CN109678954A - 一对能够特异性识别hcv ns3蛋白的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

一对能够特异性识别hcv ns3蛋白的单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了两种配对使用的能够特异性识别HCV NS3蛋白的单克隆抗体，其中所述抗体命名为3A10B5，其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；另一抗体命名为7E3B6，其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明还公开了所述单克隆抗体作为包被抗体和检测抗体配对使用在制备丙型肝炎病毒抗原ELISA检测试剂或试剂盒中的应用。实验证实本发明的单抗与HCV感染者血清中的NS3抗原的结合具有高度的特异性和亲和力，对丙型肝炎病毒筛查具有重要的应用价值。

Description

一对能够特异性识别HCV NS3蛋白的单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学与免疫学技术领域，涉及两种配对使用的能够特异性识别HCV NS3蛋白的单克隆抗体及其应用。
背景技术
丙型肝炎病毒(Hepatitis Cvirus，HCV)感染是导致人类罹患丙型肝炎的主要原因。据统计，目前全世界约有近1.7亿人口感染丙型肝炎病毒，约70％的感染者会发展为慢性感染，而其中5％的感染者病情会加重为肝硬化或肝细胞癌。目前，尚不存在可用于预防HCV感染的疫苗，因此，采用具有高灵敏度和高特异性的检测方法在相关人群中进行筛查，是控制HCV传播和尽早发现病毒携带者的有效措施，对保证人民健康和维护公共安全具有重大意义。
HCV是一种单链RNA病毒，其基因组长约9.6kb，编码一个长约3000aa的多聚蛋白前体，最终能够形成C、E1、E2、P7四种结构蛋白以及NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B六种非结构蛋白。由于病毒RNA在感染者血清样品中易降解、较不稳定，因此，HCV RNA的检测不适用于大规模人群筛查。而HCV核心抗原的出现时间在HCV感染后12-15天即可检测到，较HCVRNA的出现仅相差1-2天，因此，HCV抗原经常被应用于大规模筛查检测中。其中NS3蛋白由于在感染者体内出现时间早、持续时间长且具有较强的抗原性和免疫原性，是目前HCV检测中的主要候选抗原之一。基于此，寻找能够与NS3抗原具有高亲和力和特异性结合的抗体，有助于提高对于HCV感染者血清中NS3抗原检测的灵敏度和准确性，并且对提早发现、治疗携带者和控制病毒传播具有重要意义。经检索，有关与NS3抗原具有高亲和力和特异性结合的单克隆抗体或利用其开发HCV抗原检测试剂或试剂盒的应用目前还鲜有报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供两种配对使用的能够特异性识别HCV NS3蛋白的单克隆抗体及其应用。
本发明所述能够特异性识别HCV NS3蛋白的单克隆抗体，包括轻链和重链，其特征在于：所述抗体命名为3A10B5，其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。进一步的，本发明还公开了编码该单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸分子，其特征在于：编码该单克隆抗体轻链的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示，编码该单克隆抗体重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
同时，本发明还提供了一种能够特异性识别HCV NS3蛋白的单克隆抗体，包括轻链和重链，其特征在于：所述抗体命名为7E3B6，其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。进一步的，本发明还公开了编码该单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸分子，其特征在于：编码该单克隆抗体轻链的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示，编码该单克隆抗体重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
本发明提供了一种能分泌产生名为3A10B5单克隆抗体的杂交瘤细胞，其特征在于：所述杂交瘤细胞是命名为3A10B5的杂交瘤细胞株，该细胞株已于2018年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保存编号为：CCTCC NO.C2018227。
同时，本发明还提供了一种能分泌产生名为7E3B6单克隆抗体的杂交瘤细胞，其特征在于：所述杂交瘤细胞是命名为7E3B6的杂交瘤细胞株，该细胞株已于2018年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保存编号为：CCTCC NO.C2018228。
