen, die die alternativen Partikel verwenden.
- Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, verbesserte Kits für Bioaffinitätsassays bereitzustellen, die die alternativen Partikel verwenden.
- Somit stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Nanopartikels in einem Ligandenbindungs-Bioaffinitätsassay bereit, wobei das Nanopartikel eine sich selbst organisierende Hülle („self-assembling shell") umfasst, aufgebaut aus mehreren Protein- und/oder Peptiduntereinheiten, wobei die Protein- und/oder Peptiduntereinheiten von einem oder mehreren verschiedenen Typen sein können, die in einer organisierten Weise unter Bildung einer Hülle mit einer inneren Oberfläche, die dem Inneren zugewandt ist, und einer äußeren Oberfläche, die dem Äußeren des Partikels zugewandt ist, zusammengesetzt sind, wobei die Hülle des Nanopartikels ein rekombinantes Apoferritin-Partikel oder ein rekombinantes Apoferritin-artiges Dpr/Dps-Protein-Partikel ist, wobei
- a) einer oder mehrere der Typen von Untereinheiten eine oder mehrere genetisch fusionierte erste Bindungsgruppierungen pro Typ von Untereinheit hat/haben, wobei die Bindungsgruppierung dem Äußeren des Partikels zum Binden eines spezifischen Ligandenbindungsproteins zugewandt ist; und
- b) i) das Partikel innerhalb seiner Hülle einen Marker enthält und/oder
- ii) einer oder mehrere Typen von Untereinheiten eine oder mehrere genetisch fusionierte zweite Bindungsgruppierungen pro Typ von Untereinheit hat/haben, wobei die Bindungsgruppierung, die dem Inneren und/oder dem Äußeren des Partikels zugewandt ist, einen Marker bindet; und
- c) der Marker oder die Marker die Detektion des Partikels ermöglicht/ermöglichen.
- Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Nanopartikel bereit, das für Ligandenbindungs-Bioaffinitätsassays zweckmäßig ist, umfassend eine sich selbst organisierende Hülle, aufgebaut aus mehreren Protein- und/oder Peptiduntereinheiten, wobei die Protein- und/oder Peptiduntereinheiten von einem oder mehreren verschiedenen Typen sein können, die in einer organisierten Weise unter Bildung einer Hülle mit einer inneren Oberfläche, die dem Inneren zugewandt ist, und einer äußeren Oberfläche, die dem Äußeren des Partikels zugewandt ist, zusammengesetzt sind, wobei die Hülle des Nanopartikels ein rekombinantes Apoferritin-Partikel oder ein rekombinantes Apoferritin-artiges Dpr/Dps-Protein-Partikel ist, wobei
- a) einer oder mehrere der Typen von Untereinheiten eine oder mehrere genetisch fusionierte erste Bindungsgruppierungen pro Typ von Untereinheit hat/haben, wobei die Bindungsgruppierung dem Äußeren des Partikels zum Binden eines beliebigen spezifischen Ligandenbindungsproteins zugewandt ist; und
- b) i) das Partikel innerhalb seiner Hülle einen Marker enthält und/oder
- ii) einer oder mehrere der Typen von Untereinheiten eine oder mehrere genetisch fusionierte zweite Bindungsgruppierungen pro Typ von Untereinheit hat/haben, wobei die Bindungsgruppierung, die dem Inneren und/oder dem Äußeren des Partikels zugewandt ist, einen Marker bindet, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Enzym, lumineszenten Protein, fluoreszenten oder farbigen Protein oder organischen Molekül und einem Seltenerdmetall; und
- c) der Marker oder die Marker die Detektion des Partikels ermöglicht/ermöglichen.
- Die vorliegende Erfindung stellt auch einen Bioaffinitätsassay bereit, wobei das Nanopartikel verwendet wird.
- Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Kit für einen Bioassay bereit, umfassend das Nanopartikel.
- KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
-
1 zeigt die Struktur eines Proteinnanopartikels. -
2 zeigt die Detektion der Bindungsaktivität eines Proteinpartikels. -
3 zeigt die Struktur des Plasmids pBccpHFI. -
4 zeigt die Struktur des Plasmids pPrGHFI. -
5 zeigt die Struktur des Plasmids pTSHscHFI. -
6 zeigt die Struktur des Plasmids pCBPHFI. - DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
- Definition von Begriffen
- Der Begriff „Apoferritin" soll so verstanden werden, dass Ferritin, dem Moleküle im Hohlraum im Inneren des Proteins fehlen, gemeint ist.
- Der Begriff „ein Apoferritin-artiges Partikel" soll so verstanden werden, dass ein Ferritin-artiges Partikel, dem Moleküle im Hohlraum im Inneren des Proteins fehlen, wie in den Ansprüchen definiert, gemeint ist. Das „Apoferritin-artige Partikel" ist typischerweise ein sich selbst organisierendes Partikel aus Protein, das aus einer spezifischen Anzahl von Untereinheiten besteht. Das Partikel ist typischerweise sphärisch. Beispiele für Ferritin-artige Partikel sind oben angegeben worden.
