CN109678955B - 一对检测HCV-cAg的单克隆抗体和分泌该抗体对的杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一对检测HCV‑cAg的单克隆抗体和分泌该抗体对的杂交瘤细胞株，其中所述抗体对是体命名为2G7和6A2的单克隆抗体，所述杂交瘤细胞株是能分泌产生2G7抗体的CCTCC NO.C2018229细胞株和分泌产生6A2抗体的CCTCC NO.C2018230细胞株。本发明还公开了所述检测HCV‑cAg的单克隆抗体对作为包被抗体和检测抗体配对使用在制备HCV‑cAg的ELISA检测试剂或试剂盒中的应用。实验证实本发明的抗体对能够通过ELISA方法对HCV‑cAg的检测达到5pg/ml的灵敏度，并实现HCV患者的检出符合率达98％，对丙肝的临床检测应用具有重要的意义和价值。

Description

一对检测HCV-cAg的单克隆抗体和分泌该抗体对的杂交瘤细 胞株及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学与免疫学技术领域，涉及一对检测HCV-cAg的单克隆抗体和分泌该抗体对的杂交瘤细胞株及其应用。
背景技术
丙型病毒性肝炎，简称为丙型肝炎、丙肝，是一种由丙型肝炎病毒(HCV)感染引起的病毒性肝炎，主要经输血、针刺、吸毒等传播，据世界卫生组织统计，全球HCV的感染率约为3％，估计约1.8亿人感染了HCV，每年新发丙型肝炎病例约3.5万例。丙型肝炎呈全球性流行，可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌(HCC)。未来20年内与HCV感染相关的死亡率将继续增加，对患者的健康和生命危害极大，已成为严重的社会和公共卫生问题。丙型肝炎病毒(HCV)是一种单股正链RNA病毒，与常见的DNA病毒所不同的是RNA病毒经常会发生变异，所以现在世界上没有有效的丙肝疫苗，这就给丙肝的有效预防带来很大困难。
HCV病毒为黄病毒科，体呈球形，直径小于80nm(在肝细胞中为36～40nm，在血液中为36-62nm)，为单股正链RNA病毒，在核衣壳外包绕含脂质的囊膜，囊膜上有刺突。HCV－RNA大约有9500－10000bp组成，在5′非编码区下游紧接一开放的阅读框(ORF)，其中基因组排列顺序为5'-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4-NS5-3'，能编码一个长度大约为3014个氨基酸的多聚蛋白前体，后者可经宿主细胞和病毒自身蛋白酶作用后，裂解成10种病毒蛋白，包括三种结构蛋白，即分子量19KD的核衣壳蛋白(或称核心蛋白，Core)和两种糖蛋白(分子量为33KD的E1蛋白，分子量72Kd的E2蛋白)，p7编码一种膜内在蛋白，其功能可能是一种离子通道。非结构蛋白部分则包括NS2，NS3，NS4A，NS5A和NS5B，非结构蛋白对丙肝病毒的生活周期非常重要。
HCV具有显著异源性和高度可变性，对已知全部基因组序列的HCV株进行分析比较其核苷酸和氨基酸序列存在较大差异。并表现HCV基因组各部位的变异程度不相一致，如5′-CR最保守，同源性在92-100％，而3′NCR区变异程度较高，在HCV的编码基因中，C区最保守、非结构(NS)区次之，编码囊膜蛋白E2/NS1可变性最高称为高可变区，本实验选择core区作为免疫抗原，是因为此区域高度保守，变异性小。
在HCV现症感染者中，RNA检测能够准确筛查出HCV感染者，而HCV cAg作为HCV RNA的相关性物质，因患者血清中HCV抗原含量极低，不易被检出。HCV cAg检测和HCV RNA检测的阳性符合率一般不高于60％，极易漏检。但是RNA作为分子检测手段，检测周期长、对检测人员的技术要求非常高、且费用较高，不适合所有医院的推广使用，基于此，寻找能够与HCVcAg具有高亲和力和特异性结合的抗体，有助于提高对于HCV感染者血清中HCV cAg检测的灵敏度和准确性，实现HCV cAg检测和HCV RNA检测的阳性符合率的提高和吻合，这对丙肝的临床检测应用具有重要意义。经检索，有关HCV cAg具有高亲和力和特异性结合的单克隆抗体或利用其开发HCV抗原检测试剂或试剂盒的应用，以及分泌该检测HCV-cAg抗体的高产杂交瘤细胞株目前还鲜有报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一对检测HCV-cAg的单克隆抗体和分泌该抗体对的杂交瘤细胞株及其应用。
本发明所述的一对检测HCV-cAg的单克隆抗体，该单克隆抗体对包括独立存放的第一单克隆抗体和第二单克隆抗体；其特征在于：所述第一单克隆抗体命名为2G7，其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述第二单克隆抗体命名为6A2，其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其重链的氨基酸序列如SEQID NO.4所示。
本发明还提供了编码上述检测HCV-cAg的单克隆抗体对或其抗原结合片段的核酸分子，其特征在于：编码第一单克隆抗体2G7轻链的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示，编码第一单克隆抗体2G7重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；编码第二单克隆抗体6A2轻链的核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示，编码第二单克隆抗体6A2重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