本发明提供了一种能够特异性诱导产生名为3A10B5单克隆抗体和/或名为7E3B6单克隆抗体的抗原肽段，其特征在于：所述抗原肽段位于HCV NS3蛋白的226-480aa之间，其氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
上述名为3A10B5单克隆抗体或名为7E3B6单克隆抗体的制备方法，步骤是：
(a)用SEQ ID NO.9所示的肽段免疫小鼠；
(b)将免疫小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，获得杂交瘤细胞；
(c)从步骤(b)中的杂交瘤细胞中选出能够分泌抗截短型HCV NS3蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞，并优选出3A10B5的细胞株和/或7E3B6的细胞株；
(d)培养步骤(c)选出的杂交瘤细胞从中制得名为3A10B5单克隆抗体或名为7E3B6单克隆抗体。
本发明所述的单克隆抗体对作为包被抗体和检测抗体配对使用在制备丙型肝炎病毒抗原ELISA检测试剂或试剂盒中的应用。
其中：所述包被抗体选命名为3A10B5的单克隆抗体，所述检测抗体选命名为7E3B6的单克隆抗体；应用时ELISA检测板上包被有抗体3A10B5，酶稀样品中含有HRP标记的抗体7E3B6，所述包被抗体和检测抗体配对使用。
实验证实：ELISA检测板上包被有命名为3A10B5的单克隆抗体，酶稀样品中含有HRP标记的命名为7E3B6的单克隆抗体，构成单克隆抗体对。以此技术方案能够有效增强灵敏度和特异性，提高HCV抗原的检出率，为丙型肝炎抗原检测试剂或试剂盒的研发提供了良好的抗体来源。
本发明公开了两种配对使用的能够特异性识别HCV NS3蛋白的单克隆抗体及其应用。为实现发明目的，发明人查阅文献发现：HCV NS3近C端(181-631aa)具有三磷酸腺苷酶和解旋酶活性，且具有良好的免疫原性。进一步实验研究发现：226-480aa区段展示出更好的抗体结合能力。基于此，发明人设计载体表达此多肽，与载体蛋白偶联作为免疫原，并通过免疫原制备方式获得了单克隆抗体。
本发明的优点和突出效果在于：
1.本发明涉及的NS3抗体是通过截取NS3近C端226-480aa片段免疫所得。
2.本发明中提到的单克隆抗体对具有识别HCV NS3蛋白的极高的灵敏度和特异性。
3.本发明涉及到的HCV NS3抗体对能够应用于丙肝病毒抗原检测试剂盒的研制，在临床上适用于HCV感染者的筛查工作，能够有效减少漏检现象，在临床上具有很大的应用前景和推广价值。
附图说明
图1：HCV NS3单克隆抗体电泳图。
其中：3A10B5泳道为3A10B5单克隆抗体电泳图，7E3B6泳道为7E3B6单克隆抗体电泳图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
本发明实施例中使用的方法为常规方法，使用的试剂如弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、PEG5000、cloneeasy、HT、HRP购自sigma公司，胎牛血清、细胞培养基购自gibco公司；Balb/C小鼠购自山东省实验动物中心。
实施例1：HCV NS3单克隆抗体的制备
1.1抗原制备
根据NCBI GenBank上的HCV NS3蛋白序列(ID：O92530.3)，用TMHMM软件分析NS3蛋白的跨膜域，IEDB软件分析NS3蛋白免疫原性、亲疏水性及表面可及性，发现NS3蛋白226-480aa氨基酸抗原性、亲水性及表面可及性较强，并能通过氨基酸突变改变相应序列极性。经过上述分析，最终筛选确定重组HCV NS3抗原多肽序列为:226-480aa(氨基酸序列如SEQID NO.9所示)。该短肽及N端偶联人IL-1β蛋白短肽(IL-1β-NS3)由济南博尚生物公司合成。
1.2动物免疫
取上述合成抗原，调整其浓度至0.5mg/ml与完全弗氏佐剂等量混合通过细胞破碎仪充分混合后备用，每只小鼠通过皮下4点注射，每点注射0.25ml，共注射1ml，免疫5只雌性BalB/c小鼠(8周龄)。第一次免疫剂量为100μg/只，两周后通过不完全弗氏佐剂乳化抗原进行第二次免疫，剂量与第一次相同；两周和四周后分别进行第三次、第四次免疫，条件、步骤与第二次相同。
取截短型HCV NS3融合蛋白适当稀释后包被酶标板(2μg/ml)，4℃过夜。TBST洗涤酶标板，5％BSA溶液37℃封闭2小时；TBST漂洗三次后4℃保存备用。第四次免疫后3天，从小鼠尾部取血，离心分离血清，用样本稀释液稀释血清，进行倍比稀释后，加入封闭后的酶标板，37℃孵育1小时。TBST洗涤三遍，加入HRP标记的羊抗鼠二抗，37℃孵育40分钟。取出板条，TBST漂洗5次，加入TMB底物，37℃孵育20分钟。取出后加入终止液，酶标仪测量OD450。选取效价值在1000-5000范围的小鼠用于下一步细胞融合实验。
1.3融合和单克隆抗体筛选
1.3.1饲养细胞的制备
