DE19838751A1

DE19838751A1 - Verfahren zur Herstellung einer Affinitätsmatrix, Zwischenerzeugnis zur Herstellung und Anwendung der Affinitätsmatrix

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Publication number: DE19838751A1
Application number: DE1998138751
Authority: DE
Inventors: Hubert Kalbacher; Hermann Beck; Christian J Schroeter
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1998-08-26
Filing date: 1998-08-26
Publication date: 2000-03-09

Abstract

Ein polymerer Träger, z. B. ein aktiviertes Tentakelgel, wird teilweise mit einem säurelabilen Anker versehen, an welches eventuell ein MAP-Gerüst gekoppelt wird. Dieses Material wird einer Festphasenpeptidsynthese unterworfen. Nach Säureabspaltung wird einerseits ein Peptid oder MAP und andererseits eine Affinitätsmatrix zur Aufreinigung von Antikörpern, die gegen das Peptid oder MAP gerichtet sind, erhalten.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Affinitätsmatrix, sowie ein Zwischenerzeugnis zu dieser Herstellung. Die Erfindung betrifft ebenfalls eine Anwendung der Affinitätsmatrix.

Zur Gewinnung polyklonaler Antikörper gegen ein bestimmtes Antigen wird üblicherweise aus der Sequenz des Antigens eine passende etwa 15 Aminosäuren lange Peptidsequenz ausgewählt, die mittels Festphasenpeptidsynthese hergestellt wird. Zur Gewinnung des Antiserums werden Tiere, wie z. B. Hasen oder Ziegen, immunisiert (G. Brian Wisdom: "Peptide antigens and anti-peptide antibodies" in Peptide Antigens, Hrsg. G. Brian Wisdom, 1993, IRL Press, Oxford). Da Peptide alleine zu klein sind, um als Antigen zu wirken, werden sie auf Trägerproteine, wie z. B. Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) gekoppelt und dann in das Tier injiziert. Die Kopplung eines Peptids auf ein Trägerprotein weist einige Nachteile auf. Zum einen wird für die Kopplung Peptid/Protein ein unspezifisches Reagenz, z. B. Glutardialdehyd, verwendet, was zur Bildung von nicht genau definierten Peptid/Protein-Komplexen führt. Zum anderen ist der Peptid/Protein-Komplex häufig unlöslich. Des Weiteren kann nicht gewährleistet werden, dass das Peptid nur über seine terminale Aminogruppe an das Trägerprotein koppelt, sondern auch die Aminogruppe einer Lysinseitenkette kann reagieren. Dann ist das Peptid inmitten seiner Antigensequenz verändert und dies führt dazu, dass Ausbeute und Spezifität der erhaltenen Antikörper unzureichend sein können.

Ein anderes bekanntes Verfahren zur Herstellung eines immunogenen Antigens besteht in der Synthese eines sog. MAP (Multiple Antigen Peptide). In diesem Verfahren (James P. Tam: "Immunization with peptide-carrier complexes: traditional and multiple-antigen peptide systems" in Peptide Antigens, Hrsg. G. Brian Wisdom, 1993, IRL Press, Oxford) stellt man, auf dem Wege der Festphasensynthese, auf einem Gerüst mit meistens acht Synthesestellen, ein zur Immunisierung ausreichend großes Peptidpolymer her, das ohne Kopplung an Proteine eingesetzt werden kann. Nachteilig ist dabei, dass die üblichen analytischen Kontrollen der Peptidsynthese, wie HPLC und Massenbestimmung, im Falle der MAPs schwierig sind. Mögliche fehlerhafte Schritte während der Peptidsynthese und somit falsche Sequenzen bleiben unerkannt. Eine falsche Sequenz des immunogenen Peptids kann aber dazu führen, dass das gewonnene Antiserum keine Antikörper der gewünschten Spezifität enthält.

