CN101287989A - 一种丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种双抗原夹心法检测HCV抗体的试剂盒及其制备方法，其检测形式为“支持物－第一抗原－待测HCV抗体－第二抗原－标记物－可识别信号”。该试剂盒及其制备方法的特征在于，其中的第二抗原为HCV蛋白与标签的结合物。

Description

一种丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒及其制备方法 技术领域
本发明涉及免疫检测领域， 具体来说， 本发明涉及 HCV 抗体检测试 剂盒及其制备方法。 背景技术
丙型肝炎是由丙型肝炎病毒 (HCV)引起的严重肝脏疾病。 全世界现有 1.7亿的 HCV感染者， 我国的感染人数超过了 4000万， 在 HCV感染者中 约有 50-85%会发展成慢性肝炎， 约 10-15%会发展为肝硬化。 丙型肝炎病 毒给人类健康带来极大的危害， 给社会经济造成极大的负担。
自 1989年 Choo等成功克隆 HCV基因以来， HCV的诊断检测技术已 取得了巨大进展。 目前检测丙型肝炎主要有三个途径： 用 PCR检测 HCV RNA; 用单克隆抗体检测 HCV抗原； 用酶联免疫吸附测定法 (ELISA)、 蛋 白印染法等检测 HCV抗体。
ELISA检测 HCV抗体的试剂已经发展了三代， 笫一代 ELISA-1试剂 盒于 1990年由英国 Ortho诊断公司开发， 抗原是利用美国 Chiron公司提 供的 HCV NS4基因重组抗原 C100-3, 但是其敏感性及特异性不理想。 之 后笫二代 ELISA-2取代了 ELISA-1， ELISA-2试剂盒由英国 Ortho诊断公 司和美国 Abbott诊断公司分别开发， 使用抗原包括 CO E、 NS3和 NS4 抗原， 其敏感性和特异性有所改善， 在慢性丙肝病人中用 ELISA-2检测， 其阳性率为 92-95%。 由于采用 CORE及 NS3抗原使 HCV血清阳转的平均 窗口期由 16周缩短为 10周。 笫三代 ELISA-3试剂盒由英国 Ortho诊断公 司、 美国 Abbott诊断公司、 法国 Sanofi诊断公司率先开发生产， 使用抗原 包含 CORE、 NS3、 NS4和 NS5抗原。 采用 ELISA-3检测献血员及高危人 群的 HCV, 其敏感性均有增加， 约为 97%, HCV血清阳转的平均窗口期 缩短至 7-8周。
由于 ELISA在诊断上具有易于自动化、 使用方便、 重复性好、 成本低
确认本 并且有利于实验数据的分析整理和保存， 所以目前国际上筛查 HCV抗体 的商品化试剂主要是利用间接法开发的笫二代或笫三代 ELISA试剂盒， 虽 然 ELISA试剂已经经过了三代改进， 但仍有不足之处。 主要体现为漏检、 假阳性、 不确定结果仍较多。 这主要是由于间接法试剂在方法学上存在的 缺陷引起的， 具体表现如下：
1. 特异性差： 由于间接法采用了非特异性识别的笫二抗体 (以下简称 二抗)标记， 这种非特异性的识别导致其较低的特异性；
2. 灵敏度低： 由于特异性差， 试剂盒中包被抗原、 标记二抗的使用浓 度被迫降低， 待测样品量减少， 样品稀释倍数增加又进一步导致了灵敏度 的降低；
3. 窗口期长： 一般使用的二抗为抗 IgG抗体， 只能检测抗体中的 IgG 组分， 对其它类型抗体尤其是早期出现的 IgM抗体无法检出， 致使灵敏度 低并且延长了窗口期。
目前， 丙型肝炎的^ Γ血后感染占输血后肝炎病例的 70%, 而在丙型肝 炎感染者中更有 80-90%是属于输血后感染。 这在很大程度上是由于现有间 接法试剂的上述缺陷造成的， 因此需要开发出高灵敏度、 高特异性的 HCV 抗体诊 试剂。
双抗原夹心法是利用标记抗原代替间接法中的标记二抗， 从方法学上 解决了间接法的上述缺陷。 但是， 在双抗原夹心方法广泛应用于抗体检测 的今天， 之所以筛查 HCV 抗体的试剂盒仍没有采用较为先进的双抗原夹 心法， 主要是因为：
1. HCV蛋白标记后活性损失问题
目前抗原标记主要将标记物如辣根过氧化物酶 (HRP)直接标记到抗原 上， 但这种方法在 HCV抗原的标记过程中遇到了问题。 首先， 由于 HCV 的主要抗原表位区段 NS3抗原是对构象依赖性较强的抗原， 当被分子量较 大的 "柔性" 标记物如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记后， 其构象变化 较大，且活性表位不易暴露，标记后 NS3抗原的活性大为降低； 其次， HCV 的另一主要抗原表位区段 CORE的主要活性区富含赖氨酸， 这些赖氨酸对 CORE 的活性至关重要， 而赖氨酸侧链上的游离氨基又往往是标记反应 (如 NaI04氧化法标记 HRP)的主要靶基团， 所以标记后 CORE抗原的活性更是 大大降低， 最终使试剂盒的灵敏度还不如间接法， 存在着严重漏检。
2. 高本底问题
CORE 区抗原有很强的体内或体外的同源及异源结合能力 (Matsumoto,
M.等， Virology, 218:P43-51, 1996; Kunkel, M.等， Virology, 294: P239-245, 2002; Majeau, N.等， Journal of General Virology, 85: P971-981, 2004), 在 双抗原夹心法中标记抗原 (笫二抗原)利用此种结合能力与包被抗原 (第一抗 原）同源结合造成试剂盒的高本底。
目前国内外也有不少关于双抗原夹心法 HCV抗体检测试剂的报道， 但均存在一定的缺陷， 具体如下：
公开号为 CN 1548958A的专利申请介绍的方法没有考虑到外源蛋白的 大小对维持 HCV抗原尤其是 NS3抗原活性的重要性而没有对其桥蛋白进行 筛选， 即没有使用分子量尽可能小的桥蛋白以保证 HCV抗原的活性， 进而 保证试剂盒的灵敏度； 其次， 没有在包被液中加入一定比例的巯基试剂（如 β -巯基乙醇或二硫苏糖醇等）或变性剂（如十二烷基磺酸钠) (详见专利 US6270960和 US6261764), 没有在封闭液中加入一定比例的巯基试剂， 从 而导致包被抗原的活性无法完全体现， 致使试剂盒的灵敏度降低； 笫三， 没有在笫二抗原的稀释液中加入一定比例的巯基试剂， 从而导致笫二抗原 的活性无法完全体现，致使试剂盒的灵敏度降低；笫四，没有提出针对 CORE 区抗原的各种结合倾向而引起的高本底问题的解决办法。 另外， 其实施例 采用的 pET-32a(+)空载体表达的蛋白含有 His Tag, 其多克隆抗体标记物中 也就含有抗 His Tag抗体标记物， 而其包被抗原含有 His Tag, 这样抗 His Tag 抗体标记物可以直接与包被抗原结合而显色， 使得所有血清无论阴性、 阳 性均会呈现阳性反应。
李保昌等， 中国实验血液学杂志， 12(3)： P359-362, 2004介绍的方法 虽然研究了生物素化 HCV抗原， 但该文章仅停留在抗原水平的研究上， 没 有提出对双抗原夹心法 HCV抗体诊断试剂在开发中会遇到的上 体题的具 体解决办法。 而且该文章中利用大肠杆菌体内原始的生物素-乙酰辅酶 A羧 化酶合成酶对 HCV蛋白进行生物素化的方法生物素化效率很低， 大约仅为 10%左右 (Paul, A.S.等， Nucleic Acids Research, 26(6): P1414-1420, 1998; Tsao, K丄.等， Gene, 169: P59-64, 1996), 为了尽可能消除作为笫二抗原参加反应 时未生物素化抗原对已生物素化抗原的竟争对灵敏度的影响， 此种生物素 化方法必须另外分离出已生物素化抗原， 这就使得生物素化抗原得率低， 并增加了后续纯化的难度和成本。
专利 US6096319、 US6270960 , US6306579虽然提到了 HCV双抗原桥 式夹心法， 但并未提出对上述难点的实质性解决办法， 只提出了将在其它 领域应用已较为成熟的各种双抗原夹心诊断方法应用于 HCV诊断上的理 论。
专利 US6613530提到 HCV双抗原桥式夹心法， 其所用的抗原（包括笫一 抗原和笫二抗原)为 HCV蛋白与载体蛋白的偶联物， 分子量较大的蛋白载体 (BSA, 69KD; β -Gal, 465KD; Bovine-Fab , 75KD)只适用于 HCV短肽的 偶联,构象依赖性 HCV抗原尤其是 NS3区段抗原采用此方法时其活性明显降 低， 进而影响试剂盒的灵敏度。
曹诚等, 中华医学检验杂志， 19(4): P205-207 , 1996所提到的 HCV双 抗原夹心法是将在其它领域应用已较为成熟的双抗原夹心诊断方法直接移 植于 HCV诊断上的初步尝试， 由于没有考虑到 HCV蛋白的上述持殊性， 其 采用将 HRP直接标记到未经改造的 HCV蛋白的游离赖氨酸上， 使得标记抗 原活性大幅下降， 制成的试剂盒存在着严重的漏检。
本发明是利用双抗原夹心法开发的 HCV抗体检测试剂盒， 从方法学 角度在根本上克服了间接法的种种弊端， 也解决了目前双抗原夹心法试剂 盒存在的技术问题， 开发出了可以应用于临床检测的 HCV抗体检测试剂 盒， 为 HCV的筛查提供了更有力的工具。 发明的目的
本发明的目的在于解决 HCV双抗原夹心法试剂盒中因 CORE 区抗原 引起的高本底问题， 解决 HCV蛋白标记后的活性损失问题， 进一步结合 生物素 -亲和素放大系统， 提供灵敏度、 特异性均较目前商品化试剂有较大 提高的双抗原夹心法 HCV抗体检测试剂盒。 发明概述
本发明提供一种 HCV抗体检测试剂盒， 该试剂盒以 "支持物-笫一抗 原 -待测 HCV抗体-笫二抗原-标记物-可识别信号" 形式完成检测， 其中笫 二抗原与标记物之间进行一步或多步结合反应， 该试剂盒的特征在于所述 笫二抗原为 HCV蛋白与标签的结合物。
在本发明实施方案中， 其中所述标签为肽类标签或非肽类标签。
在本发明进一步的实施方案中， 所述非肽类标签为化合物、.半抗原、 维生素、 类固醇、 染料、 激素、 抗生素、 核酸、 或它们与肽或蛋白的组合 物。
在本发明优选实施方案中， 所述化合物为二硝基苯酚、 溴脱氧尿苷； 维生素为生物素或其衍生物； 类固醇为地高辛； 染料为吖啶酯、 罗丹明、 丹横醜氯、 焚光素、 Oregon Green、 Lucifer yellow > Alexa Fluor、 Cascade Blue。
在本发明进一步优选实施方案中， 所述非肽类标签为生物素或其衍生 物、 生物素或其衍生物与肽或蛋白的组合物。
在本发明进一步实施方案中， 所述肽类标签为含有 His Tag、 T7 Tag, S Tag、 Flag Tag, HA Tag或 HCV肽片段的肽或蛋白。
在本发明优选实施方案中， 所述肽类标签为外源蛋白时， 其分子量小 于 30 D, 优选小于 20KD， 进一步优选小于 15KD， 再进一步优选小于 10KD, 更进一步优选小于 5KD。
在本发明优选实施方案中， 所述肽类外源蛋白标签位于 HCV蛋白 的 N端时， 分子量小于 5KD; 位于 HCV蛋白的 C端时， 分子量小于 20KD。
在本发明实施方案中， 所述笫一抗原和笫二抗原包括 HCV NS3 及 CORE蛋白区段， 而且 NS3蛋白区段为从 a.a.1201士 5处起始至 a.a.l465±8 处终止的任一区段， 该蛋白区段可以存在突变而保持其抗原性不变； CORE 蛋白为含有 a.a.10-17全序列的区段， 进一步为含有 a.a.7-21全序列的区段， 更进一步为含有 a.a.6-23全序列的区段， 而且不包括 a.a.29-90全序列的区 段， 进一步为不包括 a.a.29-70全序列的区段， 再进一步为不包括 a.a.29-59 全序列的区段， 更进一步为不包括 a.a.32-48全序列的区段， 该蛋白区段可 以存在存在突变而保持其抗原性和结合能力不变。
