EP1425584A2 - Verbesserte massenspektrometrische analyse unter verwendung von nanopartikeln - Google Patents

Verbesserte massenspektrometrische analyse unter verwendung von nanopartikeln

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EP1425584A2
EP1425584A2 EP02797583A EP02797583A EP1425584A2 EP 1425584 A2 EP1425584 A2 EP 1425584A2 EP 02797583 A EP02797583 A EP 02797583A EP 02797583 A EP02797583 A EP 02797583A EP 1425584 A2 EP1425584 A2 EP 1425584A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
groups
nanoparticles
analyte
maldi
nanoparticle
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP02797583A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Jürgen SCHMUCKER
Thomas Schiestel
Herwig Brunner
Günter Tovar
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Original Assignee
Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV filed Critical Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Publication of EP1425584A2 publication Critical patent/EP1425584A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2458/00—Labels used in chemical analysis of biological material
    • G01N2458/15—Non-radioactive isotope labels, e.g. for detection by mass spectrometry
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/24—Nuclear magnetic resonance, electron spin resonance or other spin effects or mass spectrometry

Definitions

  • the molecules were coupled to the particles via a glutaraldehyde bridge or via a direct bond via CNBr-activated carbohydrates.
  • the particulate systems used up to now are not fully compatible with the actual MALDI analysis method and must therefore be removed before application to the sample carrier in order to avoid malfunctions in the MALDI process.
  • the particulate binding matrices are used to isolate and purify analytes, but must be released from the immobilized analytes in an additional step before the sample is applied to the MALDI sample carrier. Only then can the analytes be measured using the MALDI-TOF-MS method.
  • the analyte since the analyte in turn has specific functional groups, the too the functional groups on the nanoparticle surface are complementary and can form an affine bond with them, the analyte can be immobilized on the nanoparticle.
  • the nanoparticles contained in the suspension, on the surface of which the analyte is immobilized can then be washed according to the invention, the non-immobilized constituents of the sample being removed, and, after renewed suspension in an aqueous liquid, can be deposited on the MALDI sample carrier and is examined spectrometrically.
  • the invention there is also the possibility of depositing the nanoparticle suspension containing the bound analyte on the MALDI sample carrier immediately after binding of the analyte and examining it spectrometrically.
  • the present invention thus provides a method by means of which the analyte can be isolated from complex matrices and subsequently analyzed using MALDI-TOF-MS, without the analyte having to be separated from the nanoparticles again after immobilization on the nanoparticles ,
  • the method according to the invention thus has the decisive advantage over the methods known in the prior art that the analyte, after isolation and immobilization, can be subjected to a direct MALDI-TOF examination together with the nanoparticles used according to the invention. Since there is no need to separate analyte and particle, there are no analyte losses in this sample preparation step.
  • the nanoparticles according to the invention are very small with a diameter of ⁇ 150 nm in comparison to the commonly used particles. They therefore have a comparatively very large surface-to-volume ratio and can accordingly bind a large amount of the analyte per mass. Due to the very small diameter, very homogeneous layers and surfaces are created when the nanoparticles are embedded in the MALDI matrix, which is very important for the desorption process and the mass resolution. Several layers of the particles can even be applied to the sample carrier without disrupting the MALDI process, which leads to an additional enrichment of the analyte on the sample carrier.
  • the nanoparticles used according to the invention can be quickly separated by centrifugation and form very stable pellets. They can therefore be separated from liquid media quickly and without loss, which in turn leads to a maximum analyte yield.
  • the particle pellets can also be resuspended without any problems, which makes MALDI sample preparation easier and faster.
  • the nanoparticles used according to the invention are equipped with surfaces which are modified in different ways.
  • the nanoparticles different functional groups and thus allow the binding of different proteins.
  • a wide variety of analytes with complementary functional groups can therefore be separated from complex mixtures and investigated directly using the MALDI-TOF-MS method.
  • nanoparticles used according to the invention are therefore outstandingly suitable for a so-called peptide mapping, since they are the ones for the peptide Mapping does not interfere with the required enzymatic digestion and does not negatively influence the mass resolution.
  • peptide mapping it is also possible to covalently anchor the proteins on the surface of the nanoparticles by means of cross-linkers.
  • stringent washing steps which are particularly necessary for complex samples, can be carried out without loss of analyte.
  • nanoparticles equipped with suitable antibodies are particularly suitable for human medical and / or veterinary diagnostics, for example for the characterization of tumors, BSE tests etc. They offer a decisive time advantage over conventional methods, which is of particular interest in the case of time-critical infections ,
  • an “analyte” is understood to mean a substance in which the type and amount of its individual constituents are determined and / or which are to be separated from mixtures.
  • the analyte is a protein, but also others Compounds, for example nucleic acids or carbohydrates, etc.
  • the analyte is a protein, peptide, active substance, pollutant, toxin, pesticide, antigen or a nucleic acid.
  • a “protein” is understood to mean a molecule which comprises at least two amino acids connected to one another via an amide bond.
  • a protein can also be a Peptide, for example an oligopeptide, a polypeptide or a part, for example a protein domain.
  • Such a protein can be of natural or synthetic origin.
  • the protein can be modified from the wild-type protein by genetic engineering methods and / or contain unnatural and / or unusual amino acids.
  • the protein can be derivatized compared to the wild-type form, for example have glycosylations, it can be shortened, it can be fused to other proteins or it can be linked to molecules of another type, for example carbohydrates.
  • sample is understood to mean an aqueous or organic solution, emulsion, dispersion or suspension which contains an analyte defined above in isolated and purified form or as part of a complex mixture of different substances.
  • a sample can be a biological fluid, such as blood, lymph, tissue fluid, etc., ie a fluid that was taken from a living or dead organism, organ or tissue, but a sample can also be a culture medium, for example a fermentation medium, in the organism , for example microorganisms, or human, animal or plant cells have been cultivated, but a sample in the sense of the invention can also be an aqueous solution, emulsion, dispersion or suspension of an isolated and purified analyte.
  • a sample can already have been subjected to purification steps but can also be pre-cleaned lie.
  • the “provision of a sample” can therefore mean the extraction of a sample defined above as well as the partial or complete purification of the sample or of the analyte after sample collection.
  • nanoparticle is understood to mean a particulate binding matrix which comprises a core with a surface which has functional groups which are able to bind complementary functional groups of the analyte covalently or non-covalently, where the analyte is immobilized on the nanoparticles.
  • Nanoparticles have a size of ⁇ 500 nm, preferably ⁇ 150 nm. Nanoparticles are characterized in that the core, in contrast to the surface, is chemically inert.
  • the “provision of nanoparticles” can do both Production of the nanoparticles, that is to say the production of the cores using emulsion polymerisation, sol-gel processes, etc., and the modification of the core surface by applying functional groups, and also the use of finished nanoparticles which have already been produced.
  • the “provision of a suspension of the nanoparticles in an aqueous liquid” can involve both suspending nanoparticles in liquids, in particular aqueous media, optionally using additional constituents, for example pH agents, suspending aids, etc., and also using ready-made nanoparticles - Kel suspensions mean.
  • a first functional group is understood to mean a functional group of the analyte to be immobilized, which is capable of interacting with a second functional group, that is to say a chemical group applied to the surface of the core, in such a way that a affine binding of a covalent or non-covalent type can take place between the two binding partners in such a way that the analyte is immobilized on the nanoparticle.
  • the first functional group ie the functional group of the analyte
  • the first functional group is selected from the group consisting of carboxy groups, amino groups, thiol groups, biotin groups, Strep Tag I groups, Strep -Tag II groups, His-Tag groups, Flag-Tag groups, antibodies against Protein A, antibodies against Protein G, biotinylated antibodies and biotinylated receptors.
  • the receptors can be, for example, MHC proteins, cytokines, T cell receptors such as the CD-8 protein and others. Even more complex layers can be built up.
  • an antibody can have a streptavidin group and a biotinylated antibody group and a protein group, where the protein can be a receptor, for example.
  • the second functional group that is the functional group on the surface of the nanoparticle, is selected according to the invention from the group consisting of amino groups, carboxy groups, maleiminimido groups, avidin groups, streptavidin Groups, neutravidin groups, metal chelate complexes, protein A units, protein G units, antibodies, receptor units or parts thereof.
  • antibodies or receptors can also be immobilized directly on the nanoparticle as a second functional group.
  • a nanoparticle used according to the invention thus has a second functional group on its surface, which is linked covalently or non-covalently to a first functional group of an analyte to be immobilized, the first functional group being a different group than the second functional group.
  • the two groups that bond with one another must be complementary to one another, that is, be able to form a covalent or non-covalent bond with one another.
  • the second functional group is an amino group.
  • the second functional group is a carboxy group.
  • a thiol group is selected as the first functional group according to the invention, the second functional group is a maleimido group according to the invention.
  • biotin groups and / or Strep-Tag I groups and / or Strep-Tag II groups are used according to the invention as the first functional groups, the second functional group is an avidin group and / or a steptavidin group and / or a neutravidin group.
  • the second functional group according to the invention is a maleinimido group. If an antibody against protein A is used according to the invention, protein A is used as a second functional group according to the invention. If, according to the invention, an antibody against protein G is used as the first functional group, the second functional group is protein G.
  • the aforementioned first and / or second functional groups can be connected to the analyte to be immobilized, in particular the protein to be immobilized, or to the core using a spacer, or introduced to the core or in the analyte by means of a spacer.
  • the spacer thus serves on the one hand as a spacer of the functional group from the nucleus or analyte, and on the other hand as a carrier for the functional group.