本发明公开了一对产生权利要求1所述检测HCV-cAg的单克隆抗体对的杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞对包括独立存放的第一杂交瘤细胞株和第二杂交瘤细胞株；其特征在于：所述第一杂交瘤细胞株是命名为2G7的细胞株，能分泌产生单克隆抗体2G7，该细胞株已于2018年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保存编号为：CCTCC NO.C2018229；所述第二杂交瘤细胞株是命名为6A2的细胞株，能分泌产生单克隆抗体6A2，该细胞株已于2018年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保存编号为：CCTCC NO.C2018230。
本发明还提供了能够特异性诱导产生权利要求1所述检测HCV-cAg的单克隆抗体对的抗原肽段，其特征在于：所述抗原肽段位于HCV core蛋白的2-140aa之间，其氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
上述检测HCV-cAg的单克隆抗体对的制备方法，步骤是：
(a)用SEQ ID NO.9所示的肽段免疫小鼠；
(b)将免疫小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，获得杂交瘤细胞；
(c)从步骤(b)中的杂交瘤细胞中选出能够分泌用于检测HCV-cAg的单克隆抗体的杂交瘤细胞；第一杂交瘤细胞株是命名为2G7的细胞株，能分泌产生单克隆抗体2G7，第二杂交瘤细胞株是命名为6A2的细胞株，能分泌产生单克隆抗体6A2；
(d)培养步骤(c)筛选出的杂交瘤细胞从中分离纯化制得名为2G7的单克隆抗体或名为6A2的单克隆抗体。
本发明所述的检测HCV-cAg的单克隆抗体对作为包被抗体和检测抗体配对使用在制备HCV-cAg的ELISA检测试剂或试剂盒中的应用。
其中：所述包被抗体选第一单克隆抗体2G7，所述检测抗体选第二单克隆抗体6A2；应用时ELISA检测板上包被有第一单克隆抗体2G7，酶稀样品中含有HRP标记的第二单克隆抗体6A2，所述第一单克隆抗体和所述第二单克隆抗体配对使用。
实验证实：本发明的抗体对能够通过ELISA方法对HCV-cAg的检测达到5pg/ml的灵敏度，并实现HCV患者的检出符合率达98％，对丙肝的临床检测应用具有重要的意义和价值。
本发明的优点和突出效果在于：
1)本发明涉及的检测HCV-cAg的单克隆抗体对是通过截取HCV core蛋白的2-140aa之间片段免疫所得。
2)本发明中提到的检测HCV-cAg的单克隆抗体对具有极高的灵敏度和特异性，对HCV-cAg的检测灵敏度达到5pg/ml，为HCV-cAg检测试剂或试剂盒的研发提供了良好的抗体来源。
3)本发明公开的检测HCV-cAg的单克隆抗体对制备的HCV-cAg检测试剂盒，在临床上用于HCV感染者的筛查工作时，HCV患者的检出符合率达到98％，能够有效减少漏检现象，显著提高HCV cAg的检出率，在临床上具有很大的应用前景和推广价值。
附图说明
图1：配对抗体2G7-6A2的SDS-PAGE电泳图。
其中：2G7泳道为2G7单克隆抗体电泳图，6A2泳道为6A2单克隆抗体电泳图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
本发明实施例中使用的方法为常规方法；使用的试剂如弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、PEG5000、cloneeasy、HT、HRP购自sigma公司，胎牛血清、细胞培养基购自gibco公司；Balb/C小鼠购自山东省实验动物中心。
实施例1：检测HCV-cAg的单克隆抗体的制备
1.1抗原制备
根据NCBI GenBank上的HCV core蛋白序列(ID：BAM14440.1)，用TMHMM软件分析core蛋白的跨膜域，IEDB软件分析HCV core蛋白免疫原性、亲疏水性及表面可及性，发现HCV core蛋白2-140aa氨基酸抗原性、亲水性及表面可及性较强，并能通过氨基酸突变改变相应序列极性。经过上述分析，最终筛选确定重组HCV-cAg多肽序列为:2-140aa(氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示)。该短肽及N端偶联人IL-1β蛋白短肽(IL-1β-NS3)由济南博尚生物公司合成。
1.2动物免疫
1)取上述合成抗原，调整其浓度至0.5mg/ml与完全弗氏佐剂等量混合通过细胞破碎仪充分混合乳化后，在6～8周龄的Balb/C雌性小鼠背部皮下分点注射，免疫剂量为60μg/只；
2)间隔14天，用不完全佐剂乳化的抗原同样背部皮下分点注射，免疫剂量为60μg/只；
3)间隔14天，用不完全佐剂乳化的抗原再做背部皮下分点注射，免疫剂量约100μg/只；
4)间隔3天，腹腔注射不加佐剂的抗原200μg/只。
对照组未免疫的小鼠眼眦取血至1.5ml离心管，离心取血清作为阴性对照；免疫效价高的小鼠去除眼球取血至1.5ml离心管，离心取血清作为阳性对照。小鼠摘除眼球取血后拉颈处死，在75％乙醇中浸泡10min，解剖取脾脏，分离出的脾细胞过200目细胞筛网，进行下一步细胞融合。
1.3细胞融合：
1)将脾细胞与骨髓瘤细胞分别用平衡盐缓冲液洗涤，1500rpm离心5min，弃上清；
2)使用台盼蓝对脾细胞与骨髓瘤细胞进行计数，要求细胞活率达到95％以上；
3)按照脾脏细胞:骨髓瘤细胞＝3:1～10:1的比例混合细胞(1只小鼠的脾脏配合约3～4×107骨髓瘤细胞)，1500rpm离心，5min，弃上清；