在本发明优选实施方案中， 所述笫一抗原的 CORE蛋白区段为 a.a.2- 59; 所述笫二抗原的 CORE蛋白区段为 a.a.1-28; 所述笫一抗原和笫二抗 原的 NS3蛋白区段均为 a.a.l201-1465。
在本发明的实施方案中， 所述标签的结合配偶体为标签的抗体或受 体。
在本发明进一步实施方案中， 当选用生物素或其衍生物、 生物素或其 衍生物与肽或.蛋白的结合物为标签时， 其结合配偶体为亲和素、 链霉亲和 素、 中性链亲和素、 它们的类似物、 抗生物素或其衍生物抗体;. 当选用肽 类标签时， 其结合配偶体为抗该肽或蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体。
本发明还提供一种制备所述试剂盒的方法， 其中包括 HCV蛋白与标 签结合的步骤， 所述结合方法包括：
1. HCV蛋白的生物素化： 包括体内酶促生物素化、 体外生物素化、 间接生物素化、 氨基酸的生物素化；
2. HCV蛋白与肽的嵌合表达。
在本发明进一步的实施方案中， 所述体内酶促生物素化的方法为： 使编码 HCV蛋白与生物素接受蛋白的嵌合基因（简称 X)同编码生物素 -乙酰辅酶 A羧化酶合成酶的基因（简称 Y)共同在宿主体内表达， 在表达宿 主体内利用表达的生物素-乙酰辅酶 A羧化酶合成酶通过体内酶促反应使嵌 合基因 X编码蛋白的特定赖氨酸结合上生物素， 具体表达方法包括：
1) 多顺反子表达；
2) 共转化表达； 3) 多启动子表达；
4) 单顺反子表达；
5) 与宿主的生物素-乙酰辅酶 A羧化酶合成酶基因共表达。
在本发明其它实施方案中， 所述体外生物素化为通过偶联活化生物素 或体外酶促反应来完成对 HCV蛋白的生物素化。
在本发明实施方案中， 所述生物素接受蛋白为生物素羧基载体蛋白家 族或其功能区段、 SEQ ID N0.3多肽或其功能类似物。
在本发明实施方案中， 所述生物素-乙酰辅酶 A羧化醇合成酶是分类 号为 EC6.3.4.15的酶或其功能区段、 功能类似物。 附图简述
图 1为标记物直接识别笫二抗原的检测方法示意图。
图 2为标记物间接识别笫二抗原的检测方法示意图。
图 3为表达载体 P2的质粒图谱。
图 4为笫一抗原的表达质粒 P2-HCVAgl的质粒图谱。
图 5为第二抗原的双顺反子表达表达质粒 P2-X-Y的质粒图谱。 发明内容
定义
本发明中使用的术语除非另有说明， 否则具有以下含义。
本发明中使用的术语 "第一抗原" 为包被抗原。
本发明中使用的术语 "第二抗原" 是 HCV蛋白与标签的结合物， 笫 二抗原可以为一个或几个， 其各自的标签满足本发明限定条件。
本发明中使用的术语 "标记物" 为标记有可检测物质的物质， 其中可 检测物质包括但不限于酶， 例如辣根过氧化物酶、 减性磷酸酶、 β-半乳糖 苷酶等； 化学发光物质， 例如吖啶酯； 荧光物质， 例如异硫氰酸荧光素、 铕、 铕纳米颗粒等； 放射性物质， 例如 1251等； 胶体， 例如胶体金、 乳胶 等， 本发明的可检测物质可以是上述一个或几个物廣的组合。 本发明中使用的术语 "外源蛋白" 为与 HCV蛋白嵌合表达的非 HCV 编码蛋白的肽或蛋白质部分。
本发明中使用的术语 "生物素或其衍生物" 为生物素或其功能性衍生 物， 包括但不限于 D-生物素、 活化生物素、 生物胞素、 乙二胺生物素、 尸 胺生物素、 脱硫生物素等， 其共同特征为含有可与亲合素结合的咪唑酮环 或其功能类似结构。
本发明中使用的术语 "肽" 和 "蛋白" 具有本领域技术人员所理解的 一般含义， 而且可以互换使用。
本发明中使用的术语 "CORE" 和 "NS3" 分别指 HCV核心蛋白和非 结构蛋白 3。 其中前者指 HCV全基因编码蛋白的 a.a.l-191(a.a.为氨基酸的 简写， 本发明中 a.a.A-B表示 HCV全基因编码蛋白的笫 A个氨基酸到笫 B 个氨基酸的区段,其中 B>A)区段， 后者指 HCV全基因编码蛋白的 a.a.1027- 1657区段。
本发明中使用的术语 "生物素接受蛋白" （Biotin Acceptor Protein)为生 物素凝基载体蛋白 (biotin carboxyl-carrier protein, BCCP)家族或其功能区 段、 SEQ ID N0.3 多肽或其功能类似物（详见 Peter, J.S.等， Biotechnology,ll： 1138-1143,1993), 本发明选择的生物素接受蛋白可以为上 述肽或蛋白的一个、 几个或几个的组合。
本发明中使用的术语 "生物素-乙酰辅酶 A羧化酶合成酶" （Biotin- [acetyl-CoA-carboxylase] synthetase)包括分类号为 EC6.3.4.15的酶或其功能 区段、 功能类似物。
本发明中使用的术语 "结合配偶体" 为可以和标签相互结合的配体或 受体， 当选用非肽类标签时， 其结合配偶体为该标签的特异性受体或抗体， 如选用生物素或其衍生物或它们与肽或蛋白的结合物为标签时， 其结合配 偶体为亲和素、 链尊亲和素、 中性链亲和素、 它们的类似物、 抗生物素或 其衍生物抗体； 当选用肽类标签时， 其结合配偶体为抗该肽或蛋白的单克 隆抗体或多克隆抗体。
本发明中使用的术语 "高本底" 指 HCV P月性样品的检测 OD值超出 本发明试剂盒的正常本底范围， 甚至可以达到正常情况下强阳性样品的检 测 OD值。
本发明中使用的术语 "柔性" 和 "刚性" 主要指物质的结构易变性， 如 HRP等大分子蛋白质与 HCV抗原交联时， 其会与 HCV抗原 "纠缠" 在一起致使后者结构改变进而影响其活性， 此类物质即为 "柔性" 物质； 相反， 如聚苯乙烯、 胶体金等与 HCV抗原交联时， 双方并不会 "纠缠" 在一起， 这时 HCV抗原的构象变化不大， 此类物质即为 "刚性，， 物质。
本发明中使用的术语 "表达宿主" 包括原核、 真核表达系统宿主， 包 括但不限于细菌， 例如大肠杆菌、 枯草杆菌等； 酵母例如甲醇酵母、 酿酒 酵母等； 真核细胞例如昆虫细胞、 哺乳动物细胞等； 病毒； 组织、 器官或 生物活体反应器等。
本发明中使用的术语 "支持物" 包括但不限于聚苯乙烯、 聚乙烯、 纤 维素、 硝酸纤维素、 醋酸歼维素、 硅化物等材料制备的酶标板、 小球、 微 粒子、 玻片、 芯片、 塑料、 薄膜等。
本发明中使用的术语 "待检测样品" 为所有可被 HCV感染的物种的 体液， 包括但不限于全血、 血清、 血浆、 分泌物、 尿液、 唾液、 脑脊液、 淋巴液、 组织液， 粪便浸出液， 细胞培养液或细胞、 組织、 器官匀浆液 等。 标签
本发明使用术语 "标签" 为与 HCV蛋白连接的并且可与结合配偶体 特异性结合而引出后续检测反应过程的物质， 包括肽类标签和非肽类标签。
所述肽类标签为肽或蛋白 ， 包括包含有 His Tag, T7 Tag, S Tag, Flag Tag, HA Tag (有多种肽可以选择， 详见 Abeam公司 epitope tags章节的产 品介绍 http://www.abcam.com)或笫一抗原中所没有的且其结合能力不至于 引起高本底的 HCV肽片段等所有存在或可制备出相应结合配偶体的肽或 蛋白， 其主要特征为 "可与结合配偶体特异性结合而引出后续检测反应过 程的" 核心物质为肽或蛋白。 所述 His Tag指 6个连续组氨酸， 即 6xffis。 所述肽类标签为外源蛋白时， 其分子量小于 30 D, 优选小于 20KD, 进一步优选小于 15KD,再进一步优选小于 10KD,更进一步优选小于 5 D。
所述肽类外源蛋白标签位于 HCV蛋白的 N端时， 分子量小于 5KD; 位于 HCV蛋白的 C端时， 分子量小于 20KD。
所述非肽类标签为化合物 (如二硝基苯酚、 溴脱氧尿苷)、 半抗原、 维 生素 (如生物素或其衍生物)、 类固醇 (如地高辛)、 染料 (如吖啶酯、 罗丹明、 丹横醜氯、 荧光素、 Oregon Green, Lucifer yellow, Alexa Fluor ^ Cascade Blue), 激素、 抗生素、 核酸等 (有多种非肽类物质可以选择， 详见 Invitrogen 公司分子探针的产品介绍 http：〃 ww.probes.com) 所有存在或可制备出相应 结合配偶体的非肽类物质。 其主要特征为 "可与结合配偶体特异性结合而 引出后续检测反应过程的" 核心物质为非肽或蛋白类物质。
标签可以是一个、 几个或几个的组合， 可以在 HCV抗原的 N端、 C 端、 两端或内部。
标签应尽可能小， 以减少对 HCV抗原活性的损伤。 本发明试剂盒的制备、 检测原理
本发明试剂盒以 "支持物 -笫一抗原 -待测 HCV抗体-笫二抗原 -标记物- 可识别信号" 形式完成检测， 其中笫二抗原与标记物之间进行一步或多步 结合反应 , 其主要制备及检测流程如下：
包被： 将笫一抗原包被到支持物上。
封闭： 将支持物上没有包被上笫一抗原的空位点用惰性蛋白封闭， 以 免后续反应中的非特异性吸附。
笫一抗原捕获抗体:加入待测样品后孵育，笫一抗原捕获样品中的 HCV 抗体。
抗体捕获笫二抗原： 加入笫二抗原后孵育， HCV抗体捕获笫二抗原。 检测： 利用标签通过一步或几步孵育引入标记物进行检测。
本发明试剂盒主要优势如下：
1. 实现 HCV蛋白的高活性标记： 针对 HCV蛋白标记后的活性损失 问题， 特别优选采用了生物素化 HCV蛋白或 HCV蛋白与肽类标签嵌合表 达的方法来完成 HCV蛋白的间接标记， 由于生物素类或肽类标签分子量 小， 间接标记后对抗原的空间结构影响很小， 而且通过酶促反应的生物素 化可以将生物素定点加到与 HCV蛋白嵌合的生物素接受蛋白的特定赖氨 酸上， 肽通过与 HCV蛋白的嵌合表达也可以定向地插入 HCV蛋白的特定 位置， 这样就更能保存 HCV笫二抗原的活性。
2. 解决双抗原夹心法 HCV抗体诊断试剂的高本底： 针对 CORE 区 抗原的上述结合特性， 筛选出了活性高、 非特异性结合能力弱的 CORE 区 抗原区段， 解决了高本底问题。
3. 生物素 -亲合素放大系统： 提高灵敏度
亲合素与生物素之间的亲和力极强，二者结合的亲和常数 (Ka: lO^mol'1) 比抗原与抗体的亲和常数 (Ka: lO^ mol-1)至少高 1 万倍以上， 因此二者能 快速结合， 而且反应不受外界干扰。 该系统是 70年代后期应用于免疫学的 高效生物反应放大系统， 本发明试剂盒的优选制备方法是将链霉亲合素进 行辣根过氧化物酶的标记， 采用该标记物识别生物素化的 HCV笫二抗原， 即借助生物素-亲合素放大系统作为桥梁来实现标记物对笫二抗原的间接识 别， 该系统的介入使本发明试剂盒的灵敏度大大提高。
4. 三步特异性识别提高特异性： 本发明检测过程中的三步反应均为 特异性识别反应： 样品中 HCV抗体对笫一抗原的特异性识别； 笫二抗原 对 HCV抗体的特异性识别； 标记物对笫二抗原的特异性识别。 这使得本 发明试剂的特异性相对于两步特异性识别的传统双抗原夹心法试剂有了明 显改善， 相对于只有一步特异识别的间接法试剂更是有了极大的提高。