  • such a spacer can be alkylene groups or ethylene oxide oligomers with 2 to 50 C atoms, which is substituted in a preferred embodiment and has heteroatoms.
  • the spacer can be flexible and / or linear.
  • the first functional groups are a natural component of the analyte, in particular a protein.
  • unnatural amino acids for example, can be inserted into the protein molecule by genetic engineering methods or during chemical protein synthesis, for example together with spacers or linkers.
  • Such unnatural amino acids are compounds which have an amino acid function and a radical R and are not defined by a naturally occurring genetic code, these amino acids particularly preferably having a thiol group.
  • it can also be provided to modify a naturally occurring amino acid, for example lysine, for example by derivatizing its side chain, in particular their primary amino group, with the carboxylic acid function of levulinic acid.
  • antibody used in the present specification also includes antibody fragments that have been generated either by modification of whole antibodies or by de novo synthesis using recombinant DNA techniques.
  • antibody includes both intact molecules and fragments thereof, such as Fab, F (ab ') 2 and Fv, which can bind the epitope determinant.
  • proteins modified for example with unnatural amino acids, natural but unnaturally derivatized amino acids or specific strep tags, or antibody-bound proteins with complementarily reactive nanoparticle surfaces for binding in this way bring that a suitable specific, in particular non-covalent linkage of the proteins and thus an immobilization of the proteins to the 0- surfaces takes place.
  • nanoparticles which comprise a core are used in the method according to the invention.
  • sen which can be prepared from alkoxysilanes, preferably using a sol-gel process.
  • a “core” is understood to mean a chemically inert substance which serves as a framework for the immobilized analyte.
  • the core of the nanoparticles according to the invention therefore preferably consists of alkoxysilane condensates which are additionally crosslinked
  • the cores of the nanoparticles used according to the invention have a high specific weight according to the invention.
  • the specific weight of the cores is increased by the fact that during their production a cocondensation with heavy compounds , in particular tungstates etc.
  • the core of the nanoparticles according to the invention has a diameter ⁇ 500 nm, in particular 30 nm to 400 nm, preferably 50 nm to 150 nm.
  • ion exchange functions are anchored separately or additionally on the surface of the nanoparticles.
  • the salt content of the matrix is often a critical parameter, since ion accumulation suppresses ionization or causes broadening of the peaks, or peaks also occur. This problem can be avoided with nanoparticles that have a high ion exchange capacity and thereby fix disruptive salts in the matrix.
  • Nanoparticles with an ion exchange function are particularly suitable for optimizing the MALDI analysis of nucleic acids, since these can be converted into a defined mass state.
  • a preferred embodiment of the invention relates to nanoparticles whose surface is functionalized by the application of amino groups.
  • such nanoparticles are particularly suitable for the covalent immobilization of at least one protein with activated carboxy groups and / or at least one nucleic acid and for their separation from a complex mixture and direct investigations using MALDI-TOF-MS.
  • nanoparticles whose surface has carboxy groups.
  • Such nanoparticles are particularly suitable for the covalent immobilization of at least one protein with freely accessible amino groups and for its separation from a complex mixture and for direct analysis using MALDI-TOF-MS.
  • nanoparticles are provided, the surface of which has avidin groups, streptavidin groups and / or neutravidin groups.
  • Such nanoparticles are particularly suitable for immobilizing proteins with biotin groups and / or strep-tag groups and for separating them from a complex mixture and for direct analysis using MALDI-TOF-MS.
  • peptides and / or proteins can be specifically bound to the nanoparticles, which allow an internal calibration of the molecular weight (peak position) and / or the concentration (peak height).
  • Figure 2 shows further mass spectra.
  • This reaction on the one hand increases the density of the functional carboxy groups and, on the other hand, Ni 2+ ions can be bound to this surface by complexation. This surface is then capable of binding His-tag modified proteins.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur massenspektrometrischen Analyse, insbesondere zur Matrix-unterstützten Laser-Desorptions/Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS), unter Verwendung von Nanopartikeln, wobei ein Analyt einer Nanopartikelsuspension zugesetzt wird und die den gebundenen Analyten enthaltende Suspension dann direkt auf einem MALDI-Probenträger abgeschieden und massenspektrometrisch untersucht wird, sowie für dieses Verfahren geeignete Nanopartikel.

Description

Verbesserte massenspektrometrische Analyse unter Verwendung von Nanopartikeln
5 Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur massenspektrometrischen Analyse, insbesondere zur Matrix-unterstützten Laser- Desorptions/Ionisations-Flugzeit-Massenspektrome-
10 trie (MALDI-TOF-MS) , unter Verwendung von Nanopartikeln, wobei ein Analyt einer Nanopartikelsuspen- sion zugesetzt wird und die den gebundenen Analyten enthaltende Suspension dann direkt auf einem MALDI- Probenträger abgeschieden und massenspektrometrisch
15 untersucht wird, sowie für dieses Verfahren geeignete Nanopartikel .
Bei der Massenspektrometrie handelt es sich um ein Verfahren zur Strukturaufklärung von Substanzen, wobei atomare und molekulare Teilchen entsprechend
20 ihrer Masse getrennt werden. Sie beruht auf einer Reaktion zwischen Molekülen und Elektronen oder Photonen. Durch Beschuss der Probe mit Elektronen entstehen infolge der Abspaltung von Elektronen positive Molekülionen, die anschließend in verschie-
25 dene ionische, radikalische und/oder neutrale Fragmente zerfallen. Molekülionen und Fragmente werden in geeigneten Trennsystemen nach der Größe der Massezahl aufgetrennt. Im Unterschied zu den eigentlichen molekülspektrometrischen Verfahren wie
30 UV/Vis-, IR- oder NMR-Spektroskopie werden bei einer Massenspektrometrie also die aufgrund chemischer Zerfallsreaktionen infolge eines Ionisations- prozesses entstehenden Molekülionen beziehungsweise Fragmente zur Strukturaufklärung von Stoffen herangezogen.
Die gebildeten Ionen werden entsprechend ihrem Ver- hältnis Masse/Ladung (m/z) in einem Analysator, beispielsweise einem magnetischen oder elektrischen Feld, aufgetrennt. Ein Massenspektrometer besteht daher generell aus den folgenden Hauptteilen: Im Einlasssystem wird die Probensubstanz verdampft und dampfförmig in die Ionenquelle eingeführt, in welcher die Ionisierung durch beispielsweise Elektronenstöße stattfindet. Der Analysator dient zur Trennung, das heißt zur Fokussierung, der in der Ionenquelle gebildeten Radikal-Kationen und Katio- nen nach dem Verhältnis von Masse zu Ladung. Die vom Einlasssystem in die Ionenquelle gelangte dampfförmige Substanz wird dort mit Elektronen beschossen, die von einem elektrisch beheizten Metalldraht, dem Filament, ausgesendet werden. Zwi- sehen dem Filament und dem Elektronenauffänger, dem Probenträger, liegt die sogenannte Kammerspannung, welche die Elektronen auf die gewünschte Energie beschleunigt .
Flugzeit-Massenspektrometer besitzen dynamische Io- nentrennsysteme . Beim Flugzeit-Massenspektrometer werden Ionen verschiedener Masse aufgrund ihrer unterschiedlichen Flugzeit für eine vorgegebene Weglänge getrennt. Die beschleunigten Ionen treten in das Flugrohr ein, in dem leichtere schneller als schwerere Ionen das Ende erreichen. Neben der E- lektronenstoß-Ionisation werden als weitere Ionisationsverfahren die Feld- und Feld-Desorptions- Ionisation verwendet. Bei der Feld-Ionisation werden positive Ionen durch Entzug eines Elektrons in einem stark elektrischen Feld erzeugt. Aufgrund der geringen Energie der Molekülionen treten nur wenige Fragmentierungen auf. Zur Ionisation schwer verdampfbarer Verbindungen (Feld-Desorptions- Ionisation) wird eine Lösung dieser Verbindungen auf einen aktivierenden, als Anode geschalteten Metalldraht aufgebracht. Nach Anlegen des elektri- sehen Feldes werden die entstandenen Ionen desor- biert .
Die Matrix-unterstützte Laser-Desorptions/Ioni- sations-Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS) hat sich in den letzten Jahren zu einem wichtigen Verfahren zur Analyse von unterschiedlichsten Substanzen, insbesondere Proteinen, entwickelt. Die Hauptvorteile dieses Verfahrens umfassen die äußerst schnelle positive Identifizierung eines Ana- lyten, beispielsweise eines Proteins, durch dessen Masse-zu-Ladungs-Verhältnis (m/z) und die äußerst geringe Nachweisgrenze, die im Femtomol-Bereich o- der darunter liegt.
In den letzten Jahren sind Proteinbiochips für die massenspektrometrische Analyse entwickelt worden. Dabei werden chemisch funktionelle Gruppen kovalent an der Chip-Oberfläche als selbst-organisierende Monoschichten (SAM) verankert. An diese systematisch angeordneten Ankermoleküle werden adäquat vorbereitete Proteine als Rezeptoren angebracht. Im Anschluss daran werden Bibliotheken optionaler Bindungspartner auf die Oberfläche aufgebracht . Unter Verwendung geeigneter Reinigungsschritte wird über- schüssiges Material entfernt, während spezifisch gebundene Liganden an der Oberfläche verankert bleiben und direkt massenspektrometrisch vermessen werden können.
Die Bindung von Ankerproteinen, die zum Einfangen von Liganden dienen, an flache Oberflächen weist jedoch zwei prinzipielle Probleme auf. Eine flache Oberfläche beschränkt erheblich die Menge der Ankerproteine, die in einem relativ kleinen Bereich gebunden werden können, und der Analyt wird gegenüber der Festphasen-Einfangoberfläche nicht effizient ausgerichtet.