4)将混合后的细胞轻轻拍打、混合均匀，浸入先前准备的烧杯中，60～90s内加入1mL PEG，边流加边缓慢搅动；
5)静置1min后，120s内缓慢加入2mL基础培养基，接着120s内加入8mL基础培养基以终止PEG的作用；
6)将融合好的细胞，1000rpm离心，5min，弃上清；
7)将融合好的细胞用添加Medium A(10×)的完全培养基混合，轻轻吹散均匀，准备铺板于96孔板中；
8)通常一只小鼠的脾脏铺12块板，每孔200uL。置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
9)融合后的第七天，将培养基吸净，每孔加入150uL之前准备的添加Medium B(10×)的完全培养基。此时可以观察到杂交瘤细胞集落；
10)融合后第12～14天时，进行抗体的检测；
1.4ELISA筛选阳性杂交瘤细胞
1)融合后的细胞培养约12-14天，看到杂交瘤细胞生长到培养孔的底面积的1/4时，取细胞培养上清用ELISA法检测特异性反应，对杂交瘤细胞进行筛选。以1μg/mL的浓度包被常规ELISA板，ELISA板中加100μL/孔的细胞培养上清液，以SP2/0细胞孔培养上清为阴性对照，免疫鼠血清为阳性对照(1:10000稀释，稀释液为PBS)。37℃孵育30min，洗涤6次后每孔加入100μL HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(1:20000稀释)，37℃孵育30min，弃二抗。洗板6次后每孔加TMB100μL显色10min，再加入2M稀H2SO4 50μL/孔终止反应。测OD450吸光值。
2)ELISA筛选获得10株能针对HCV抗原分泌单抗的阳性杂交瘤细胞株；上述10株杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体均对HCV-cAg具有阳性反应。
将10株细胞株直接扩大培养，冻存。
1.5有限稀释法进行克隆化培养
1)用移液器将进行亚克隆的细胞混匀，用筛选培养基稀释细胞至密度为4cell/ml；
2)将稀释后细胞悬液接入96孔板，每孔200μl，置5％CO2、37℃的培养箱中进行培养；
3)培养至第4天时，显微镜下观察并标记出生长单个细胞团的孔，培养至第7天左右，每孔取100μl上清液，用ELISA方法进行检测；
4)两天之后，重复检测一次；
5)将两次ELISA检测均表现强阳性的孔内细胞再次进行亚克隆；
6)将第二次亚克隆ELISA检测结果最好的杂交瘤细胞扩大培养、冻存。
1.6单克隆抗体的制备
1.6.1腹水的制备
小鼠对不同杂交瘤细胞的敏感性不同，有的注射后一周即死亡，有的会出现血性腹水，有的可以反复收取腹水2-3次。具体操作如下：
1)用致敏剂石蜡油0.5ml/只注射12周龄BALB/c小鼠腹腔；
2)7天后以106个对数生长期杂交瘤细胞注射到每只小鼠腹腔，注射细胞少，腹水形成慢但效价会更高；
3)待第7天左右开始密切观察小鼠的腹水及存活情况，有明显移动性腹水，可以利用5ml注射器收集腹水，每隔3天收集一次，直到小鼠死亡；
4)将腹水以3000rpm，离心10min；留上清4℃冰箱保存备用。
1.6.2单克隆抗体的纯化(proteinA亲和层析)
1.6.2.1腹水处理
腹水中的抗体粗纯使用加辛酸和硫酸铵沉淀的方法，具体操作步骤如下：
1)腹水中加入等体积生理盐水；
2)加入等体积0.01M HAc-NaAc(pH4.0)buffer；
3)用6M HCl调节pH至4.8；
4)边搅拌边滴加辛酸25ul/ml(按腹水体积)，继续搅拌30min；
5)4℃，12000rpm离心30min；
6)弃沉淀和上层脂肪，收集上清加入0.02M PBS pH7.2(PBS加入量相当于上清体积的0.1倍)；
6)用5M NaOH调pH至7.6；
7)变搅拌边缓慢加入固体硫酸铵，继续搅拌1h，4℃放置过夜；
8)20℃，12000rpm离心30min，弃上清；
9)用0.02M PBS pH7.2悬浮沉淀；
10)用0.02M PBS pH7.2透析两天，换液3次，每次5L；
11)4℃，12000rpm离心5min，弃沉淀，收集上清液准备亲和层析。
1.6.2.2抗体亲和层析：
1)用PBS缓冲液pH7.2冲洗柱子，约5个柱体积。
2)上样：将准备的上清液上样，是其中的抗体与填料中ProteinA结合。
3)平衡：PBS缓冲液冲洗柱子，直至基线平衡，一般5个柱体积。
4)洗脱：使用柠檬酸钠溶液pH3.2进行抗体洗脱。
1.6.2.3抗体脱盐纯化
1)平衡：用超纯水冲洗柱子，约5个柱体积；用PBS缓冲液pH7.2冲洗层析柱，约5个柱体积。
2)上样：将抗体浓缩液上样至脱盐层析柱。
3)收集：所收集到流穿液为抗体溶液。
1.6.3抗体亚型鉴定、浓度测定与保存
1.6.3.1单克隆抗体亚型的鉴定
利用MOUSE单克隆抗体亚型鉴定试剂盒(ProteinTech公司)对各单克隆抗体进行亚类鉴定，具体操作步骤如下：
1)将待测样本适当稀释加入板条样品孔中，50μL/孔；
2)无需孵育，将1×羊抗鼠IgM+IgG-HRP加入样品孔中，50μL/孔。混匀器上轻轻混匀，也可用手轻轻敲击板架两侧1min；
3)盖上封板膜，室温孵育1h；
4)弃去孔内液体，1×PBST洗板3次，吸水纸上拍干；
5)将现配的显色液加入孔中，100μL/孔；
6)室温避光显色10-20min。每孔加入终止液，100μL/孔。
如上述方法对10株杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体进行单克隆抗体亚型的鉴定，结果及相关命名如表1，轻链均为Kappa链。
表1：单克隆抗体的亚型鉴定
名称 1B5 2G7 2F7 3C6 4H1 6A2 8F9 8G8 10D5 12C9