另外， 本发明的检测原理适用于酶联免疫、 发光免疫、 荧光免疫、 放 射免疫、 微粒子免疫或金标免疫等多种免疫检测方法， 应用范围广泛。 第一抗原与第二抗原中的 HCV蛋白优选区段
本发明中使用的 HCV基因型为 HCV lb, 针对不同地区的基因型分布 情况可以釆用不同基因型的基因片断或几种基因型基因片断的组合， 但选 用的氨基酸区段不变， 此点本领域普通技术人员按现有常规方法可以推导。 在 HCV蛋白中， CORE及 NS3为 HCV主要抗原表位区段， 二者的表 位区分别集中在其 N端和 C端， 即 CORE的 a.a.1-90和 NS3的 a.a.1192- 1657, 对上述区段进行分析和筛选后确定了其中的核心表位区段为 CORE 的 a.a.7-2K 29-48、 49-90及 NS3 的 a.a.l359-1454。 我们经过筛选， 最终 选择了 a.a.l201-1465(以下筒称 G)作为 NS3区段抗原。
另外， 经研究发现引起 CORE蛋白结合倾向的主要区段为 a.a.l-90。 为了解决双抗原夹心法 HCV抗体检测试剂盒中由于 CORE抗原引起的高 本底问题， 我们设计了数个不同 CORE 区段与 NS3 G 区段的嵌合表达抗 原分别作为笫一抗原和笫二抗原， 以求筛选出既保持 CORE 区抗原的高灵 敏度， 又保证其结合能力不影响双抗原夹心法 HCV抗体检测试剂盒开发 的 CORE 区抗原的基因区段范围， 并得出满足双抗原夹心法的 HCV抗原 中 CORE区段的特征为：含有 a.a.10-17全序列的区段，进一步为含有 a.a.7-21 全序列的区段，更进一步为含有 a.a.6-23全序列的区段，而且不包括 a.a.29-90 全序列的区段， 进一步为不包括 a.a.29-70全序列的区段， 再进一步为不包 括 a.a.29-59全序列的区段， 更进一步为不包括 a.a.32-48全序列的区段， 所 蛋白区段可以存在突变而保持其抗原性和结合能力不变。
上述条件是本发明试剂盒， 同时也是其它使用包含 CORE 区段抗原的 HCV双抗原夹心法检测试剂盒研制的重要条件。
最终我们选择笫一抗原的 CORE 区段为 a.a.2-59, 笫二抗原的 CORE 区段为 a.a.l-28。
第二抗原中 HCV蛋白与标签的结合
本发明引入标签及其结合配偶体来完成对 HCV蛋白的间接标记， 在 选择标签时的一个重要标准是标签尽可能小以减小对 HCV 抗原活性的损 伤。 标签可以是一个、 几个或几个的组合， 可以结合在 HCV蛋白的 N端、 C端、 两端或内部。
非肽类物质如化合物 (二硝基苯酚或溴脱氧尿苷)； 维生素 (生物素或其 衍生物)；类固醇 (地高辛)；染料 (吖啶酯、罗丹明、丹磺酰氯、荧光素、 Oregon Green、 lucifer yellow、 Alexa Fluor、 Cascade Blue)等所有存在或可制备出 相应结合配偶体的非肽类物质、 或它们与肽或蛋白的组合物均可作为本发 明的标签。
肽类如 His Tag等所有存在或可制备出相应结合配偶体的肽或蛋白也 可作为本发明的标签。
某些小分子可检测化学发光物质 (如吖啶酯)、 荧光物质 (如异硫氰酸荧 光素、 铕)、 放射性同位素 (如 1251)等， 或 "刚性" 大分子可检测物质如： 胶 体金、 乳胶颗粒、 偶联有标记物的纳米颗粒等还可以直接标记 HCV蛋白 制成标记抗原用于双抗原夹心检测， 这些可检测物在某种程度上也可以看 作是本发明特指的标签。
至于标签的选择， 本领域普通技术人员可以根据以上原则按照现有实 猃方法去推导， 在此不再详述。 这里我们仅以 His Tag代表肽类， 生物素 或其衍生物代表非肽类物质进行说明。
本发明优选的 HCV蛋白与标签的结合方法为： HCV蛋白的生物素化；
HCV蛋白与肽的嵌合表达。
1、 HCV蛋白的生物素化
HCV蛋白生物素化的具体方法包括：
a)体内酶促生物素化；
b)体外生物素化；
c)间接生物素化；
d)氨基酸的生物素化。
1.1体内酶促生物素化
本发明主要是使编码生物素接受蛋白与编码 HCV蛋白的嵌合基因 X 同编码生物素-乙酰辅酶 A羧化酶合成酶的基因 Y共同在宿主体内表达， 在表达宿主体内利用生物素-乙酰辅酶 A羧化酶合成酶通过体内酶促反应使 嵌合基因 X编码蛋白的特定赖氨酸结合上生物素， 制成生物素化 HCV蛋 白。 天然的生物素接受蛋白主要存在于生物素羧基载体蛋白家族中， 其核 心部分是含有与生物素结合的特定位点赖氨酸的蛋白或肽。 多肽 SEQ ID NO.3是合成的， 具有同生物素羧基载体蛋白一样的结合生物素的能力。 两 类生物素接受蛋白的共同特征为在生物素-乙酰辅酶 A羧化酶合成酶作用下 可以与生物素结合， 二者均可在本检测系统中应用。 本发明选取 SEQ ID NO.3基因编码产物作为生物素接受蛋白进行说明。
具有催化蛋白生物素化的生物素-乙酰辅酶 A羧化酶合成酶来源广泛， 包括但不限于细菌， 如大肠杆菌（Escherichia coli)、 枯草杆菌（Bacillus subtilis)、 流感杆菌 (Haemophilus influenzae)、 根瘤菌 (Rhizobium)、 乳酸菌 (Lactobacillus)、 伤寒沙门菌 (Salmonella typhimurium)、 粘嚢菌 (Synechocystis sp.)、 链求菌 (streptococcus)和脱氮副球菌 (Paracoccusdenitrificane)的 BirA基 因编码产物， 伤寒立克次氏体 (Rickettsia mooseri)的 BirA基因编码产物， 曱垸球菌 (Methanococcus jannaschii)的 MJ1619基因编码产物 , 梅毒螺旋体 (Treponema Pallidum)的 TP0357 基因编码产物； 酵母， 如分裂酵母 (Schizosaccharomyces pombe)的 SPBC30D10.07c基因编码产物、 啤酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)的 BPL1 基因编码产物； 植物， 如拟南芥 (Arabidopsis thaliana)的 BirA基因编码产物； 动物, 如人 (Homo sapiens)或 小鼠 (Mus musculus)的 HLCS基因编码产物等。 生物素-乙酰辅酶 A羧化酶 合成酶还包括上述酶的功能区段或其功能类似物。 本发明逸取大肠杆菌 ER2566的 BirA基因编码产物进行说明。
1.1.1 多顺反子表达
即基因 X、 Y在表达载体同一启动子作用下以多顺反子形式在宿主体 内表达以完成生物素化的方法。
操纵元是原核基因表达调控的一种重要组织形式， 大肠杆菌基因多数 以操纵元形式组成基因表达调控的单元。 操纵元中被调控的编码蛋白质的 基因可称为结构基因。 一个操纵元中含有 2个以上的结构基因， 多的可达 十几个。 每个结构基因是一个连续的开放读框， 5'端有翻译起始码， 3'端有 翻译终止码。 各结构基因头尾衔接、 串连排列， 组成结构基因群。 至少在 笫一个结构基因 5'侧具有核糖体结合位点， 因而当这段含多个结构基因的 DNA被转录成多顺反子 mRNA, 就能被核糖体所识别结合， 并起始翻译。 核糖体沿 mRNA移动； 在合成完笫一个编码的多肽后， 核糖体可以不脱离 m NA 而继续翻译合成下一个基因编码的多肽， 直至合成完这奈多顺反子 mR A所编码的全部多肽。
上述多顺反子表达形式在多种生物体内均存在， 根据以上原理， 我们 将 X、 Y 以双顺反子的形式连接到表达载体上， 转入表达宿主后利用宿主 体内的物质和环境并通过 Y表达出的生物素-乙酰辅酶 A羧化酶合成酶将 已加入培养基中的生物素添加至与 HCV蛋白嵌合表达的生物素接受蛋白 的特定赖氨酸位点上， 从而完成对 HCV蛋白的定点生物素化。
这里所讲的多顺反子， 可以将 X放在 N端或 C端， 也可以是一个 X 与几个 Y, —个 Y与几个 X, 几个 X与几个 Y等所有排列组合形式的多 顺反子。
在本发明的所有抗原生物素化方法中， "多顺反子表达" 为最稳定、 最方便、 成本最低的方法， 我们以此方法作为生物素化抗原及本发明 HCV 蛋白与标签结合的优选方法。
1.1.2共转化表达
即将分别克隆有基因 X和 Y的两个不同表达载体共同转入表达宿主内 进行共表达以完成生物素化的方法。
将 X、 Y分别克隆到两个不同的表达载体中， 这两个表达载体可以具 有相同或不同的性质， 只要在相应的抗性选择压力下可以分别表达出嵌合 有生物素接受蛋白的 HCV抗原和生物素-乙酰辅酶 A羧化酶合成酶， 并保 证生物素-乙酰辅酶 A羧化酶合成酶可以将 HCV抗原最大程度的生物素化 即可。
1.1.3 多启动子表达
即基因 X、 Y分别利用同一表达载体的不同启动子启动转录进而在表 达宿主内共表达以完成生物素化的方法。
将基因 X和基因 Y克隆到同一表达载体的不同操纵元件调控的两个 启动子下进行有效的转录和翻译， 以实现嵌合有生物素接受蛋白的 HCV 抗原和生物素-乙酰辅酶 A羧化酶合成酶在同一宿主中的共表达并完成 HCV 抗原的生物素化。
1.1.4 单顺反子表达
即将基因 X、 Y 以单顺反子的形式进行不同方式的嵌合表达以完成生 物素化的方法。
将基因 X、 Y 以不同的方式进行嵌合表达， 表达的嵌合蛋白既有合成 酶的功能又有生物素接受能力， 可以在嵌合蛋白之间完成其相互的生物素 化。 这里所讲的不同方式， 可以将 X放在 N端或 C端， 也可以是一个 X 与几个 Y, —个 Y与几个 X, 几个 X与几个 Y等所有排列组合的形式。 1.1.5 与宿主的生物素-乙酰辅酶 A羧化酶合成酶基因共表达
即利用表达宿主体内的与基因 Y功能类似的基因表达出的生物素-乙 酰辅酶 A羧化酶合成酶将基因 X编码蛋白最大程度地生物素化。
我们可以利用基因工程方法将内源或外源的编码生物素-乙酰辅酶 A 羧化酶合成酶的基因整合到表达宿主体内或将表达宿主体内原始存在的类 似生物素-乙酰辅酶 A羧化酶合成酶的基因以一定的方式活化以提高其表达 水平， 使其表达出的生物素-乙酰辅酶 A羧化酶合成酶将 HCV蛋白与生物 素接受蛋白的融合蛋白达到最大程度的生物素化。 或者利用表达宿主体内 原有的与 Y功能类似的基因表达出的生物素-乙酰辅酶 A羧化酶合成酶完 成对 HCV蛋白的部分生物素化， 一般情况下宿主体内原有的与 Y功能类 似的基因表达水平很低， 以至于未经改造的该类原始宿主只能低效率地对 可结合生物素的蛋白或多肽进行体内生物素化， 所以后一种方法在純化抗 原时需要将大部分未生物素化抗原去除， 以便尽可能消除作为笫二抗原参 加反应时未生物素化抗原对已生物素化抗原的竟争， 其它生物素化方法也 最好将未生物素化抗原去除干净已提高灵敏度。
1.2 体外生物素化
1.2.1 活化生物素标记 HCV蛋白
通过偶联的方法将活化生物素直接偶联到 HCV蛋白上， 与 HCV蛋白 的何种基团偶联及具体活化生物素的选择和偶联方法可参考美国 PIERCE 公司产品目录。
1.2.2 利用体外酶促反应将生物素添加到 HCV蛋白上
体外酶促反应主要指将 X编码产物与生物素-乙酰辅酶 A羧化酶合成 酶在体外混合并提供一定的酶促反应环境， 使生物素-乙酰辅酶 A羧化酶合 成酶在体外通过酶促反应完成对 HCV蛋白的生物素化。
1.3 间接生物素化
间接生物素化指将 HCV蛋白与物质 A相连， 用物质 B去结合物质 A, 再用物质 C去结合物质 B, 依此类推可以实现对 A的一级或多级识别， 在 最后一级的结合物质上利用上述生物素化方法连接生物素， 最终以 HCV 蛋白 -A(-B-C ... ... ) -生物素的形式实现 HCV蛋白的间接生物素化。
