ES2293243T3 - Nanoparticula para ensayos de bioafinidad. - Google Patents
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Abstract
Sistema de encendido para una máquina de fumar, que está constituido por una fuente de calor que está adaptada para emitir calor para encender la punta de un artículo fumable soportado por una máquina de fumar, un detector automático que está adaptado para detectar la posición de dicha punta del artículo fumable; y por unos medios de control comunicados con dicho detector, que están adaptados para ajustar automáticamente los parámetros de funcionamiento de dicha fuente de calor dependiendo de la posición de dicha punta detectada por dicho detector, para encender con éxito dicha punta mediante dicha fuente de calor
Description
Nanopartícula para ensayos de bioafinidad.
La presente invención se refiere a
nanopartículas para ensayos de bioafinidad. Más particularmente, la
presente invención se refiere a partículas de ferritina para ensayos
de bioafinidad.
La ferritina es una proteína producida, por
ejemplo, por bacterias, plantas y mamíferos, incluyendo los seres
humanos. Es una proteína particular y hueca que consta de múltiples
subunidades que pueden ser de tipo similar o diferente. Típicamente,
una molécula de ferritina consta de 24 subunidades que se
autoensarnblan en una estructura esférica. Por ejemplo, la
ferritina hepática humana consta de subunidades pesadas (peso
molecular 21 kDa) y subunidades ligeras (19 kDa) [Boyd D, Vecoli C,
et al. (1985) Journal of Biological Chemistry
260:11755-61]. Tiene un diámetro de 12 nm, y una
cavidad interior con un diámetro de 8 nm. La cavidad interior es
capaz de almacenar alrededor de 4500 iones de
hierro como óxido férrico hidratado [Chasteen ND, Harrison PM. (1999) Journal of Structural Biology 126:182-94].
hierro como óxido férrico hidratado [Chasteen ND, Harrison PM. (1999) Journal of Structural Biology 126:182-94].
Además, se han encontrado en bacterias proteínas
esféricas similares a ferritina, con un menor tamaño. Los ejemplos
son la proteína Dpr, producida por Streptococci [Haataja S,
Penttinen A, et al. Acta Crystallographica (2002)
58:1851-1853], la proteína Dps producida por
Listeria [Bozzi M, Mignogna G, et al. (1997) Journal
of Biological Chemistry 272:3259-3265], la proteína
Dps producida por Helicobacteria [Tonello F, Dundon WG,
et al. (1999) Molecular Microbiology
34:238-246], y la proteína Dps producida por
Escherichia [llari A, Ceci P, et al. (2002) Journal of
Biological Chemistry 277:37619-37623].
El núcleo de hierro es visible en el microscopio
electrónico, y se ha utilizado en microscopía electrónica como un
marcador [Anderson KL. (1998) Biotechnic and Histochemistry
73:278-88].
La ferritina se ha conjugado químicamente con
otras moléculas [Hsu KC. (1981) Scanning electron microscopy
4:17-26], o mediante fusiones proteínicas [Lofdahl,
S, Uhlen, M et al. patente US n° 5.100.788].
Se ha estudiado ampliamente la expresión de
proteínas o péptidos extraños sobre la superficie de virus como
fusiones proteínicas de la superficie de virus. También se ha
estudiado la presentación de proteínas y péptidos sobre la
superficie de bacteriófagos T4, T7 \lambda y [Sternberg, N. y
Hoess, R. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92,
1609-1613; Ren, Z. y Black, L. (1998), Gene 215,
439-444; Danner, S. y Belasco, J. (2001), Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 98, 12954-12959]. En estos
ejemplos, los fagos conectan la actividad de unión localizada sobre
la superficie de una partícula a la información genética localizada
en el interior de la partícula. Además, se ha investigado la
expresión de proteínas extrañas sobre la superficie de virus con el
objeto de usar estos virus modificados como vacunas, inmunógenos y
agentes de revestimiento (US n° 5.008.373; US n° 5.041.385; US n°
5.463.024; US n° 5.736.368; US n° 5.804.196 y US n° 6.051.410).
Además, se ha sugerido el uso de cápsidas víricas o a base de fagos
como partículas funcionales en ensayos de bioafinidad (documento US
2002/0025515).
Las ventajas de cápsidas fágicas y víricas son
que se autoensamblan en estructuras similares a partículas. Sin
embargo, tienen desventajas: se pueden replicar en sus hospedantes
respectivos. Pueden infectar a sus hospedantes por accidente y, en
consecuencia, pueden dar como resultado un brote descontrolado de
virus o fagos. También contienen moléculas de ácidos nucleicos que
pueden dar como resultado una producción accidental de proteínas
indeseadas en situaciones imprevistas. El tamaño de incluso el
bacteriófago más pequeño supera el óptimo para la estabilidad
coloidal óptima de las partículas.
Un marcador es una molécula que es posible
detectar por medios químicos o físicos. El marcador puede tener
actividad catalítica, que se usa para la detección. Los ejemplos de
esos marcadores son ácidos nucleicos o proteínas que tienen
actividad catalítica. Una manera útil para detectar un marcador se
basa en sus propiedades de fluorescencia, luminiscencia, ópticas,
eléctricas o magnéticas. Las proteínas marcadoras se usan
ampliamente en investigación biológica, y especialmente en ensayos
de bioafinidad. Las siguientes enzimas son ejemplos de proteínas
marcadoras ampliamente usadas: fosfatasa alcalina (EC 3.1.3.1),
\beta-galactosidasa (EC 3.2.1.23),
\beta-glucuronidasa (EC 3.2.1.31), glucosa
oxidasa (EC 1.1.3.4), luciferasa (EC 1.13.12.7), y peroxidasa de
rábano picante (EC 1.11.1.7). La característica común de todas ellas
es que su detección es posible a concentraciones bajas usando un
protocolo simple. Además de las enzimas, se han descrito proteínas
marcadoras alternativas, tales como las proteínas fluorescentes
[Heim R, y Tsien RY, (1996), Current Biology
6:178-82] o las proteínas coloreadas [Lukyanov KA,
Fradkov AF, et al (2000), Journal of Biological Chemistry
275: 25879-82].