亚型 IgG2b IgG2a IgG2a IgG1 IgG2a IgG2b IgG2b IgG2c IgG2a IgG1
实施例2：对HCV阳性血清样本的单克隆抗体配对筛选
2.1单克隆抗体的酶标
本实施例使用过碘酸钠法标记抗体，具体操作步骤如下：
1)称取5mg HRP溶解于1ml蒸馏水中。
2)于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟。
3)将上述溶液装入透析袋中，对1mM pH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。
4)加20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使HRP的pH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mg IgG在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。
5)加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液，混匀，再置4℃2小时。
6)将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4PBS透析，4℃过夜。
7)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。
8)3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M pH7.4的PBS中。
9)将上述溶液装入透析袋中，对0.15M pH7.4的PBS缓冲盐水透析，去除铵离子，10000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。
2.2单克隆抗体的配对筛选
2.2.1对单克隆抗体配对筛选
10株单克隆抗体，一共获得10×10组配对单克隆抗体，组合成10×10(100)种双抗夹心配对。以重组HCV-cAg 1ng/ml样本对每一种组合进行测试。结果见表2。
表2：抗体配对检测重组HCV-cAg结果
1B5 2F7 2G7 3C6 4H1 6A2 8F9 8G8 10D5 12C9
1B5 -- 0.755 0.628 0.762 0.322 0.459 0.586 0.468 0.825 0.736
2F7 0.086 -- 0.821 0.521 0.648 0.537 0.516 0.278 0.330 0.675
2G7 0.437 0.636 -- 1.247 0.796 1.648 0.548 0.899 1.059 1.137
3C6 0.938 0.563 0.721 -- 0.338 0.487 1.524 0.731 0.802 0.865
4H1 0.819 0.356 0.537 0.398 -- 0.536 0.837 0.945 0.821 0.538
6A2 0.532 0.865 1.236 0.211 0.738 -- 1.321 1.088 0.691 0.844
8F9 0.355 0.555 0.446 0.337 0.922 0.577 -- 0.659 0.351 0.878
8G8 0.912 0.637 0.421 0.610 0.553 0.959 0.338 -- 0.177 0.610
10D5 1.039 0.221 0.547 0.767 0.738 0.855 0.689 0.648 -- 0.838
12C9 0.398 0.437 0.318 0.438 0.567 0.914 0.836 0.883 0.537 --
将针对重组HCV-cAg样本呈阳性反应的2对配对单克隆抗体2G7-6A2和3C6-8F9筛选出来作为候选的配对单抗。对于候选的2对配对单抗2G7-6A2和3C6-8F9进一步检测其对HCV阳性血清检测灵敏度和特异性。
2.2.2对HCV阳性血清样本的单克隆抗体配对筛选
收集50份RNA检测HCV阳性血清样本，使用候选的2对配对抗体2G7-6A2和3C6-8F9对80份血清样本进行检测，确定此2对配对抗体检测患者血清的阳性符合率。结果见表3。
表3：候选配对抗体检测HCV阳性血清样本结果
阳性例数 符合率
2G7-6A2 49 98％
3C6-8F9 41 82％
确定2G7-6A2为较佳配对抗体。
2.3配对抗体灵敏度评价
本实验将筛选确定的配对抗体2G7-6A2，第一单克隆抗体2G7和第二单克隆抗体6A2对重组HCV-cAg进行梯度稀释检测，确定配对抗体2G7-6A2对重组HCV-cAg的灵敏度。
表4：2G7-6A2配对抗体灵敏度检测结果
Figure BDA0001931209600000081
Figure BDA0001931209600000091
配对抗体2G7-6A2对重组HCV-cAg的检测灵敏度为5pg/ml，高于一般检测试剂盒的灵敏度。
相应的，分泌第一单克隆抗体2G7的交瘤细胞株命名为2G7的细胞株，已于2018年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保存编号为：CCTCC NO：C2018229；分泌第二单克隆抗体6A2的交瘤细胞株命名为6A2的细胞株，该细胞株已于2018年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保存编号为：CCTCC NO：C2018230。中国典型培养物保藏中心地址：中国，武汉，武汉大学。
上述杂交瘤细胞以第一杂交瘤细胞株和第二杂交瘤细胞株形式配对使用，独立存放。
实施例3：配对抗体特异性评价