Zur Lösung dieser Probleme wurden daher partikuläre Bindematrices eingesetzt, da Partikel, insbesondere Partikel im Nanometerbereich, eine sehr große Oberfläche aufweisen. Für die hochaffine Anbindung, Separation und Voranreicherung von Proteinen werden insbesondere partikuläre Systeme mit magnetischen Eigenschaften eingesetzt (Merchant und Weinberger, Electrophoreses, 21 (2000), 1164-1167). Gängig ist die Probenvorbereitung zur MALDI-TOF-MS-Analyse . Beispielsweise wurden Antikörper eines zu isolierenden Proteins auf der Partikeloberfläche immobilisiert und anschließend aus komplexen Matrices das entsprechende Protein gefischt (Hurst et al., Anal. Chem., 71 (1999), 4727-4733). Als Partikel wurden insbesondere magnetische Partikel, Polystyrol- Partikel und Sephacryl-Partikel eingesetzt. Die An- kopplung der Moleküle an die Partikel erfolgte über eine Glutaraldehyd-Brücke oder über eine direkte Bindung über CNBr-aktivierte Kohlenhydrate. Es zeigte sich jedoch, dass die bisher eingesetzten partikulären Systeme mit dem eigentlichen MALDI- Analyseverfahren nicht völlig kompatibel sind und daher vor dem Auftrag auf den Probenträger entfernt werden müssen, um Störungen des MALDI-Prozesses zu vermeiden. Das heißt, die partikulären Bindematrices werden verwendet, um Analyten zu isolieren und aufzureinigen, müssen jedoch vor dem Probenauftrag auf dem MALDI-Probenträger in einem zusätzlichen Arbeitsschritt wieder von den immobilisierten Analyten freigesetzt werden. Erst dann können die Analyten mittels des MALDI-TOF-MS-Verfahrens vermessen werden.
Das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende technische Problem besteht also darin, Mittel und Verfahren zu entwickeln, mit deren Hilfe die Isolierung, Aufreinigung und anschließende MALDI-TOF- Analyse von Analyten, insbesondere Proteinen, möglich ist, wobei insbesondere die im Stand der Tech- nik bekannten Probleme vermieden werden, das heisst, dass die zur Isolierung von Analyten aus komplexen Matrices verwendeten Mittel das nachfolgende MALDI-TOF-Verfahren nicht stören und daher vor Durchführung dieses Verfahrens nicht entfernt werden müssen und dass somit sowohl die Probenvorbereitung als auch die MALDI-TOF-Analyse erheblich vereinfacht wird.
Die vorliegende Erfindung löst das ihr zugrunde liegende Problem durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Untersuchung mindestens eines Analyten mittels Matrix-unterstützter Laser- Desorptions/Ionisations-Flugzeit-Massenspektrome- trie (MALDI-TOF-MS) , umfassend die Bereitstellung einer Probe mit dem erste funktioneile Gruppen aufweisenden Analyten, die Bereitstellung von Nanopartikeln, die einen Kern mit einer Oberfläche umfas- sen, die die ersten funktioneilen Gruppen bindende komplementäre zweite funktioneile Gruppen aufweist, die Bereitstellung einer Suspension der Nanoparti- kel in einer wässrigen oder organischen Flüssigkeit, die Zugabe der den mindestens einen Analyten enthaltenden Probe zu der Suspension, oder die Zugabe der Nanopartikel-Suspension zu der den Analyten enthaltenden Probe, die affine Bindung des Analyten an die Nanopartikel, das anschließende Abscheiden der den gebundenen Analyten enthaltenden Suspension auf einem MALDI-Probenträger und die spektrometrische Untersuchung des Analyten.
Die vorliegende Erfindung stellt also ein Verfahren bereit, mit dessen Hilfe eine Probe für die anschließende massenspektrometrische Analyse aufbe- reitet werden kann, das heißt das ein Analyt aus einer Probe isoliert und von anderen Bestandteilen der Probe abgetrennt und anschließend mittels Mat- rix-unterstützten Laser-Desoptions/Ionisations- Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS) unter- sucht werden kann. Dabei wird der Probe, die den Analyten enthält, bei der es sich beispielsweise um eine ungereinigte biologische Flüssigkeit handeln kann, eine Suspension von Nanopartikeln zugesetzt, deren Oberfläche spezifisch auf den Analyten abge- stimmte funktionelle Gruppen aufweist, oder die den Analyten enthaltende Probe wird der Nanopartikel- Suspension zugesetzt. Da der Analyt seinerseits spezifische funktionelle Gruppen aufweist, die zu den funktioneilen Gruppen an den Nanopartikel- Oberfläche komplementär sind und mit diesen eine affine Bindung eingehen können, kann der Analyt an den Nanopartikel immobilisiert werden. Die in der Suspension enthaltenen Nanopartikel, an deren Oberfläche der Analyt immobilisiert ist, können erfindungsgemäß danach gewaschen werden, wobei die nicht-immobilisierten Bestandteile der Probe entfernt werden, und können nach erneuter Suspendie- rung in einer wässrigen Flüssigkeit auf dem MALDI- Probenträger abgeschieden und spektrometrisch untersucht wird. Erfindungsgemäß besteht jedoch auch die Möglichkeit, die den gebundenen Analyten enthaltende Nanopartikel-Suspension unmittelbar nach Bindung des Analyten sofort auf dem MALDI- Probenträger abzuscheiden und spektrometrisch zu untersuchen .
Die vorliegende Erfindung stellt also ein Verfahren bereit, mit dessen Hilfe eine Isolierung des Analy- ten aus komplexen Matrices und dessen anschließende Analyse mittels MALDI-TOF-MS möglich ist, ohne dass der Analyt nach Immobilisierung an die Nanopartikel wieder von den Nanopartikeln getrennt werden muss. Das erfindungsgemäße Verfahren weist also gegenüber den im Stand der Technik bekannten Verfahren den entscheidenden Vorteil auf, dass der Analyt nach Isolierung und Immobilisierung zusammen mit den erfindungsgemäß verwendeten Nanopartikeln einer direkten MALDI-TOF-Untersuchung unterworfen werden kann. Da eine Separation von Analyt und Partikel nicht erforderlich ist, treten in diesem Probenvor- bereitungsschrittschritt keine Analyt-Verluste auf. Unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann eine Vielzahl unterschiedlicher Analyte untersucht werden, beispielsweise Proteine, Nucleinsäu- ren etc. Insbesondere lassen sich Komplexe aus meh- reren Proteinen und/oder Peptiden untersuchen, beispielsweise ein biotinyliertes Protein, das in einem Komplex ein weiteres Protein und zusätzlich ein Peptid bindet. Der Analyt kann mit einer funktioneilen Gruppe versehen werden, die mehrere Bestand- teile umfasst. Beispielsweise kann ein Protein als funktionelle Gruppe einen Antikörper und einen damit verbundenen Rezeptor enthalten. Beispielsweise kann eine cDNA immobilisiert und damit nach Proteinen, beispielsweise Transkriptionsfaktoren, gesucht werden.
Überraschenderweise hat sich auch gezeigt, dass die für die MALDI-TOF-Analyse notwendigerweisende zuzugebende Matrix, die während der Analyse gemeinsam mit dem Analyten verdampft wird, entweder vor dem Aufbringen der Nanopartikel-Suspension oder gemeinsam mit dieser oder nach deren Aufbringen auf dem MALDI-Probenträger aufgebracht werden kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann also gegenüber herkömmlichen Verfahren in erheblich einfacherer Weise und in wesentlich kürzerer Zeit durchgeführt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren führt vorteilhafterweise auch zu deutlich niedrigeren Nachweisgrenzen, zu einem verbesserten Signal/Rausch- Verhältnis und zu einer guten Peakauflösung. Die unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens erhaltenen MS-Spektren zeichnen sich beispielsweise dadurch aus, dass unter üblichen MALDI-TOF- Bedingungen, beispielsweise Laserstärke, keine Störpeaks auftreten und somit klarere Untersuchungsergebnisse erhalten werden.
Die überraschenden Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens beruhen insbesondere auf den Eigenschaften der erfindungsgemäß eingesetzten Nanopartikel. Vorteilhafterweise stören die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Nanopartikel die MALDI- Analyse in keinster Weise, sondern gestatten sogar gegenüber herkömmlichen Probenaufbereitungs- und MALDI-Verfahren eine erheblich verbesserte Analytik des Analyten. Die erfindungsgemäß verwendeten Nanopartikel weisen bezüglich des erfindungsgemäßen Verfahrens die folgenden Vorteile auf:
Die erfindungsgemäßen Nanopartikel sind mit einem Durchmesser von <150 nm im Vergleich zu den üblicherweise benutzten Partikeln sehr klein. Sie besitzen daher ein vergleichsweise sehr großes Oberfläche-Volumen-Verhältnis und können dementspre- chend eine große Menge des Analyten pro Masse binden. Aufgrund des sehr kleinen Durchmessers entstehen beim Einbetten der Nanopartikel in die MALDI- Matrix sehr homogene Schichten und Oberflächen, was für den Desorptionsprozess und die Massen-Auflösung sehr wichtig ist. Ohne Störung des MALDI-Prozesses können sogar mehrere Lagen der Partikel auf den Probenträger aufgebracht werden, was zu einer zusätzlichen Anreicherung des Analyten auf dem Probenträger führt.