Se han producido numerosos conjugados bien
definidos entre una molécula de unión y una proteína marcadora para
el desarrollo de un ensayo. Un conjugado se produce
tradicionalmente marcando in vitro la molécula de unión con
una proteína o péptido marcador [Kopetzki, E.; Lehnert, K; Buckel,
P. Clin. Checo. (1994), 40: 688-704]. Una manera
alternativa para producir el conjugado es fusionar genes que
codifican una molécula de unión con una proteína informadora, lo
que da como resultado la producción de una proteína de fusión que
tiene actividad tanto de unión como marcadora [Zenno e Inouye,
Biochemical and Biophysical Research Communications (1990),
171:169-74].
Luzzago et al. [The EMBO Journal 8,
569-576 (1989)] describen el aislamiento de
mutaciones de punto que afectan al plegamiento de la cadena H de la
ferritina humana en E. coli usando una molécula híbrida
recombinante que comprende el \alpha-péptido de
\beta-galactosidasa. Si las mutaciones no afectan
al plegamiento, el dominio del \alpha-péptido se
segrega en el interior de la corteza de apoferritina al ensamblarse,
y es incapaz de interactuar con el sustrato y realizar su función
enzimática.
El documento US n° 5.358.722 describe análogos
de ferritina que comprenden una corteza proteínica de apoferritina
que rodea a un núcleo sólido con forma de esférula de un material
inorgánico u orgánico que está desprovisto esencialmente de
ferrihidrita. El material puede ser, por ejemplo, europio.
El documento EP0354847 describe un conjugado
para uso en un sistema de marcaje, que comprende avidina o
estreptavidina enlazada a una partícula portadora, por ejemplo
apoferritina. El conjugado es útil para formar un sistema reactivo
fluorescente. El sistema de marcaje fluorescente es particularmente
útil en ensayos de unión.
El documento WO 03/094849 describe proteínas de
fusión de ferritina, para uso en vacunas y en otras
aplicaciones.
Un objetivo de la presente invención consiste en
proporcionar partículas alternativas para ensayos de
bioafinidad.
Otro objetivo de la presente invención consiste
en proporcionar ensayos de bioafinidad que hagan uso de las
partículas alternativas.
Todavía otro objetivo de la presente invención
es proporcionar kit mejorados para ensayos de bioafinidad que hagan
uso de las partículas alternativas.
De este modo, la invención proporciona el uso de
una nanopartícula en un ensayo de bioafinidad de unión a ligando,
en el que dicha nanopartícula comprende una corteza que se
autoensambla formada por varias subunidades proteínicas y/o
peptídicas, subunidades proteínicas y/o peptídicas las cuales
pueden ser de uno o varios tipos diferentes, ensambladas de una
manera organizada para formar la corteza que tiene una superficie
interna que mira hacia el interior y una superficie externa que mira
hacia el exterior de dicha partícula, en la que la corteza de la
nanopartícula es una partícula de apoferritina recombinante o una
partícula de proteína Dpr/Dps similar a apoferritina recombinante,
en el que
- a)
- uno o varios de los tipos de subunidades tienen uno o varios primeros restos de unión genéticamente fusionados por tipo de subunidad, mirando el resto de unión hacia el exterior de la partícula para la unión de cualquier proteína de unión a ligando específica; y
- b) {}\hskip0.5cm i)
- la partícula contiene dentro de su corteza un marcador y/o
- ii)
- uno o varios de los tipos de subunidades tienen uno o varios segundos restos de unión genéticamente fusionados por tipo de subunidad, mirando el resto de unión hacia el interior y/o el exterior de la partícula que se une a un marcador; y
- c)
- el marcador o marcadores que permiten la detección de una partícula.
La presente invención también proporciona una
nanopartícula, útil para ensayos de bioafinidad de unión a ligando,
que comprende una corteza que se autoensambla formada por varias
subunidades proteínicas y/o peptídicas, subunidades proteínicas y/o
peptídicas las cuales pueden ser de uno o varios tipos diferentes,
ensambladas de una manera organizada para formar la corteza que
tiene una superficie interna que mira hacia el interior y una
superficie externa que mira hacia el exterior de dicha partícula, en
la que la corteza de la nanopartícula es una partícula de
apoferritina recombinante o una partícula proteínica Dpr/Dps
similar a apoferritina recombinante, en la que
- a)
- uno o varios de los tipos de subunidades tienen uno o varios primeros restos de unión genéticamente fusionados por tipo de subunidad, mirando el resto de unión hacia el exterior de la partícula para la unión de cualquier proteína de unión a ligando específica; y
- b) {}\hskip0.5cm i)
- la partícula contiene dentro de su corteza un marcador y/o
- ii)
- uno o varios de los tipos de subunidades tienen uno o varios segundos restos de unión genéticamente fusionados por tipo de subunidad, mirando el resto de unión hacia el interior y/o el exterior de la partícula para la unión a un marcador seleccionado de entre el grupo constituido por una enzima, una proteína luminiscente, una proteína fluorescente o coloreada o una molécula orgánica, y un metal de tierras raras, y
- c)
- el marcador o marcadores permiten la detección de la partícula.
La presente invención también proporciona un
ensayo de bioafinidad que usa la nanopartícula.
La presente invención proporciona además un kit
para un ensayo de bioafinidad, que comprende la nanopartícula.
La Figura 1 muestra la estructura de una
nanopartícula proteínica.
La Figura 2 muestra la detección de la actividad
de unión de una partícula proteínica.
La Figura 3 muestra la estructura del plásmido
pBccpHFI.
La Figura 4 muestra la estructura del plásmido
pPrGHFI.
La Figura 5 muestra la estructura del plásmido
pTSHscHFI.
La Figura 6 muestra la estructura del plásmido
pCBPHFI.
El término "apoferritina" debe entenderse
que consiste en ferritina carente de moléculas en el interior de la
cavidad de una proteína.
La expresión "una partícula similar a
apoferritina" debe entenderse que consiste en una partícula
similar a ferritina deficiente en moléculas en el interior de la
cavidad de la proteína, como se define en las reivindicaciones. La
"partícula similar a apoferritina" típicamente es una
partícula de proteína que se autoensambla, que consiste en un
número específico de subunidades. La partícula es típicamente
esférica. Más abajo se han dado ejemplos de partículas similares a
ferritina.