1.4 氨基酸的生物素化
氨基酸的生物素化是将某种或某几种氨基酸经过生物素化 (沈宗旋等, 合成化学, 10(4):359-361,2002)后作为宿主培养基成分加入表达体系中 , 利 用宿主的蛋白质翻译过程将生物素添加到 HCV蛋白的肽链中制成生物素 化笫二抗原。
2、 HCV蛋白与肽的嵌合表达
除生物素类标签外， 肽类物廣也可以作为笫二抗原的标签， 肽类标签 可以利用基因工程嵌合表达的方法融合在 HCV蛋白的 N端、 C端、 两端 或内部。 这时标签的结合配偶体为肽类物质的特异性识别物， 如单克隆抗 体或多克隆抗体。
由于 HCV 抗原具有一定的特殊性， 表现在其活性随着外源蛋白分子 量的增加而减弱， 这种情况在 N端融合中体现更为明显， 所以本发明选择 分子量尽可能小的肽作为标签。
本发明选择的肽类标签为 His Tag。
2.1 非 HCV肽标签
这里我们选择的非 HCV肽标签为 His Tag标签， 通过基因工程方法将 编码 His Tag的基因与编码 HCV蛋白基因嵌合表达制成笫二抗原， 用标记 的抗 His Tag单克隆抗体对笫二抗原进行识别完成检测。
2.2 HCV肽标签
当选择 HCV肽作为标签时， 要注意以下两点：
1) 该 HCV肽片段应为其相应抗体与笫一抗原不具有特异性亲和力的 区段， 以防止标记物与笫一抗原结合。
2) 该 HCV肽片段最好避开有严重结合倾向的 HCV蛋白区段以避免 试剂盒的高本底。
其具体制备和检测过程同上。 下面通过具体实施例对本发明作进一步详细阐述。 实施例 1 第一抗原的制备
本发明参考罗文新等， 生物工程学报， 16(5)： P578-581 , 2000, 得到 改造载体 pTO-T7, 合成引物扩增其 Ndel和 Bamffl之间的基因序列， 上游 引物带有 Ndel和 BamHI位点， 下游引物带有 BamHI和 EcoRI位点。 片段 回收后 (本发明所使用的分子生物学提取和回收试剂盒均购自上海华舜生物 工程有限公司）经 NdeI/EcoRI(本发明所采用的各种分子生物学用酶均购自 大连宝生物工程有限公司）酶切后克隆到同样酶切处理的 pTO-T7 载体上。 阳性克隆经 BamHI单酶切后回收载体再自身连接， 即除去了 pTO-T7载体 上 Ndel和 BamHI之间的 T7 Tag基因， 得到的载体命名为 Pl。
由于载体 P1的 T7启动子的上游有一个 Bglll位点， 不利于本发明的 克隆。 因此合成引物扩增载体 P1 的 Bglll和 Xbal之间的基因片段， 其上 游引物带有 BamHI位点， 下游引物带有 Xbal位点。 片段经 BamHI/Xbal 酶切后克隆到 Bglll/Xbal酶切后的载体 P1上， 得到的阳性克隆即为 Bglll 位点被封闭的表达庸粒 P2, 也就是本发明所使用的克隆载体， 在实施本发 明的过程中 P1和 P2并不是必须表达载体， 其上游的增强子在本发明中也 不起实^作用， 构建此载体只是为了克隆方便， 其它许多表达载体如 pET- 24a(+) (美国 Novagen公司， 货号 69749-3)均可用于实施本发明。
PCR扩增 a.a.1201-1465基因， 其上游引物带有 BamHI位点， 下游引 物带有 Bglll和 EcoRI位点且两位点间含有终止密码 TAA。 PCR扩增 a.a.2-59 基因， 其上游引物带有 BamHI位点， 下游引物带有 EcoRI位点。 通过 BamHI/EcoRI酶切将片段 a.a.1201-1465基因克隆到同样酶切处理的表达载 体 P2上得到 P2-G。 将该克隆载体 Bglll/EcoRI酶切后插入经 BamHI/EcoRI 酶切的片段 a.a.2-59基因， 得到的阳性克隆为 P2-G-CO E(a.a.2-59) ， 也即 本发明笫一抗原的表达质粒， 命名为 P2-HCVAgl , 含有该质粒的 ER2566 ^Escherichia coli ER2566/P2-HCVAgl)已经于 2005年 1月 21 日保藏于 中国典型培养物保藏中心（中国湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学校内， 邮编 430072), 保藏号为： CCTCC M 205009, 其表达抗原命名为 HCVAgl。 本发明在筛选笫一抗原时设计的克隆采用相同方法进行构建。
将 P2-HCVAgl 转化大肠杆菌 ER2566(美国 New England Biolabs公 司）， 涂布于含 100ug/ml卡那霉素 (上海生工生物工程技术服务有限公司， 以下简称生工， 货号 KE170)的 LB平板上， 37 °C过夜培养， 挑取单克隆， 用含同一浓度卡那霉素的 500ml LB培养基 37 °C振荡培养至 OD6Q。 1.0左右， 用终浓度为 0.5mM的 IPTG (生工， 货号 IB0168)进行诱导， 诱导条件为： 37 °C , 200rpm, 4小时。 4°C 5000rpm 离心 20分钟收集菌体， 每升菌液的菌 体用 10ml裂解緩冲液 (50mM Tirs-HCl， pH8.0 , ImM EDTA, lOOmM NaCl) 重悬， 超声破碎， 4°C 12000rpm 离心 20分钟收集包涵体， 用含 2% Triton X-100(生工 货号 T0694)的溶液 I(20mM Tirs-HCl, pH8.5 , 5mM EDTA, lOOmM NaCl)重悬， 4°C 12000rpm 离心 20分钟收集包涵体， 用溶液 I配 置的 4M尿素溶解后对 100倍体积的 PB緩冲液 (pH7.0, 20mM)透析， 换液 3 次， 4 °C 12000rpm 离心 20分钟去除沉淀后制成粗抗原， 用同一 PB緩 冲液平衡 Sephacryl S-200凝胶柱 (美国 Amersham Biosciences公司)后将上 迷粗抗原过柱， 收集并合并含目的蛋白的溶液， 再过 CM琼脂糖离子交换 柱 (美国 Amersham Biosciences公司）， HCV抗原可被吸附， 用 PBS緩冲液 (pH7.0, 20mM PB , 50mM NaCl)洗涤以去除未被吸附的杂蛋白， 再以 PBS
更正页（细则第 91条) 緩冲液 (pH7.0, 20mM PB, 500mM NaCl)洗脱目的蛋白， 测定蛋白浓度， 4 -20。C保存备用。 实施例 2 笫二抗原的制备
1. 生物素化第二抗原的制备
1.1 体内酶促生物素化
1.1.1 共转化表达
PCR扩增编码 HCV抗原 a.a.1-28基因， 其上游引物带有 BamHI位点， 下游引物带有 Bglll和 EcoRI位点且两位点间含有终止密码 TAA。 PCR扩 增编码生物素接受蛋白的基因片段 L(SEQ ID N0.3), 其上游引物带有 BamHI位点， 下游引物带有 Bglll和 EcoRI位点且两位点间含有终止密码 TAA。
通过 BamHI/EcoRI酶切将片段 a.a.1-28基因克隆到 Bglll/EcoRI酶切 处理的表达载体 P2-G上， 得到的阳性克隆 P2-G-CORE(a.a.l-28)命名为 PS- HCVAg2, 其表达抗原命名为 HCVAg2。 通过 BamHI/EcoRI酶切将基因 L 克隆到 Bglll/EcoRI酶切处理的表达载体 P2-G-CORE(a.a.l-28)上， 得到的 阳性克隆 P2-G-CORE(a.a.l-28)-L命名为 P2-X。
本发明使用的生物素接受蛋白除了 SEQ Π) N0.3编码的多肽或其功能 类似物外，还可以是生物素羧基载体蛋白家族或其功能区段。设计引物 PCR 扩增生物素羧基载体蛋白编码基因， 可以之代替基因 L完成克隆。 引物如 下：
上游引物 1： 5'- CGCGGATCCATGAAACTAAAGGTAACAGTCA
ACGGCA -3'
上游引物 2: 5'-GGCAGGATCCCCGGGTAAGGCAGGAGAGGG
CGAGA TTC-3'
下 游 引 物 ： 5，-CGCGAATTCTTAAGATCTACCACCTTCTATTAA
CTCTAAATCCCCGATCTTGATGAG-3 ,
上游引物带有 BamHI位点， 下游引物带有 Bglll和 EcoRI位点且两位点间 含有终止密码 TAA。 以 Pinpoint™ Xa-1 (美国 Promega公司， 货号 V2031) 为模板， 以上游引物 1和下游引物 PCR扩增得到 128个氨基酸的生物素羧 基载体蛋白区段编码基因 Xal; 以上游引物 2和下游引物 PCR扩增得到 81 个氣基酸的生物素羧基载体蛋白区段编码基因 Xas。 它们与基因 L一样， 其编码产物都含有可结合生物素的特定赖氨酸位点。 我们对上述三种不同 的生物素接受蛋白做了比较发现： 三者结合生物素的能力为 Xal> Xas > L, 即区段完整的大分子量生物素接受蛋白结合生物素能力强， 但由于分子量 增加对 HCV抗原的损伤也增加，所以三者作为生物素接受蛋白嵌合于 HCV 蛋白 C端时， 经生物素化后作为笫二抗原的活性相当， 本发明以下的实验 主要以基因 L作为生物素接受蛋白编码基因来说明。
提取大肠杆菌 ER2566总基因组， 以其作为模板对大肠杆菌 K12生物 素-乙酰辅酶 A羧化酶合成酶 BirA基因 Y进行 PCR扩增。 扩增引物如下： 引物 1： 5'-CCC GAA TTC ATG AAG GAT AAC ACC GTG CC-3' 引物 2: 5'-GGG AAG CTT TTA TTT TTC GGC ACT ACG CAG GGA TAT TTC ACC-3'
其上游引物带有 EcoRI位点， 下游引物带有 Hindlll位点。 扩增出的 基因片段 Y 经 EcoRI /Hindin酶切后克隆到经同样酶切处理的质粒载体 pET-32a (+) (美国 Novagen公司,货号 70785-3)上得到 pET-32a-Y。
表达质粒 P2-X带有卡那霉素抗性基因， pET-32a-Y带有氨苄青霉素抗 性基因。 将这两种表达质粒分别通过转化共同转入表达宿主 ER2566 中， 用含 100ug/ml卡那霉素和 100ug/ml氨苄青霉素 (生工，货号 A0741)的双抗性 LB平板筛选出两个蛋白均有明显表达的克隆， 将该克隆用含同一浓度卡那 霉素和氨苄青霉素双抗性且含终浓度 20uM D-生物素（美国 Sigma-Aldrich 公司,货号 B-4501)的 500ml LB培养基 37°C振荡培养至 OD60。 1.0左右， 用 终浓度为 0.5mM的 IPTG进行诱导， 诱导奈件为： 37°C , 200rpm, 4小时。 离心收集菌体， 每升菌液的菌体用 10ml 裂解緩冲液重悬， 超声破碎， 4°C noOOrpm 离心 20分钟的上清经 10%-30%饱和硫酸铵沉淀， 用 PB緩冲液 (lOOmM, pH7.0)复溶， 4°C 12000rpm 离心 10分钟除去不溶物后， 再经过 含 SoftLink Soft Release Avidin树脂的亲和素层析柱純化 (纯化过程详见美 国 Promega公司，货号 V2012说明书）， 以含有 5mM D-生物素的 PB緩冲液 (lOOmM, pH7.0)洗脱即得纯化的生物素化抗原， 然后对 100倍体积的 PB 緩冲液透析以去除游离生物素， 换液 3次， 离心上清测定蛋白浓度， 4°C或 -20。C保存备用。
1.1.2 多顺反子表达