Da die erfindungsgemäß verwendeten Partikel vorzugsweise hochgradig quervernetzte, glasartige AI- koxysilan-Kondensate sind, ist eine Mobilisierung der Partikel in das Massenspektrometer nahezu ausgeschlossen. Unter normalen MALDI-Bedingungen, beispielsweise Laserstärke, treten daher im Gegensatz zu Partikeln aus synthetischen Polymeren keine Störpeaks im MS-Spektrum auf.
Die erfindungsgemäß verwendeten Nanopartikel lassen sich aufgrund ihres hohen spezifischen Gewichtes schnell durch Zentrifugation abtrennen und bilden sehr stabile Pellets. Sie können daher schnell und verlustfrei aus flüssigen Medien abgetrennt werden, was wiederum zu einer maximalen Analyt-Ausbeute führt. Die Partikel-Pellets lassen sich auch problemlos resuspendieren, wodurch die MALDI- Probenpräparation erleichtert und beschleunigt wird.
Die erfindungsgemäß verwendeten Nanopartikel sind chemisch ausgesprochen inert und mechanisch stabil. In Lösungsmitteln erfolgt keine Quellung der Parti- kel. Das heißt, die Partikel verändern ihre Morphologie nicht, auch wenn sie mehrmals über längere Zeit in Lösungsmitteln suspendiert werden. Die immobilisierten Analyten können deshalb von störenden Substanzen, wie unspezifisch gebundenen Verbindun- gen mit ähnlichen Massen oder den MALDI-Prozess störenden Stoffen, wie Detergenzien und Salze, über beliebig lange Waschprozesse hinweg optimal abgetrennt werden.
Die erfindungsgemäß verwendeten Nanopartikel sind mit Oberflächen ausgestattet, die in unterschiedlicher Weise modifiziert sind. Die Nanopartikel tra- gen unterschiedliche funktionelle Gruppen und erlauben somit die Bindung unterschiedlicher Proteine. Unter Verwendung der erfindungsgemäß verwendeten Partikel können daher die unterschiedlichsten Analyten mit komplementären funktionellen Gruppen aus komplexen Gemischen abgetrennt und direkt mit Hilfe des MALDI-TOF-MS-Verfahrens untersucht werden.
Die erfindungsgemäß verwendeten Nanopartikel zeigen eine sehr guten Haftung auf herkömmlichen MALDI- Probenträgern. Die Partikel können dadurch problemlos in jedem MALDI-Gerätesystem verwendet werden und sind systemunabhängig . Die MALDI-massen- spektrometrischen Verfahren unterscheiden sich im besonderen in der Art des verwendeten Massenanaly- sators . Die erfindungsgemäß verwendeten Nanopartikel stören den Matrix-unterstützten Desorptions- und Ionisierungsprozess nicht und können somit in allen gängigen MALDI-massenspektrometrischen Ver- fahren zur direkten Untersuchung von Analyten nach der Immobilisierung eingesetzt werden. Die am häufigsten verwendeten Massenanalysatoren sind Flug- zeitanalysatoren (TOF) . Die Nanopartikel können bei linearer und bei reflektierter MALDI-TOF-MS einge- setzt werden. Bei dem Reflektionsverfahren ist dadurch auch eine sogenannte Post Source Decay- Untersuchung möglich, das heißt die Struktur des immobilisierten Analyten kann mittels gezielter Fragmentanalyse ermittelt werden.
Die erfindungsgemäß verwendeten Nanopartikel eignen sich daher in hervorragender Weise für ein sogenanntes Peptid-Mapping, da sie den für das Peptid- Mapping erforderlichen enzymatischen Verdau nicht stören und auch die Massenauflösung nicht negativ beeinflussen. Insbesondere für ein solches Peptid- Mapping ist es auch möglich, die Proteine auf der Oberfläche der Nanopartikel kovalent durch Cross- Linker zu verankern. Dadurch können stringente Waschschritte, die insbesondere bei komplexen Proben erforderlich sind, ohne Analyt-Verluste durchgeführt werden. Ferner eignen sich mit geeigneten Antikörpern ausgestattete Nanopartikel in besonderer Weise für die humanmedizinische und/oder veterinärmedizinische Diagnostik, beispielsweise zur Charakterisierung von Tumoren, BSE-Tests usw. Sie bieten gegenüber herkömmlichen Verfahren einen ent- scheidenden Zeitvorteil, was insbesondere bei zeitkritischen Infektionen von Interesse ist.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem „Analyten" eine Substanz verstanden, bei der Art und Menge ihrer Einzelbestandteile be- stimmt und/oder die aus Gemischen abgetrennt werden soll . Insbesondere handelt es sich bei dem Analyten um Proteine, aber auch um andere Verbindungen, beispielsweise Nucleinsäuren oder Kohlenhydrate und ähnliche. In bevorzugter Ausführungsform der Erfin- düng ist der Analyt ein Protein, Peptid, Wirkstoff, Schadstoff, Toxin, Pestizid, Antigen oder eine Nuc- leinsäure .
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem „Protein" ein Molekül verstanden, das mindestens zwei über eine Amidbindung miteinander verbundene Aminosäuren umfasst. Im Kontext der vorliegenden Erfindung kann ein Protein also auch ein Peptid, zum Beispiel ein Oligopeptid, ein Polypep- tid oder ein Teil, zum Beispiel eine Protein-Domäne sein. Ein derartiges Protein kann natürlichen oder synthetischen Ursprungs sein. Das Protein kann durch gentechnische Verfahren gegenüber dem Wildtyp-Protein modifiziert sein und/oder unnatürliche und/oder ungewöhnliche Aminosäuren enthalten. Das Protein kann gegenüber der Wildtyp-Form derivati- siert sein, beispielsweise Glykosylierungen aufwei- sen, es kann verkürzt sein, es kann mit anderen Proteinen fusioniert sein oder mit Molekülen anderer Art, beispielsweise mit Kohlenhydraten, verbunden sein.
Unter einer „Probe" wird eine wässrige oder organi- sehe Lösung, Emulsion, Dispersion oder Suspension verstanden, die einen vorstehend definierten Analyten in isolierter und aufgereinigter Form oder als Bestandteil eines komplexen Gemisches unterschiedlicher Substanzen enthält. Bei einer Probe kann es sich beispielsweise um eine biologische Flüssigkeit, wie Blut, Lymphe, Gewebeflüssigkeit etc., handeln, also eine Flüssigkeit, die einem lebenden oder toten Organismus, Organ oder Gewebe entnommen wurde. Eine Probe kann jedoch auch ein Kulturmedi- um, beispielsweise ein Fermentationsmedium, sein, in dem Organismen, beispielsweise Mikroorganismen, oder menschliche, tierische oder pflanzliche Zellen kultiviert wurden. Bei einer Probe im Sinne der Erfindung kann es sich jedoch auch um eine wässrige Lösung, Emulsion, Dispersion oder Suspension eines isolierten und aufgereinigten Analyten handeln. Eine Probe kann bereits Aufreinigungsschritten unterworfen worden sein, kann aber auch ungereinigt vor- liegen. Die „Bereitstellung einer Probe" kann daher sowohl die Gewinnung einer vorstehend definierten Probe als auch die teilweise oder vollständige Aufreinigung der Probe beziehungsweise des Analyten nach Probengewinnung bedeuten.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem „Nanopartikel" eine partikuläre Bindematrix verstanden, die einen Kern mit einer Oberfläche umfasst, die funktionelle Gruppen aufweist, die in der Lage sind, komplementäre funktionelle Gruppen des Analyten kovalent oder nicht-kovalent zu binden, wobei der Analyt auf dem Nanopartikel immobilisiert wird. Nanopartikel weisen eine Größe von < 500 nm, vorzugsweise < 150 nm auf. Nanoparti- kel sind dadurch charakterisiert, dass der Kern im Gegensatz zur Oberfläche chemisch inert ist. Die „Bereitstellung von Nanopartikeln" kann sowohl die Herstellung der Nanopartikel, das heißt die Herstellung der Kerne unter Verwendung von Emulsi- onspolymerisations-, Sol-Gel-Verfahren, etc., und die Modifizierung der Kernoberfläche durch Aufbringen funktioneller Gruppen, als auch die Verwendung bereits hergestellter fertiger Nanopartikel bedeuten.
Die „Bereitstellung einer Suspension der Nanopartikel in einer wässrigen Flüssigkeit" kann sowohl das Suspendieren von Nanopartikeln in Flüssigkeiten, insbesondere wässrigen Medien, gegebenenfalls unter Verwendung zusätzlicher Bestandteile, beispielswei- se pH-Mittel, Suspendierhilfen etc., als auch die Verwendung bereits fertig hergestellter Nanoparti- kel-Suspensionen bedeuten. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer ersten funktioneilen Gruppe eine funktionelle Gruppe des zu immobilisierenden Analyten verstanden, die in der Lage ist, mit einer zweiten funktioneilen Gruppe, also einer auf die Oberfläche des Kerns aufgebrachten chemischen Gruppe, derart zu interagieren, dass eine affine Bindung kovalen- ter oder nicht-kovalenter Art zwischen den beiden Bindungspartnern stattfinden kann, dergestalt, dass der Analyt auf dem Nanopartikel immobilisiert wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die erste funktionelle Gruppe, also die funktionelle Gruppe des Analyten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Carboxy-Gruppen, Amino-Gruppen, Thiol-Gruppen, Biotin-Gruppen, Strep-Tag I-Gruppen, Strep-Tag II-Gruppen, His-Tag- Gruppen, Flag-Tag-Gruppen, Antikörpern gegen Protein A, Antikörpern gegen Protein G, biotinylierte Antikörper und biotinylierte Rezeptoren. Bei den Rezeptoren kann es sich beispielsweise um MHC- Proteine, Cytokine, T-Zell-Rezeptoren wie das CD-8- Protein und andere handeln. Auch komplexere Schichten können aufgebaut werden. Beispielsweise kann ein Antikörper eine Streptavidin-Gruppe und eine biotinylierte-Antikörper-Gruppe und ein Protein- Gruppe aufweisen, wobei das Protein beispielsweise ein Rezeptor sein kann.