- Der Begriff „Bioaffinitätsassays" soll so verstanden werden, dass einstufige und mehrstufige kompetitive und nicht-kompetitive Ligandenbindungsassays und Immunoassays, basierend auf einer einzelnen oder mehreren spezifische Liganden bindenden Gruppierung(en), zum Beispiel monoklonale Antikörper, Polypeptide, Rezeptoren, rekombinante Antikörper oder Antikörperfragmente, sowie künstliche Bindesubstanzen („artificial binders"), wie Aptamere und (gentechnisch) veränderte Proteine ("engineered Proteins"), gemeint sind.
- Biaffinitätsassays umfassen heterogene und homogene Assays. Im heterogenen Assay wird der Analyt an eine Festphase gebunden und ein Partikel wird zur Detektion des gebundenen Analyten verwendet. Ein Partikel kann direkt an den Analyten oder an ein Molekül, das an den Analyten gebunden ist, binden.
- Partikel und Analyt können der Reaktion entweder sequentiell oder gleichzeitig zugegeben werden. Im homogenen Assay wird der Analyt aus der Lösung ohne Abtrennung ungebundener Partikel detektiert. Ein homogener Assay kann zum Beispiel auf Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) oder Biolumineszenzresonanzenergietransfer (BREI) (Route, N, Jockers, R und Issad, T. 2002. Trends in Pharmacological Sciences 23:351–354) basieren. Er kann auch auf der Kanalisierung („channeling”) von Substrat, Produkt oder Intermediat einer Enzymreaktion basieren (Gibbons, I, Armenta, R, DiNello, RK und Uliman, EF. 1987. Methods in Enzymology 136:93–103).
- Der Begriff "Marker" soll verstanden werden als ein Merkmal, das durch Messung von Lumineszenz oder Absorption, sowie anderen optischen Eigenschaften, elektrischen Eigenschaften, z.B. elektrischer Strom oder Spannung, oder magnetische Eigenschaften, die aus der Existenz des Merkmals direkt hervorgehen oder indirekt daraus resultieren, detektierbar ist. Ein Beispiel für die direkte Messung des Merkmals ist die Messung der Fluoreszenzemission von grün fluoreszierendem Protein bzw. Green Fluorescent Protein unter Verwendung einer geeigneten Anregungsbeleuchtung. Ein Beispiel für eine indirekte Messung des Merkmals ist die Messung der Lumineszenz, die aus einer chemischen Reaktion, katalysiert durch den Luciferase-Enzymmarker, hervorgeht. Ein Beispiel für die Messung von elektrischen Eigenschaften ist zum Beispiel die Detektion einer Redoxreaktion durch Messung von elektrischer Spannung oder elektrischem Strom.
- Der Begriff „Lumineszenz" soll so verstanden werden, dass er Lumineszenz, Biolumineszenz, Chemilumineszenz, Elektrolumineszenz, Photolumineszenz, Fluoreszenz, verzögerte Fluoreszenz und Phosphoreszenz umfasst.
- Der Begriff „lumineszentes Protein" (bzw. „lumineszierendes Protein") und „fluoreszentes Protein" (bzw. „fluoreszierendes Protein") soll als ein Protein oder Enzym verstanden werden, welches Lumineszenz erzeugt bzw. fluoreszent ist, mit oder ohne prosthetische Gruppen. Ein Beispiel für ein lumineszentes Protein ist das Luciferaseenzym. Ein Beispiel für ein fluoreszentes Protein ist Green Fluorescent Protein (GFP).
- Der Begriff „Nanopartikel" soll als ein partikelförmiges Reagenz verstanden werden, bestehend aus mehrfachen „Untereinheiten", wobei jede aus Proteinen oder Polypeptiden und zusätzlich gegebenenfalls aus einem oder mehreren Merkmalen aus den folgenden besteht: Nucleinsäuren, prosthetische Gruppen, organische und anorganische Verbindungen. Der partikelförmige Stoff weist wenigstens eine einzige „Bindungsgruppierung" auf der äußeren Oberfläche auf und der partikelförmige Stoff enthält einen einzelnen „Marker" oder mehrfache „Marker". Die Dimensionen des partikelförmigen Stoffs liegen zwischen einem Nanometer und zehn Mikrometer.
- Die Begriffe „Lanthanid" und „Seltenerdmetall" sollen so verstanden werden, dass sie Elemente und Kombinationen aus verschiedenen Elementen von Seltenerdionen aus den folgenden umfassen: Neodym (Nd), Samarium (Sm), Europium (Eu), Gadolinium (Gd), Terbium (Tb), Dysprosium (Dy), Erbium (Er), Ytterbium (Yb) und Yttrium (Y).
- Der Begriff „Untereinheit" soll als ein einzelnes Protein oder Polypeptid oder Komplex aus mehreren Proteinen oder Polypeptiden, zusammengesetzt aus identischen oder unterschiedlichen Komponenten, verstanden werden.
- Der Begriff „Bindungsgruppierung" soll so verstanden werden, dass er monoklonale Antikörper, Polypeptide, Rezeptoren, rekombinante Antikörper oder Antikörperfragmente, sowie künst liche Bindungssubstanzen, wie Aptamere und (gentechnisch) veränderte Proteine, oder eine derivatisierte Form eines beliebigen der aufgelisteten Merkmale umfasst. Ein Beispiel für ein Polypeptid ist das Calmodulin-Bindungspeptid (CBP). Ein Beispiel des derivatisierten Merkmals ist eine Peptidsequenz des bzw. aus dem Biotin-Carboxyl-Carrier-Protein (BCCP), welche in vivo mit dem Biotinligaseenzym BirA biotinyliert werden kann.