用小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，于融合前一天制备。具体操作如下：选取健康的BALB/c小鼠(8周龄)，颈椎脱臼处死，75％乙醇消毒5分钟。将小鼠固定于解剖台，用镊子提起腹部，用无菌剪沿两侧剪开皮肤，充分暴露腹部。用酒精擦拭消毒后，用注射器取5mlRPMI 1640培养基注入小鼠腹腔，且注射器在腹腔内反复抽吸数次后，吸出腹腔内液体，注入离心管内，1000rpm，离心10min，弃上清。用5ml HAT培养基悬浮细胞，计数，调整细胞浓度为2×105/ml。
将细胞悬液加入96孔培养板，每孔0.1ml，37℃，5％CO2培养箱中培养。
1.3.2骨髓瘤细胞的培养
在融合前2周将骨髓瘤细胞SP2/0从液氮罐取出，37℃水浴解冻，1500rpm离心8min，弃上清后用含20％胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬，置37℃、5％CO2培养箱中培养，次日换液，连续培养3天待骨髓瘤细胞的活性恢复后，扩大培养。在培养瓶中接种骨髓瘤细胞，一周后再次接种，使细胞处于对数生长期。融合前12小时换液一次。融合当天，将细胞从瓶壁上轻轻吹起，收集于50ml离心管内，1000rpm离心5-10min，弃上清，加入30ml培养基，重复离心一次，然后重悬于10ml无血清的RPMI 1640培养基中。
1.3.3小鼠脾脏细胞的获得
细胞融合前三天用抗原对小鼠进行腹腔脾区加强免疫一次，三天后取血清效价最高的小鼠，处死后，乙醇消毒，在超净台内取出脾脏。剥离结缔组织，用液体培养基轻轻洗涤。将脾脏置于200目筛网上研磨，加入液体培养基过滤后，1500rpm离心5min，收集沉淀，得到脾细胞。
1.3.4细胞融合
将分离的脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0以(5-10):1的比例混合于50ml的离心管中，1000rpm离心10min，弃上清，轻柔打散沉淀的细胞，置37℃水浴中预热，缓慢沿离心管壁滴加1ml 50％的PEG 4000，边加边转动离心管，1min内加完，轻柔悬浮细胞使两种细胞融合，静置1min，加入15ml RPMI 1640培养基终止融合，静置10min，1000rpm离心10min，弃上清，1％HAT和20％(体积比)胎牛血清的RPMI 1640改良型培养基重悬细胞融合物。将细胞悬液按150μl/孔分配到96孔饲养细胞板中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。5天后用含1％HAT的培养基半换液；10天后用1％HT的培养基置换出HAT。待培养至细胞覆盖孔底时，吸取细胞上清进行抗体检测。
1.4杂交瘤细胞株的筛选、克隆
适当稀释融合后的细胞，通过96孔板培养10-14天，待克隆生长到全孔的1/4左右时，标记单克隆及多克隆，对单克隆进行ELISA检测。挑选OD值最高的单克隆再进行有限稀释，接入96孔板上再次亚克隆，重复数次至阳性孔比率为100％。将筛选得到的阳性单克隆进行扩大培养，收集并保存细胞。最终，筛选到能够稳定分泌单克隆抗体的5个细胞株，分别命名为：3A10B5、3E2B10、5A10C9、7E3B6和8D11B11。
1.5单克隆抗体的制备
于杂交瘤细胞接种前一周，取3只8周龄的小鼠，每只注射0.5ml灭菌液体石蜡。
复苏杂交瘤细胞，扩大培养，收集细胞后，用RPMI 1640培养基调整细胞数目为5×105-1×106个/ml，按照0.5ml/只的剂量注射一周前处理好的小鼠。待小鼠腹部明显膨大时，用12号注射器抽取腹水。10000rpm离心10min，小心吸取中层清液，即得到抗体粗提液。-20℃保存备用。
实施例2：单克隆抗体的纯化
用超纯水冲洗柱子，约5个柱体积；用平衡液冲洗柱子，约5个柱体积(流速为1.5ml/min)。将抗体粗提液用缓冲液稀释2-3倍，采用0.45μm微孔滤膜抽滤后，与填料中的protein A结合(1.5ml/min)。平衡液冲洗柱子，直至把基线平衡，至少10个柱体积。使用洗脱液进行抗体洗脱(流速为1.5ml/min)，当UV值高于0.1时开始收集流穿液，UV值升值2.0以上时开始降落，当UV值低于0.1时，停止接收流穿液，所收集到流穿液为截短型HCV NS3单克隆抗体溶液。利用超滤浓缩管浓缩收集液至15ml。洗脱液继续冲洗亲和柱至UV值平衡，约5个柱体积。用超纯水冲洗柱子，约5个柱体积；用脱盐液冲洗柱子，约5个柱体积(流速为3ml/min)，把UV值调零点。
将抗体浓缩液上样至脱盐柱，使用洗脱液进行抗体洗脱(流速为1.5ml/min)，当UV值高于0.1时开始收集流穿液，UV值上升，当UV值低于0.1时，停止接收流穿液，所收集到流穿液为截短型HCV NS3单克隆抗体溶液。平衡液继续冲洗亲和柱至UV值平衡，约5个柱体积。
使用Nanodrop测定截短型HCV NS3单克隆抗体溶液浓度，加0.025％浓度NaN3置4℃保存。
实施例3：抗体鉴定
3.1单克隆抗体的效价鉴定
取合成HCV NS3抗原短肽包被酶标板，5％BSA溶液封闭后间接ELASA法检测纯化后单克隆抗体的效价。把含有上述单克隆抗体的腹水样品分别做倍比稀释，PBS做阴性对照，每孔100μl，加入酶标板中，37℃温育1小时。TBST洗涤后，加入1:4000稀释的HRP标记的二抗，每孔100μl，37℃孵育1小时。TBST洗涤后，加入TMB底物显色20min后终止反应。酶标仪读取OD450值，检测结果见表1。