Die zweite funktionelle Gruppe, also die funktionelle Gruppe auf der Oberfläche des Nanopartikels, ist erfindungsgemäß ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Amino-Gruppen, Carboxy-Gruppen, Malei- nimido-Gruppen, Avidin-Gruppen, Streptavidin- Gruppen, Neutravidin-Gruppen, Metallchelatkomplexe, Protein A-Einheiten, Protein G-Einheiten, Antikörper, Rezeptor-Einheiten oder Teilen davon. Für spezielle Problemlösungen können als zweite funktio- nelle Gruppe auch Antikörper oder Rezeptoren direkt auf dem Nanopartikel immobilisiert werden.
Ein erfindungsgemäß verwendetes Nanopartikel weist also an seiner Oberfläche eine zweite funktionelle Gruppe auf, die kovalent oder nicht-kovalent mit einer ersten funktioneilen Gruppe eines zu immobilisierenden Analyten verknüpft wird, wobei die erste funktionelle Gruppe eine andere Gruppe als die zweite funktionelle Gruppe ist. Die beiden miteinander in Bindung tretenden Gruppen müssen komple- mentär zueinander sein, das heißt in der Lage sein, eine kovalente oder nicht-kovalente Bindung miteinander einzugehen.
Wird erfindungsgemäß als erste funktionelle Gruppe beispielsweise eine Carboxy-Gruppe verwendet, ist die zweite funktionelle Gruppe eine Amino-Gruppe. Wird erfindungsgemäß umgekehrt eine Amino-Gruppe als erste funktionelle Gruppe verwendet, ist erfindungsgemäß die zweite funktionelle Gruppe eine Carboxy-Gruppe. Wird erfindungsgemäß eine Thiol-Gruppe als erste funktionelle Gruppe ausgewählt, ist die zweite funktionelle Gruppe erfindungsgemäß eine Ma- leinimido-Gruppe . Werden erfindungsgemäß als erste funktionelle Gruppen Biotin-Gruppen und/oder Strep- Tag I-Gruppen und/oder Strep-Tag II-Gruppen verwen- det, ist die zweite funktionelle Gruppe eine Avi- din-Gruppe und/oder eine Steptavidin-Gruppe und/oder eine Neutravidin-Gruppe . Wird erfindungs- gemaß eine Thiol-Gruppe als erste funktionelle Gruppe ausgewählt, ist die zweite funktionelle Gruppe erfindungsgemaß eine Maleinimido-Gruppe . Wird erfindungsgemaß ein Antikörper gegen Protein A eingesetzt, wird als zweite funktionelle Gruppe er- findungsgemaß Protein A eingesetzt. Wird erfindungsgemäß als erste funktionelle Gruppe ein Anti- korper gegen Protein G verwendet, ist die zweite funktionelle Gruppe Protein G.
Die vorgenannten ersten und/oder zweiten funktioneilen Gruppen können erfindungsgemaß mit Hilfe eines Spacers mit dem zu immobilisierenden Analyten, insbesondere dem zu immobilisierenden Protein, beziehungsweise dem Kern verbunden beziehungsweise mittels eines Spacers an den Kern oder in den Analyten eingeführt werden. Der Spacer dient also einerseits als Abstandshalter der funktioneilen Gruppe zu Kern beziehungsweise Analyten, andererseits als Trager für die funktionelle Gruppe. Ein derar- tiger Spacer kann erfindungsgemaß Alkylen-Gruppen oder Ethylenoxid-Oligomere mit 2 bis 50 C-Atomen darstellen, der in bevorzugter Ausführungsform substituiert ist und Heteroatome aufweist. Der Spacer kann flexibel und/oder linear sein.
In bevorzugter Ausfuhrungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die ersten funktioneilen Gruppen ein naturlicher Bestandteil des Analyten, insbesondere eines Proteins, sind.
Bei einem Protein mittlerer Große, also einer Große von etwa 50 kDA mit etwa 500 Aminosäuren, gibt es etwa 20 bis 30 reaktive Amino-Gruppen, die prinzi- piell als funktionelle Gruppe zur Immobilisierung in Frage kommen. Insbesondere handelt es sich dabei um Amino-Gruppen am N-terminalen Ende eines Proteins. Auch die Amino-Gruppen und alle Lysinreste kommen für die Immobilisierung in Frage. Auch Argi- nin mit seiner Guanidium-Gruppe kommt als funktionelle Gruppe in Betracht. Analyten wie Nucleinsäu- ren enthalten beispielsweise Carbonsäure-Gruppen, die zur Immobilisierung verwendet werden können. Bei Proteinen müssen die Carbonsäure-Gruppen hingegen aktiviert werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, die ersten funktionellen Gruppen mittels gentechnischer Verfahren, biochemi- scher, enzymatischer und/oder chemischer Derivati- sierung oder chemischer Syntheseverfahren in den Analyten einzuführen.
Ist der Analyt ein Protein, können beispielsweise unnatürliche Aminosäuren durch gentechnische Ver- fahren oder während einer chemischen Proteinsynthese in das Proteinmolekül eingefügt werden, beispielsweise zusammen mit Spacern oder Linkern. Derartige unnatürliche Aminosäuren sind Verbindungen, die eine Aminosäurefunktion und einen Rest R auf- weisen und nicht über einen natürlich vorkommenden genetischen Code definiert sind, wobei diese Aminosäuren in besonders bevorzugter Weise eine Thiol- Gruppe aufweisen. Erfindungsgemäß kann auch vorgesehen sein, eine natürlicherweise vorkommende Ami- nosäure, beispielsweise Lysin, zu modifizieren, zum Beispiel durch Derivatisierung ihrer Seitenkette, insbesondere deren primärer Aminogruppe, mit der Carbonsäurefunktion von Lävulinsäure .
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können funktionelle Gruppen durch Modifikation eines Proteins in dieses eingeführt werden, wobei dem Protein Tags, also Markierungen, hinzugefügt werden, vorzugsweise an den C- Terminus oder den N-Terminus . Diese Tags können jedoch auch intramolekular angeordnet sein. Insbeson- dere ist vorgesehen, dass ein Protein dadurch modifiziert wird, dass mindestens ein Strep-Tag, beispielsweise ein Strep-Tag I oder Strep-Tag II oder Biotin hinzugefügt wird. Erfindungsgemäß werden unter einem Strep-Tag auch funktionelle und/oder strukturelle Äquivalente verstanden, sofern sie Streptavidin-Gruppen und/oder dessen Äquivalente binden können. Der Begriff „Streptavidin" erfasst im Sinne der vorliegenden Erfindung also auch dessen funktionelle und/oder strukturelle Äquivalente.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können Proteine, die mittels MALDI-TOF-Verfahren analysiert werden sollen, unter Verwendung üblicher Verfahren mit Antikörpern, insbesondere Antikörpern gegen Protein A oder Antikörpern gegen Protein G markiert werden.
"Antikörper" bedeutet ein Polypeptid, das im wesentlichen von einem Immunglobulin-Gen oder Im- munglobulin-Genen codiert wird, oder Fragmente davon, das/die einen Analyten (Antigen) spezifisch bindet/binden und erkennt/erkennen. Bekannte Im- munglobulin-Gene umfassen sowohl die kappa-, lamb- da-, alpha-, gamma-, delta-, epsilon- und mu-Gene für den konstanten Bereich als auch die unzähligen Gene für den variablen Immunglobulin-Bereich . Antikörper kommen beispielsweise als intakte Immunglo- buline oder als eine Reihe gut charakterisierter Fragmente vor, die mittels Spaltung mit verschiedenen Peptidasen erzeugt werden. "Antikörper" bedeutet auch modifizierte Antikörper (z.B. oligomere, reduzierte, oxidierte und markierte Antikörper) . Der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Begriff "Antikörper" umfasst auch Antikörper- Fragmente, die entweder mittels Modifikation ganzer Antikörper oder mittels de novo-Synthese unter Verwendung von DNA-Rekombinationstechniken erzeugt worden sind. Der Begriff "Antikörper" umfaßt sowohl intakte Moleküle als auch Fragmente davon, wie Fab, F(ab')2 und Fv, die die Epitop-Determinante binden können.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist also vorgesehen, Proteine, die beispielsweise mit unnatürlichen Aminosäuren, natürlichen, aber unnatürlich derivatisierten Aminosäuren oder spezifischen Strep-Tags modifiziert sind, oder Antikörper-gebundene Proteine mit dazu komplementär reak- tiven Nanopartikel-Oberflachen derart zur Bindung zu bringen, dass eine geeignete spezifische, insbesondere nicht-kovalente Anbindung der Proteine und damit eine Immobilisierung der Proteine an die 0- berflachen erfolgt.