- Der Begriff „Enzym" soll als ein Protein oder Polypeptid oder eine Nucleinsäure mit katalytischer Aktivität verstanden werden. Beispiele für Enzyme sind Luciferase und Galactoseoxidase (GAO).
- Der Begriff „Galactoseoxidase (GAO)" soll als Enzym mit der Enzyme Commission-Nummer EC 1.1.3.9 verstanden werden.
- Der Begriff „farbiges Protein" soll als ein Protein oder Polypeptid verstanden werden, welches eine signifikante Absorption bei sichtbaren Wellenlängen, 300–700 nm, aufweist, mit oder ohne prosthetische Gruppen.
- Der Begriff „organisches Molekül" soll als eine beliebige chemische Verbindung, enthaltend wenigstens Kohlenstoff, mit einem Molekulargewicht unter 7.000 Dalton verstanden werden. Beispiele für organische Moleküle sind prosthetische Gruppen im fluoreszenten Allophycocyaninprotein.
- Der Begriff „anorganisches Molekül" soll als beliebige(s) anorganisches Atom, chemische Verbindung, bestehend aus anorganischen Atomen, oder eine Kombination von Atomen auf eine organisierte Art verstanden werden. Ein Beispiel für ein anorganisches Molekül ist ein fluoreszierendes CdSe-Halbleiterpartikel.
- Der Begriff „selbstorganisierende Hülle" („self-assembling shell") soll als eine partikelförmige Struktur verstanden werden, die zur Selbstorganisation aus einem Pool vitaler Hüllproteine fähig ist.
- Der Begriff „vitales Hüllprotein" soll als Protein verstanden werden, das zur Selbstorganisation einer partikelförmigen Entität, z.B. eines Nanopartikels, benötigt wird.
- Der Begriff „GFP” soll als grün fluoreszierendes Protein bzw. Green Fluorescent Protein aus Aequorea victoria, dessen mutierte Derivate oder ein homologes Protein aus anderen Arten verstanden werden.
- Der Begriff „CRP" soll als C-reaktives Protein verstanden werden.
- Der Begriff „TSH" soll als thyreotropes Hormon verstanden werden.
- Der Begriff „BCCP" soll als Biotin-Carboxyl-Carrier-Protein verstanden werden.
- Der Begriff „Protein G" soll als Protein G aus Bakterien in der Gattung Streptococcus verstanden werden.
- Der Begriff „Protein A" soll als Protein A aus Bakterien in der Gattung Staphylococcus verstanden werden.
- Der Begriff „Protein L" soll als Protein L aus Bakterien in der Gattung Peptostreptococcus verstanden werden.
- Allgemeine Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen
- Die erfindungsgemäßen Nanopartikel können nützliche Eigenschaften aufweisen. Diese können, ohne Beschränkung darauf, geringe Kosten, einfache Produktion, hohe Stabilität und in hohem Maße definierte Struktur sein. Die Produktion kann sehr einfach sein, wobei eine einfache mikrobielle Fermentation mit geringer nachfolgender Bearbeitung typischerweise alles ist, was benötigt wird.
- Das erfindungsgemäße Nanopartikel kann einen Marker aufweisen, der ein Enzym, lumineszentes Protein, fluoreszentes oder farbiges Protein oder organisches Molekül oder ein Seltenerdmetall ist. Falls der Marker ein Protein ist, kann er ein Enzym, wie Luciferase oder GAO, oder ein fluoreszentes Protein, wie GFP, sein. Falls der Marker ein Seltenerdmetallion ist, kann er ein Tb-, Eu-, Sm- oder Dy-Ion sein. Der Marker kann auch ein anorganisches Partikel sein, z.B. ein CdSe-Partikel.
- Das erfindungsgemäße Nanopartikel kann zusätzlich zu den ersten und zweiten Bindungsgruppierungen dritte Bindungsgruppierungen haben. Ein oder mehrere der Typ(en) von Untereinheiten kann/können zum Beispiel eine oder mehrere dritte Bindungsgruppierung(en) pro Typ von Untereinheit haben, wobei die Bindungsgruppierung dem Äußeren des Partikels zum Binden an einen festen Träger zugewandt ist. Das Nanopartikel kann auch zusätzliche Bindungsgruppierungen mit zusätzlichen Funktionen haben.
- Die Hülle des Nanopartikels ist ein rekombinantes Apoferritin- oder ein Ferritin-artiges Partikel.
- Die erste, zweite, dritte oder zusätzliche Bindungsgruppierung kann Protein A, Protein G, Protein L oder Calmodulin-Bindungspeptid (CBP) sein. Die erste, zweite, dritte oder zu sätzliche Bindungsgruppierung kann ein Antikörper sein, zum Beispiel gegen CRP, ABO-Blutgruppenantigene oder TSH. Die erste, zweite, dritte oder zusätzliche Bindungsgruppierung kann Protein A, Protein G, Protein L oder CBP sein.
- Der minimale Radius des Nanopartikels beträgt typischerweise von 10 bis 40 nm. Die Zahl an Untereinheiten der Hülle des Nanopartikels beträgt typischerweise mehr als 8, vorzugsweise mehr als 20.