3.2亚型鉴定
使用抗体分型试剂盒对所述单克隆抗体进行亚型鉴定，其中3A10B5、3E2B10、5A10C9和7E3B6为IgG2b亚型，轻链为κ链，8D11B11为IgG2a亚型，轻链为λ链，结果见表1。
表1抗体效价检测及亚型鉴定实验结果
3.3抗体配对实验
为了挑选包被抗体和检测抗体的最佳组合，将3A10B5、3E2B10、5A10C9、7E3B6和8D11B11五株单克隆抗体分别包被酶标板，4℃过夜。第二天取出酶标板，TSBT洗涤一次，5％BSA溶液37℃封闭2小时；每孔加入HCV NS3抗原100μl(500pg/ml)，以标准品蛋白稀释液作为阴性对照，37℃孵育1小时。孵育完成后取出酶标板，TBST洗涤三次，分别加入已经通过过碘酸钠法标记过HRP的3A10B5、3E2B10、5A10C9、7E3B6和8D11B11检测抗体，将五株单克隆抗体和所对应的酶标单抗两两配对进行双抗体夹心ELISA实验，37℃孵育1小时。TBST洗涤五次，加入TMB底物，37℃显色20min。取出后加终止液，在酶标仪上测定OD450读数。根据标准品的OD值与阴性对照的背景值，选出最为理想的单克隆抗体对，配对筛选结果见表2。最终确定以为3A10B5包被抗体，以7E3B6为检测抗体。
表2抗体配对实验筛选结果
注：×表示未进行该组测定
3.4 HCV NS3单克隆抗体可变区序列的测定
提取杂交瘤细胞3A10B5和7E3B6的mRNA并反转录，以cDNA为模板使用可变区通用引物和高保真酶进行PCR扩增，回收目的片段，克隆连入T载体，送青岛华大公司进行测序。
3A10B5单克隆抗体，其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。进一步的，编码该单克隆抗体轻链的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示，编码该单克隆抗体重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
7E3B6单克隆抗体，其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。进一步的，编码该单克隆抗体轻链的核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示，编码该单克隆抗体重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
其中：能分泌产生名为3A10B5单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为3A10B5杂交瘤细胞株，该细胞株已于2018年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保存编号为：CCTCCNO.C2018227。能分泌产生名为7E3B6单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为7E3B6杂交瘤细胞株，该细胞株已于2018年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保存编号为：CCTCCNO.C2018228。中国典型培养物保藏中心地址：中国，武汉，武汉大学。
实施例4抗体特异性及交叉反应检测
4.1抗体特异性检测
用pH9.6的碳酸盐缓冲液将抗体3A10B5稀释到1.0μg/ml，包被酶标板，4℃过夜。第二天取出酶标板，TSBT洗涤一次，5％BSA溶液37℃封闭2小时；每孔加入收集的HCV阳性血清(经HCV抗体检测确定)，以健康人血清样品阴性对照，37℃孵育1小时。孵育完成后取出酶标板，TBST洗涤三次，分别加入标记了HRP的7E3B6抗体100μl(1:4000稀释)，37℃孵育1小时。TBST洗涤五次，加入TMB底物，37℃显色20min。取出后加终止液，在酶标仪上测定OD450读数，检测结果见表3。结果表明，在100例样本中可以检出98例阳性样本，阳性符合率达到98％。
表3抗体特异性检测结果
试剂名称 阳性血清
北京万泰HCV抗体检测试剂盒 50
3A10B5/7E3B6抗体对检测 49
4.2抗体交叉性检测
采集了200例非HCV疾病的交叉样本，主要包括艾滋病(HIV)、梅毒(TP)、乙肝(HBV)，检测抗体组合与其他抗原是否存在交叉反应，见表4。实验表明，使用本抗体对检测HIV、TP和HBV抗原未出现假阳性现象，表明本抗体对HIV、TP和HBV抗原无交叉现象。
表4抗体交叉性检测结果
HBV TP HIV
医院检测结果(例) 65 65 70
3A10B5/7E3B6抗体对检测阳性(例) 0 0 0
上述结果表明，本抗体对特异好、灵敏度高，使用本抗体对能够有效提高HCV抗原的检出率，为丙型肝炎抗原检测试剂或试剂盒的研发提供了良好的抗体来源。
序列表
<110> 山东莱博生物科技有限公司
<120> 一对能够特异性识别HCV NS3蛋白的单克隆抗体及其应用
<141> 2018-12-07