本发明将扩增出的基因片段 Y经 EcoRI /Hindlll酶切后克隆到同样酶 切处理的质粒载体 P2-X 中， 得到的阳性克隆命名为 P2-X-Y, 也即本发明 优选笫二抗原的表达质粒, 含有该质粒的 ER2566 菌株 0¾c/2 'c/2/: coli ER2566/P2-HCVAgl)已经于 2005年 1月 21 日保藏于中国典型培养物保藏中 心（中国湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学校内， 邮编 430072), 保藏号 为： CCTCC M 205010。 基因 X和 Y之间有一个终止密码 TAA, 因此在 P2- X-Y中， 基因 X和 Y组成了在同一表达调控元件作用下的双顺反子。 本发 明以该表达方式筛选笫二抗原时设计的克隆均采用相同方法进行构建。
将 P2-X-Y 转化大肠杆菌 ER2566 , 按上述方法表达纯化得到抗原 HCVAg。
在本生物素化方法中， 我们又进一步尝试了在 X 的终止密码和 Y 的 起始密码之间加入 SD序列（具体方法为基因工程现有常规技术， 详细可参 考 Tsao,I L.等， Gene,169;P59-64,1996), 使基因 Y编码蛋白的表达量增加， 可以在一定程度上提高生物素化效率进而提高本发明试剂盒的灵敏度。
1.1.3 多启动子表达
PCR扩增出的基因片段 Y经 EcoRI /Hindlll酶切后克隆到同样酶切处 理的质粒载体 P1 中， 得到的表达质粒命名为 Pl-Y。 在 Ρ2-Χ的 Τ7启动子 的上游和终止子的下游设计一对正反引物如下：
引物 1 : 5'-GGCAGATCTTAATACGACTCACTATAGGG-3'
引物 2: 5'-CCCAGATCTTGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'
上下游引物均含有 Bglll位点， 以 P2-X质粒为模板扩增出带有基因 X 的整个 T7操纵元件。 然后将该片段经 Bglll酶切克隆到相同酶切处理的表 达载体 P1-Y中， 即得到双启动子表达载体 P1-X/Y, 基因 X和基因 Y可以
更正页（细则第 91条) 在各自的操纵元件的调控下进行转录和翻译。
将 P1-X/Y转化大肠杆菌 ER2566进行目的蛋白的表达和纯化。
1.1.4. 单顺反子表达
以 ER2566总基因组作为模板对基因 Y进行 PCR扩增。扩增引物如下： 引物 1： 5'-CCC AGA TCT ATG AAG GAT AAC ACC GTG CC-3' 引物 2: 5'-GGG GAA TTC TTA TTT TTC GGC ACT ACG CAG GGA TAT TTC ACC-3'
其上游引物带有 Bglll位点， 下游引物带有 EcoRI位点。 扩增出的基 因片段 Y经 Bglll/EcoRI酶切后克隆入相同酶切处理的质粒载体 P2-X中， 得到表达质粒命名为 P2-XY。 由于基因 X 的 3'端的酶切位点为 Bglll和 EcoRI, 两位点间有一终止密码子 TAA, 因此 P2-X以 Bglll/EcoRI酶切作 为载体时， 终止密码子已被切掉， 连接入的基因 Y与基因 X组成了单一顺 反子， 即组成了嵌合表达基因 XY。
将 Ρ2-ΧΥ转化大肠杆菌 ER2566进行目的蛋白的表达和纯化。
1.1.5 与宿主的生物素-乙酰辅酶 Α羧化 成酶基因共表达
将 P2-X转化大肠杆菌 ER2566进行目的蛋白的表达。 利用 ER2566体 内原始表达的生物素-乙酰辅酶 A羧化酶合成酶对 HCV抗原进行部分生物 素化。 利用上述 SoftLink Soft Release Avidin树脂亲和纯化。
在以上体内酶促生物素化各方法中， 我们又进一步尝试利用低温诱导 表达、 引入分子伴侣作为目的蛋白的上游顺反子或外源蛋白等一系列方法 尽力使 HCV嵌合抗原及生物素-乙酰辅酶 A羧化酶合成酶以可溶形式表 达， 这使得生物素化效率有一定的提高， 至于采用的促进基因工程蛋白可 溶性表达的方法为本领域普通技术人员应该掌握的常规方法， 在此不再详 述。
1.2 体外生物素化
1.2.1 通过偶联实现的 HCV抗原体外生物素化
在此我们以 sulfo- HS-LC-生物素标记 HCV抗原氨基进行说明， 其标 记过程如下： 1) 取 HCVAg2抗原 lmg对含 2M尿素的 PBS(100mM PB, 150mM NaCl, pH7.2)透析过夜；
2) 生物素溶液： 2.2mg sulfo-NHS-LC-生物素 (美国 PIEROE公司， 货 号 21335)溶解在 0.4ml超纯水 (本发明中所有用水均为超纯水)中 , 现用现配；
3) 将蛋白溶液和生物素溶液以摩尔比 1: 10_20混合， 0-4。C交联 2小 时或者室温交联 30分钟；
4) 将反应液对含有 0.05%SDS的 PB(100mM PB, pH7.2)緩冲液透析， 除去游离生物素；
5) 加入终浓度 50%的甘油后储存于 -20°C备用。
还可以选择不同的活化生物素标记 HCV抗原的不同基团 (如琉基、 羧 基等)， 具体可参考美国 PIERCE公司产品目录。
1.2.2 通过酶促反应实现的 HCV抗原体外生物素化
在含有 ATP和 D-生物素的特定緩冲体系中， 生物素-乙酰辅酶 A羧化 酶合成酶同样可以发挥出其在体内的作用， 使带有生物素接受蛋白的 HCV 抗原标记上生物素。
我们将生物素-乙酰辅酶 A羧化酶合成酶基因 Y克隆到 pET-32a(+)进 行表达， 然后经 Co-金属亲和层析柱纯化出一定量的合成酶， 并利用它对 含生物素接受蛋白的 HCV抗原进行体外生物素化。 将纯化的 HCV抗原和 适量的生物素-乙酰辅酶 A羧化酶合成酶加入含 10mM ATP (生工， 货号 ΑΒ0020)、 50μΜ D-生物素、 50mM Bicine (生工， 货号 BB0266)、 10 mM MgOAc (生工， 货号 MB0326), pH 8.3 生物素化緩冲液中进行生物素化反 应， 室温反应 12 小时即可。 反应后将抗原对 100 倍体积的 PB 緩冲液 (lOOmM, pH7.0)进行透析以去除游离的生物素， 换液 3 次， 离心上清经 SoftLink Soft Release Avidin树脂的亲和素层析柱纯化， 以 5mM D-生物素 的 PB洗脱即得纯化的生物素化抗原， 纯化后的抗原再一次透析即可。
1.3 间接生物素化
我们以 His Tag代表物质 A, 以抗 His Tag单克隆抗体 (美国 Novagen 公司， 货号 70796-3)代表物质 B, 物质 B上连接生物素为例来说明 HCV 抗原的间接生物素化。
按前述方法得到克隆 P2-G-CORE(a.a.l-28)-His命名为 P2-HCVAg3 , 将其转化后表达并纯化出相应抗原 HCVAg3, 其中的 His表示 His Tag, 采 用其它多肽嵌合时的表示方法相同。
抗 His Tag单克隆抗体的生物素标记通过与活化生物素的偶联反应来 实现， 方法同上。 酶标单克隆抗体可以与 HCV 抗原特异性地结合， 从而 实现了 HCV抗原的间接生物素化。
生物素的结合配偶体即链霉亲和素的酶标记方法为 NaI04氧化法。 称 取 lOmgH P 溶解于 1ml超纯水中， 再緩慢滴加 1ml超纯水新鲜配制的 5mg/ml NaI04 (生工， 货号 ST1244)溶液， 室温下避光轻柔搅拌 40分钟后加 入 20%乙二醇 (生工， 货号 E0582)溶液 0.05ml, 室温下避光搅拌 40分钟。 然后立即加入事先对 lOOmM, pH9.51 碳酸盐緩冲液透析 2小时， 2.5mg/ml 的链霉亲和素 (生工， 货号 SE497)溶液 lml, 4°C避光对 lOOmM, pH9.51 碳 酸盐緩冲液透析过夜。 次日， 向混合物中滴加 0.1ml新鲜配制的 4mg / ml NaBH4(生工， 货号 ST1268)溶液， 混匀， 4°C静置 2小时。 将上述液装入透 析袋中， 对 PBS緩冲液 (150mM， pH7.4)透析， 4°C过夜。 加入酶保护剂及 终浓度 50%的甘油混匀后 -20°C避光保存备用。
笫二抗原为生物素化 HCV蛋白时， 本试剂盒的检测模式为：
1) 直接生物素化模式 "支持物 -笫一抗原 -待测 HCV抗体 -生物素化笫 二抗原 -HRP标记的链酶亲和素 -HRP底物显色形成可识别信号" ； 2) 间接生物素化模式 "支持物 -笫一抗原-待测 HCV抗体-笫二抗原 (His Tag与 HCV蛋白嵌合表达物) -生物素标记抗 His Tag单克隆抗体- HRP标记的链霉亲和素 -HRP底物显色形成可识别信号" 。
2. 带有肽类标签的第二抗原的制备
我们以 His Tag为例进行说明。 在上面的实施例中， 本发明已经构建 了 HCV 抗原 C端带有 His Tag 的克隆 P2-HCVAg3 并制备了相应抗原 HCVAg3 , 我们还尝试了利用上述方法在 HCV蛋白的 N端、 两端或在 NS3 与 CORE之间嵌合上 His Tag, 四者均被证实可在本发明中用作笫二抗原。 同理上述的生物素接受蛋白也可以釆用这四种嵌合方法的任意一种。 其中 同种或不同种标签的多次嵌合在一定程度上还可以提高灵敏度， 这在本发 明中也得到了证实。 上述各方法涉及到的基因嵌合及表达技术为本领域普 通技术人员应该掌握的常规现有技术， 在此不再详述。
肽类标签也可以为笫一抗原中不含有的且结合倾向不强的 HCV肽片 段， 其原理和方法与以 His Tag作为肽类标签类似， 不再详述。
HRP标记单克隆抗体的方法与上述 H P标记链霉亲和素的方法类似， 主要区别为： 单克隆抗体与 HRP的质量标记比为 1 : 1-2; 标记时间为 3-6 小时。
笫二抗原为肽类标签与 HCV蛋白嵌合表达物时， 本试剂盒的检测模 式为： "支持物-笫一抗原-抗体-第二抗原 (肽与 HCV蛋白嵌合表达物) -HRP 标记的抗肽单克隆抗体 -HRP底物显色形成可识别信号" 。
除了 HRP夕卜， 供选择的可检测物质还有很多种， 例如碱性磷酸酶、 β- 半乳糖苷酶等酶类； 吖啶酯等化学发光物质； 异硫氰酸荧光素、 铕、 铕纳 米颗粒等荧光物盾； 1251等放射性物质； 胶体金、 乳胶等胶体。 选择不同 的可检测物也就选择了不同的免疫诊断方法即酶联免疫、 化学发光免疫、 荧光免疫、 时间分辨荧光免疫、 放射免疫或金标免疫等。 这些可检测物质 标记链霉亲和素或单克隆抗体的方法以及各种免疫诊断方法虽各不相同， 但均属于本领域普通技术人员应该掌握的常规实验方法， 在此不再详述。
我们还对笫一抗原和笫二抗原尝试采用了不同的基因嵌合方式， 不同 的表达载体， 不同的纯化方法来加大二者的 "差距" ， 以便进一步提高本 发明试剂盒的特异性， 均取得了一定效果。 这些方法为本领域普通技术人 员应该掌握的常规现有方法， 在此不再详述。 实施例 3 笫一抗原和第二抗原中 HCV蛋白区段的筛选