In einer weiteren Ausführungs orm der Erfindung ist vorgesehen, dass im erfindungsgemäßen Verfahren Nanopartikel verwendet werden, die einen Kern umfas- sen, der, vorzugsweise unter Verwendung eines Sol- Gel-Verfahrens, aus Alkoxysilanen herstellbar ist.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem „Kern" ein chemisch inerter Stoff ver- standen, der als Gerüst für den immobilisierten A- nalyten dient. Vorzugsweise besteht der Kern der erfindungsgemäßen Nanopartikel daher aus Alkoxysi- lan-Kondensaten, die zusätzlich quervernetzt sind und dadurch bedingt eine glasartige Beschaffenheit aufweisen. Die Kerne der erfindungsgemäß verwendeten Nanopartikel weisen erfindungsgemäß ein hohes spezifisches Gewicht auf. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass das spezifische Gewicht der Kerne dadurch erhöht ist, dass bei ihrer Herstellung eine Cokondensation mit schweren Verbindungen, insbesondere Wolframaten usw. erfolgt. Erfindungsgemäß ist weiterhin vorgesehen, dass der Kern der erfindungsgemäßen Nanopartikel einen Durchmesser < 500 nm, insbesondere 30 nm bis 400 nm, vorzugsweise 50 nm bis 150 nm aufweist .
Die Oberfläche des Kerns ist erfindungsgemäß dadurch charakterisiert, dass sie durch Aufbringen der die ersten funktionellen Gruppen bindenden kom- plementären zweiten funktionellen Gruppen modifiziert ist. Erfindungsgemäß ist insbesondere vorges- hen, dass die funktionellen Gruppen unter Verwendung von Standardverfahren wie Pfropfpolymerisation, Silanisierung, chemischer Derivatisierung und ähnlicher geeigneter Verfahren auf die Oberfläche des Kerns aufgebracht sind. In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass die Kernoberfläche durch Aufbringen zusätzlicher Funktionalitäten modifiziert sein kann.
Vorzugsweise weist die Oberfläche der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nanopartikel chemische Verbindungen auf, die eine unspezifische Adsorption von weiteren Analyten, insbesondere weiteren Proteinen, an den Nanopartikeln verhindern oder verringern. Besonders bevorzugt weist die O- berfläche Ethylenglycol-Oligomere auf.
Erfindungsgemäß besteht auch die Möglichkeit, dass auf der Oberfläche der Nanopartikel separat oder zusätzlich Ionenaustausch-Funktionen verankert sind. In der MALDI-Analytik ist der Salz-Gehalt der Matrix oft eine kritische Größe, da es durch Ionen- Anlagerung zu einer Unterdrückung der Ionisation oder zu einer Peak-Verbreiterung kommt beziehungsweise dass sich auch Störpeaks ergeben. Mit Nano- partikeln, die eine hohe Ionenaustausch-Kapazität besitzen und dadurch störende Salze in der Matrix fixieren, lässt sich dieses Problem umgehen. Nanopartikel mit Ionenaustausch-Funktion sind insbesondere zur Optimierung der MALDI-Analyse von Nuclein- säuren geeignet, da diese dadurch in einen definierten Masse-Zustand überführt werden können.
Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass dass die für die MALDI-TOF-Analyse notwendigerweisende zuzugebende Matrix, die während der Analyse gemeinsam mit dem Analyten verdampft wird, entweder vor dem Aufbringen der Nanopartikel-Suspension oder gemeinsam mit dieser oder nach deren Aufbringen auf dem MALDI-Probenträger aufgebracht werden kann.
Matrixsubstanzen, die in der MALDI-Massen- spektrometrie eingesetzt werden, sind niedermoleku- lare Verbindungen, die einerseits die Wellenlänge des zur Desorption eingesetzten Lasers absorbieren können und andererseits die Analyte gut in sich einbetten können. Dadurch wird eine Desorption und Ionisierung erst ermöglicht. Die Ionisierung er- folgt vorwiegend durch Ionenübertragung auf den A- nalyten, beispielsweise durch Protonierung. Als Matrixsubstanzen werden verschiedene Verbindungen für unterschiedliche Laserwellenlängen und verschiedene Analyt-Klassen verwendet. In der Regel handelt es sich um Verbindungen mit aromatischen Gruppen. Bei der UV-MALDI-TOF-MS von Proteinen sind die am häufigsten eingesetzten Matrices 3,5- Dimethoxy-zimtsäure (Sinapinsäure) oder α-Cyano-4- hydroxy-zimtsäure . Zusätzlich können auch Gemische aus diesen Matrixverbindungen und sogenannten Cati- onizern verwendet werden. Diese Cationizer sind vor allem Natrium-, Kalium- oder Silbersalze und ermöglichen die Ionisierung von Kohlenhydraten oder synthetischen Polymeren während der Laserdesorption.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Nanopartikel, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Untersuchung eines Analyten, insbesondere eines Proteins, mittels Matrix-unterstützter Laser- Desorptions/Ionisations-Flugzeit-Massenspektrosko- pie (MALDI-TOF-MS) Verwendung finden. Die erfindungsgemäß verwendeten Nanopartikel umfassen einen Kern mit einer Oberfläche, die unterschiedliche funktionelle Gruppen zur affinen Bindung komplementärer funktioneller Gruppen aufweist. Aufgrund der unterschiedlichen Oberflächenmodifikationen mit unterschiedlichen funktionellen Gruppen sind die erfindungsgemäßen Nanopartikel zur Immobilisierung einer Vielzahl von Analyten geeignet.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung be- trifft Nanopartikel, deren Oberfläche durch Aufbringen von Amino-Gruppen funktionalisiert ist. Erfindungsgemäß sind derartige Nanopartikel insbesondere zur kovalenten Immobilisierung mindestens eines Proteins mit aktivierten Carboxy-Gruppen und/oder mindestens einer Nucleinsäure und zu deren Abtrennung aus einem komplexen Gemisch und direkten Untersuchungen mittels MALDI-TOF-MS geeignet.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform betrifft Nanopartikel, deren Oberfläche Carboxy-Gruppen auf- weist. Derartige Nanopartikel sind insbesondere zur kovalenten Immobilisierung mindestens eines Proteins mit frei zugänglichen Amino-Gruppen und zu dessen Abtrennung aus einem komplexen Gemisch und direkten Untersuchung mittels MALDI-TOF-MS geeignet.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft Nanopartikel, deren Oberfläche Malei- nimido-Gruppen aufweist. Derartige Nanopartikel sind insbesondere zur kovalenten Immobilisierung mindestens eines Proteins mit Thiol-Gruppen und zu dessen Abtrennung aus einem komplexen Gemisch und direkten Untersuchung mittels MALDI-TOF-MS geeignet .
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden Nanopartikel bereitgestellt, deren Oberflä- ehe Avidin-Gruppen, Streptavidin-Gruppen und/oder Neutravidin-Gruppen aufweist. Derartige Nanopartikel sind insbesondere zur Immobilisierung von Proteinen mit Biotin-Gruppen und/oder Strep-Tag- Gruppen und zu deren Abtrennung aus einem komplexen Gemisch und direkten Untersuchung mittels MALDI- TOF-MS geeignet.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft Nanopartikel, deren Oberfläche Protein A-Einheiten aufweist. Derartige Nanopartikel sind insbesondere zur Immobilisierung mindestens eines Antikörpers und/oder eines Antikörper-gebundenen Proteins und zu deren Abtrennung aus einem komplexen Gemisch und direkten Untersuchung mittels MALDI-TOF-MS geeignet .
Noch eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft Nanopartikel, deren Oberfläche Protein G-Einheiten aufweist. Derartige Nanopartikel sind insbesondere zur Immobilisierung von Antikörpern und/oder Antikörper-gebundenen Proteinen und zu deren Abtrennung aus einem komplexen Gemisch und direkten Untersuchung mittels MALDI-TOF-MS geeignet .
Die erfindungsgemäßen Nanopartikel umfassen einen
Kern, der aus einem chemisch inerten Material, vor- zugsweise aus glasartigen quervernetzten Alkoxysi- lan-Kondensaten besteht, wobei die Herstellung des Kerns vorzugsweise mittels Sol-Gel-Synthese unter Verwendung von Alkoxysilanen erfolgt. Die erfindungsgemäßen Nanopartikel weisen, bedingt durch die Zusammensetzung der Kerne, ein hohes spezifische Gewicht auf. Dieses hohe Gewicht der Kerne kann erfindungsgemäß dadurch erhöht sein, dass bei der Herstellung der Kerne zusätzlich eine Cokondensati- on mit schweren Verbindungen, insbesondere mit Wolframaten, erfolgte.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist weiterhin vorgesehen, dass die Nanopartikel, die unterschiedliche funktionelle Gruppen auf ihrer Oberfläche aufweisen, unterschiedliche Farbmarkierungen tragen. Die unterschiedlichen Farbmarkierungen erleichtern einerseits die Unterscheidung der verschiedenen Oberflächenmodifizierungen, also der unterschiedlichen funktionellen Gruppen, der erfindungsgemäßen Partikel. Anderer- seits erleichtern die Farbmarkierungen die Handhabung der erfindungsgemäßen Nanopartikel, was sich insbesondere bei Zentrifugationen vorteilhaft auswirkt, da auch sehr kleine Pellets leicht erkannt werden können.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine fertige Nanopartikel-Suspension, die mindestens eine erfindungsgemäße Nanopartikel-Spezies, das heißt Nanopartikel mit einer der vorstehend genannten spezifischen Oberflächenmodifikationen, in einem wäss- rigen Medium, gegebenenfalls zusammen mit weiteren Zusätzen, beispielsweise pH-Mittel, Suspendierhilfen, etc. umfasst. Solche Nanopartikelsuspensionen können unmittelbar zur Probenpräparation, das heißt Isolierung und Aufreinigung eines Analyten, für eine nachfolgende MALDI-TOF-Analyse eingesetzt werden .