- Apoferritin besitzt eine Größe, die in erhöhter kolloidaler Stabilität resultiert. Es besteht nur aus Proteinuntereinheiten ohne Nucleinsäuren, was es als solches zu einem biologisch sicheren Partikel („biosafe particle") macht, und es organisiert sich in Lösung auch selbst.
- Beschreibung der Figuren
-
1 zeigt die Struktur eines erfindungsgemäßen Proteinnanopartikels. Die Figur zeigt eine Proteinhülle1 , ein erstes Bindungsmolekül2 , das dem Äußeren des Nanopartikels zugewandt ist, einen Marker3 innerhalb der Hülle des Nanopartikels und ein zweites oder drittes Bindungsmolekül4 , das dem Äußeren des Nanopartikels zugewandt ist. -
2 zeigt die Detektion der Bindungsaktivität eines Proteinpartikels. Ein Analyt, der für das zu testende Bindungsmolekül spezifisch ist, wird mit einem zur Detektion geeigneten Molekül markiert. Der markierte Analyt wird dann mit Partikeln umgesetzt und Partikel/Analyt-Komplexe werden von ungebundenem Analyten mittels Gelfiltration abgetrennt und das Signal der Markierung wird gemessen. -
3 zeigt die Struktur des Plasmids pBccpHFI. Die Abkürzungen stehen für: Bccp-Ferritin = Gen, codierend für BCCP-humanes Ferritin-Leichtkette-Fusionsprotein. -
4 zeigt die Struktur des Plasmids pPrGHFI. Die Abkürzungen stehen für: pBR322ori = Replikationsstartpunkt, Kan = Kanamycinresistenzgen, LacI = Gen, codierend für den Lac-Repressor, Protein G-Ferritin = Gen, codierend für Protein G-humanes Ferritin-Leichtkette-Fusionsprotein. -
5 zeigt die Struktur des Plasmids pTSHscHFI. Die Abkürzungen stehen für: anti-TSHsc-Ferritin = Gen, codierend für antiTSHscFv-Antikörper-humanes Ferritin-Leichtkette-Fusionsprotein. -
6 zeigt die Struktur des Plasmids pCBPHFI. Die Abkürzungen stehen für: CBP-Ferritin = Gen, codierend für CBP-humanes Ferritin-Leichtkette-Fusionsprotein. - Methoden
- DNA-Manipulationen
- Alle DNA-Manipulationen wurden gemäß bekannter Protokolle [Sambrook J, Fritsch EF und Maniatis T, (1989), Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour] durchgeführt.
- Bakterienstämme
- Die folgenden Bakterienstämme werden in den Beispielen verwendet: XL-1 Blue, BL21, BL21(DE3), BL21(DE3:pLysS), Origami B, Origami B(DE3) und Origami B(DE3:pLysS) (Stratagene, La Jolla, CA, USA).
- Messung der Fluoreszenz
- Eine zeitaufgelöste Fluoreszenz von Europium und Terbium wurde mit Delfia-Reagentien von PerkinElmer Life Sciences (Boston, MA, USA) gemessen. Die Fluoreszenz von Alexa Fluor 594 (Molecular Probes Europe, Leiden, Niederlande) wurde wie vom Hersteller vorgeschlagen gemessen. Alle Messungen wurden mit einem Multimarkierungszählgerät vom Typ Wallac Victor (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA) durchgeführt.
- Detektion von Reporterproteinen
- Die Aktivität der Leuchtkäfer-Luciferase wurde durch Messung der mit dem Luciferase-Assaykit von BioThema Ltd. (Haninge, Schweden) erzeugten Lumineszenz bestimmt.
- Die Aktivität der Galactoseoxidase wurde bestimmt durch Messung der Lumineszenz aus Luminoloxidation durch H2O2, gebildet in der Reaktion des Enzyms mit 50 mM Galactose in 100 mM Phosphatpuffer, enthaltend 1 mM Luminol und 0,4 mM CuSO4, bei pH 8,6. Alle Messungen wurden mit einem Multimarkierungszählgerät vom Typ Wallac Victor (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA) durchgeführt.
- Beispiel 1
- Produktion von Ferritin-basierten Partikeln
- Escherichia coli-Zellen, die Plasmide exprimieren, die für ein Bindungsmolekül, fusioniert an den N-Terminus von Ferritin (Beispiel 8, Beispiel 9, Beispiel 10 und Beispiel 11) -Untereinheiten, codieren, wurden in 50 ml SB-Medium unter Schütteln bei 37°C wachsen gelassen, bis die OD600 0,4 erreichte. Die Proteinproduktion wurde durch Zugeben von IPTG bis zu einer Konzentration von 0,5 mM induziert und die Kul tivierung wurde bei 26°C über Nacht fortgesetzt. Danach wurden die Zellen mittels Zentrifugation bei 1.500 g für 10 Minuten gesammelt und auf 5 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) suspendiert. Die Zellen wurden dann mittels (Ultra)Schallbehandlung analysiert und Zelldebris wurde mittels Zentrifugation bei 5.000 g für 10 Minuten entfernt. Der Überstand wurde dann mit Filtern mit einer Trenngrenze („cut-off value") von 100 kDa (Pall Life Science, Ann Arbor, MI, USA) filtriert und das Retentat wurde auf bzw. in PBS suspendiert.