La expresión "ensayos de bioafinidad" debe
entenderse que incluye ensayos de unión a ligando competitivos y no
competitivos, de una sola etapa y de múltiples etapas, e
inmunoensayos basados en restos de unión a ligandos específicos
individuales o múltiples, por ejemplo anticuerpos monoclonales,
polipéptidos, receptores, anticuerpos recombinantes o fragmentos de
anticuerpos, así como ligantes artificiales como aptámeros y
proteínas modificadas mediante ingeniería.
Los ensayos de bioafinidad incluyen ensayos
heterogéneos y homogéneos. En el ensayo heterogéneo, el analito se
une a una fase sólida, y la partícula se usa para la detección del
analito unido. Una partícula se puede unir directamente al analito o
a una molécula, que está unida al analito. La partícula y el
analito se pueden añadir a la reacción ya sea secuencial o
simultáneamente. En el ensayo homogéneo, el analito se detecta de
la disolución sin la separación de la partícula no unida. El ensayo
homogéneo se puede basar, por ejemplo, en transferencia de energía
de resonancia por fluorescencia (FRET) o transferencia de energía
de resonancia por bioluminiscencia (BRET) (Boute, N, Jockers, R e
Issad, T. 2002. Trends in Pharmacological Sciences
23:351-354). También se puede basar en la
canalización del sustrato, producto o intermedio de una reacción
enzimática (Gibbons, I, Armenta, R, DiNello, RK y Ullman, EF. 1987.
Methods in Enzymology 136:93-103).
El término "marcador" debe entenderse como
una característica detectable midiendo la luminiscencia o
absorbancia, así como otras propiedades ópticas, propiedades
eléctricas, por ejemplo corriente eléctrica o voltaje, o propiedades
magnéticas, que se originan directamente o que resultan
indirectamente de la existencia de la característica. Un ejemplo de
la medida directa de la característica es la medida de la emisión de
fluorescencia de la proteína fluorescente verde usando una luz de
excitación apropiada. Un ejemplo de medida indirecta de la
característica es una medida de la luminiscencia que se origina de
una reacción química catalizada por el marcador enzimático
luciferasa. Un ejemplo de la medida de propiedades eléctricas es,
por ejemplo, la detección de la reacción redox midiendo el voltaje
eléctrico o corriente.
El término "luminiscencia" debe entenderse
que cubre la luminiscencia, bioluminiscencia, quimioluminiscencia,
electroluminiscencia, fotoluminiscencia, fluorescencia,
fluorescencia retrasada o fosforescencia.
La expresión "proteína luminiscente" y
"proteína fluorescente", respectivamente, debe entenderse como
una proteína o enzima, que produce luminiscencia o es fluorescente,
respectivamente, con o sin grupos prostéticos. Un ejemplo de
proteína luminiscente es la enzima luciferasa. Un ejemplo de
proteína fluorescente es la proteína fluorescente verde (GFP).
El término "nanopartícula" debe entenderse
como un reactivo en partículas compuesto de múltiples
"subunidades", cada una compuesta de proteínas o polipéptidos
y, además, opcionalmente de una o múltiples características de las
siguientes: ácidos nucleicos, grupos prostéticos, compuestos
orgánicos e inorgánicos. El material en partículas tiene al menos
un único "resto de unión" sobre la superficie exterior, y el
material en partículas contiene un único "marcador" o múltiples
"marcadores". Las dimensiones del material en partículas
oscilan entre un nanómetro y diez micró-
metros.
metros.
El término "lantánido" y la expresión
"metal de tierras raras" deben entenderse que incluyen
elementos y combinaciones de diferentes elementos de iones de
tierras raras, a partir de los siguientes: neodimio (Nd), samario
(Sm), europio (Eu), gadolinio (Gd), terbio (Tb), disprosio (Dy),
erbio (Er), iterbio (Yb) e itrio (Y).
El término "subunidad" debe entenderse como
una única proteína o polipéptido o complejo de múltiples proteínas
o polipéptidos, compuestos de componentes idénticos o
diferentes.
La expresión "resto de unión" debe
entenderse que cubre anticuerpos monoclonales, polipéptidos,
receptores, anticuerpos recombinantes o fragmentos de anticuerpos,
así como aptámeros artificiales de tipo ligantes y proteínas
manipuladas mediante ingeniería genética, o una forma derivatizada
de cualquiera de las características enumeradas. Un ejemplo de
polipéptido es el péptido de unión a calmodulina (CBP). Un ejemplo
de una característica derivatizada es una secuencia peptídica de
una proteína transportadora de carboxibiotina (BCCP), que se puede
biotinilar in vivo con la enzima biotina ligasa BirA.
El término "enzima" se debe entender como
una proteína o polipéptido o ácido nucleico con actividad
catalítica. Los ejemplos de enzimas son la luciferasa y la galactosa
oxidasa (GAO).
La expresión "galactosa oxidasa (GAO)" debe
entenderse como una enzima con el número de comisión de enzima EC
1.1.3.9.
La expresión "proteína coloreada" debe
entenderse como una proteína o polipéptido, que tiene una absorción
significativa a longitudes de onda visibles,
300-700 nm, con o sin grupos prostéticos.
La expresión "molécula orgánica" debe
entenderse como cualquier compuesto químico que contiene al menos
carbono, con un peso molecular por debajo de 7.000 Daltons. Los
ejemplos de moléculas orgánicas son grupos prostéticos en la
proteína aloficocianina fluorescente.
La expresión "molécula inorgánica" debe
entenderse como cualquier átomo inorgánico, compuesto químico
formado por átomos inorgánicos, o una combinación de átomos de
manera organizada. Un ejemplo de molécula inorgánica es la partícula
semiconductora de CdSe fluorescente.
La expresión "corteza que se autoensambla"
debe entenderse como una estructura en partículas capaz de
ensamblarse ella misma a partir de un conjunto de proteínas de
corteza vitales.
La expresión "proteína de corteza vital"
debe entenderse como una proteína que es necesaria para el
autoensamblado de una entidad en forma de partículas, por ejemplo
una nanopartícula.
El término "GFP" debe entenderse como
proteína fluorescente verde procedente de Aequorea victoria,
sus derivados mutantes o una proteína homóloga procedente de otra
especie.
El término "CRP" debe entenderse como
proteína reactiva C.
El término "TSH" debe entenderse como
hormona estimulante de tiroides.