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 单克隆抗体3A10B5轻链氨基酸序列
<400> 1
EIVMTQASLP SPVSLGVQAS ISCEQSALLE HNNGNTYLNW OLYPKGQSPQ LLIYRVSNRF 60
ALGDDRFSGS GSGASFTLKI SRVEAEDLGV YFCLQAAHVP FTASLNTKLE IKRADASVPT 120
SIFPPSSEQL TSGGASVVCF LNNFYPKDIN VKWKIDGSER QNGVLNSWTD QDSKDSTYSM 180
SSTLTLTKDE YERHNSYTCE ATHKTSTSPI VKSFYRNEC 219
<210> 2
<211> 478
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 单克隆抗体3A10B5重链氨基酸序列
<400> 2
MDRLTASLFA LIVPAYVLSQ ETLKESGPGI LKPSSTLSLA CSFSTASLST SGMGVSSIRQ 60
PSTGLEWLAH IAWDSDKVYN PSEVSALTIS KDQSRQQVFL KITSSDSADT ATYYCVRASD 120
EYGSSRDYFD YWCQGTFLTV ESAKTTPSVR YPLACGCGDT TGSPVTLACS PPGYFPESVT 180
VTWNSGSLSK GVHTFPALLQ SGLLYMSSAQ TVPSSTWPSQ TVTCSVAHPA SSTTVDKKLE 240
PSGPISTINP CPPCKECHKC PAPNLEGGPS VFIFPDNIKD VLMISLTPKV TCVVVPVSED 300
DPDALISWFV NNVEVHTAQT QTHREDYNST IRVVSTLPIQ HQDWMSGKEF KCKVNNKDLP 360
SPIERTISKI KGLVRAPQVY ILPPTAEQLS RKDVSLTCLV VGFNPGDISV EWTSNGHTEE 420
NYKDTAPVLD SDGSYKIYSK LNMKTSKWEK TDSFSCNVRH EGLKNYYLKK TISRSPGK 478
<210> 3
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 单克隆抗体7E3B6轻链氨基酸序列
<400> 3
EISMTQAQLP SPVSLGDQAI QSCEQSALNE HYDGNTYLNE NLYPKGQSPQ LSSYRVSEVF 60
ALGEERFSGA GSGASFTLLI SRVEAESLGV YFCLQANHVP FTASLNTKAI KRADASVPTS 120
IFVPSSEQLT SGGASVVCFL NNFYPKDINV KWKIDGSERQ NGVLNSWTDQ DSKDSTYSMS 180
STLTLTKDEY ERHNSYTCEA THKTSTSPIV KSFYRNEC 218
<210> 4
<211> 479
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 单克隆抗体7E3B6重链氨基酸序列
<400> 4
MDRLTSSFLL LIVPEYSLSQ VTLAQSGAGI LKPSQTLSST CAFSGFSLST SGMCVGWIRQ 60
SSGKGLEWLA HIWEDSDKHY NPSLKSQLTI SKDWSFNAVF LKITSVDTAD TATDYCVERS 120
FSALPSRDYF DYWAYYTTLT VSEAKTTPPS NYPLAPGCSV TTASQVTLGC LVKGYFPASV 180
TVTWNSGSLS ESVHTYLALL QSGLYTMSSQ VTVPSSTGAS QTVTMSVAHP ASELTVHDKL 240
EPSGPISTIC PCPLCKECHK CPAPNLEGGT SVFIFPPNIK DVLMISLTPS VTCVVVNVSE 300
DDPDVQISWF VGNVEVHTAQ TQTHREDYNS TIRVVSTLPI QHQDWMSGKE FKCKVNNKDL 360
PSPIERTPSK IKGLVRAPQV YILPPPAEQL SEASVSLTCL VIGFNPGDIS VEWTSAGHTE 420
ENYADTAPVL DSDMSYFIYS KLEMDDSKWE KTDSFSCNVR AWGLKNYYLK KTISRSPGK 479
<210> 5
<211> 654
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 单克隆抗体3A10B5轻链核苷酸序列
<400> 5
gagatcgtga tgacccaggc cagcctgccc agccccgtga gcctgggcgt gcaggccagc 60
atcagctgcg agcagagcgc cctgctggag cacaacaacg gcaacaccta cctgaactgg 120
ctgtacccca agggccagag cccccagctg ctgatctaca gggtgagcaa caggttcgcc 180