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung auch Kits, die mindestens eine der vorstehend genannten Nanopartikel-Spezies, das heißt Nanopartikel mit einer der vorstehend genannten funktionellen Gruppe, vorzugsweise jedoch meh- rere dieser Nanopartikelspezies in Pulverform und/oder als Suspension umfassen. Solche Kits können zur Probenpräparation für eine Vielzahl unterschiedlicher Analyten für eine nachfolgende MALDI- TOF-Analyse eingesetzt werden.
Die Analyt tragenden Nanopartikel können in besonders bevorzugter Ausführungsform nicht nur einmal auf den MALDI-Probenträger aufgetragen werden. Durch ein erfindungsgemäß bevorzugtes mehrfaches Aufbringen, insbesondere 2x-100x, bevorzugt 10x-20x im Wechsel mit einem Trocknungsschritt und/oder einer Matrixabscheidung kann der Analyt auf dem Probenträger au konzentriert werden, ohne daß die Partikel den MALDI-Prozeß negativ beeinflussen.
Neben dem Analyten können gezielt weitere Peptide und/oder Proteine an die Nanopartikel gebunden werden, die eine interne Kalibration des Molekulargewichtes (Peaklage) und/oder der Konzentration (Peakhöhe) erlauben.
Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen. Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele und Figuren näher erläutert.
Figur 1 zeigt zwei Massenspektren.
Figur 2 zeigt weitere Massenspektren.
Beispiel 1
Herstellung nanopartikulärer Kerne
Silica-Träger
Zu 200 ml Ethanol wurden 12 mMol Tetraethoxysilan und 90 mMol NH3 gegeben. Das Gemisch wurde 24 Stun- den bei Raumtemperatur gerührt und anschließend wurden die gebildeten Partikel durch mehrfaches Zentrifugieren gereinigt. Dabei wurden 650 mg Sili- ca-Partikel mit einer mittleren Partikelgröße von 125 nm erhalten.
Beispiel 2
Oberflächenmodifizierung der Kerne
2.1 Aminiofunktionalisierte Oberfläche
Eine 1 Gew.-% wässrige Suspension der in Beispiel 1 erhaltenen Kerne wurde mit 10 Vol.-% 25 % Ammoniak versetzt. 20 Gew.-% Aminpropyltriethoxysilan, bezogen auf die Kerne, wurden zugegeben und es wurde eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die Partikel wurden durch mehrfaches Zentrifugieren gereinigt. Die erhaltenen Partikel tragen funktionelle Aminogruppen auf ihrer Oberfläche (Zetapotential im 0,1 M Acetat-Puffer: +35 mV).
2.2 Pegylierte Oberfläche
1 mg aminofunktionalisierte Partikel (Bsp.: 2.1) werden in 1 ml 10 mM Phosphatpuffer (pH: 7.0) suspendiert. Anschließend werden bis zu 1 mg hetero- funktionelle Polyethylenglykole wie mPEG- succinimidyl-propionat, t-Boc-NH-PEG-succinimidyl- propionat, Maleinimido-PEG-succinimidyl-propionat oder deren Gemische, zugegeben und 3 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Sind Schutzgruppen auf der Oberfläche vorhanden, werden diese durch eine 2 Stunden Behandlung mit 1 % Trifluoressigsäure entfernt. Die Partikel werden zweimal mit 1 ml 10 mM Phosphatpuffer (pH: 7.0) gewaschen.
Diese Oberflächen sind zur Vermeidung einer unspezifischen Anlagerung von Proteinen geeignet.
Falls diese Oberflächen nach der Deblockierung der Schutzgruppen Aminogruppen tragen, können sie in Bsp. 2.6/2.7 weiterverwendet werden.
2.3 Carboxy-funktionalisierte Oberfläche
Zunächst wurde eine 2 Gew.-% Suspension aminofunk- tionalisierter Kerne in Tetrahydrofuran hergestellt. Zu 10 ml dieser Lösung wurden 260 mg Bernsteinsäureanhydrid gegeben. Nach einer 5- minütigen Behandlung mittels Ultraschall wurde eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurden die Kerne durch mehrfaches Zentrifugieren gerein- gigt. Die erhaltenen Silica-Kerne tragen funktio- nelle Carboxygruppen (Zetapotential im 0,1 M Ace- tat-Puffer: -35 mV) auf ihrer Oberfläche und besitzen eine mittlere Partikelgröße von 170 nm.
2.4 Nitrilotriessigsäure (NTA) -Oberfläche
10 mg Carboxy-modifizierte Kerne wurden zweimal mit 1 ml Acetonitril (MeCN) gewaschen und anschließend in 1 ml MeCN aufgenommen. Dazu wurden 10 μMol Di- cyclohexylcarbodiimid und 10 μMol N-Hydroxy- succinimid gegeben. Anschließend wurde zwei Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Danach wurde einmal mit 1 ml Cyclohexan und einmal mit 1 ml MeCN gewaschen. Die Partikel wurden anschließend in 1 ml MeCN aufgenommen. Dazu wurden 4 μMol N,N-Bis- Carboxymethyl-L-Lysin gegeben und drei Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Danach wurde einmal mit 1 ml Acetonitril und zweimal mit 1 ml 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen.
Durch diese Umsetzung wird einerseits die Dichte der funktionellen Carboxy-Gruppen erhöht und ande- rerseits können mit dieser Oberfläche Ni2+-Ionen durch Komplexierung gebunden werden. Diese Oberfläche ist dann zur Bindung von His-Tag-modifizierten Proteinen befähigt.
2.5 Thiol-Oberflache
10 mg Carboxy-modifizierte Kerne wurden zweimal mit 1 ml Acetonitril (MeCN) gewaschen und dann in 1 ml MeCN aufgenommen. Dazu wurden 10 μMol Dicyclophe- xylcarbodiimid und 10 μMol N-Hydroxysuccinimid gegeben und anschließend wurde zwei Stunden bei Raum- temperatur geschüttelt. Dann wurde einmal mit 1 ml Cyclohexan und einmal mit 1 ml MeCN gewaschen. Die Kerne wurden dann in 1 ml MeCN aufgenommen. Dazu wurden 500 μg Cystein gegeben und drei Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Im Anschluss daran wur- de einmal mit 1 ml Acetonitril und zweimal mit 1 ml 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen.
Diese Oberfläche ist insbesondere zur Immobilisierung von Proteinen über Disulfid-Brücken geeignet.
2.6 Maleimido-aktivierte Oberfläche
500 μg aminofunktionalisierte Kerne, wurden in 1 ml 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) resuspendiert. Dazu wurden 1,25 μMol Sulfo-Succinimidyl-4- (N- aleimidomethyl) -cyclohexan-1-carboxylat gegeben und eine Stunde bei Raumtemperatur geschüttelt. Da- nach wurde einmal mit kaltem 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und die Kerne wurden in 1 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) aufgenommen.
2.7 Iodacetyl-aktivierte Oberfläche
500 μg aminofunktionalisierte Kerne wurden in 1 ml 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) resuspendiert. Dazu wurden 1.25 μMol Succinimidyl- ( 4-iodoacetyl ) - aminobenzoat gegeben und eine Stunde bei Raumtemperatur geschüttelt. Danach wurde einmal mit kaltem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und die Kerne wurden in 1 ml 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) aufgenommen .
Diese Oberflächen von 2.8 und 2.9 sind zur Ankopp- lung von Proteinen geeignet, die freie Thiol- Gruppen tragen. 2.8 Streptavidin-modifizierte Partikel
15 μg Streptavidin wurden in 1 ml MES-Puffer (pH 5,0) gegeben. Hierzu wurden 500 μgCarboxy- funktionalisierte Nanopartikel und 100 nMol EDC ge- geben. Es wurde 3 h bei Raumtemperatur geschüttelt, die Partikel wurden abzentrifugiert und zweimal mit 1 ml PBS-Puffer gewaschen. Nach Suspendierung in PBS sind die Partikel 200 nm groß und tragen 3 Gew.-% Streptavidin auf ihrer Oberfläche. Mittels dieses Verfahrens lassen sich auch andere Proteine, beispielsweise Streptactin und Protein G auf der Oberfläche immobilisieren.
Beispiel 3
MALDI
Immobilisierung und direkte MALDI-MS Detektion von huMIF auf Streptavidin konjugierten Silika- Nanopartikeln .
Die Figur la) zeigt ein Massenspektrum von Nanopartikeln ohne Immobilisierung von Proteinen. Das Spektrum zeigt nur Peaks vom Monomer des Streptavidin. Die Figur lb) zeigt ein Massenspektrum von Nanopartikeln, nachdem diese in eine Lösung von huMIF und biotinyliertem Anti-huMIF-Antikörper gegeben und anschließend mehrfach mit Pufferlösungen gewa- sehen wurden. Es werden eindeutige Signale des huMIF erhalten. Dies bedeutet, dass huMIF spezifisch an die Nanopartikel gebunden wurde und direkt auf diesen nachgewiesen werden kann. Beispiel zur Aufkonzentrierung von Nanopartikeln auf MALDI-Probenträgern.
Die Figur 2 demonstriert die Aufkonzentrierung von Silika-Nanopartikeln auf MALDI-Probenträgern. Die Figuren 2 (a) - (c) zeigen Massenpektren von (a) 50 pmol, (b) 5.0 pmol, and (c) 0.50 pmol biotinyliertem MF2 immobilisiert auf jeweils 25 μg Silika- Nanopartikeln. (a) und (b) zeigen Peaks mit sinkender Intensität entsprechend der absoluten Analyt- menge auf den Probenträgern. In (c) werden keine Signale mehr vom Analyt erhalten. Figur 2 (d) zeigt ein Massenspektrum derselben Silika-Nanopartikel aus (c) . Dabei wurden 250 μg dieser Partikel, durch wiederholtes Aufbringen auf den Probenträger aufge- geben, so dass sich insgesamt 5,0 pmol des Analyten - also die zehnfache Menge wie in (c) - auf dem Target befinden. Das Massenspektrum zeigt Peaks mit nahezu dem selben Signal-zu-Rauschverhältnis wie das Massenspektrum aus (b) , bei dem ebenfalls 5,0 pmol Analyt absolut auf das Target aufgebracht wurden .