- Beispiel 2
- Reinigung von Partikeln mit Gelfiltration
- Proteinnanopartikel wurden mittels Gelfiltration mit einer 10 ml-Sepharose 6B-Säule (Amersham Biosciences Corp, Piscataway, NJ, USA) gereinigt. Die Säule wurde zunächst unter Verwendung von Puffer, enthaltend 5 mM Tris-HCl, 0,01% Tween-20 und 0,05% NaN3, mit pH 7,5 mit 10 Säulenvolumen äquilibriert. Eine Probe von 500 μl wurde auf die Säule aufgebracht und Fraktionen von 1 ml wurden gesammelt.
- Beispiel 3
- Detektion der Bindungsaktivität an der Oberfläche von Proteinpartikeln unter Verwendung von Gelfiltration
- Das Prinzip der Analyse der Aktivität von Bindungsmolekülen an den Oberflächen der Partikel ist in
2 gezeigt. Ein für das zu testende Bindungsmolekül spezifischer Analyt wurde mit einem zur Detektion geeigneten Molekül markiert. Analyte wurden wie folgt markiert: TSH (thyroitropes Hormon) (Scripps Laboratories, San Diego, CA, USA), Streptavidin (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA) und Antikörper mit Europium, und Calmodulin mit Alexa Fluor 594. Ein Gemisch aus vier monoklonalen Eu-markierten Antikörpern wurde bei der Analyse von Protein G-Aktivität verwendet. Die Markierung der Moleküle mit Europium erfolgte mit einem Reagenzkit, das von Perkin Elmer Life Sciences (Boston, MA, USA) erhalten wurde. Markiertes Calmodulin wurde von Molecular Probes (Leiden, Niederlande) erhalten. Markierter Analyt wurde mit Partikeln umgesetzt und Partikel/Analyt-Komplexe wurden mittels Gelfiltration, wie in Beispiel 2 beschrieben, von ungebundenem Analyten abgetrennt. Ferritin-basierte Partikel wurden wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Partikel, hergestellt ohne Bindungsmolekül, wurden als Negativkontrolle verwendet. - Beispiel 4
- Detektion der Bindungsaktivität an der Oberfläche von Proteinpartikeln unter Verwendung von Multiwell-Platten
- Die in vitro-Biotinylierung von TSH und Antikörpern erfolgte mittels des Reagenskits, das von Perkin Elmer Life Sciences (Boston, MA, USA) erhalten wurde. Ein Gemisch aus vier monoklonalen Eu-markierten Antikörpern wurde bei der Analyse von Protein G-Aktivität verwendet. Biotinylierte Moleküle wurden an Streptavidin-beschichtete 96-Well-Platten (Innotrac Diagnostics, Turku, Finnland) gebunden, wie es im Kit beschrieben ist, und die Wells wurden viermal gewaschen. Danach wurden die zu testenden Partikel zugegeben und die Wells wurden wiederum viermal gewaschen. Dann wurde der Analyt, markiert wie in Beispiel 3 beschrieben, zugegeben und die Wells wurden viermal gewaschen und das Signal aus der Markierung wurde gemessen.
- Beispiel 5
- Detektion der Bindungsaktivität an der Oberfläche von Proteinpartikeln unter Verwendung von Molekulargewichtstrenngrenzenfiltern („molecular weight cut-off filters")
- Analytmoleküle wurden markiert, wie in Beispiel 3 beschrieben. Partikel wurden zusammen mit gebundenen Analyten von kleineren Molekülen mit Filtern mit einer Trenngrenze von 100 kDa (Pall Life Science, Ann Arbor, MI, USA) abgetrennt. Das Signal des markierten Moleküls wurde ausgehend vom Retentat gemessen.
- Beispiel 6
- Beladung von Ferritin-basierten Partikeln mit Terbium
- Der beim Laden von Terbiumionen in Ferritin verwendete Reaktionspuffer bestand aus 50 mM HEPES, 50 mM NaCl und 10 mM TbCl3, mit pH 7,0. Ferritin wurde dem Puffer zu 0,1 μM zugegeben und die Reaktion wurde bei 37°C für 20 h inkubiert. Nicht umgesetztes Terbium wurde mittels Gelfiltration mit einer NAP-5-Säule (Amersham Biosciences Corp, Piscataway, NJ, USA) entfernt.
- Beispiel 7
- Beladung von Ferritin mit Europium
- Eine pelletierte Fraktion aus einer 100 ml-Bakterienkultur, hergestellt gemäß Beispiel 1 unter Verwendung von E. coli BL21(DE3:pLysS:pBccpHFI), wurde in 1,5 ml 8 M Harnstoff gelöst und bei 5.000 g zentrifugiert. 10 ml einer Lösung, enthaltend 100 mM Tris, 150 mM NaCl, mit pH 8,5 wurden zugegeben und das Gemisch wurde bei +4°C über Nacht inkubiert. Dann wurde HCl zugegeben bis der pH der Lösung 6,0 erreichte und die Lösung wurde bei 4°C über Nacht inkubiert. 0,056 ml einer 0,01 M EuCl3-Lösung wurden zugegeben und die Lösung wurde bei 25°C für 2 h inkubiert, wonach Puffer (133 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 9,0) stufenweise zugegeben wurde, bis der pH 8,5 erreichte. Dann wurde ausgefälltes Europium von löslichem Europium-beladenem Ferritin abgetrennt, indem nach 10-minütiger Zentrifugation bei 5.000 g Überstand entnommen wurde. Mit Europium beladene Partikel wurden gemäß Beispiel 4 auf die Bindungskapazität getestet und das Europium im Inneren des Ferritins wurde detektiert. Die einen Überschuss an löslichem Biotin (0,001 mM Biotin) enthaltende Reaktion wurde als Kontrolle verwendet. Ein Signal ohne Biotin war 163-fach, verglichen mit der Kontrolle, was das Binden von Eu-markierten Partikeln an die Streptavidin-beschichtete feste Phase zeigt.