本实验筛选到的配对单克隆抗体：第一单克隆抗体2G7和第二单克隆抗体6A2，应用其对90份非丙肝患者血清样本进行检测，其中30份乙肝患者血清样本、30份梅毒患者血清样本、30份类风湿患者血清样本，检测结果如表5所示。
表5：2G7-6A2配对抗体特异性检测结果
交叉反应率
乙肝 0
梅毒 0
类风湿 0
结果显示：配对单克隆抗体2G7-6A2对所有乙肝患者血清没有交叉反应、对所有梅毒患者血清没有交叉反应、对所有类风湿患者血清没有交叉反应，说明本抗体对的特异性较高。
综上所述，本发明筛选到了一对单克隆抗体，该配对单克隆抗体为2G7-6A2，其能够通过ELISA检测HCV-cAg的检测灵敏度达5pg/mL，并且对乙肝、梅毒、类风湿因子等不呈现交叉反应，具有较高的灵敏度和特异性。
检测HCV-cAg的单克隆抗体2G7-6A2可变区序列的测定
提取杂交瘤细胞2G7和6A2的mRNA并反转录，以cDNA为模板使用可变区通用引物和高保真酶进行PCR扩增，回收目的片段，克隆连入T载体，送青岛华大公司进行测序。
2G7单克隆抗体，其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；6A2单克隆抗体，其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步的，编码上述检测HCV-cAg的单克隆抗体对或其抗原结合片段的核酸分子具体是：编码第一单克隆抗体2G7轻链的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示，编码第一单克隆抗体2G7重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；编码第二单克隆抗体6A2轻链的核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示，编码第二单克隆抗体6A2重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
序列表
<110> 山东莱博生物科技有限公司
<120> 一对检测HCV-cAg的单克隆抗体和分泌该抗体对的杂交瘤细胞株及其应用
<141> 2018-12-07
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 单克隆抗体2G7轻链氨基酸序列
<400> 1
EIVMTQSPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLE HNNGNTYLNW YQQKPGKAPK LLIYRASSLQ 60
SGGLDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCLQGTHVP FTAGSATKLE IKRADAAKTV 120
SIFPVVSEQL TSGGASVVCF LNNFYPKDIN VKWKIDGSER QNGVLNSWQQ QDSKDSTYSM 180
SSTLTLTKDE CCRHNSYTCE ATHKTSTSPI VKSFYRNEC 219
<210> 2
<211> 479
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 单克隆抗体2G7重链氨基酸序列
<400> 2
MDRLTSSFLL LIVPAYVLSQ ASLETLKESG PGILKPSTTL SLTCSFSGFS LSTSGMGVSS 60
IRQPSGKGLE WLAHIWWDKV YLLLKSALTI SKDQSRNQVC GCGTSLDTAD TATYYCVRRA 120
FSYGTTRDYF DYWCQGTFLT VSSAKTTPPV VYPLAPGCGD TTGSSVTLAC SVKGYFPESV 180
TVTWNSGSLS SSVHTFPALL QSGLYTMSSS VTVPSSTWPS QTVTCSVAHP ASSTTVDKKL 240
EPSGPISTIN PCPPCKECHK CPAPNLEGGP SVFIFPDNIK DVLMISLTPK VTCVVVPVSE 300
DDPDALISWF VNNVEVHTAQ TQTHREDYNS TIRVVSTLPI QHQDWMSGKE FKCKVNNKDL 360
PSPIERTISK IKGLVRAPQV YILPPTAEQL SRKDVSLTCL VVGFNPGDIS VEWTSNGHTE 420
ENYKDTAPVL DSDGSYKIYS KLNMKTSKWE KTDSFSCNVR HEGLKNYYLK KTISRSPGK 479
<210> 3
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 单克隆抗体6A2轻链氨基酸序列
<400> 3
EIVMVQSPDS LSASVGTRVT CITCRAGQSI SSYLNLYDQK PGKAPKLLIY AACSLQSGVP 60
SSFSGSVDGT DFALTISSLQ PEDFATYYCQ QSYSFPVTFG QGTKVEIKRE IKRADAAKTV 120
SIFPVVSEQL TSGGASVVCF LNNFYPKDIN VKWKIDGSER QNGVLNSWQQ QDSKDSTYSM 180
SSTLTLTKDE CCRHNSYTCE ATHKTSTSPI VKSFYRNEC 219
<210> 4
<211> 479
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 单克隆抗体6A2重链氨基酸序列
<400> 4