我们首先对 NS3区段抗原进行筛选,按前述方法得到克隆 P2-G (含 NS3 区段 a.a.1201-1465), 将其表达纯化后的抗原 NS3G利用间接 ELISA进行 活性检测,与 Chiron公司专利 EP-A-0450931 的 C33C(NS3a.a.l 192-1457)及 Roche公司专利 US6096319的 D26(NS3a.a.1207-1488)相比， 发现 S3G的 特异性有所改进 (见表 1), 灵敏度相当。 我们又进一步在 a.a.l201±5 处及 a.a.l465±8 处分别设计引物并得到克隆 P2-NS3(a.a.l 196-1473)、 P2- NS3(a.a.1206-1457)、 P2-NS3(a.a.1196-1457)、 P2-NS3(a.a.1206-1473), 上述 克隆经表达纯化后分别进行活性检测， 其反应性与 NS3G相当。 最终我们 选择了 a.a.l201-1465(以下简称 G)作为本发明 NS3 区段抗原， 筛选过程使 用的均为本领域普通技术人员应该掌握的常规实验方法， 具体可参考专利 US6096319所述方法， 在此不再详述。 表 1 NS3G与 C33C、 D26特异性比较
3000份临床阴性血清检测结果
抗原名称 阳性 (份） 阴性 (份） 假阳性率
C33C 13 2987 0.43%
D26 12 2988 0.40%
NS3G 6 2994 0.20% 为从根本上解决 CORE区段蛋白引起的非特异性反应， 本发明就笫二 抗原的 CORE区段按前述方法设计了不同克隆， 以 HCVAgl作为笫一抗原 进行灵敏度检测得到笫二抗原不同 CORE 区段试剂盒灵敏度的差异， 结果 见表 2。 笫二抗原不同 CORE区段试剂盒灵敏度的差异
第二抗原 灵敏度 第二抗原 灵敏度 第二抗原 灵敏度 a. a.1-23 a.a.1-21 V a.a.1-17 V
a. a.6-48 V a.a.7-48 V a. a.10-48 V
a. a.1-6 a. a.1-7 X a.a.1-10
a.a.23-48 a.a.21-48 a.a.17-48 注： 1) a.a.1-23表示克隆 P2-G-CORE(a.a.l-23) -L-Y表达产物， 其它同；
2) 灵敏度可以达到现有商品化间接法试剂 (本发明中如无特殊说明， 均指 Murex Anti-HCV 4.0)标准的表示为 'V" , 否则为 。 我们就笫一抗原的 CORE区段设计了上述类似克隆， 以 HCVAg作为 笫二抗原进行灵敏度检测时也得到了与表 2类似的结果。
上述实验结果表明，在夹心法中，当 HCV笫一抗原或笫二抗原的 CORE 区缺失 a.a.6-23全序列区段， 进一步为缺失 a.a.7-21全序列区段， 更进一 步为缺失 a.a.10-17全序列区段时， 试剂盒灵敏度较低。
我们就第二抗原的 CORE区段设计了不同克隆， 以 HCVAgl作为笫一 抗原， 以相同的试剂盒系统进行检测， 得到笫二抗原不同 CORE区段试剂 盒本底的差异， 结果见表 3。 笫二抗原不同 CORE区段试剂盒本底的差异
CORE区段 a.a.1-90 a.a.1-70 a.a.1-59 a.a.1-48 a.a.1-28 3x(a.a.l-28)
本底 -H- -H- -H- -H- ― -H-
CORE区段 a.a.32-90 a. 32-70 a.a.32-48 a.a.1-28 & 49-70
本底 -H- -H- ++ ++
CORE区段 a.a49-70 Na.a49-70
本底 + 一 注： 1) a.a.1-90表示克隆 P2-G-CORE(a.a.l-90) -L-Y表达产物， 其它同；
2) 3x(a.a.l-28)表示克隆 P2-G-3xCORE(a.a.l-28)-L-Y表达产物； 3χ表示将 a.a.1-28基因重 复嵌合三次；
3) Na.a.49-70表示克隆 P2-L -CORE(a.a.49-70)-G -Y表达产物；
4) ++表示本底高， +表示本底较高， -表示本底正常 上述结果显示： HCV CORE区笫一表位 a.a.l-28(简称 a)、 笫二表位 a.a.32-48(简称 b)、 笫三表位 a.a.49_70(简称 c)均有结合倾向， 其中 b的结合 倾向最强， 当笫二抗原中同时存在上述三个区段的两个或两个以上区段， 并且存在区段暴露较为充分时， 试剂盒本底高。
我们又对笫一抗原的 CORE区段做了与上述类似的实验， 试剂盒本底 也有上迷随着 CORE区 C端的加长而升高的趋势， 但并不向笫二抗原那么 明显， 说明 HCV夹心法试剂盒的高本底主要是由于笫二抗原的 CORE蛋 白区段引起。 上述实验的结果表明， 当 HCV抗原尤其是第二抗原的 CORE 区包含 有 a.a.32_48全序列区段， 进一步为包含有 a.a.29_59全序列区段， 再进一步 为包含有 a.a.29-70全序列区段，更进一步为包含有 a.a.29-90全序列区段时， 试剂盒本底较高。
因此本发明中 HCV CORE蛋白特征为： 含有 a.a.10-17全序列的区段， 进一步为含有 a.a.7-21全序列的区段， 更进一步为含有 a.a.6-23全序列的区 段， 而且不包括 a.a.29-90全序列的区段， 进一步为不包括 a.a.29-70全序列 的区段， 再进一步为不包括 a.a.29-59 全序列的区段， 更进一步为不包括 a.a.32-48 全序列的区段， 该蛋白区段可以存在突变而保持其抗原性和结合 能力不变。
为了进一步确证高本底是由 CORE区抗原的结合能力引起的， 我们还 ：了以下实^ r:
1) 验证同源结合： 我们选择了 HCVAgl作为笫一抗原。
2) 验证异源结合： 我们选择了 fflVgp 抗原、梅毒螺旋体 Tpl7抗原、 牛血清白蛋白 (笫五组分)（BSA, 上海纬群生物技术有限公司）分别 作为笫一抗原。
选择 P2-G-CORE(a.al-70)-L-Y表达产物作为笫二抗原， 待测样品我们 自正常人群)， 20%新生牛血清， 1%BSA， 无待测样品 (样品稀释液代替样 品)进行检测， 实验结果见表 4。
CORE区抗原的同源和异源结合倾向确证实验
第一抗原
待测样品 HCVAgl HIVgp41 Tpl7 BSA
HCV阴性血清 ++ + + +
20%新生牛血清 ++ + + +
1%BSA ++ + + + 样品稀释液 ++ + + + 注： ++表示本底高， +表示本底较高 当我们仅以 P2-G表达产物作为第一抗原， P2-G-L-BirA表达产物或 P2-G-CORE(a.a. l-70)-L-Y表达产物分别作为笫二抗原， 前者即仅以 NS3 抗原夹心时上述高本底问题不再存在， 而后者同样存在高本底。
以上结果说明双抗原夹心法检测 HCV抗体试剂盒的高本底是由 CORE 区抗原的同源结合和异源结合倾向引起， 其反应模式为： "支持物-笫一抗 原-笫二抗原-标记物-可识别信号" 。
所以本发明得出在选择夹心法 HCV抗原 CORE 区段的原则是： 在保 证活性要求的前提下， 区段越短越好， 且首选 N端。
通过上述筛选， 本发明确定了笫一抗原的 CORE 区段为 a.a.2-59, 笫 二抗原的 CORE区段为 a.a.l-28。
我们又进一步尝试在保证活性的前提下将笫一抗原和笫二抗原的 CORE区段进一步缩短， 使试剂盒的本底有了一定的改善， 且 NS3抗原的 活性有了一定的提高。 实施例 4 作为外源蛋白的肽类标签分子量的确定 为了比较肽类标签作为外源蛋白对 HCV抗原活性的影响， 本发明设 计了在 HCV蛋白 N端和 C端融合不同大小肽类标签的克隆。 克隆的构建、 蛋白的表达及纯化可参考实施例 1 和 2 中的方法。 以 HCVAgl 作为笫一 抗原， 上述克隆的各纯化抗原作为笫二抗原， 以 HRP标记抗 His Tag单克 隆抗体作为标记物对两份正常人阴性血清分别稀释的各 100份 HCV 阳性 血清进行检测， 对照选用英科新创 (厦门)科技有限公司 HCV 间接法诊断试 剂及 Abbott公司 Murex Anti-HCV 4.0。 结果见表 5和表 6。 N端肽类标签对 HCV抗原活性的影响
100份血中检测出的份数
N端伴侣蛋白 血清稀释度 (倍） 笫二抗原
分子量约为 1 25 50 100 200
HCVAg-Nl 1KD 100 100 98 96 80
HCVAg-N2 2KD 100 100 98 95 79
HCVAg-N3 5KD 100 99 96 92 72
HCVAg-N4 10KD 100 93 90 81 60
HCVAg-N5 15KD 100 89 80 62 41
HCVAg-N6 20KD 100 88 76 55 39 新创间接法 100 75 62 40 28
MurexAnti-HCV 4.0 100 85 73 50 37 注： ' HCVAg-Nl为克隆 P2-His-G-CORE(a.a.l-28)的表达产物；
HCVAg-N2为克隆 P2-His-T7-G-CORE(a.a.l-28)的表达产物； HCVAg-N3为克隆 pET-30a-G-CORE(a.a.l-28)的表达产物；
HCVAg-N4为克隆 P2- His-Xas-G-CORE(a.a.l-28)的表达产物； HCVAg-N5为克隆 P2- His-Xal-G-CORE(a.a.l-28)的表达产物； HCVAg-N6为克隆 P2- His-Xas-Xas-G-CORE(a.a.l-28)的表达产物。 表 6 C端肽类标签对 HCV抗原活性的影响
100份血中检测出的份数
c端伴侣蛋白 血清稀释度 (倍) 第二抗原
分子量约为 1 25 50 100 200
HCVAg-Cl 1KD 100 100 99 97 84
HCVAg-C2 2KD 100 100 99 97 83
HCVAg-C3 5KD 100 100 97 94 80
HCVAg-C4 10KD 100 99 94 89 71
HCVAg-C5 15KD 100 96 90 81 61
HCVAg-C6 20KD 100 94 87 74 49
HCVAg-C7 30KD 100 89 78 59 39 新创间接法 100 72 59 37 26 '
MurexAnti-HCV 4.0 100 83 69 45 35 注： HCVAg-Cl为克隆 P2-G-CO E(a.a.l-28)- His的表达产物；
HCVAg-C2为克隆 P2 -G-CORE(a.a.l-28)- T7- His的表达产物；
HCVAg-C3为克隆 P2 -G-CORE(a.a.l-28)- L-L- His的表达产物；
HCVAg-C4为克隆 P2 -G-CORE(a.a.l-28)- Xas- His的表达产物；
HCVAg-C5为克隆 P2 -G-CORE(a.a.l-28)-Xal- His的表达产物；
HCVAg-C6为克隆 P2 -G-CORE(a.a.l-28)- Xas-Xas- His的表达产物；
HCVAg-C7为克隆 P2 -G-CORE(a.a.l-28)- Xas-Xas-Xas- His的表达产物。 本实验证实了外源蛋白引起的 HCV抗原活性损失。 由结果可以看出， 外源蛋白越大， HCV抗原的活性损失越大， 这一点在 N端融合时体现尤 为突出， 我们随后证实这种情况在笫一抗原中也同样存在。 因此本发明对 HCV笫一抗原及笫二抗原的外源蛋白的选择标准为： 外源蛋白分子量越小 越好，其分子量标准可逐级优化为小于 30KD、 20KD、 15KD、 10KD至 5KD。
但在选择以生物素与生物素接受蛋白组合物为标签的第二抗原时， 还应同时考虑生物素接受蛋白的生物素结合能力， 即在保证生物素化不 受影响的前提下， 生物素接受蛋白的分子量尽可能小， 所以生物素接受 蛋白的分子量不完全受上述限制。 实施例 5 本发明试剂盒的生产及使用
1. 生物素化 HCV抗原作为第二抗原