Immunisierung und Gewinnung des Antiserums erfolgen gemäß bekannter erprobter Verfahrensprotokolle. Häufig muss jedoch das gewonnene Antiserum aufgereinigt werden, um unspezifische Kreuzreaktionen mit anderen Antigenen zu unterbinden. Die beste bekannte Methode zur Aufreinigung des gewünschten polyklonalen Antikörpers ist eine Affinitätsreinigung. Das zur Immunisierung eingesetzte Peptid wird z. B. an CNBr-aktivierter Sepharose immobilisiert und zur affinitätschromatographischen Reinigung des gewünschten Antikörpers verwendet (Michael R. Price & Kami Beyzavi: "Preparative immunoaffinity techniques" in Peptide Antigens, Hrsg. G. Brian Wisdom, 1993, IRL Press, Oxford). Da ein MAP dabei nicht verwendet werden kann, ergibt sich als Nachteil, dass, falls MAPs zur Immunisierung eingesetzt wurden, vorerst eine weitere Festphasensynthese eines Peptids derselben Sequenz erforderlich ist. Des Weiteren ist die Kopplung eines Peptids an Sepharose nicht unkritisch; z. B. können Aminogruppen von Lysinseitenketten reagieren. Solche Fehlkopplungen können dazu führen, dass der zu trennende Antikörper das immobilisierte Peptid nicht mehr erkennt und deshalb chromatographisch nicht gereinigt werden kann. Um das Problem der unerwünscht reagierenden Lysinseitenketten zu umgehen, wurden schon spezielle Techniken, wie eine Immobilisierung über die Thiolfunktion eines terminal angefügten Cysteins vorgeschlagen ((Michael R. Price & Kami Beyzavi: "Preparative immunoaffinity techniques" in Peptide Antigens, Hrsg. G. Brian Wisdom, 1993, IRL Press, Oxford); diese Techniken sind aber mit erheblichem Aufwand und Kosten verbunden.

In den vorhergehend beschriebenen Verfahren wird ein gegen organische Lösungsmittel und gegen Druck stabiler Träger in der Peptidsynthese eingesetzt. Ein anderer, durch wässrige Lösungen wenigstens benetzbarer und vorzugsweise gelierbarer Träger, z. B. CNBr aktivierte Sepharose, wird in der Affinitätsreinigung der Antikörper eingesetzt.

Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Nachteile, die bei der Kopplung eines immonugenen Peptids an einen Träger wie z. B. Sepharose auftreten, zu vermeiden. Es ist ebenfalls die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, bei der Verwendung von MAP zur Immunisierung eine zweite Festphasenpeptidsynthese zu vermeiden sowie eine zusätzliche Kontrolle der MAP-Sequenz zu ermöglichen. Es ist endlich die Aufgabe der Erfindung, das gesamte Verfahren zur Produktion und Aufreinigung von Antikörpern zu vereinfachen.

Diese Aufgabe löst ein Verfahren zur Herstellung einer Affinitätsmatrix, indem ein polymerer Träger unter den bis zu mindestens 10 bar druckbelastbaren, gegen organische, während einer Peptidsynthese einzusetzende Reagenzien stabilen, mit Wasser benetzbaren und mit funktionellen Gruppen aktivierten polymeren Trägern ausgewählt wird, und wenigstens ein erster Teil der funktionellen Gruppen mit einer Aminosäurenkette in einem Peptidsyntheseverfahren kovalent gekoppelt wird.

Durch die erfindungsgemäße Auswahl des polymeren Trägers erfüllt dieser die nötigen Anforderungen, um nacheinander mehrere Aminosäuren, zu einer Peptidkette, auf dem Weg der Peptidsynthese, insbesondere der Festphasenpeptidsynthese, an den Träger zu koppeln.

Die erfindungsgemäße Affinitätsmatrix erfüllt ebenfalls die Anforderungen an ihre Anwendung zur Affinitätsreinigung von Antikörpern oder peptidbindender Proteine, bzw. für die Affinitätschromatographie.

Bei der erfindungsgemäßen Affinitätsmatrix entfällt eine Immobilisierung eines immunogenen Peptids durch Kopplung. Folglich sind die vorhergehend geschilderten Nachteile, die bei Kopplungen an CNBr aktivierte Sepharose auftreten können, ausgeschlossen.

Für die Anwendungen, die sich auf Affinitätsreinigung beschränken, können alle funktionellen Gruppen oder deren weitaus größter Teil direkt mit einer Peptidkette gekoppelt sein. Um die sterische Zugänglichkeit zu verbessern, kann als polymerer Träger ein Tentakel tragendes Harz, d. h. ein Pfropfpolymer, verwendet werden. Besonders geeignet sind sog. Tentakelgele für die Affinitätschromatographie, wobei die funktionellen Gruppen, wie Epoxy(Oxiran), Amino, Aldehyd, Hydrazin, Diol oder -SH auf den Tentakeln, d. h. auf den Seitenketten, getragen werden. Für eine Kopplung mit dem C- Terminus einer Aminosäurenkette sind NH₂-Gruppen besonders geeignet. Nötigenfalls können vorhandene, weniger geeignete Gruppen nach bekannten chemischen Verfahren umfunktionalisiert oder derivatisiert werden, so dass eine Peptidbindung oder ähnliche Bindung mit einer ersten Aminosäure bzw. geschützten Aminosäure, hergestellt werden kann, nach der eine Weiterbildung einer Peptidkette möglich ist.