MDRLTSSFCG CIVPAYVLSQ ASLETLKESG PGILKPACGL SLTEWEGSFF SLSTSGAPSS 60
SIRQPSGKGL EWLAHIPPDK VCGCKSALTI SKAGSRNQVG GCCTSLDTAD TATWCCVRRA 120
FSYGTTRDYF DYWCQGTFLT VSSAKTTPPV VYPLAPGCGD TTGSSVTLAC SVKGYFPESV 180
TVTWNSGSLS SSVHTFPALL QSGLYTMSSS VTVPSSTWPS QTVTCSVAHP ASSTTVDKKL 240
EPSGPISTIN PCPPCKECHK CPAPNLEGGP SVFIFPDNIK DVLMISLTPK VTCVVVPVSE 300
DDPDALISWF VNNVEVHTAQ TQTHREDYNS TIRVVSTLPI QHQDWMSGKE FKCKVNNKDL 360
PSPIERTISK IKGLVRAPQV YILPPTAEQL SRKDVSLTCL VVGFNPGDIS VEWTSNGHTE 420
ENYKDTAPVL DSDGSYKIYS KLNMKTSKWE KTDSFSCNVR HEGLKNYYLK KTISRSPGK 479
<210> 5
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 单克隆抗体2G7轻链核苷酸序列
<400> 5
gagatcgtga tgacccagag ccccctgagc ctgcccgtga gcctgggcga ccaggccagc 60
atcagctgca ggagcagcca gagcctggag cacaacaacg gcaacaccta cctgaactgg 120
taccagcaga agcccggcaa ggcccccaag ctgctgatct acagggccag cagcctgcag 180
agcggcggcc tggacaggtt cagcggcagc ggcagcggca ccgacttcac cctgaagatc 240
agcagggtgg aggccgagga cctgggcgtg tacttctgcc tgcagggcac ccacgtgccc 300
ttcaccgccg gcagcgccac caagctggag atcaagaggg ccgacgccgc caagaccgtg 360
agcatcttcc ccgtggtgag cgagcagctg accagcggcg gcgccagcgt ggtgtgcttc 420
ctgaacaact tctaccccaa ggacatcaac gtgaagtgga agatcgacgg cagcgagagg 480
cagaacggcg tgctgaacag ctggcagcag caggacagca aggacagcac ctacagcatg 540
agcagcaccc tgaccctgac caaggacgag tgctgcaggc acaacagcta cacctgcgag 600
gccacccaca agaccagcac cagccccatc gtgaagagct tctacaggaa cgagtgc 657
<210> 6
<211> 1437
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 单克隆抗体2G7重链核苷酸序列
<400> 6
atggacaggc tgaccagcag cttcctgctg ctgatcgtgc ccgcctacgt gctgagccag 60
gccagcctgg agaccctgaa ggagagcggc cccggcatcc tgaagcccag caccaccctg 120
agcctgacct gcagcttcag cggcttcagc ctgagcacca gcggcatggg cgtgagcagc 180
atcaggcagc ccagcggcaa gggcctggag tggctggccc acatctggtg ggacaaggtg 240
tacctgctgc tgaagagcgc cctgaccatc agcaaggacc agagcaggaa ccaggtgtgc 300
ggctgcggca ccagcctgga caccgccgac accgccacct actactgcgt gaggagggcc 360
ttcagctacg gcaccaccag ggactacttc gactactggt gccagggcac cttcctgacc 420
gtgagcagcg ccaagaccac cccccccgtg gtgtaccccc tggcccccgg ctgcggcgac 480
accaccggca gcagcgtgac cctggcctgc agcgtgaagg gctacttccc cgagagcgtg 540
accgtgacct ggaacagcgg cagcctgagc agcagcgtgc acaccttccc cgccctgctg 600
cagagcggcc tgtacaccat gagcagcagc gtgaccgtgc ccagcagcac ctggcccagc 660
cagaccgtga cctgcagcgt ggcccacccc gccagcagca ccaccgtgga caagaagctg 720
gagcccagcg gccccatcag caccatcaac ccctgccccc cctgcaagga gtgccacaag 780
tgccccgccc ccaacctgga gggcggcccc agcgtgttca tcttccccga caacatcaag 840