El término "BCCP" debe entenderse como
proteína transportadora de carboxibiotina.
La expresión "proteína G" debe entenderse
como proteína G procedente de bacterias de los géneros
Streptococcus.
La expresión "proteína A" debe entenderse
como proteína A procedente de bacterias de los géneros
Staphylococcus.
La expresión "proteína L" debe entenderse
como proteína L procedente de bacterias de los géneros
Peptostreptococcus.
Las nanopartículas según la invención pueden
tener propiedades útiles. Éstas pueden ser, pero sin limitarse a,
bajo coste, producción simple, alta estabilidad y una estructura
muy definida. La producción puede ser muy simple, ya que todo lo que
se necesita es típicamente una simple fermentación microbiana con
un pequeño procesamiento aguas abajo.
La nanopartícula según la invención puede tener
un marcador que es una enzima, una proteína luminiscente, una
proteína fluorescente coloreada, o una molécula orgánica, o un
metal de tierras raras. Si el marcador es una proteína, puede ser
una enzima, tal como luciferasa o GAO, o una proteína fluorescente
corno GFP. Si el marcador es un ion de metal de tierras raras,
puede ser un ion de Tb, Eu, Sm o Dy. El marcador también puede ser
una partícula inorgánica, por ejemplo una partícula de CdSe.
La nanopartícula de la invención puede tener,
además de los primeros y segundos restos de unión, terceros restos
de unión. Uno o varios de los tipos de subunidades pueden tener,
por ejemplo, uno o varios terceros restos de unión por tipo de
subunidad, mirando el resto de unión el exterior de la partícula
para la unión a un soporte sólido. La nanopartícula puede tener
también restos de unión adicionales con funciones adicionales.
La corteza de la nanopartícula es una partícula
de apoferritina recombinante o de tipo ferritina.
El primer, segundo, tercer o adicionales restos
de unión pueden ser proteína A, proteína G, proteína L o proteína
de unión a calmodulina (CBP). El primer, segundo, tercero o
adicional resto de unión puede ser un anticuerpo frente a, por
ejemplo, CRP, antígenos del grupo sanguíneo AB0 o TSH. El primer,
segundo, tercer o adicionales restos de unión pueden ser proteína
A, proteína G, proteína L o CBP.
El radio mínimo de la nanopartícula es
típicamente de 10 a 40 nm. El número de subunidades de la corteza
de la nanopartícula es típicamente superior a 8, preferentemente
superior a 20.
La apoferritina tiene un tamaño que da como
resultado una mayor estabilidad coloidal. Consiste solamente en
subunidades proteínicas sin ácidos nucleicos, lo que hace que sea
una partícula biosegura como tal, y también se autoensambla en
disolución.
La Figura 1 muestra la estructura de una
nanopartícula proteínica según la invención. La figura muestra una
corteza proteínica 1, una primera molécula de unión 2 que mira
hacia el exterior de la nanopartícula, un marcador 3 dentro de la
corteza de la nanopartícula, y una segunda o tercera molécula de
unión 4 que mira hacia el exterior de la nanopartícula.
La Figura 2 muestra la descripción de la
actividad de unión de una partícula proteínica. El analito
específico de la molécula de unión a ensayar se marca con una
molécula adecuada para la detección. El analito marcado se hace
reaccionar entonces con partículas, y los complejos de
partícula/analito se separan del analito no unido mediante
filtración en gel, y se mide la señal del marcador.
La Figura 3 muestra la estructura del plásmido
pBccpHFI. Las abreviaturas representan:
Bccp-ferritina = gen que codifica
BCCP-proteína de fusión de cadena ligera de
ferritina humana.
La Figura 4 muestra la estructura del plásmido
pPrGHFI. Las abreviaturas representan: pBR322 ori = origen de la
replicación, Kan gen de resistencia a canamicina, Lacl = gen que
codifica el represor de Lac, Proteína G-ferritina =
gen que codifica la proteína G-proteína de fusión
de cadena ligera de ferritina humana.
La Figura 5 muestra la estructura del plásmido
pTSHscHFI. Las abreviaturas representan:
anti-TSHsc-ferritina = gen que
codifica anticuerpo antiTSHscFV-proteína de fusión
de cadena ligera de ferritina humana.
La Figura 6 muestra la estructura del plásmido
pCBPHFI. Las abreviaturas representan:
CBP-ferritina = gen que codifica
CBP-proteína de fusión de cadena ligera de
ferritina humana.
Todas las manipulaciones del ADN se realizaron
según protocolos conocidos [Sambrook J, Fritsch EF, y Maniatis T,
(1989), Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbour
Laboratory Press, Cold Spring Harbour).
Se usaron en los ejemplos las siguientes cepas
bacterianas: XL-1 Blue, BL21, BL21 (DE3), BL21
(DE3:pLysS), Origami B, Origami B(DE3) y Origami
B(DE3:pLysS) (Stratagene, La Jolla, CA, USA).
La fluorescencia de europio y terbio, resuelta
en el tiempo, se midió con reactivos Delfia de Perkin Elmer Life
Sciences (Boston, MA, USA). La fluorescencia de Alexa Fluor 594
(Molecular Probes Europe, Leiden, Países bajos) se midió como lo
sugiere el fabricante. Todas las medidas se realizaron con un
contador de múltiples marcadores Wallac Victor (Perkin Elmer Life
Sciences, Boston, MA, USA).
\newpage
La actividad de la luciferasa de luciérnaga se
midió midiendo la luminiscencia producida con el kit de ensayo de
luciferasa de BioThema ltd (Haninge, Suecia).
La actividad de la galactosa oxidasa se
determinó midiendo la luminiscencia de la oxidación del luminol
mediante H_{2}O_{2} generado en la reacción de la enzima con 50
mM de galactosa en 100 mM de tampón de fosfato que contiene
1 mM de luminol y 0,4 mM de CuSO_{4} a pH 8,6. Todas las medidas se realizaron en un contador de múltiples marcadores Wallac Victor (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA).
1 mM de luminol y 0,4 mM de CuSO_{4} a pH 8,6. Todas las medidas se realizaron en un contador de múltiples marcadores Wallac Victor (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA).