ctgggcgacg acaggttcag cggcagcggc agcggcgcca gcttcaccct gaagatcagc 240
agggtggagg ccgaggacct gggcgtgtac ttctgcctgc aggccgccca cgtgcccttc 300
accgccagcc tgaacaccaa gctggagatc aagagggccg acgccagcgt gcccaccagc 360
atcttccccc ccagcagcga gcagctgacc agcggcggcg ccagcgtggt gtgcttcctg 420
aacaacttct accccaagga catcaacgtg aagtggaaga tcgacggcag cgagaggcag 480
aacggcgtgc tgaacagctg gaccgaccag gacagcaagg acagcaccta cagcatgagc 540
agcaccctga ccctgaccaa ggacgagtac gagaggcaca acagctacac ctgcgaggcc 600
acccacaaga ccagcaccag ccccatcgtg aagagcttct acaggaacga gtgc 654
<210> 6
<211> 1434
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 单克隆抗体3A10B5重链核苷酸序列
<400> 6
atggacaggc tgaccgccag cctgttcgcc ctgatcgtgc ccgcctacgt gctgagccag 60
gagaccctga aggagagcgg ccccggcatc ctgaagccca gcagcaccct gagcctggcc 120
tgcagcttca gcaccgccag cctgagcacc agcggcatgg gcgtgagcag catcaggcag 180
cccagcaccg gcctggagtg gctggcccac atcgcctggg acagcgacaa ggtgtacaac 240
cccagcgagg tgagcgccct gaccatcagc aaggaccaga gcaggcagca ggtgttcctg 300
aagatcacca gcagcgacag cgccgacacc gccacctact actgcgtgag ggccagcgac 360
gagtacggca gcagcaggga ctacttcgac tactggtgcc agggcacctt cctgaccgtg 420
gagagcgcca agaccacccc cagcgtgagg taccccctgg cctgcggctg cggcgacacc 480
accggcagcc ccgtgaccct ggcctgcagc ccccccggct acttccccga gagcgtgacc 540
gtgacctgga acagcggcag cctgagcaag ggcgtgcaca ccttccccgc cctgctgcag 600
agcggcctgc tgtacatgag cagcgcccag accgtgccca gcagcacctg gcccagccag 660
accgtgacct gcagcgtggc ccaccccgcc agcagcacca ccgtggacaa gaagctggag 720
cccagcggcc ccatcagcac catcaacccc tgccccccct gcaaggagtg ccacaagtgc 780
cccgccccca acctggaggg cggccccagc gtgttcatct tccccgacaa catcaaggac 840
gtgctgatga tcagcctgac ccccaaggtg acctgcgtgg tggtgcccgt gagcgaggac 900
gaccccgacg ccctgatcag ctggttcgtg aacaacgtgg aggtgcacac cgcccagacc 960
cagacccaca gggaggacta caacagcacc atcagggtgg tgagcaccct gcccatccag 1020
caccaggact ggatgagcgg caaggagttc aagtgcaagg tgaacaacaa ggacctgccc 1080
agccccatcg agaggaccat cagcaagatc aagggcctgg tgagggcccc ccaggtgtac 1140
atcctgcccc ccaccgccga gcagctgagc aggaaggacg tgagcctgac ctgcctggtg 1200
gtgggcttca accccggcga catcagcgtg gagtggacca gcaacggcca caccgaggag 1260
aactacaagg acaccgcccc cgtgctggac agcgacggca gctacaagat ctacagcaag 1320