Vorzugsweise wird vor dem Peptidsyntheseverfahren ein Teil der funktionellen Gruppen mit einem Anker (Linker) versehen bzw. gekoppelt. Dieser Anker kann unter den bekannten Ankern der Festphasenpeptidsynthese-Varianten ausgewählt werden. Durch diese Maßnahme werden während der Festphasenpeptidsynthese ein erster Teil der Peptide direkt an funktionelle Gruppen der Affinitätsmatrix in solcher Weise gekoppelt, dass sie nicht oder nur sehr schwer abgespalten werden können. Ein zweiter Teil der synthetisierten Peptide ist an den Ankern gekoppelt, so dass sie nach erfolgter Synthese leicht mit denselben Verfahrensprotokollen abgespalten werden können, wie bei den üblichen Festphasenpeptidsynthesen. Dadurch werden freie Peptide erhalten, die mit den an der Affinitätsmatrix fest verbundenen Peptidketten identisch sind. Diese freien Peptide können sowohl, in kleineren Mengen, für analytische Kontrollzwecke wie auch, in größeren Mengen, zu Erzeugniszwecken verwendet werden. Insbesondere können diese Peptide, nach Kopplung an ein immunogenes Protein, in bekannter Weise zur Produktion von Antikörpern dienen. Der wesentliche Vorteil der Erfindung besteht in diesem Falle darin, dass dieselben Antikörper durch die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens ohne zusätzliche Kopplung hergestellte Affinitätsmatrix aufgereinigt werden und sichergestellt ist, dass die Peptidketten an der Affinitätsmatrix richtig gekoppelt und orientiert sind.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird auf den erwähnten Anker ein MAP-Gerüst synthetisiert. Nach der Festphasenpeptidsynthese trägt ein erster Teil der funktionellen Gruppen direkt jeweils eine nicht oder schwierig abspaltbare Peptidkette, während ein zweiter Teil der funktionellen Gruppen jeweils über einen labilen Anker und ein MAP-Gerüst mehrere Peptidketten trägt. Nach der Abspaltung, die nach einem, in der Festphasenpeptidsynthese bekanntem Verfahrensprotokoll erfolgt, werden einerseits MAPs erhalten, die sich zur Produktion von Antikörpern eignen, wobei die Probleme der Kopplung eines Peptids an ein antigen wirkendes Protein umgangen werden, und wird andererseits eine Affinitätsmatrix erhalten, die dazu geeignet ist, die durch das Immunisierverfahren gewonnenen Antikörper aufzureinigen.

Weitere Vorteile und Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der nun folgenden Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen und Ausführungsbeispielen.

Als polymere Träger können sog. Peptidharze mit Polyethylen- Glycol-Polyacrylamid-Copolymere-Ketten (z. B. PEGA-Harz) verwendet werden. Besonders geeignet sind hydrophile Polyacrylamid-Tentakelharze, die mit Glycidyl-Methacrylat- Oligomeren gepfropft sind. Als solche Harze eignen sich z. B. die Tentakel-Gele der Produktserie "Fractogel EMD" von Merck, Darmstadt. Diese Produkte sind nicht toxisch, druckstabil, ebenfalls stabil gegen Säuren und Alkali sowie gegen die in der Festphasenpeptidsynthese verwendeten Reagenzien und organischen Lösungsmittel. Sie werden handelsüblich in Korngrößen von 20-40 µm oder 40-90 µm, mit Porendurchmessern < 800 Å angeboten. Für die vorgesehene. Festphasenpeptidsynthese können diese polymeren Träger in der aminofunktionalisierten Form verwendet werden. Wenn sie in einer anderen, z. B. der handelsüblicheren Epoxyform vorhanden sind, können sie zuerst in die Aminoform umgeführt werden, z. B. mittels Ethylendiamin oder N-Boc-1,6 Diaminohexan. Diese polymeren Träger weisen dann eine Beladungsdichte von typischerweise 200-800 µmol Aminofunktion pro Gramm trockenes Harz auf.

Gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung wird solch ein polymerer Träger mit funktionellen Amino-Gruppen zu einem geringen Anteil, 1 bis 10%, wobei jedoch meistens ca. 5% und darunter genügen, mit einem säurelabilen Anker derivatisiert. Dazu eignen sich prinzipiell die in der Festphasenpeptidsynthesetechnik verwendeten Anker, z. B. ein sog. Rink-Amid-Anker oder ein Wang-Anker. Das Trägermaterial wird danach einer Peptidsynthese unterworfen. Zur Peptidsynthese kann entweder ein Reaktionsgefäß zur manuellen Peptidsynthese oder ein handelsüblicher automatischer kontinuierlicher Peptidsyntheseapparat verwendet werden. Die Festphasenpeptidsyntheseprozeduren sind dem Fachmann wohlbekannt und brauchen hier nicht beschrieben zu werden (Solide phase peptide synthesis: a practical approach, Hrsg. E. Atherton & R. C. Sheppard, 1989, IRL Press, Oxford). Die freien Aminogruppen des Trägers, welche den überwiegenden Anteil der Bindungsstellen bilden, sowie die säurelabilen Anker, werden während der Synthese mit Aminosäureketten beladen. Nach Beendigung der Synthese wird der säurespaltbare geringe Anteil des Produktes vom Träger z. B. mit 90% TFA (Trifluoressigsäure) abgespalten und zur analytischen Kontrolle der Synthese eingesetzt. Sofern eine analytische Kontrolle nicht notwendig erscheint, kann in dieser Ausführungsform der Erfindung auf die Derivatisierung, d. h. die Kopplung mit einem Anker bzw. Linker, vollständig verzichtet werden. Das mit den Peptidketten versehene Trägermaterial kann zur Affinitätsreinigung verwendet werden.

Anwendungsbeispiele sind die Affinitätsreinigung von Antikörpern, die Reinigung peptidbindender Proteine wie z. B. Heat Shock Proteins aus Zelllysaten, usw. Wesentliche Vorteile dieser Affinitätsmatrix gegenüber bisher bekannten Affinitätsträgern sind insbesondere:

- sehr hohe Beladungskapazität: dadurch können ein geringes Gelvolumen bei der Chromatographie sowie geringe Elutionsvolumina eingesetzt werden. Folglich kann das zu reinigende Produkt in hohen Konzentrationen gewonnen werden.
- Die Peptidkette ist über ihren C-Terminus in genau definierter Weise an den polymeren Träger gebunden, so dass die Probleme, wie sie bei Kopplungen mit Sepharose auftreten, vermieden werden.
- Der Verfahrensschritt einer Sepharose- oder ähnlichen Kopplung entfällt.

Gemäß einer zweiten Ausführungsform wird der polymere Träger ebenfalls mit einem säurelabilen Anker versehen, jedoch zu einem höheren Anteil, 10 bis 90%, typischerweise ca. 50% der funktionellen Gruppen. Nach der Festphasenpeptidsynthese, die in derselben Weise ausgeführt wird, wird ebenfalls eine saure Abspaltung in bekannter Weise vorgenommen, wobei freies Peptid gewonnen wird. Die Ausbeute an freiem Peptid ist in der Größenordnung der Peptidmenge, die auf dem polymeren Träger gebunden bleibt.

Der abgespaltene Anteil der Peptidketten kann zu einem geringen Anteil zur Analytik, jedoch auch insbesondere zur Gewinnung von Antikörpern verwendet werden. Dabei werden z. B. die abgespaltenen Peptidketten zur Immunisierung von Tieren nach Kopplung an KLH-Protein eingesetzt. Der Träger mit dem noch gebundenen Peptid wird zur Affinitätsreinigung der erhaltenen Antikörper eingesetzt. In dieser Ausführungsform der Erfindung wird ebenfalls eine gesonderte Kopplung des Peptids an z. B. CNBr aktivierte Sepharose vermieden.

Gemäß einer dritten Ausführungsform der Erfindung werden wiederum ein wesentlicher Teil, 10 bis 90%, üblicherweise ca. 50%, der funktionellen Gruppen eines polymeren Trägers mit einem säurelabilen Anker derivatisiert. Dafür eignen sich wiederum die in der Festphasenpeptidsynthese üblichen Anker bzw. Linker. Auf diesen Anker wird dann ein MAP-Gerüst synthetisiert. Das Syntheseverfahren eines MAP-Gerüstes ist an sich dem Fachmann bekannt und braucht nicht erneut beschrieben zu werden.

Zu analytischen Zwecken kann ein dritter geringer Teil der funktionellen Gruppen, 1 bis 10%, jedoch üblicherweise ca. 5% oder darunter, mit einem zweiten Anker bzw. Linker, der labiler ist als der erste Anker, versehen werden. Wenn z. B. der erste Anker mit 90%iger TFA (Trifluoressigsäure) aufspaltbar ist, so wird als zweiter Anker ein extrem säurelabiler Anker, wie z. B. ein Tritylanker oder modifizierter Wang-Anker (4-Hydroxymethyl-3-methoxy phenoxyessigsäure), der mit 1%iger TFA aufspaltbar ist, verwendet.