Se hicieron crecer en 50 ml de medio SB en
agitación, a 37°C, hasta que se alcanzó una OD_{600} de 0,4,
células de Escherichia coli que expresan plásmidos que
codifican una molécula de unión fusionada al término N de
subunidades de ferritina (Ejemplo 8, Ejemplo 9, Ejemplo 10 y
Ejemplo 11). La producción de proteínas se indujo añadiendo IPTG a
la concentración de 0,5 mM, y el cultivo se continuó a 26°C toda la
noche. Después de eso, las células se recogieron mediante
centrifugación a 1500 g durante 10 minutos, y se suspendieron hasta
5 ml de disolución salina tamponada con fosfato (PBS). Las células
se lisaron entonces mediante tratamiento con ultrasonidos, y el
desecho celular se eliminó mediante centrifugación a 5000 g durante
10 minutos. El sobrenadante se filtró entonces con filtros con un
valor de corte de 100 kDa (Pall Life Science, Ann Arbor, MI, USA),
y el retenido se suspendió en PBS.
Las nanopartículas proteínicas se purificaron
mediante filtración en gel con una columna de 10 ml de Sepharose 6B
(Amersham Biosciences Corp. Piscataway, NJ, USA). La columna se
equilibró primeramente usando tampón que contiene 5 mM de
Tris-HCl, 0,01% de Tween-20 y 0,05%
de NaN_{3}, a pH 7,5, con 10 volúmenes de la columna. Se aplicó a
la columna una muestra de 500 \mul, y se recogieron fracciones de
1 ml.
En la Figura 2 se muestra el fundamento del
análisis de la actividad de las moléculas de unión sobre las
superficies de las partículas. El analito específico para la
molécula de unión a ensayar se marcó con una molécula adecuada para
la detección. Los analitos se marcaron según lo siguiente: TSH
(hormona estimulante del tiroides) (Scripps Laboratories, San
Diego, CA, USA), estreptavidina (Perkin Elmer Life Sciences, Boston,
MA, USA) y anticuerpos con europio y calmodulina con Alexa Fluor
594. En el análisis de la actividad de la Proteína G, se usó una
mezcla de cuatro anticuerpos monoclonales marcados con Eu. El
marcaje de las moléculas con Europio se realizó con un kit de
reactivos obtenido de Perkin Elmer Life Sciences (Boston, MA, USA).
La calmodulina marcada se obtuvo de Molecular Probes Leiden, Países
Bajos). El analito marcado se hizo reaccionar con partículas, y los
complejos de partícula/analito se separaron del analito sin unir
mediante filtración en gel, como se describe en el Ejemplo 2. Las
partículas a base de ferritina se produjeron como se describe en el
Ejemplo 1. Como control negativo, se usaron partículas producidas
sin molécula de unión.
La biotinilación in vitro de TSH y
anticuerpos se realizó mediante el kit de reactivos obtenido de
Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA). En el análisis de la
actividad de la Proteína G se usó una mezcla de cuatro anticuerpos
monoclonales marcados con Eu. Las moléculas biotiniladas se
adhirieron a placas de 96 pocillos revestidas con estreptavidina
(Innotrac Diagnostics, Turku, Finlandia), como se describe en el
kit, y los pocillos se lavaron cuatro veces. Después de eso, se
añadieron las partículas a ensayar, y los pocillos se lavaron
nuevamente durante cuatro veces. Después, se añadió el analito
marcado como se describe en el Ejemplo 3. los pocillos se lavaron
cuatro veces, y se midió la señal del marcador.
Las moléculas del analito se marcaron como se
describe en el Ejemplo 3. Las partículas junto con el analito unido
se separaron de las moléculas más pequeñas con filtros de valor de
corte de 100 kDa (Pall Life Science, Ann Arbor, MI, USA). La señal
de la molécula marcada se midió a partir del retenido.
El tampón de reacción usado en la carga de iones
de terbio en ferritina consistió en 50 mM de HEPES, 50 mM de NaCl y
10 mM de TbCl_{3}, a pH 7,0. La ferritina se añadió al tampón en
una concentración de 0,1 \muM, y la reacción se incubó a 37°C
durante 20 h. El terbio sin reaccionar se eliminó mediante
filtración en gel con una columna NAP-5 (Amersham
Biosciences Corp., Piscataway, NJ, USA).
La fracción peletizada de un cultivo bacteriano
de 100 ml producido según el Ejemplo 1 usando BL21 de E.
coli (DE3:pLysS:pBccpHFI) se disolvió hasta 1,5 ml de 8 M de
urea, y se centrifugó a 5000 g. Se añadieron 10 ml de una disolución
que contiene 100 mM de Tris, 150 mM de NaCl a pH 8,5, y la mezcla
se incubó a +4°C toda la noche. Después se añadió HCl hasta que el
pH de la disolución alcanzó 6,0, y la disolución se incubó a 4°C
toda la noche. Se añadieron 0,056 ml de EuCl_{3} 0,01 M, y la
disolución se incubó a 25°C durante 2 h, después de lo cual se
añadió gradualmente tampón (133 mM de Tris, 150 mM de NaCl, pH 9,0)
hasta que el pH alcanzó 8,5. El europio que precipitó se separó
entonces de la ferritina soluble cargada con europio, recogiendo el
sobrenadante después de 10 minutos de centrifugación a 5000 g. Las
partículas cargadas con europio se ensayaron para determinar la
capacidad de unión según el Ejemplo 4, y se detectó el europio
dentro de la ferritina. Como control, se usó la reacción que
contiene exceso de biotina soluble (0,001 mM de biotina). La señal
sin biotina fue de 163 veces la del control, mostrando la unión de
las partículas marcadas con Eu a la fase sólida revestida con
estreptavidina.