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur Untersuchung mindestens eines Analyten mittels Matrix-unterstützter Laser- Desorptions/Ionisations-Flugzeit-Massenspektrome- trie (MALDI-TOF-MS), umfassend die Bereitstellung einer Probe mit dem erste funktionelle Gruppen aufweisenden Analyten, die Bereitstellung von Nanopartikeln, die einen Kern mit einer Oberfläche umfassen, die die ersten funktionellen Gruppen bindende komplementäre zweite funktionelle Gruppen aufweist, die Bereitstellung einer Suspension der Nanopartikel in einer wässrigen Flüssigkeit, die Zugabe der den mindestens einen Analyten enthaltenden Probe zu der Nanopartikel-Suspension oder die Zugabe der Suspension zu der den Analyten enthaltenden Probe, die affine Bindung des Analyten an die Nanopartikel, das anschließende Abscheiden der den gebundenen Analyten enthaltenden Suspension auf einem MALDI-Probenträger und die spektrometrische Untersuchung des Analyten.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die ersten funktionellen Gruppen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Carboxy-Gruppen, Amino-Gruppen, Thiol-Gruppen, Biotin-Gruppen, His-Tag, FLAG-Tag, Strep-Tag I-Gruppen, Strep-Tag II-Gruppen, Histi- din-Tag-Gruppen, FLAG-Tag-Gruppen, Antikörpern gegen Protein A, Antikörpern gegen Protein G, bioti- nylierten Antikörper und biotinylierten Rezeptoren.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die die ersten funktionellen Gruppen bindenden komplementären zweiten funktionellen Gruppen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Amino-Gruppen, Carboxy-Gruppen, Maleinimido-Gruppen, Avidin-Gruppen, Streptavidin-Gruppen, Neutravidin-Gruppen, Metall- chelatkomplex, Protein A-Einheiten, Protein G- Einheiten, Antikörpern, Rezeptor-Einheiten oder Teilen davon.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die ersten funktionellen Gruppen ein natürlicher Bestandteil des Analyten sind.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die ersten funktionellen Gruppen mittels gentechnischer Verfahren, biochemischer, enzymatischer und/oder chemischer Derivatisierung oder chemischer Syntheseverfahren in den Analyten eingeführt werden .
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Kerne aus Alkoxysilanen hergestellt werden.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Kerne mit einem Durchmesser von 30 bis 400 nm, vorzugsweise 50 nm bis 150 nm hergestellt werden.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die die ersten funktionellen Gruppen bindenden komplementären zweiten funktionellen Gruppen mittels Propfpolymerisation, Silanisierung, chemischer Derivatisierung und ähnlicher geeigneter Verfahren auf die Oberfläche der Kerne aufgebracht werden.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Oberfläche des Kerns durch Aufbringen zusätzlicher Funktionalitäten modifiziert wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei chemische Verbindungen zur Verhinderung oder Verminderung einer unspezifischen Adsorption von weiteren Proteinen auf die Oberfläche des Kerns aufgebracht werden.
11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei Ethy- lenglykol-Oligomere auf die Oberfläche des Kerns aufgebracht werden.
12. Verfahren nach Anspruch 9, wobei eine Ionenaustausch-Funktion auf die Oberfläche des Kerns aufgebracht wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Nanopartikel nach Bindung des Analyten mittels mindestens einer Zentrifugation und mindestens eines Waschvorgangs von der probenhaltigen Suspension abgetrennt und erneut suspendiert werden .
14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Nanopartikel 10 Minuten bei 15 000 g zentrifugiert werden.
15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei die Nanopartikel mit niedrig-konzentrierten Puffersystemen, entionisiertem Wasser, organischen Lösungsmitteln oder überkritischem C02 gewaschen werden.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei eine im Verlauf des MALDI-TOF-MS-Verfahrens eingesetzte Matrix vor oder nach dem Abscheiden der Nanopartikel-haltigen Suspension oder gemeinsam damit auf den MALDI-Probenträger aufgetragen wird.
17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Analyt tragenden Nanopartikel mehrfach auf den MALDI-Probenträger aufgebracht werden.
18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zur internen Kalibration des Molekulargewichts oder der Konzentration neben den Analyten Peptide oder Proteine an die Nanopartikel gebunden werden.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18 zur Durchführung von BSE-Tests, zur Tumordiagnostik und zur Diagnostik von Infektionskrankheiten.
20. Nanopartikel zur Untersuchung eines Analyten mittels Matrix-unterstützter Laser-Desorptions/ Ionisations-Flugzeit-Massenspektroskopie (MALDI- TOF-MS) , umfassend einen Kern mit einer Oberfläche, die funktionelle Gruppen zur affinen Bindung komplementärer funktioneller Gruppen mindestens eines Analyten und damit zur Immobilisierung des mindestens einen Analyten aufweist.
21. Nanopartikel nach Anspruch 20, wobei die Oberfläche Amino-Gruppen aufweist.
22. Nanopartikel nach Anspruch 21, geeignet zur Immobilisierung mindestens eines Proteins mit aktivierten Carboxy-Gruppen und/oder mindestens einer Nucleinsäure und zu deren Abtrennung aus einem komplexen Gemisch und direkten Untersuchung mittels MALDI-TOF-MS.
23. Nanopartikel nach Anspruch 20, wobei die Oberflache Carboxy-Gruppen aufweist.
24. Nanopartikel nach Anspruch 23, geeignet zur kovalenten Immobilisierung mindestens eines Proteins mit frei zugänglichen Amino-Gruppen und zu dessen Abtrennung aus einem komplexen Gemisch und direkten Untersuchung mittels MALDI-TOF-MS.
25. Nanopartikel nach Anspruch 20, wobei die Oberflache Maleinimido-Gruppen aufweist.
26. Nanopartikel nach Anspruch 25, geeignet zur kovalenten Immobilisierung mindestens eines Proteins mit Thiol-Gruppen und zu dessen Abtrennung aus einem komplexen Gemisch und direkten Untersuchung mittels MALDI-TOF-MS.
27. Nanopartikel nach Anspruch 20, wobei die Oberfläche Avidin-Gruppen, Streptavidin-Gruppen und/oder Neutravidin-Gruppen aufweist.
28. Nanopartikel nach Anspruch 27, geeignet zur Immobilisierung mindestens eines Proteins mit Biotin- Gruppen und/oder Strep-Tag-Gruppen und zu dessen Abtrennung aus einem komplexen Gemisch und direkten Untersuchung mittels MALDI-TOF-MS.
29. Nanopartikel nach Anspruch 20, wobei die Oberflache Protein A-Einheiten aufweist.
30. Nanopartikel nach Anspruch 29, geeignet zur Immobilisierung mindestens eines Antikörpers und/oder eines Antikörper-gebundenen Proteins und zu deren Abtrennung aus einem komplexen Gemisch und direkten Untersuchung mittels MALDI-TOF-MS.
31. Nanopartikel nach Anspruch 20, wobei die Oberfläche Protein G-Einheiten aufweist.
32. Nanopartikel nach Anspruch 31, geeignet zur Immobilisierung mindestens eines Antikörpers und/oder eines Antikörper-gebundenen Proteins und zu deren Abtrennung aus einem komplexen Gemisch und direkten Untersuchung mittels MALDI-TOF-MS.
33. Nanopartikel nach einem der Ansprüche 20 bis 32, wobei der Kern aus einem chemisch inerten Material besteht.
34. Nanopartikel nach Anspruch 33, wobei der Kern aus quervernetzten Alkoxysilan-Kondensaten besteht.
35. Nanopartikel nach einem der Ansprüche 20 bis 34, wobei der Kern aus Alkoxysilanen herstellbar ist .
36. Nanopartikel nach Anspruch 35, wobei der Kern durch Cokondensation mit schweren Verbindungen herstellbar ist.
37. Nanopartikel nach Anspruch 36, wobei der Kern durch Cokondensation mit Wolframaten herstellbar ist .
38. Nanopartikel nach einem der Ansprüche 20 bis 37, wobei das Nanopartikel eine Größe von 30 bis 400 nm, vorzugsweise 50 nm bis 150 nm aufweist.
39. Nanopartikel nach einem der Ansprüche 20 bis 38, wobei das Nanopartikel eine Farbmarkierung trägt .
40. Nanopartikel-Suspension, enthaltend mindestens ein Nanopartikel nach einem der Ansprüche 20 bis 39 in einem wässrigen Medium.
41. Kit, umfassend mindestens ein Nanopartikel nach einem der Ansprüche 20 bis 39 in Pulverform und/oder mindestens eine Nanopartikelsuspension nach Anspruch 40.
42. Verwendung eines Nanopartikels nach einem der Ansprüche 20 bis 39, einer Nanopartikel-Suspension nach Anspruch 40 und/oder eines Kits nach Anspruch 41 zum Peptid-Mapping.
43. Verwendung eines Nanopartikels nach einem der Ansprüche 20 bis 39, einer Nanopartikel-Suspension nach Anspruch 40 und/oder eines Kits nach Anspruch 41 zur Durchführung von MALDI-TOF-MS-Verfahren und anderer MALDI-MS-Verfahren .
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