Somit ist ein erster Teil der funktionellen Gruppen des polymeren Träger in der Lage, während einer Festphasenpeptidsynthese mit einzelnen Peptidketten direkt gekoppelt zu werden, während ein zweiter Teil der funktionellen Gruppen des polymeren Trägers, über den ersten Anker und das MAP-Gerüst mit mehreren, typischerweise mit jeweils acht Peptidketten gekoppelt werden kann. Der dritte geringe Teil der funktionellen Gruppen, die mit dem zweiten Anker gekoppelt sind, ist über diesen Anker jeweils mit einer einzelnen Peptidkette gekoppelt.

Die Festphasenpeptidsynthese wird, wie bei den zwei ersten Ausführungsformen nach den bekannten Protokollen der Festphasenpeptidsynthese ausgeführt. Nach der Festphasenpeptidsynthese ist ein erster Teil der funktionellen Gruppen des polymeren Trägers direkt an Peptidamidketten gekoppelt, die nicht oder nur schwierig abspaltbar sind; ein zweiter Teil der funktionellen Gruppen ist über den ersten säurelabilen Anker an das abspaltbare MAP gekoppelt und der dritte geringe Teil der funktionellen Gruppen ist wiederum über den zweiten extrem säurelabilen Anker mit jeweils einer einzelnen sehr leicht abspaltbaren Peptidkette gekoppelt.

Durch Abspaltung mit z. B. 1% TFA kann das an den zweiten Anker gekoppelte Peptid zur Analyse und Kontrolle der Peptid- bzw. MAP-Synthese freigesetzt werden, bevor die Abspaltung des MAP, mit z. B. 90%iger TFA erfolgt. Nach Abspaltung des MAP wird dieses in einem Immunisierungsverfahren zur Produktion von Antikörpern verwendet. Der nicht mit säurelabilen Ankern versehene erste Teil des Trägers bleibt auch nach der sauren Abspaltung mit Peptidketten beladen und die so erhaltene Affinitätsmatrix kann, wie weiter oben beschrieben, zur Affinitätsreinigung der mit den MAP erzeugten Antikörper eingesetzt werden.

Die wesentlichen Vorteile dieser Ausführungsform ergeben sich daraus:

- eine analytische Kontrolle der Peptidsequenz des MAPs, die mit der Peptidsequenz der freien abgespaltenen Peptide identisch ist, wird deutlich erleichtert;
- eine zweite Peptidsynthese für die Affinitätsreinigung der Antikörper ist nicht nötig;
- die Probleme bei der Kopplung von Peptiden auf Trägerproteine oder Sepharose werden vermieden;
- durch die hohe Beladungskapazität des polymeren Trägers mit antigenem Peptid kommt man mit einem sehr geringen Gelvolumen und geringen Elutionsvolumina bei der Affinitätsreinigung aus; somit können höhere Antikörperkonzentrationen nach Aufreinigung erhalten werden.

Die vorhergehend beschriebenen Ausführungsformen der Erfindung werden nun anhand der folgenden Ausführungsbeispiele illustrativ dargestellt. In allen Beispielen werden folgende Chemikalien und Geräte verwendet:

Chemikalien

Biokompatibles Harz, z. B. Merck "Fractogel EMD Amino(M)" mit einer Beladungsdichte von 0,6 mmol/g Harz.
Dimethylformamid (DMF) zur Synthese; 2-(1-H-Benzotriazol-1- yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborat (TBTU);
p-[R,S)-α-[1-(9H-Fluoren-9-yl)methoxyformamido]-2,4- dimethoxybenzyl]-phenoxyessigsäure (Rink-Anker)
4-Hydroxymethylphenoxyessigsäure (HMPA, Wang-Anker)
4-Hydroxymethyl-3-methoxy-phenoxyessigsäure (modifizierter, sehr säurelabiler Wang-Anker).

Geräte

Zur Peptidsynthese wurde entweder ein Reaktionsgefäß zur manuellen Peptidsynthese oder vorwiegend ein automatischer continuous flow Peptidsynthesizer MilliGen 9050 mit on-line monitoring des Syntheseverlaufs eingesetzt.

Peptide wurden über HPLC an reversed phase Phasen auf Reinheit überprüft, die Identität wurde über Elektrospray- Massenspektrometrie bewiesen.

Beispiel 1 Synthese eines Harzes zur simultanen Herstellung von Peptiden und einer Affinitätsmatrix zur Reinigung von Antipeptid-Antikörpern

a) Funktionalisierung des polymeren Trägers mit einem Amidanker:
1 g (0,6 mMol) eines biokompatiblen Harzes, Fractogel EMD Amino M (Merck) werden in 5 ml Dimethylformamid suspendiert und mit einer Lösung von 1,62 g (0,3 mMol) Rink-Anker und 0,98 g, 80,3 mMol) TBTU versetzt. Nun gibt man 2,6 ml (0,6 mMol) N- Methylmorpholin zu und schüttelt die Lösung in einer Schüttelente mit integrierter Fritte für 18 Stunden. Nach Filtration und Waschen mit je 10 ml Dimethylformamid, Isopropanol und Diethylether wird im Exsikkator getrocknet.