El gen que codifica la proteína G estreptocócica
se insertó en un plásmido que produce la cadena ligera de ferritina
humana ligando el fragmento digerido con NheI, obtenido mediante PCR
con los oligonucleótidos 5'-AAGGATCC
CATATGAACCTCTGTAACCATTTCAG (SEC ID n°: 1) y 5'-AACCATGGCATATGGTGACAACTTACAAACT
(SEC ID n°: 2) con ADN genómico de Streptococcus G148 como molde, con el plásmido pET-26(+)rHuLFt digerido con NheI (Grace JE Jr., Van Eden ME, Aust SD. 2000. Archives in Biochemistry and Biophysics 384:116-22). El constructo resultante se transformó en células BL21 de E. coli (DE3:pLysS). La estructura del plásmido resultante, pPrGHFI, se verificó mediante secuenciación parcial. En la Figura 4 se muestra la estructura de pPrGHFI. Las partículas a base de ferritina, que expresan la Proteína G sobre su superficie, se produjeron con células BL21 de E. coli (DE3:pLysS:pPrGHFI) usando el protocolo descrito en el Ejemplo 1. El retenido se suspendió en 1 ml y se diluyó diez veces antes del análisis de la funcionalidad según el Ejemplo 5 usando como marcador anticuerpos marcados con Eu. Las partículas con Proteína G dieron una señal de 5,5 veces en comparación con las partículas producidas con pET-26(+)rHuLFt.
CATATGAACCTCTGTAACCATTTCAG (SEC ID n°: 1) y 5'-AACCATGGCATATGGTGACAACTTACAAACT
(SEC ID n°: 2) con ADN genómico de Streptococcus G148 como molde, con el plásmido pET-26(+)rHuLFt digerido con NheI (Grace JE Jr., Van Eden ME, Aust SD. 2000. Archives in Biochemistry and Biophysics 384:116-22). El constructo resultante se transformó en células BL21 de E. coli (DE3:pLysS). La estructura del plásmido resultante, pPrGHFI, se verificó mediante secuenciación parcial. En la Figura 4 se muestra la estructura de pPrGHFI. Las partículas a base de ferritina, que expresan la Proteína G sobre su superficie, se produjeron con células BL21 de E. coli (DE3:pLysS:pPrGHFI) usando el protocolo descrito en el Ejemplo 1. El retenido se suspendió en 1 ml y se diluyó diez veces antes del análisis de la funcionalidad según el Ejemplo 5 usando como marcador anticuerpos marcados con Eu. Las partículas con Proteína G dieron una señal de 5,5 veces en comparación con las partículas producidas con pET-26(+)rHuLFt.
El gen que codifica el fragmento
anti-TSHscFv se insertó en un plásmido que produce
la cadena ligera de ferritina humana, ligando el fragmento digerido
con NheI, obtenido mediante PCR con los oligonucleótidos
5'-GTTATAT
CAACTGTAAAAGT (SEC ID n°: 3) y 5'-AAC-CATGGCATATGGAAATTGTGCTCACCCA (SEC ID n°: 4) con pTSHscHoc como molde, con el plásmido pET-26(+)rHuLFt digerido con NheI (Grace JE Jr., Van Eden ME, Aust SD. 2000. Archives in Biochemistry Biophysics 384:116-22). El constructo resultante se transformó en células Origami B de E. coli (DE3:pLysS). La estructura del plásmido resultante, pTSHscHFI, se verificó mediante secuenciación parcial. En la Figura 5 se muestra la estructura de pTSHscHFI. Las partículas a base de ferritina, que expresan el anticuerpo anti-TSHscFv sobre su superficie, se produjeron con células Origami B de E. coli (DE3:pLysS:pTSHHFI) usando el protocolo descrito en el Ejemplo 1. El retenido se suspendió en 1 ml y se diluyó cinco veces antes del análisis de la funcionalidad según el Ejemplo 5 usando como marcador TSH marcada con Eu. Las partículas con anti-TSHscFv dieron una señal de 33 veces en comparación con las partículas producidas con pET-26(+)rHuLFt.
CAACTGTAAAAGT (SEC ID n°: 3) y 5'-AAC-CATGGCATATGGAAATTGTGCTCACCCA (SEC ID n°: 4) con pTSHscHoc como molde, con el plásmido pET-26(+)rHuLFt digerido con NheI (Grace JE Jr., Van Eden ME, Aust SD. 2000. Archives in Biochemistry Biophysics 384:116-22). El constructo resultante se transformó en células Origami B de E. coli (DE3:pLysS). La estructura del plásmido resultante, pTSHscHFI, se verificó mediante secuenciación parcial. En la Figura 5 se muestra la estructura de pTSHscHFI. Las partículas a base de ferritina, que expresan el anticuerpo anti-TSHscFv sobre su superficie, se produjeron con células Origami B de E. coli (DE3:pLysS:pTSHHFI) usando el protocolo descrito en el Ejemplo 1. El retenido se suspendió en 1 ml y se diluyó cinco veces antes del análisis de la funcionalidad según el Ejemplo 5 usando como marcador TSH marcada con Eu. Las partículas con anti-TSHscFv dieron una señal de 33 veces en comparación con las partículas producidas con pET-26(+)rHuLFt.
El gen que codifica cbp se construyó en dos
reacciones de PCR. La primera PCR se realizó con los
oligonucleótidos 5'-GAATTCGGATCCTTAGTCGTGCTTG (SEC
ID n°: 5) y 5'-CTGCTGCGAACCGTTTCAAGAAAA
TCAGCTCTTCCGGTGCTGGCGGTATGAGCTCCCAGATTCGTCAGAATT (SEC ID n°: 6), con pET-26(+)
rHuLFt como molde. El producto de la primera PCR se usó como molde de la segunda PCR con los oligonucleótidos 5'-GAATTCGGATCCTTAGTCGTGCTTG (SEC ID n°: 7) y 5'-TAGATATACATATGAAACGCCGTTG
GAAGAAAGCGTTCATCGCTGTTTCTGCTGCGAACCGTTTCAAGAAAAT (SEC ID n°: 8). El segundo producto, digerido con NdeI-BamHI, se ligó con el fragmento de 5,3 kb de pET-26(+)rHuLFt digerido con NdeI-BamHI. El constructo resultante se transformó en células BL21 de E. coli (DE3:pLysS). La estructura del plásmido resultante, pCBPHFI, se verificó mediante secuenciación parcial. En la Figura 6 se muestra la estructura de pCBPHFI. Las partículas a base de ferritina, que expresan cbp sobre su superficie, se produjeron con células BL21 de E. coli (DE3:pLysS:pCBPHFI) usando el protocolo descrito en el Ejemplo 1. El retenido se suspendió en 1 ml y se diluyó cinco veces antes del análisis de la funcionalidad según el Ejemplo 3, con calmodulina marcada con Alexa Fluor 594. Las partículas con cbp dieron una señal de 4,1 veces en comparación con las partículas producidas con pET-26(+)rHuLFt.