ctgaacatga agaccagcaa gtgggagaag accgacagct tcagctgcaa cgtgaggcac 1380
gagggcctga agaactacta cctgaagaag accatcagca ggagccccgg caag 1434
<210> 7
<211> 654
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 单克隆抗体7E3B6轻链核苷酸序列
<400> 7
gagatcagca tgacccaggc ccagctgccc agccccgtga gcctgggcga ccaggccatc 60
cagagctgcg agcagagcgc cctgaacgag cactacgacg gcaacaccta cctgaacgag 120
aacctgtacc ccaagggcca gagcccccag ctgagcagct acagggtgag cgaggtgttc 180
gccctgggcg aggagaggtt cagcggcgcc ggcagcggcg ccagcttcac cctgctgatc 240
agcagggtgg aggccgagag cctgggcgtg tacttctgcc tgcaggccaa ccacgtgccc 300
ttcaccgcca gcctgaacac caaggccatc aagagggccg acgccagcgt gcccaccagc 360
atcttcgtgc ccagcagcga gcagctgacc agcggcggcg ccagcgtggt gtgcttcctg 420
aacaacttct accccaagga catcaacgtg aagtggaaga tcgacggcag cgagaggcag 480
aacggcgtgc tgaacagctg gaccgaccag gacagcaagg acagcaccta cagcatgagc 540
agcaccctga ccctgaccaa ggacgagtac gagaggcaca acagctacac ctgcgaggcc 600
acccacaaga ccagcaccag ccccatcgtg aagagcttct acaggaacga gtgc 654
<210> 8
<211> 1437
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 单克隆抗体7E3B6重链核苷酸序列
<400> 8
atggacaggc tgaccagcag cttcctgctg ctgatcgtgc ccgagtacag cctgagccag 60
gtgaccctgg cccagagcgg cgccggcatc ctgaagccca gccagaccct gagcagcacc 120
tgcgccttca gcggcttcag cctgagcacc agcggcatgt gcgtgggctg gatcaggcag 180
agcagcggca agggcctgga gtggctggcc cacatctggg aggacagcga caagcactac 240
aaccccagcc tgaagagcca gctgaccatc agcaaggact ggagcttcaa cgccgtgttc 300
ctgaagatca ccagcgtgga caccgccgac accgccaccg actactgcgt ggagaggagc 360
ttcagcgccc tgcccagcag ggactacttc gactactggg cctactacac caccctgacc 420
gtgagcgagg ccaagaccac cccccccagc aactaccccc tggcccccgg ctgcagcgtg 480
accaccgcca gccaggtgac cctgggctgc ctggtgaagg gctacttccc cgccagcgtg 540
accgtgacct ggaacagcgg cagcctgagc gagagcgtgc acacctacct ggccctgctg 600
cagagcggcc tgtacaccat gagcagccag gtgaccgtgc ccagcagcac cggcgccagc 660
cagaccgtga ccatgagcgt ggcccacccc gccagcgagc tgaccgtgca cgacaagctg 720
gagcccagcg gccccatcag caccatctgc ccctgccccc tgtgcaagga gtgccacaag 780
tgccccgccc ccaacctgga gggcggcacc agcgtgttca tcttcccccc caacatcaag 840
gacgtgctga tgatcagcct gacccccagc gtgacctgcg tggtggtgaa cgtgagcgag 900
gacgaccccg acgtgcagat cagctggttc gtgggcaacg tggaggtgca caccgcccag 960
acccagaccc acagggagga ctacaacagc accatcaggg tggtgagcac cctgcccatc 1020