Beladungsbestimmung: Die photometrische Beladungsbestimmung ergibt einen nahezu quantitativen Verlauf der Reaktion. Sie wird nach bekannter Prozedur vorgenommen: 1,4 mg des Harzes wird in 250 µl 20% Piperidinlösung in DMF für 15 min belassen. Nach Auffüllen auf exakt 10 ml Lösung mit DMF wird die Absorption des entstandenen Dibenzofulvens bei 301 nm vermessen.

b) Peptidsynthese am funktionalisierten Harz:
0,1 mMol des funktionalisierten Harzes werden in eine Säule gepackt und mithilfe des continuous flow Verfahrens am MilliGen 9050 Synthesizer nach einem Standardprotokoll (Fmoc- OBut-Strategie) synthetisiert. Der Synthesezyklus von 33 Minuten wird automatisch aufgezeichnet und zeigt einen typischen Syntheseverlauf. Am Ende der Synthese wird die N- terminale Fmoc-Gruppe mit 20% Piperidin abgespalten. Nach Waschen mit DMF, Isopropanol und Diethylether wird das Harz gut getrocknet.

c) Abspaltung des Peptidamins vom Harz:
160 mg des Harzes werden mit einer Mischung von Trifluoressigsäure/Thiosanisol/Phenol/Wasser/Ethandithiol (85 : 5 : 5 : 2,5 : 2,5 v/v) für zwei Stunden versetzt. Nach Ende der Reaktion wird direkt in einen eisgekühlten Diethylether filtriert. Das präzipitierte Peptid wird zentrifugiert und das Pellet noch dreimal mit je 10 ml Diethylether gewaschen und danach aus tert. Butanol/Wasser (4 : 1) lyophilisiert.

d) Vorbereitung des Affinitätsharzes:
Das verbleibende Harz enthält das kovalent verknüpfte Peptid und wird mit Isopropanol sowie Methanol gewaschen und danach mit 30 ml PBS, pH 7,4 in einer Säule äquilibriert und bis zur Reinigung der Antikörper bei 4°C aufbewahrt.

e) Die Durchführung der Affinitätsreinigung erfolgt gemäß bekanntem Verfahren. Ihre Beschreibung findet der Fachmann z. B. in: Michael R. Price & Kami Beyzavi: "Preparative immunoaffinity techniques" in Peptide Antigens, Hrsg. G. Brian Wisdom, 1993, IRL Press, Oxford.

Beispiel 2 Synthese eines Harzes zur Herstellung von freien Peptiden und Affinitätsmatrix

a) Umsetzung des Harzes mit 4-Hydroxymethylphenoxyessigsäure (HMPA):
1 g (0,6 mMol) des Harzes werden mit 0,72 g (0,4 mMol) HMPA und 1,28 g TBTU (0,4 mMol) in 5 ml DMF versetzt. Nach Zugabe von 1,14 ml 0,7 M (0,8 mMol) NMM-Lösung in DMF wird 18 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach Waschen des Harzes mit DMF, Isopropanol und Diethylether wird das Harz in einem Reaktionsgefäß mit 0,5 mMol der C-terminalen Fmoc-Aminosäure versetzt und durch Zugabe von 1,6 g (0,5 mMol) TBTU und 1,4 ml (1 mMol) NMM-Lösung in DMF für vier Stunden bei Raumtemperatur gekoppelt. Nach Waschen mit DMF, Isopropanol und Diethylether wird das Harz getrocknet. Die Beladungskontrolle der Aminosäure wird wie unter 1a) beschrieben vorgenommen.

b) Peptidsynthese am funktionalisierten Harz:
Das weitere Vorgehen entspricht dem Beispiel 1, Schritte b) bis d). Die Synthese wird im automatischen Synthesizer vorgenommen.