将 HCV笫一抗原以一定比例用碳酸盐緩冲液 (50mM, pH9.51 , 含 0.2 %0SDS)稀释， lOOul/孔加入酶标板 (深圳金灿华实业有限公司辐照酶标板)， 4°C包被 24小时， 次日用 PBST(10mM PB, 150mM NaCl, 0.05% Tween-20, pH7.4)洗涤液洗板二次， 拍干， 120ul/孔加入含 30%新生牛血清（北京元亨 圣马生物技术研究所)， 8%蔗糖， 5%。酪蛋白（美国 Sigma-Aldrich公司,货号 C-8645), 1% β -巯基乙醇 (生工，货号 M0482)， 150mM aCl的 pH7.4, lOmM PB封闭液， 37°C封闭 2小时， 甩掉孔内液体， 拍干， 置室温 20-25°C、 湿 度 55%-65%、 有通风设备的房间内风干。 封装于加有干燥剂的铝膜袋中， 包被完毕。 检测时可分两步和三步两种方法进行。 1.1 两步法：
在包被酶标板中先加入 50ul待测标品、 阴性 (正常人阴性血清)、 阳性 (HCV 抗体阳性血清)对照， 再 50ul/孔加入含 1 %。 β -巯基乙醇， 0.5 %0 TritonX-100, 20%新生牛血清， 5%。酪蛋白， 150mM NaCl及以一定比例稀 释生物素化 HCV第二抗原 (临用前稀释)的 pH7.4的 20mM PB緩冲液， 37 °C温育 90分钟； 用 PBST洗涤液洗板五次， 拍干； 用含 1%。酪蛋白， 20% 新生牛血清及以一定比例稀释链霉亲和素酶标记物（临用前稀释)的 pK7.4 的 20mM PB緩冲液， lOOul/孔加入反应板， 37°C温育 30分钟； 用 PBST 洗涤液洗板五次， 拍干， 加入含 0.5%。过氧化氢尿素 (生工， 货号 UB1753)、 4.76%Q三水合乙酸钠、 0.9%。水醋酸的显色剂 A及含 0. 32%。TMB (生工， 货 号 TB0514)、 5mM柠檬酸、 0.5mM EDTA-2Na、 5%甲醇、 2%。二曱基曱酰 氨的显色剂 B各 50ul, 37°C避光显色 30分钟。 每孔加 50ul, 含 2M硫酸 的终止液终止反应， 酶标仪 450nm波长 (参考波长 630nm)空白孔校零后读 取 OD值， Cutoff Value计算： COV =阴性对照平均 OD值 χ 2.0 (阴性对 照 OD值低于 0.075作 0.075计算， 高于 0.075按实际 OD值计算)， 待测样 品 OD值 > COV 为阳性， 待测样品 OD值 < COV 为阴性。
1.2 三步法：
在包被板中先加入标本稀释液 (含 1 %。 β -巯基乙醇， 1 %。TritonX-l 00 , 20%新生牛血清， ρΗ7·4的 20mM PB)50ul, 再加入 50ul待检标本、 阴性、 阳性对照， 37°C温育 60分钟； 用 PBST洗涤液洗板五次， 拍干， lOOul/孔 加入含 1 %。 β -巯基乙醇， l%。TritonX-100, 20%新生牛血清， 150mM NaCl 及以一定比例稀释的生物素化 HCV抗原 (临用前稀释)的 pH7.4的 20mM PB 緩冲液 37°C温育 30分钟， 后续过程同前述两步法。
上述生物素化 HCV 抗原及链霉亲和素酶标记物的稀释比例应根据实 际情况具体摸索已达到最佳效果， 反应物稀释比例及各步反应时间也可以 根据需要在实际生产中进行调整以便在保证检测效果的同时缩短检测时间 提高工作效率， 这种摸索和调整为本领域普通技术人员应该掌握的常规实 验方法， 在此不再详述。 本发明的检测方法优选三步法。
2. 以带有 His Ta 标签的 HCVAg3抗原作为第二抗原
具体方法参照上述生物素化 HCV抗原作为笫二抗原时试剂盒的生产 及使用。 实施例 6 本发明试剂盒的性能评价
(一)、 灵敏度
我们将生物素化 HCV蛋白作为笫二抗原的夹心法试剂盒与现有商 品化间接 ELISA试剂盒的灵敏度做了比较， 得到了与表 6类似的结果， 结果表明本发明的试剂盒和商品化间接 ELISA试剂盒对各稀释度血清反 应的灵敏度差异均具有统计意义 (P<0.05)。 由此可见， 本发明试剂较现 有间接法试剂的灵敏度有较大的提高。
(二)、 特异性
本发明采用了三步特异性识别， 所以较只有一步特异性识别的间接 法试剂有了极大改善。 我们用本发明试剂盒和英科新创 (厦门）科技有限 公司的 HCV 间接法试剂分别检测了 3000份临床阴性血清， 本试剂假阳 性率为 0.067%, 而该间接法为 0.67%, 我们又进一步将后者的假阳性经 MurexAnti-HCV 4.0间接 ELISA试剂盒检测， 其假阳性率仍为 0.4%。
(三)、 可疑血清
我们经过筛选， 得到如下 12份本室间接法试剂判定为阳性， HCV
RIBA确证试剂 (新加坡 Genelabs公司，货号 11130-018)检测为可疑， PCR 检测 (瑞士 ROCHE公司 COBAS Ampliscreen™ HCV 2.0)为阴性， 其提供 者在临床上不具有任何肝炎症状的可疑血清 (数据见表 7), 除 C5之夕卜的 11份血夹心法为阴性， 用夹心法所使用的笫一抗原和笫二抗原包被的间 接法检测均为阳性， RIBA结果为 NS4单独阳性，但上述两抗原均无 NS4 区段， 综上可推知这 11 份血应为本室间接法试剂的假阳性。 C5 与上 述 11 份血类似， 虽然其在夹心法检测中为阳性， 但夹心法反应 OD值 明显低于间接法， 推测其应为间接与夹心的共同假阳性。 同理可推导除 C4、 C6外的其它 10份应为 MurexAnti-HCV 4.0试剂盒的假阳性。 综上, 本发明试剂盒对可疑血清判定的准确性较现有商品化试剂和本室内部的 间接法试剂均有较大提高。 本发明试剂盒检测可疑血清 (均为阴性)情况
Genelabs HCV
本发明笫一抗原间接生物素化笫二抗原 Murex Anti- 标本 BLOT Version
试剂盒 ELISA法检测间接 ELISA法检测 HCV 4.0
3.0
CI - + + + NS4 + 一
C2 - + + + NS4 + -
C3 - + + + NS4 + ―
C4 - + + - NS3-1 + -
C5 弱 + + + + NS4 + 一
C6 - + + - NS3-1 + -
C7 - + + + NS4 + 一
C8 - + + + NS4 + -
C9 - + + + NS4 + - en - + + + NS4 + 一
C12 - + + + NS4 + - 注： +表示阳性， -表示阴性
(四)、 重复性
对阴、 阳性待测样品各 240份， 采用不同时不同批次不同操作者进 行多次检测， 考查本发明试剂盒判定结果的重复性， 结果显示本发明试 剂盒对阴、 阳性判定结果的重复性为 100%。 这表明本方法检测结果的 再现性好， 结果判定可靠。 (五)、 稳定性
将整套试剂（包括包被酶标板、 待测样品稀释液、 笫二抗原、 笫二抗 原稀释液、 链霉亲和素酶标记物、 酶稀释液、 阴性对照、 阳性对照、 显 色剂人和 终止液 )37°C考核 72小时， 取出后与同时 4°C存放的试剂在 同一条件下检测相同的阴、 阳性质控血清， 其结果见表 8。 实验表明， 本 发明试剂盒稳定性好。 表 8 本试剂盒稳定性实验结果
阳性对照 阴性对照 阴、 阳性 试剂保存状态 线性 CV值
均值 均值 质控血清
4'C存放 99.90% 9% 2.500 0.050 两条件下标本 测得 OD值
37°C考核 72小时 99.90% 8% 2.318 无明显差异
(六)、 精密性
在同一反应板上对同一份已知阳性标本， 多次平行^大于等于 10孔 重复检测， 得到各孔的检测 OD值， 计算其 CV值均低于 15%, 说明本试 剂盒精密性较好。
o
o
关于微生物保藏的说明
(细则 13之二）
PCT/RO/134表（ 1992年 7月）

Claims (1)

  1. 权 利 要 求
    1. 一种检测 HCV抗体的试剂盒， 该试剂盒以 "支持物-第一抗原-待 测 HCV抗体-笫二抗原-标记物-可识别信号" 形式完成检测， 其中第二抗 原与标记物之间进行一步或多步的结合反应， 其特征在于所述笫二抗原为 HCV蛋白与标签的结合物， 所述标签为肽类标签或非肽类标签。
    2. 权利要求 1 的试剂盒， 其中所述非肽类标签为化合物、 半抗原、 维 生素、 类固醇、 染料、 激素、 抗生素、 核酸或者为它们与肽或蛋白的组合 物。
    3.权利要求 2 的试剂盒， 其中所述化合物为二硝基苯酚或溴脱氧尿 苷； 维生素为生物素或其衍生物； 类固醇为地高辛； 染料为吖啶酯、 罗丹 明、 丹磺酰氯或荧光素。
    4. 权利要求 1的试剂盒， 其中所述肽类标签为含有 His Tag、 T7 Tag,
    S Tag、 Flag Tag, HA Tag或 HCV肽片段的肽或蛋白。
    5.权利要求 4的试剂盒， 其中所述肽类标签为外源蛋白时， 其分子量 小于 30KD。
    6.权利要求 5的试剂盒， 其中所述夕卜源蛋白分子量小于 20KD。
    7. 权利要求 6的试剂盒， 其中所述夕卜源蛋白分子量小于 15KD。
    8.权利要求 7的试剂盒， 其中所述外源蛋白分子量小于 10KD。
    9.权利要求 8的试剂盒， 其中所述外源蛋白分子量小于 5KD。
    10. 权利要求 5的试剂盒， 其中所述外源蛋白位于 HCV蛋白的 N端 时， 其分子量小于 5KD; 位于 HCV蛋白的 C端时， 其分子量小于 20KD。
    11. 权利要求 1-10任一项的试剂盒， 其中笫一抗原和笫二抗原包括 HCV NS3及 CORE蛋白区段， 所述 NS3蛋白区段为从 a.a.l201±5处起始 至 a.a.l465±8 处终止的任一区段， 该蛋白区段可以存在突变而保持其抗原 性不变； 所述 CORE蛋白区段为含有 a.a.10-17全序列的区段， 进一步为含 有 a.a.7-21全序列的区段， 更进一步为含有 a.a.6-23全序列的区段的区段， 而且不包括 a.a.29-90全序列的区段， 进一步为不包括 a.a.29-70全序列的区 段， 再进一步为不包括 a.a.29-59全序列的区段， 更进一步为不包括 a.a.32- 48 全序列的区段， 该蛋白区段可以存在突变而保持其抗原性和结合能力不 变。
    12. 权利要求 1-10任一项的试剂盒， 其中笫一抗原的 CORE蛋白区 段为 a.a.2-59; 笫二抗原的 CORE蛋白区段为 a.a.1-28; 笫一抗原和笫二抗 原的 NS3蛋白区段均为 a.a.l201-1465。
    13. 权利要求 1-12任一项的试剂盒， 其中所述标签为生物素或其衍 生物、 生物素或其衍生物与肽或蛋白的结合物时， 其结合配偶体为亲和素、 链霉亲和素、 中性链亲和素、 它们的类似物、 抗生物素或其衍生物的抗体； 所述标签为肽或蛋白时， 其结合配偶体为抗该肽或蛋白的单克隆抗体或多 克隆抗体。
    14. 一种制备权利要求 1试剂盒的方法， 其中包括 HCV蛋白与标签 结合的步骤， 所述结合方法包括：
    1) HCV蛋白的生物素化；
    2) HCV蛋白与肽的嵌合表达。
    15. 权利要求 14的方法， 其中 HCV蛋白生物素化的方法包括：
    1)体内酶促生物素化；
    2)体外生物素化;
    3) 间接生物素化；
    4)氨基酸的生物素化。
    16. 权利要求 15的方法， 其中体内酶促生物素化的方法为：
    使编码 HCV蛋白与生物素接受蛋白的嵌合基因 X同编码生物素 -乙酰 辅酶 A羧化酶合成酶的基因 Y共同在宿主体内表达， 在表达宿主体内利用 生物素-乙酰辅酶 A羧化酶合成酶通过体内酶促反应使嵌合基因. X编码蛋 白的特定赖氨酸结合上生物素， 具体方法包括：