TCAGCTCTTCCGGTGCTGGCGGTATGAGCTCCCAGATTCGTCAGAATT (SEC ID n°: 6), con pET-26(+)
rHuLFt como molde. El producto de la primera PCR se usó como molde de la segunda PCR con los oligonucleótidos 5'-GAATTCGGATCCTTAGTCGTGCTTG (SEC ID n°: 7) y 5'-TAGATATACATATGAAACGCCGTTG
GAAGAAAGCGTTCATCGCTGTTTCTGCTGCGAACCGTTTCAAGAAAAT (SEC ID n°: 8). El segundo producto, digerido con NdeI-BamHI, se ligó con el fragmento de 5,3 kb de pET-26(+)rHuLFt digerido con NdeI-BamHI. El constructo resultante se transformó en células BL21 de E. coli (DE3:pLysS). La estructura del plásmido resultante, pCBPHFI, se verificó mediante secuenciación parcial. En la Figura 6 se muestra la estructura de pCBPHFI. Las partículas a base de ferritina, que expresan cbp sobre su superficie, se produjeron con células BL21 de E. coli (DE3:pLysS:pCBPHFI) usando el protocolo descrito en el Ejemplo 1. El retenido se suspendió en 1 ml y se diluyó cinco veces antes del análisis de la funcionalidad según el Ejemplo 3, con calmodulina marcada con Alexa Fluor 594. Las partículas con cbp dieron una señal de 4,1 veces en comparación con las partículas producidas con pET-26(+)rHuLFt.
El gen que codifica el péptido transportador de
carboxibiotina (BCCP) se insertó en el plásmido que produce la
cadena ligera de ferritina humana ligando el fragmento digerido con
NheI, obtenido mediante PCR con los oligonucleótidos
5'-AACCATGGCATATGGAAGCGCCAGCAGCAGC (SEC ID n°: 9) y
5'-AGCCGCTGGTCGTCATC
GAGGGTGGCCATATGCGTT-GCAA (SEC ID n°: 10) con ADN genómico XL-1 Blue de E. coli como molde, con el plásmido pET-26(+)rHuLFt digerido con NheI (Grace JE Jr., Van Eden ME, Aust SD. 2000. Archives in Biochemistry and Biophysics 384:116-22). El constructo resultante se transformó en células BL21 de E. coli (DE3:pLysS). La estructura del plásmido resultante, pBccpHFI, se verificó mediante secuenciación parcial. La estructura de pBccpHFI se muestra en la Figura 3. Las partículas a base de ferritina que expresan BCCP sobre su superficie se produjeron con células BL21 de E. coli (DE3:pLysS:pBccpHFI) usando el protocolo descrito en el Ejemplo 1. El retenido se suspendió en 1 ml y se diluyó mil veces antes del análisis de la funcionalidad según el Ejemplo 4, usando como marcador estreptavidina marcada con Eu. Las partículas producidas con pBccpHFI dieron una señal de 326 veces en comparación con las partículas producidas con pET-26(+)rHuLFt.
GAGGGTGGCCATATGCGTT-GCAA (SEC ID n°: 10) con ADN genómico XL-1 Blue de E. coli como molde, con el plásmido pET-26(+)rHuLFt digerido con NheI (Grace JE Jr., Van Eden ME, Aust SD. 2000. Archives in Biochemistry and Biophysics 384:116-22). El constructo resultante se transformó en células BL21 de E. coli (DE3:pLysS). La estructura del plásmido resultante, pBccpHFI, se verificó mediante secuenciación parcial. La estructura de pBccpHFI se muestra en la Figura 3. Las partículas a base de ferritina que expresan BCCP sobre su superficie se produjeron con células BL21 de E. coli (DE3:pLysS:pBccpHFI) usando el protocolo descrito en el Ejemplo 1. El retenido se suspendió en 1 ml y se diluyó mil veces antes del análisis de la funcionalidad según el Ejemplo 4, usando como marcador estreptavidina marcada con Eu. Las partículas producidas con pBccpHFI dieron una señal de 326 veces en comparación con las partículas producidas con pET-26(+)rHuLFt.
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<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaggatccca tatgaacctc tgtaaccatt tcag
\hfill34
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<210> 2
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<211> 31
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador
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<400> 2
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaccatggca tatggtgaca acttacaaac t
\hfill31
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<210> 3
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador
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<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskipgttatatcaa ctgtaaaagt
\hfill20
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<210> 4
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<211> 31
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador
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<400> 4
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<211> 25
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador
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<400> 5
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\hfill25
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<210> 6
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<211> 72
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<212> ADN
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<213> Secuencia artifical
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<220>
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<223> cebador
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<400> 6
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<211> 25
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<400> 7
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\hfill25
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<210> 8
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<211> 73
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador
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<400> 8
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<210> 9
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<211> 31
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<400> 9
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\hskip-.1em\dddseqskipaaccatggca tatggaagcg ccagcagcag c
\hfill31
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<210> 10
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador
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<400> 10
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagccgctggt cgtcatcgag ggtggccata tgcgttgcaa
\hfill40
Claims (24)
1. Uso de una nanopartícula en un ensayo de
bioafinidad de unión a ligando, en el que dicha nanopartícula
comprende una corteza que se autoensambla formada de varias
subunidades proteínicas y/o peptídicas, subunidades proteínicas y/o
peptídicas las cuales pueden ser de uno o varios tipos diferentes,
ensambladas de manera organizada para formar la corteza que tiene
una superficie interna que mira hacia el interior y una superficie
externa que mira hacia el exterior de dicha partícula, en el que la
corteza de la nanopartícula es una partícula de apoferritina
recombinante o una partícula proteínica de Dpr/Dps de tipo
apoferritina recombinante, en el que
- a)
- uno o varios de los tipos de subunidades tienen uno o varios primeros restos de unión genéticamente fusionados por tipo de subunidad, mirando el resto de unión hacia el exterior de la partícula para la unión de cualquier proteína de unión a ligando específica; y
- b) {}\hskip0.5cm i)
- la partícula contiene dentro de su corteza un marcador y/o
- ii)
- uno o varios de los tipos de subunidades tienen uno o varios segundos restos de unión genéticamente fusionados por tipo de subunidad, mirando el resto de unión el interior y/o el exterior de la partícula que se une a un marcador; y
- c)
- el marcador o marcadores permiten la detección de la partícula.