- Beispiel 8
- Produktion von Protein G an der Oberfläche von Ferritin
- Ein Gen, das für Streptococcus-Protein G codiert, wurde in ein Plasmid, produzierend die Leichtkette von humanem Ferritin, inseriert, indem ein NheI-verdautes Fragment, erhalten mittels PCR mit den Oligonucleotiden 5'-AAGGATCCCATATGAACCTCTGTAACCATTTCAG (SEQ ID NO:1) und 5'-AACCATGGCATATGGTGACAACTTACAAACT (SEQ ID NO:2), mit genomischer DNA von Streptococcus G148 als Matrize mit dem NheI-verdautem Plasmid pET-26(+)rHuLFt (Grace JE Jr, Van Eden ME, Aust SD. 2000. Archives in Biochemistry and Biophysics 384:116–22) ligiert wurde. E. coli-BL21(DE3:pLysS)-Zellen wurden mit dem resultierenden Konstrukt transformiert. Die Struktur des resultierenden Plasmids, pPrGHFI, wurde mittels partieller Sequenzierung verifiziert. Die Struktur von pPrGHFI ist in
4 gezeigt. Ferritin-basierte Partikel, die Protein G an ihrer Oberfläche exprimieren, wurden mit E.coli-BL21(DE3:pLysS:pPrGHFI)-Zellen unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Protokolls produziert. Das Retentat wurde in 1 ml suspendiert und 10-fach verdünnt vor der Analyse der Funktionalität gemäß Beispiel 5, wobei Eu-markierte Antikörper als Markierung verwendet wurden. Die Partikel mit Protein G haben ein 5,5-faches Signal, verglichen mit Partikeln, produziert mit pET-26(+)rHuLFt. - Beispiel 9
- Produktion eines scFv-Fragments an der Oberfläche von Ferritin
- Ein Gen, codierend für ein anti-TSHscFv-Fragment, wurde in ein Plasmid, produzierend die Leichtkette von humanem Ferritin, inseriert, indem ein NheI-verdautes Fragment, erhalten mittels PCR mit den Oligonucleotiden 5'-GTTATATCAACTGTAAAAGT (SEQ ID NO:3) und 5'-AACCATGGCATATGGAAATTGTGCTCACCCA (SEQ ID NO:4), mit pTSHscHoc als Matrize, mit dem NheI-verdauten Plasmid pET-26(+)rHuLFt (Grace JE Jr, Van Eden ME, Aust SD. 2000. Archives in Biochemistry Biophysics 384:116–22) ligiert wurde. E. coli-Origami B(DE3:pLysS)-Zellen wurden mit dem resultierenden Produkt transformiert. Die Struktur des resultierenden Plasmids, pTSHscHFI, wurde mittels partieller Sequenzierung verifiziert. Die Struktur von PTSHscHFI ist in
5 gezeigt. Ferritin-basierte Partikel, die den anti-TSHscFv-Antikörper an ihrer Oberfläche exprimieren, wurden mit E. coli-Origami B(DE3:pLysS:PTSHHFI)-Zellen unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Protokolls produziert. Das Retentat wurde in 1 ml suspendiert und 5-fach verdünnt vor der Analyse der Funktionalität gemäß Beispiel 5, wobei Eu-markiertes TSH als Markierung verwendet wurde. Die Parti kel mit anti-TSHscFv ergaben ein 33-faches Signal, verglichen mit Partikeln, produziert mit pET-26(+)rHuLFt. - Beispiel 10
- Produktion von Calmodulin-Bindungs-Peptid auf der Oberfläche von Ferritin
- Ein Gen, codierend für cbp, wurde in zwei PCR-Reaktionen konstruiert. Eine erste PCR-Reaktion erfolgte mit den Oligonucleotiden 5'-GAATTCGGATCCTTAGTCGTGCTTG (SEQ ID NO: 5) und 5'-CTGCTGCGAACCGTTTCAAGAAAATCAGCTCTTCCGGTGCTGGCGGTATGAGCTCCCAGATTCGTCAGAATT (SEQ ID NO: 6) mit pET-26(+)rHuLFt als Matrize. Das Produkt der ersten PCR wurde als Matrize für die zweite PCR mit den Oligonucleotiden 5'-GAATTCGGATCCTTAGTCGTGCTTG (SEQ ID NO: 7) und 5'-TAGATATACATATGAAACGCCGTTGGAAGAAAGCGTTCATCGCTGTTTCTGCTGCGAACCGTTTCAAGAAAAT (SEQ ID NO: 8) verwendet. Das NdeI-BamHI-verdaute zweite Produkt wurde mit einem 5,3 kb großen NdeI-BamHI-Fragment von pET-26(+)rHuLFt ligiert. E. coli BL21(DE3:pLysS)-Zellen wurden mit dem resultierenden Konstrukt transformiert. Die Struktur des resultierenden Plasmids pCBPHFI wurde mittels partieller Sequenzierung verifiziert. Die Struktur von pCBPHFI ist in
6 gezeigt. Ferritin-basierte Partikel, die cbp auf ihrer Oberfläche exprimieren, wurden mit E. coli BL21(DE3:pLysS:pCBPHFI)-Zellen unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Protokolls produziert. Das Retentat wurde in 1 ml suspendiert und 5-fach verdünnt vor der Analyse der Funktionalität gemäß Beispiel 3 mit Alexa Fluor 594-markiertem Calmodulin. Die Partikel mit cbp ergaben ein 4,1-faches Signal, verglichen mit Partikeln, produziert mit pET-26(+)rHuLFt. - Beispiel 11