    1) 多顺反子表达；
    2) 共转化表达；
    3) 多启动子表达； 4)单顺反子表达；
    5)与宿主的生物素-乙酰辅酶 A羧化酶合成酶基因共表达。
    17. 权利要求 15 的方法， 其中体外生物素化为通过偶联活化生物素 或体外酶促反应来完成对 HCV蛋白的生物素化。
    18. 权利要求 16 的方法， 其中所述生物素接受蛋白为生物素羧基载 体蛋白家族或其功能区段、 SEQ ID N0.3多肽或其功能类似物。
    19. 权利要求 16 的方法， 其中所述生物素-乙酰辅酶 A羧化晦合成 酶是分类号为 EC6.3.4.15的酶或其功能区段、 功能类似物。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101968483A (zh) * 2009-07-27 2011-02-09 深圳市菲鹏生物股份有限公司 一步半双抗原夹心免疫检测法
CN105467113A (zh) * 2015-11-10 2016-04-06 国家纳米科学中心 一种基于荧光素和萤光素酶生物发光反应的免疫分析方法
CN109678954A (zh) * 2018-12-29 2019-04-26 山东莱博生物科技有限公司 一对能够特异性识别hcv ns3蛋白的单克隆抗体及其应用
CN110456073A (zh) * 2019-08-21 2019-11-15 广东菲鹏生物有限公司 双抗原夹心检测抗体的方法及试剂盒

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080220448A1 (en) * 2006-09-01 2008-09-11 Blincko Stuart J Antigenic protein conjugates and process for preparing same
CN101363849A (zh) * 2008-09-24 2009-02-11 深圳市菲鹏生物股份有限公司 间接标记纳米颗粒的抗体检测捕获法及其试剂盒
CN101363848B (zh) * 2008-09-24 2013-05-29 深圳市菲鹏生物股份有限公司 间接标记纳米颗粒的抗体检测双抗原夹心法及其试剂盒
CN101614739A (zh) * 2009-07-30 2009-12-30 杭州艾力康医药科技有限公司 丙型肝炎病毒抗体唾液快速检测试纸条
CN102109523A (zh) * 2009-12-29 2011-06-29 北京库尔科技有限公司 丙型肝炎病毒IgG、IgM抗体联检试剂盒及其制备方法
CN103869077A (zh) * 2012-12-14 2014-06-18 北京和杰创新生物医学科技有限公司 提升包被抗原反应活性的工艺方法
CN105358977A (zh) 2013-04-26 2016-02-24 生物辐射实验室股份有限公司 多重乙肝试验
CN105277711B (zh) * 2014-07-21 2017-11-21 广州瑞博奥生物科技有限公司 一种用于检测he4的酶联免疫试剂盒
KR102628570B1 (ko) * 2015-11-30 2024-01-23 에프. 호프만-라 로슈 아게 Fc 영역 변형 항체의 측정을 위한 면역 분석
CN105486856A (zh) * 2015-12-24 2016-04-13 泰州泽成生物技术有限公司 一种定性检测丙型肝炎抗体的试剂盒及其制备方法和应用
CN106153905A (zh) * 2016-06-21 2016-11-23 广西中医药大学附属瑞康医院 一种检测艾滋病病毒的试剂盒
CN105974115A (zh) * 2016-07-07 2016-09-28 苏州新波生物技术有限公司 一种丙型肝炎病毒抗体时间分辨检测试剂盒及其制备方法
US20200209226A1 (en) * 2017-01-20 2020-07-02 Shenzhen New Industries Biomedical Engineering Co. Labeled complex, preparation method thereof, kit containing the same, application of kit and detection system comprising kit
CN107402304A (zh) * 2017-06-26 2017-11-28 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种流产衣原体抗体双抗原夹心elisa检测方法
CN110261616B (zh) * 2019-04-30 2021-07-20 广东菲鹏生物有限公司 一种丙型肝炎病毒检测试剂盒
CN111218438B (zh) * 2019-11-22 2022-11-15 东方海洋(北京)医学研究院有限公司 一种链球菌dna酶b抗原及其应用
CN111965356B (zh) * 2019-11-28 2023-09-08 上海荣盛生物药业股份有限公司 巯基还原组合物及荧光微球层析试纸和应用
CN111579781A (zh) * 2020-05-21 2020-08-25 深圳市宇诺生物技术有限公司 丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒、制备方法及检测方法
CN114184784A (zh) * 2020-09-14 2022-03-15 深圳普门科技股份有限公司 新型冠状病毒抗体检测试剂盒及新型冠状病毒抗体检测装置
CN113219169B (zh) * 2021-05-22 2021-12-17 北京金诺百泰生物技术有限公司 生物检测用封闭剂及其制备方法、包被板及应用该包被板的试剂盒

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH03287069A (ja) * 1990-04-02 1991-12-17 Kuraray Co Ltd 測定試薬
US5712087A (en) * 1990-04-04 1998-01-27 Chiron Corporation Immunoassays for anti-HCV antibodies employing combinations of hepatitis C virus (HCV) antigens
JP3287069B2 (ja) 1993-08-13 2002-05-27 住友電気工業株式会社 全反射蛍光ｘ線分析の測定方法及びその装置
DE4430973A1 (de) * 1994-07-25 1996-02-01 Boehringer Mannheim Gmbh Hapten-markierte Peptide
DE4428705A1 (de) * 1994-08-12 1996-02-15 Boehringer Mannheim Gmbh Rekombinantes Antigen aus der NS3-Region des Hepatitis C Virus
US5861264A (en) * 1996-05-21 1999-01-19 Axys Pharmaceuticals, Inc. Anti-tryptase detection as a diagnostic for inflammatory diseases
GB2339018B (en) * 1998-06-22 2003-07-30 Ortho Clinical Diagnostics Specific binding assays using methyl orange
US20030027214A1 (en) * 1999-02-17 2003-02-06 Kamb Carl Alexander Methods for substrate-ligand interaction screening
AU2001272945A1 (en) * 2000-06-15 2001-12-24 Chiron Corporation Immunoassays for anti-hcv antibodies
US6984494B2 (en) * 2000-08-15 2006-01-10 Genentech, Inc. Analytical method
KR100434117B1 (ko) * 2000-11-03 2004-06-04 동화약품공업주식회사 Ｈｃｖ유래 재조합 혼합항원을 이용한 ｃ형 간염바이러스의 검출방법과 진단키트
US20030170618A1 (en) * 2001-02-02 2003-09-11 Chien David Y. Buffers for stabilizing antigens
US20030108563A1 (en) * 2001-11-07 2003-06-12 Chander Bahl Reagents for the simultaneous detection of HCV core antigens and antibodies
US7332269B2 (en) * 2001-11-11 2008-02-19 Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. HCV core protein sequences
US7172877B2 (en) * 2003-01-09 2007-02-06 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for peptide and protein labeling
EP1452601A1 (en) * 2003-02-28 2004-09-01 Roche Diagnostics GmbH Enhanced expression of fusion polypeptides with a biotinylation tag
CN100401067C (zh) * 2003-05-09 2008-07-09 李晨阳 丙型肝炎病毒抗体桥式双抗原夹心elisa检测法

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101968483A (zh) * 2009-07-27 2011-02-09 深圳市菲鹏生物股份有限公司 一步半双抗原夹心免疫检测法
CN105467113A (zh) * 2015-11-10 2016-04-06 国家纳米科学中心 一种基于荧光素和萤光素酶生物发光反应的免疫分析方法
CN109678954A (zh) * 2018-12-29 2019-04-26 山东莱博生物科技有限公司 一对能够特异性识别hcv ns3蛋白的单克隆抗体及其应用
CN110456073A (zh) * 2019-08-21 2019-11-15 广东菲鹏生物有限公司 双抗原夹心检测抗体的方法及试剂盒
CN110456073B (zh) * 2019-08-21 2023-09-22 广东菲鹏生物有限公司 双抗原夹心检测抗体的方法及试剂盒

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