2. Uso según la reivindicación 1,
caracterizado porque la corteza de la nanopartícula es una
proteína Dpr/Dps seleccionada de entre el grupo constituido por
proteínas de Dpr/Dps producidas por Streptococci, Listeria,
Helicobacter y Escherichia.
3. Uso según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque el marcador se selecciona de entre el
grupo constituido por una enzima, una proteína luminiscente, una
proteína fluorescente coloreada o una molécula orgánica, y un metal
de tierras raras.
4. Uso según la reivindicación 3,
caracterizado porque el marcador es una proteína,
preferentemente una enzima seleccionada de entre el grupo
constituido por luciferasa, GAO y GFP.
5. Uso según la reivindicación 3,
caracterizado porque el marcador es un lantánido,
preferentemente seleccionado de entre el grupo constituido por Tb,
Eu, Sm y Dy.
6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores, caracterizado porque uno o varios de los tipos
de subunidades tienen uno o varios terceros restos de unión
genéticamente fusionados por tipo de subunidad, mirando el resto de
unión el exterior de la partícula para la unión a un soporte
sólido.
7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores, caracterizado porque se selecciona un primer
resto de unión a partir del grupo constituido por proteína A,
proteína G, proteína L, péptido de unión a calmodulina (CBP) y
proteína transportadora de carboxibiotina (BCCP).
8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores, caracterizado porque un primer resto de unión es
un anticuerpo frente a uno de los miembros del grupo constituido
por CRP, antígenos del grupo sanguíneo AB0 o TSH.
9. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores, caracterizado porque un segundo resto de unión
es un resto de unión seleccionado de entre el grupo constituido por
proteína A, proteína G, proteína L, péptido de unión a calmodulina
(CBP) y proteína transportadora de carboxibiotina (BCCP).
10. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores, caracterizado porque un segundo resto de unión
es un anticuerpo frente a uno del grupo constituido por CRP,
antígenos del grupo sanguíneo AB0 y TSH.
11. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores, caracterizado porque el radio mínimo de la
nanopartícula es de 10 a 40 nm.
12. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores, caracterizado porque el número de subunidades es
superior a 8, preferentemente superior a 20.
13. Nanopartícula, útil para ensayo de
bioafinidad de unión, que comprende una corteza que se autoensambla
formada por varias subunidades proteínicas y/o peptídicas,
subunidades proteínicas y/o peptídicas las cuales pueden ser de uno
o varios tipos diferentes, ensambladas de manera organizada para
formar la corteza que tiene una superficie interna que mira hacia
el interior y una superficie externa que mira hacia el exterior de
dicha partícula, en el que la corteza de la nanopartícula es una
partícula de apoferritina recombinante o una partícula proteínica
de Dpr/Dps de tipo apoferritina recombinante, en la que
- a)
- uno o varios de los tipos de subunidades tienen uno o varios primeros restos de unión genéticamente fusionados por tipo de subunidad, mirando el resto de unión el exterior de la partícula para la unión de cualquier proteína de unión a ligando específica; y
- b){}\hskip0.5cm i)
- la partícula contiene, dentro de su corteza, un marcador seleccionado de entre el grupo constituido por una enzima, una proteína luminiscente, una proteína fluorescente o coloreada, o una molécula orgánica, y un metal de tierras raras, y/o
- ii)
- uno o varios de los tipos de subunidades tienen uno o varios segundos restos de unión genéticamente fusionados por tipo de subunidad, mirando el resto de unión el interior y/o el exterior de la partícula que se une a un marcador seleccionado de entre el grupo constituido por una enzima, una proteína luminiscente, una proteína fluorescente o coloreada, o una molécula orgánica, y un metal de tierras raras; y
- c)
- el marcador o marcadores permiten la detección de la partícula.
14. Nanopartícula según la reivindicación 13,
caracterizada porque los primeros restos de unión se
seleccionan de entre el grupo constituido por en anticuerpos
monoclonales, polipéptidos, receptores, anticuerpos recombinantes o
fragmentos de anticuerpos, aptámeros, proteínas manipuladas
mediante ingeniería genética, y sus derivados.
15. Nanopartícula según la reivindicación 14,
caracterizada porque el marcador es una proteína,
preferentemente una enzima seleccionada de entre el grupo
constituido por luciferasa, GAO y GFP.
16. Nanopartícula según la reivindicación 13,
caracterizada porque el marcador es un lantánido,
seleccionado preferentemente de entre el grupo constituido por Tb,
Eu, Sm y Dy.
17. Nanopartícula según la reivindicación 13,
caracterizada porque una o varios de los tipos de
subunidades tienen uno o varios de terceros restos de unión
genéticamente fusionados por tipo de subunidad, mirando el resto de
unión el exterior de la partícula para la unión a un soporte
sólido.
18. Nanopartícula según la reivindicación 14,
caracterizada porque se selecciona un primer resto de unión
del grupo constituido por proteína A, proteína G, proteína L,
péptido de unión a calmodulina (CBP) y proteína transportadora de
carboxibiotina (BCCP).
19. Nanopartícula según la reivindicación 14,
caracterizada porque un primer resto de unión es un
anticuerpo frente a uno de los miembros del grupo constituido por
CRP, antígenos del grupo sanguíneo AB0 y TSH.
20. Nanopartícula según cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 19, caracterizada porque un segundo
resto de unión es un resto de unión seleccionado de entre el grupo
constituido por proteína A, proteína G, proteína L, proteína de
unión a calmodulina (CBP) y proteína transportadora de
carboxibiotina (BCCP).
21. Nanopartícula según cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 20, caracterizada porque un segundo
resto de unión es un anticuerpo frente a uno del grupo constituido
por CRP, antígenos del grupo sanguíneo AB0 y TSH.
22. Nanopartícula según cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 21, caracterizada porque el radio
mínimo de la nanopartícula es de 10 a 40 nm.
23. Nanopartícula según cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 22, caracterizada porque el número de
subunidades es superior a 8, preferentemente superior a 20.
24. Kit para un inmunoensayo de unión a ligando,
que comprende la nanopartícula según cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 23.
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