- Produktion von biotinyliertem Peptid auf der Oberfläche von Ferritin
- Ein Gen, codierend für Biotin-Carboxyl-Carrier-Peptid (BCCP) wurde in ein Plasmid, das die Leichtkette von humanem Ferritin produziert, inseriert, indem ein NheI-verdautes Fragment, erhalten mittels PCR mit den Oligonucleotiden 5'-AACCATGGCATATGGAAGCGCCAGCAGCAGC (SEQ ID NO:9) und 5'-AGCCGCTGGTCGTCATCGAGGGTGGCCATATGCGTTGCAA (SEQ ID NO:10), mit genomischer DNA von E.coli-XL-1 Blue als Matrize, mit dem NheI-verdauten Plasmid pET-26(+)rHuLFt (Grace JE Jr, Van Eden ME, Aust SD. 2000. Archives in Biochemistry and Biophysics 384:116–22) ligiert wurde. E.coli-BL21(DE3:pLysS)-Zellen wurden mit dem resultierenden Konstrukt transformiert. Die Struktur des resultierenden Plasmids, pBccpHFI, wurde mittels partieller Sequenzierung verifiziert. Die Struktur von pBccpHFI ist in
3 gezeigt. Ferritin-basierte Partikel, die BCCP auf ihrer Oberfläche exprimieren, wurden mit E.coli-BL21(DE3:pLysS:pBccpHFI)-Zellen unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Protokolls produziert. Das Retentat wurde in 1 ml suspendiert und tausendfach verdünnt vor der Analyse der Funktionalität gemäß Beispiel 4, wobei Eumarkiertes Streptavidin als Markierung verwendet wurde. Die mit pBccpHFI produzierten Partikel ergaben ein 326-faches Signal, verglichen mit Partikeln, produziert mit pET-26(+)rHuLFt. - SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (24)
- Verwendung eines Nanopartikels in einem Ligandenbindungs-Bioaffinitätsassay, wobei das Nanopartikel eine sich selbst organisierende Hülle umfasst, aufgebaut aus mehreren Protein- und/oder Peptiduntereinheiten, wobei die Protein- und/oder Peptiduntereinheiten von einem oder mehreren verschiedenen Typen sein können, die in einer organisierten Weise unter Bildung der Hülle mit einer inneren Oberfläche, die dem Inneren zugewandt ist, und einer äußeren Oberfläche, die dem Äußeren des Partikels zugewandt ist, zusammengesetzt sind, wobei die Hülle des Nanopartikels ein rekombinantes Apoferritin-Partikel oder ein rekombinantes Apoferritinartiges Dpr/Dps-Protein-Partikel ist, wobei a) einer oder mehrere der Typen von Untereinheiten eine oder mehrere genetisch fusionierte erste Bindungsgruppierungen pro Typ von Untereinheit hat/haben, wobei die Bindungsgruppierung dem Äußeren des Partikels zum Binden eines spezifischen Ligandenbindungsproteins zugewandt ist; und b) i) das Partikel innerhalb seiner Hülle einen Marker enthält und/oder ii) einer oder mehrere Typen von Untereinheiten eine oder mehrere genetisch fusionierte zweite Bindungsgruppierungen pro Typ von Untereinheit hat/haben, wobei die Bindungsgruppierung, die dem Inneren und/oder dem Äußeren des Partikels zugewandt ist, einen Marker bindet; und c) der Marker oder die Marker die Detektion des Partikels ermöglicht/ermöglichen.
- Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Hülle des Nanopartikels ein Dpr/Dps-Protein ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Dpr/Dps-Proteinen, die von Streptococci, Listeria, Helicobacter und Escherichia erzeugt wurden.
- Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Marker ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem Enzym, lumineszenten Protein, fluoreszenten oder farbigen Protein oder einem organischen Molekül und einem Seltenerdmetall.
- Verwendung gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Marker ein Protein ist, vorzugsweise ein Enzym, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Luciferase, GAO und GFP.
- Verwendung gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Marker ein Lanthanid ist, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Tb, Eu, Sm und Dy.
- Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass einer oder mehrere der Typen von Untereinheiten eine oder mehrere genetisch fusionierte dritte Bindungsgruppierungen pro Typ von Untereinheit hat/haben, wobei die Bindungsgruppierung dem Äußeren des Partikels zum Binden an einen festen Träger zugewandt ist.
- Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine erste Bindungsgruppierung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Protein A, Protein G, Protein L, Calmodulin-Bindungs-Peptid (CBP) und Biotin-Carboxyl-Carrier-Protein (BCCP).
- Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine erste Bindungsgruppierung ein Antikörper gegen eines der Mitglieder der Gruppe, bestehend aus CRP, ABO-Blutgruppenantigenen und TSH, ist.
- Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine zweite Bindungsgruppierung eine Bindungsgruppierung ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Protein A, Protein G, Protein L, Calmodulin-Eindungs-Protein (CBP) und Biotin-Carboxyl-Carrier-Protein (BCCP).
- Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine zweite Bindungsgruppierung ein Antikörper gegen eines aus der Gruppe, bestehend aus CRP, ABO-Blutgruppenantigenen und TSH, ist.
- Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der minimale Radius des Nanopartikels von 10–40 Nanometer beträgt.
- Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Anzahl an Untereinheiten größer als 8, vorzugsweise größer als 20, ist.
- Nanopartikel, das für Ligandenbindungs-Bioaffinitätsassays zweckmäßig ist, umfassend eine sich selbst organisierende Hülle, aufgebaut aus mehreren Protein- und/oder Peptiduntereinheiten, wobei die Protein- und/oder Peptiduntereinheiten von einem oder mehreren verschiedenen Typen sein kön nen, die in einer organisierten Weise unter Bildung der Hülle mit einer inneren Oberfläche, die dem Inneren zugewandt ist, und einer äußeren Oberfläche, die dem Äußeren des Partikels zugewandt ist, zusammengesetzt sind, wobei die Hülle des Nanopartikels ein rekombinantes Apoferritin-Partikel oder ein rekombinantes Apoferritin-artiges Dpr/Dps-Protein-Partikel ist, wobei a) einer oder mehrere der Typen von Untereinheiten eine oder mehrere genetisch fusionierte erste Bindungsgruppierungen pro Typ von Untereinheit hat/haben, wobei, die Bindungsgruppierung dem Äußeren des Partikels zum Binden eines beliebigen spezifischen Ligandenbindungsproteins zugewandt ist; und b) i) das Partikel innerhalb seiner Hülle einen Merker enthält, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Enzym, lumineszenten Protein, fluoreszenten oder farbigen Protein oder organischen Molekül und einem Seltenerdmetall, und/oder ii) einer oder mehrere der Typen von Untereinheiten eine oder mehrere genetisch fusionierte zweite Bindungsgruppierungen pro Typ von Untereinheit hat/haben, wobei die Bindungsgruppierung, die dem Inneren und/oder dem Äußeren des Partikels zugewandt ist, einen Marker bindet, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Enzym, lumineszenten Protein, fluoreszenten oder farbigen Protein oder organischen Molekül und einem Seltenerdmetall; und c) der Marker oder die Marker die Detektion des Partikels ermöglicht/ermöglichen.
- Nanopartikel gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die ersten Bindungsgruppierungen ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus monoklonalen Antikörpern, Polypeptiden, Rezeptoren, rekombinanten Antikörpern oder Antikörperfragmenten, Aptameren, manipulierten Proteinen und Derivaten davon.
- Nanopartikel gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Marker ein Protein ist, vorzugsweise ein Enzym, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Luciferase, GAO und GFP.
- Nanopartikel gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Marker ein Lanthanid ist, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Tb, Eu, Sm und Dy.
- Nanopartikel gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass einer oder mehrere der Typen von Untereinheiten eine oder mehrere dritte genetisch fusionierte Bindungsgruppierungen pro Typ von Untereinheit hat/haben, wobei die Bindungsgruppierung dem Äußeren des Partikels zum Binden an einen festen Träger zugewandt ist.
- Nanopartikel gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass eine erste Bindungsgruppierung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Protein A, Protein G, Protein L, Calmodulin-Bindungs-Peptid (CBP) und Biotin-Carboxyl-Carrier-Protein (BCCP).
- Nanopartikel gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass eine erste Bindungsgruppierung ein Anti körper gegen eines der Mitglieder der Gruppe, bestehend aus CRP, ABO-Blutgruppenantigenen und TSH, ist.
- Nanopartikel gemäß einem der Ansprüche 13 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass eine zweite Bindungsgruppierung eine Bindungsgruppierung ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Protein A, Protein G, Protein L, Calmodulin-Eindungs-Protein (CBP) und Biotin-Carboxyl-Carrier-Protein (BCCP).
- Nanopartikel gemäß einem der Ansprüche 13 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass eine zweite Bindungsgruppierung ein Antikörper gegen eines aus der Gruppe, bestehend aus CRP, ABO-Blutgruppenantigenen und TSH, ist.
- Nanopartikel gemäß einem der Ansprüche 13 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass der minimale Radius des Nanopartikels von 10 bis 40 Nanometer beträgt.
- Nanopartikel gemäß einem der Ansprüche 13 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Anzahl der Untereinheiten größer als 8, vorzugsweise größer als 20, ist.
- Kit für einen Ligandenbindungs-Immunoassay, umfassend das Nanopartikel gemäß einem der Ansprüche 13 bis 23.
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