gacgtgctga tgatcagcct gacccccaag gtgacctgcg tggtggtgcc cgtgagcgag 900
gacgaccccg acgccctgat cagctggttc gtgaacaacg tggaggtgca caccgcccag 960
acccagaccc acagggagga ctacaacagc accatcaggg tggtgagcac cctgcccatc 1020
cagcaccagg actggatgag cggcaaggag ttcaagtgca aggtgaacaa caaggacctg 1080
cccagcccca tcgagaggac catcagcaag atcaagggcc tggtgagggc cccccaggtg 1140
tacatcctgc cccccaccgc cgagcagctg agcaggaagg acgtgagcct gacctgcctg 1200
gtggtgggct tcaaccccgg cgacatcagc gtggagtgga ccagcaacgg ccacaccgag 1260
gagaactaca aggacaccgc ccccgtgctg gacagcgacg gcagctacaa gatctacagc 1320
aagctgaaca tgaagaccag caagtgggag aagaccgaca gcttcagctg caacgtgagg 1380
cacgagggcc tgaagaacta ctacctgaag aagaccatca gcaggagccc cggcaag 1437
<210> 7
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 单克隆抗体6A2轻链核苷酸序列
<400> 7
gagatcgtga tggtgcagag ccccgacagc ctgagcgcca gcgtgggcac cagggtgacc 60
tgcatcacct gcagggccgg ccagagcatc agcagctacc tgaacctgta cgaccagaag 120
cccggcaagg cccccaagct gctgatctac gccgcctgca gcctgcagag cggcgtgccc 180
agcagcttca gcggcagcgt ggacggcacc gacttcgccc tgaccatcag cagcctgcag 240
cccgaggact tcgccaccta ctactgccag cagagctaca gcttccccgt gaccttcggc 300
cagggcacca aggtggagat caagagggag atcaagaggg ccgacgccgc caagaccgtg 360
agcatcttcc ccgtggtgag cgagcagctg accagcggcg gcgccagcgt ggtgtgcttc 420
ctgaacaact tctaccccaa ggacatcaac gtgaagtgga agatcgacgg cagcgagagg 480
cagaacggcg tgctgaacag ctggcagcag caggacagca aggacagcac ctacagcatg 540
agcagcaccc tgaccctgac caaggacgag tgctgcaggc acaacagcta cacctgcgag 600
gccacccaca agaccagcac cagccccatc gtgaagagct tctacaggaa cgagtgc 657
<210> 8
<211> 1437
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 单克隆抗体6A2重链核苷酸序列
<400> 8
atggacaggc tgaccagcag cttctgcggc tgcatcgtgc ccgcctacgt gctgagccag 60
gccagcctgg agaccctgaa ggagagcggc cccggcatcc tgaagcccgc ctgcggcctg 120
agcctgaccg agtgggaggg cagcttcttc agcctgagca ccagcggcgc ccccagcagc 180
agcatcaggc agcccagcgg caagggcctg gagtggctgg cccacatccc ccccgacaag 240
gtgtgcggct gcaagagcgc cctgaccatc agcaaggccg gcagcaggaa ccaggtgggc 300
ggctgctgca ccagcctgga caccgccgac accgccacct ggtgctgcgt gaggagggcc 360
ttcagctacg gcaccaccag ggactacttc gactactggt gccagggcac cttcctgacc 420
gtgagcagcg ccaagaccac cccccccgtg gtgtaccccc tggcccccgg ctgcggcgac 480
accaccggca gcagcgtgac cctggcctgc agcgtgaagg gctacttccc cgagagcgtg 540
accgtgacct ggaacagcgg cagcctgagc agcagcgtgc acaccttccc cgccctgctg 600
cagagcggcc tgtacaccat gagcagcagc gtgaccgtgc ccagcagcac ctggcccagc 660
cagaccgtga cctgcagcgt ggcccacccc gccagcagca ccaccgtgga caagaagctg 720