Beispiel 3 Synthese eines Peptidharzes zur simultanen Darstellung eines MAP-Antigens und der entsprechenden Affinitätsmatrix zur Reinigung der Antipeptidantikörper

a) Funktionalisierung mit Tritylchlorid:
1 g (0,6 mMol) des Harzes werden mit 0,4 mMol Tritylchlorid in DMF und 0,4 mMol Triethylamin für 24 Stunden bei Raumtemperatur gekoppelt. Nach Waschen mit DMF werden die restlichen Aminogruppen mit Bromphenolblau-Reagenz quantitativ bestimmt.

b) Umsetzung des Tritylharzes mit Rinkamid-Linker:
1 g des Trityl-funktionalisierten Harzes werden mit 0,4 mMol Rinkamid-Anker in DMF wie unter 1a) beschrieben funktionalisiert. Die Umsetzung wird durch Bestimmung evtl. freibleibender Aminogruppen sowie über die Fmoc-Beladung quantitativ bestimmt.

c) Abspaltung der Fmoc-Gruppe des Rink-Ankers:
0,9 g des Harzes werden durch Zugabe von 20% Piperidin in DMF von der Fmoc-Gruppe befreit. Das Harz wird wie üblich mit DMF, Isopropanol und Diethylether gewaschen.

d) Umsetzung mit Fmoc-β-Ala-OH:
0,82 g (0,5 mMol) des entacylierten Harzes werden nun durch Zugabe von 1 mMol Fmoc-β-Ala-OH, TBTU und NMM wie unter 1a) beschrieben umgesetzt.

e) Umsetzung zum Fmoc₈-Lys₄-Lys₂-Lys-β-Ala-(MAP)-Harz:
0,5 mMol des β-Ala-funktionalisierten Harzes werden nun mit 1 mMol Fmoc-Lys(Fmoc)-OH zunächst zum Fmoc₂-Lys-β-Ala-Harz, durch weitere Kupplung mit 2 mMol Fmoc-Lys(Fmoc)-OH zum Fmoc₄-Lys₂- Lys-β-Ala-Harz und schließlich durch Zugabe von 4 mMol Fmoc- Lys(Fmoc)-OH zum Fmoc₈-Lys₄-Lys₂-Lys-β-Ala-Harz mithilfe der TBTU/NMM-Methode umgesetzt. Die Beladung wird, wie unter Beispiel 1a) beschrieben, photometrisch bestimmt.

f) Enttritylierung des Harzes:
0,5 mMol des Harzes werden für eine Stunde in 50% Essigsäure geschüttelt. Nach Waschen mit DMF, Dichlormethan, Isopropanol und Diethylether werden die freigesetzten Aminogruppen photometrisch mit Bromphenolblau bestimmt.

g) Peptidsynthese am MAP-funktionalisierten Harz:
Die Synthese des Peptids wird am automatischen Peptidsynthesizer MilliGen 9050 unter Standardbedingungen durchgeführt. Die Synthesezyklen werden on-line photometrisch kontrolliert.

h) Freisetzung des MAP-Antigens:
0,5 mMol des Harzes werden durch Zugabe von 5 ml Trifluoressigsäure/Thiosanisol/Phenol/Ethandithiol/Wasser (85 : 5 : 5 : 2,5 : 2, 5 v/v) während zwei Stunden abgespalten. Die Aufarbeitung erfolgt wie unter Beispiel 1, c) und d) beschrieben.

Beispiel 4 Darstellung eines MAP-Affinitätsharzes mit zusätzlicher Möglichkeit, freies Peptid abzuspalten

a) 0,5 mMol des unter 3f) hergestellten Harzes werden nun mit 0,1 mMol 4-Hydroxymethyl-3-methoxy-phenoxyessigsäure und 0,1 mMol TBTU und 0,2 mMol NMM-Lösung in DMF funktionalisiert. Nach 12 Stunden Reaktionszeit wird wie üblich gewaschen und die restlichen Aminogruppen photometrisch mit Bromphenolblau bestimmt.

b) Peptidsynthese am bifunktionalisierten Harz:
Die Anknüpfung der C-terminalen Aminosäure wird von Hand vorgenommen, evtl. freie Amino/OH-Gruppen werden durch Acetanhydrid/Pyridin acetyliert. Die weitere Synthese wird wie üblich am Syntheseautomat vorgenommen.

c) Abspaltung des freien Peptids:
0,5 mMol des Harzes wird für eine Stunde bei Raumtemperatur mit einer Lösung aus 1% TFA in Dichlormethan geschüttelt. Das Filtrat wird mit DCM gewaschen und am Rotationsverdampfer eingeengt. Durch Zugabe von kaltem Diethylether wird das freie Peptid erhalten.