cagcaccagg actggatgag cggcaaggag ttcaagtgca aggtgaacaa caaggacctg 1080
cccagcccca tcgagaggac ccccagcaag atcaagggcc tggtgagggc cccccaggtg 1140
tacatcctgc ccccccccgc cgagcagctg agcgaggcca gcgtgagcct gacctgcctg 1200
gtgatcggct tcaaccccgg cgacatcagc gtggagtgga ccagcgccgg ccacaccgag 1260
gagaactacg ccgacaccgc ccccgtgctg gacagcgaca tgagctactt catctacagc 1320
aagctggaga tggacgacag caagtgggag aagaccgaca gcttcagctg caacgtgagg 1380
gcctggggcc tgaagaacta ctacctgaag aagaccatca gcaggagccc cggcaag 1437
<210> 9
<211> 280
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> HCV NS3抗原氨基酸序列
<400> 9
APVRSLYCTL RDSQQKSLVM GGGGCLNPSV AATLGFGSYM STAHGIDPNI RTGVRTITTG 60
GPITYSTYGK FLADGGCSGG AYDIIICDEC HSTDPTTVLG IGTVLDQAET AGVRLTVLAT 120
ATPPGSVTVP HPNITETALP STGEVPFYGK AIPLECIKGG RHLIFCHSSS SCDELAKQLR 180
TLGLNAVAFY RGVDVSVIPT AGDAAVCATD ALMTGYTGDF DSVIDCNVAV TQIVDFSLDP 240
TFSIEAGDVP QDAVARSQRR GRTGRGKPGV YRYVSQGERP 280

Claims (9)

1.一种能够特异性识别HCV NS3蛋白的单克隆抗体，包括轻链和重链，其特征在于：所述抗体命名为3A10B5，其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.编码权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸分子，其特征在于：编码单克隆抗体轻链的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示，编码单克隆抗体重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
3.一种能够特异性识别HCV NS3蛋白的单克隆抗体，包括轻链和重链，其特征在于：所述抗体命名为7E3B6，其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其重链的氨基酸序列如SEQID NO.4所示。
4.编码权利要求3所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸分子，其特征在于：编码单克隆抗体轻链的核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示，编码单克隆抗体重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
5.一种能分泌产生权利要求1所述单克隆抗体的杂交瘤细胞，其特征在于：所述杂交瘤细胞是命名为3A10B5的杂交瘤细胞株，该细胞株已于2018年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保存编号为：CCTCC NO.C2018227。
6.一种能分泌产生权利要求3所述单克隆抗体的杂交瘤细胞，其特征在于：所述杂交瘤细胞是命名为7E3B6的细胞株，该细胞株已于2018年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保存编号为：CCTCC NO.C2018228。
7.能够特异性诱导产生权利要求1和/或3所述单克隆抗体的抗原肽段，其特征在于：所述抗原肽段位于HCV NS3蛋白的226-480aa之间，其氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
8.权利要求1和3所述的单克隆抗体作为包被抗体和检测抗体配对使用在制备丙型肝炎病毒抗原ELISA检测试剂或试剂盒中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述包被抗体选命名为3A10B5的单克隆抗体，所述检测抗体选命名为7E3B6的单克隆抗体；应用时ELISA检测板上包被有抗体3A10B5，酶稀样品中含有HRP标记的抗体7E3B6，所述包被抗体和检测抗体配对使用。
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