gagcccagcg gccccatcag caccatcaac ccctgccccc cctgcaagga gtgccacaag 780
tgccccgccc ccaacctgga gggcggcccc agcgtgttca tcttccccga caacatcaag 840
gacgtgctga tgatcagcct gacccccaag gtgacctgcg tggtggtgcc cgtgagcgag 900
gacgaccccg acgccctgat cagctggttc gtgaacaacg tggaggtgca caccgcccag 960
acccagaccc acagggagga ctacaacagc accatcaggg tggtgagcac cctgcccatc 1020
cagcaccagg actggatgag cggcaaggag ttcaagtgca aggtgaacaa caaggacctg 1080
cccagcccca tcgagaggac catcagcaag atcaagggcc tggtgagggc cccccaggtg 1140
tacatcctgc cccccaccgc cgagcagctg agcaggaagg acgtgagcct gacctgcctg 1200
gtggtgggct tcaaccccgg cgacatcagc gtggagtgga ccagcaacgg ccacaccgag 1260
gagaactaca aggacaccgc ccccgtgctg gacagcgacg gcagctacaa gatctacagc 1320
aagctgaaca tgaagaccag caagtgggag aagaccgaca gcttcagctg caacgtgagg 1380
cacgagggcc tgaagaacta ctacctgaag aagaccatca gcaggagccc cggcaag 1437
<210> 9
<211> 159
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> HCV cAg抗原氨基酸序列
<400> 9
APVRSLYCTL RDSQQKSLVM GGGGCMPNVT PTAAHRTSGS RAVVRSLVEF TCCRAAAPGW 60
VCARLGRLPS GRNLVEGDNL SQRLADPRAG PGLSCGTLGP SMACCAWGGQ DGSCHPAAPG 120
LVGAPRTPGV GRVTWVRSSI PLHAASPISW GTFRSSAPP 159

Claims (6)

1.一对检测HCV-cAg的单克隆抗体，该单克隆抗体对包括独立存放的第一单克隆抗体和第二单克隆抗体；其特征在于：所述第一单克隆抗体命名为2G7，其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示；所述第二单克隆抗体命名为6A2，其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示，其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
2.编码权利要求1所述检测HCV-cAg的单克隆抗体对或其抗原结合片段的核酸分子，其特征在于：编码第一单克隆抗体2G7轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，编码第一单克隆抗体2G7重链的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示；编码第二单克隆抗体6A2轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，编码第二单克隆抗体6A2重链的核苷酸序列如SEQ ID NO. 8所示。
3.一对产生权利要求1所述检测HCV-cAg的单克隆抗体对的杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞对包括独立存放的第一杂交瘤细胞株和第二杂交瘤细胞株；其特征在于：所述第一杂交瘤细胞株是命名为2G7的细胞株，能分泌产生单克隆抗体2G7，该细胞株已于2018年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保存编号为：CCTCC NO. C2018229；所述第二杂交瘤细胞株是命名为6A2的细胞株，能分泌产生单克隆抗体6A2，该细胞株已于2018年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保存编号为：CCTCC NO.C2018230。
4.能够特异性诱导产生权利要求1所述检测HCV-cAg的单克隆抗体对的抗原肽段，其特征在于：所述抗原肽段位于HCV core蛋白的2-140aa之间，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 9所示。
5.权利要求1所述的检测HCV-cAg的单克隆抗体对作为包被抗体和检测抗体配对使用在制备HCV-cAg的ELISA检测试剂或试剂盒中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述包被抗体选第一单克隆抗体2G7，所述检测抗体选第二单克隆抗体6A2；应用时ELISA检测板上包被有第一单克隆抗体2G7，酶稀样品中含有HRP标记的第二单克隆抗体6A2，所述第一单克隆抗体和所述第二单克隆抗体配对使用。
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