d) Abspaltung des MAP-Peptids:
Die Abspaltung des MAP-Peptids sowie die Vorbereitung des Affinitätsharzes wird wie unter 1c) und d) vorgenommen.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer Affinitätsmatrix, insbesondere für die Affinitätschromatographie, dadurch gekennzeichnet, dass ein polymerer Träger, der bis zu mindestens 10 bar druckbelastbar, gegen organische, während einer Peptidsynthese einzusetzenden Reagenzien stabil, mit Wasser benetzbar und mit funktionellen Gruppen aktiviert ist, ausgewählt wird, und wenigstens ein erster Teil der funktionellen Gruppen mit einer Aminosäurenkette in einem Peptidsyntheseverfahren kovalent gekoppelt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der polymere Träger aus einem Tentakel tragenden Harz, insbesondere einem Tentakelgel, besteht und die genannten funktionellen Gruppen sich auf den Tentakeln befinden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Hauptkette des tentakeltragenden Harzes zwischen den Polyethylen-Glycol-Polyacrylamid-Copolymeren, den hydrophilen Polyacrylamiden, insbesondere den hydrophilen Methacrylat-Polymeren ausgewählt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die funktionellen Gruppen fähig sind, mit einer Aminosäure eine Peptidbindung zu bilden, insbesondere Amino-Gruppen sind.

5. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die funktionellen Gruppen Epoxygruppen sind, welche vor dem Peptidsyntheseverfahren mit Diaminen versetzt werden.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Tentakel oligomere Methacrylsäureglycidylester sind.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Epoxygruppen mit Ethylendiamin oder N-Boc-1,6- Diaminohexan versetzt werden.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Peptidsyntheseverfahren ein zweiter Teil der funktionellen Gruppen mit einem, in einer Festphasenpeptidsynthese verwendbaren ersten Anker gekoppelt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der genannte zweite Teil der funktionellen Gruppen mit einem säurelabilen Anker, insbesondere einem Rink-Amid- Anker, einem Wang-Anker oder einem HMP-Anker kovalent gekoppelt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass der genannte zweite Teil 1-10%, insbesondere ca. 5% der funktionellen Gruppen beträgt.

11. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass der genannte zweite Teil 10-90%, insbesondere ca. 50%, der funktionellen Gruppen beträgt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass auf den genannten ersten Anker ein MAP-Gerüst synthetisiert wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das MAP-Gerüst aus Fmoc₈-Lys₄-Lys₂-Lys-β-Ala besteht.

14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass ein dritter Teil der funktionellen Gruppen mit einem zweiten Anker gekoppelt wird.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass der genannte dritte Teil 1-10%, insbesondere ca. 5% der funktionellen Gruppen beträgt und dass der zweite Anker labiler ist als der erste Anker, insbesondere ein modifizierter Wang-Anker ist.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das nach Kopplung des ersten Ankers erhaltene Erzeugnis einer Festphasenpeptidsynthese unterworfen wird und danach eine Abspaltung von freien Peptiden erfolgt.

17. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass das, nach Synthese des MAP-Gerüstes erhaltene Erzeugnis einer Festphasenpeptidsynthese unterworfen wird und danach eine Abspaltung von MAP erfolgt.

18. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass das, nach der Synthese des MAP- Gerüsts und nach Kopplung des zweiten Ankers erhaltene Erzeugnis einer Festphasenpeptidsynthese unterworfen wird und danach eine Abspaltung von freien Peptiden und eine Abspaltung von MAP erfolgen.

19. Anwendung einer, gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 18 hergestellten Affinitätsmatrix zur Affinitätsreinigung von Antikörpern oder peptidbindender Proteine.

20. Anwendung eines, gemäß Anspruch 16 erhaltenen Peptids zur Erzeugung von Antikörpern und einer, gemäß Anspruch 16 hergestellten Affinitätsmatrix zur Reinigung derselben Antikörper.

21. Anwendung eines, gemäß Anspruch 17 oder 18 erhaltenen MAPs zur Erzeugung von Antikörpern und einer, gemäß Anspruch 17 oder 18 hergestellten Affinitätsmatrix zur Reinigung derselben Antikörper.

22. Zwischenerzeugnis zur Durchführung eines Verfahrens nach irgendeinem der Ansprüche 8 bis 18, bestehend aus dem genannten polymeren Träger, wobei 1-10% der funktionellen Gruppen an den genannten ersten Anker gekoppelt sind.

23. Zwischenerzeugnis zur Durchführung eines Verfahrens nach irgendeinem der Ansprüche 8 bis 18, bestehend aus dem genannten polymeren Träger, wobei 10-90%, insbesondere ca. 50% der funktionellen Gruppen an den genannten ersten Anker gekoppelt sind.

24. Zwischenerzeugnis nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass an den genannten ersten Anker ein MAP-Gerüst gebunden ist.

25. Zwischenerzeugnis nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass das MAP-Gerüst aus Fmoc₈-Lys₄-Lys₂- Lys-β-Ala besteht.

26. Zwischenerzeugnis nach Anspruch 24 oder 25, zur Durchführung eines Verfahrens nach Anspruch 14, 15 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass 2-10%, der funktionellen Gruppen an den genannten zweiten Anker gekoppelt sind.