WO2007104556A1 - Typ-pat1-protein-assay - Google Patents

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WO2007104556A1
WO2007104556A1 PCT/EP2007/002264 EP2007002264W WO2007104556A1 WO 2007104556 A1 WO2007104556 A1 WO 2007104556A1 EP 2007002264 W EP2007002264 W EP 2007002264W WO 2007104556 A1 WO2007104556 A1 WO 2007104556A1
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WO
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complex
active substance
medium
protein
mmol
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PCT/EP2007/002264
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French (fr)
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Kerstin Diekert
Wolfgang Dörner
Renate Gauss
Béla KELETY
Natalie Watzke
Maarten Ruitenberg
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Iongate Biosciences Gmbh
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Publication date
Application filed by Iongate Biosciences Gmbh filed Critical Iongate Biosciences Gmbh
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/005—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/91045—Acyltransferases (2.3)
    • G01N2333/91051—Acyltransferases other than aminoacyltransferases (general) (2.3.1)

Definitions

  • the invention relates to a type-PAT1 protein assay and, more particularly, to a method for identifying a drug complex which modifies an enzymatic property of a site complex containing one type of PATI proteme.
  • the invention further relates to an active ingredient complex which is or has been identified according to the inventive method, a method for producing a drug, a test kit for carrying out the erfmdungsgeloisen method, a screening method and the uses of the erfmdungsgetaineen method, the erfmdungsgeschreiben test kit and the drug.
  • the PAT proteins belong to the SLC36 family (SLC: souther carrier) according to the Human Genome Organization (HUGO) Nomenclature Committee and also include, among others, proton-coupled and thus proton-dependent amino acid transporters (PAT: proton-coupled ammo acid transporter). It is in the transmembrane proteins. So far, two proton-dependent amino acid transporters have been identified in mammals, designated PAT1 and PAT2. There are two more orphane transporters belonging to the SLC36 family, designated PAT3 and PAT4.
  • PATl is found mainly in the plasma membrane of enterocytes and in lysosomal membranes of neurons, but also in the kidney, lung and liver.
  • PAT2 was detected mainly in the heart and lungs, but also in neurons expressing the N-methyl-D-aspartate receptor subtype NRl.
  • PATl has a broader substrate spectrum than PAT2, but PAT2 shows the higher affinity.
  • PAT1 and PAT2 are responsible for the uptake of small, neutral amino acids from the gut, primary urine, and blood, respectively.
  • the neuronal-expressed PAT2 together with GIyTl and GlyT2 may be responsible for the regulation of glycine concentration, which modulates glycemic and glutamatergic neuronal signaling.
  • PATl and PAT2 also transport short-chain fatty acids in an electroneutral process.
  • PAT1 may be responsible for the export of small neutral amino acids after lysosomal proteolysis.
  • the driving force for transport is the proton gradient and, in the case of electrogenic amino acid transport, also the membrane potential across the membrane.
  • PAT1 and PAT2 are composed of 9 and 11 transmembrane domains, respectively.
  • the fact that neurons express PATl lysosomally and PAT2 endosomally as well as in ER showed that they are of great importance for neuronal activity and represent future targets for the CNS area.
  • PATI hereditary iminoglycemia, in which the transport of proline, hydroxyprolm and glycine into intestine and kidney does not work.
  • PATl transports therapeutically relevant proline derivatives, as well as D-serine and D-cycloserine, which are used in cancer and GERD. Patl is therefore a candidate for the absorption of pharmaceutically active substances when given orally.
  • the PATI protein is integrated into a superordinate site complex.
  • This may be an arrangement of multiple PATI units or protein molecules to an oligomer.
  • other, e.g. enzymatic components present in cooperation with the PATI protein. These may also be spatially spaced.
  • Electrophysiological methods are also known, for example the so-called patch-clamp technique or voltage-clamp technique, in which, for example, cells are accessible in isolation from an electrophysiological examination.
  • patch-clamp technique or voltage-clamp technique
  • native cells are exposed to different conditions and certain electrical activities mediated across the cell membrane by proteins, protein complexes or the like contained therein are measured.
  • Radioactive measurements require specially trained personnel and necessary safety equipment. Both methods can only be performed offline and require intermediaries in the form of color reagents or radioactively labeled substrates. What is determined is not the immediate enzyme activity, but the change in a substrate concentration after completion of the transport. They record transport activity in minutes.
  • the invention is therefore based on the object, a type PATl-
  • Protein assay in which a rapid drug test is performed in a particularly simple yet reliable manner. tion, in particular in mass production, at a reasonable cost.
  • the invention is also based on the object to investigate the interaction of substances with PATI. If e.g. transported by a substance of PATl, this may be an indication of a high oral absorption rate and thus for high bioavailability of this substance.
  • the bioavailability of pharmaceutically active substances is a crucial feature for their clinical application and therefore commercial use.
  • the subject matter of the present invention is an active substance or active substance complex according to claim 20, a process for
  • the invention is based, inter alia, on the idea that this amino-acid-dependent charge transfer can be carried out directly, for example by attaching enzyme preparations on a suitable surface, which is integrated in a flow-through system and / or in which a substrate concentration jump can be carried out.
  • a possible investigation of a possible proton dependency that is to say a dependency of the proton concentration, eg also in the context of a proton concentration or pH jump, is also included.
  • the substrate-dependent, aminoscol and / or aminosanalogabhangige charge shift - ie the proton or more generally an ion transport - in the measured current flow, as elektn- see potential change and / or in their time course examine.
  • the invention thus relates to a method for identifying an active substance complex which modifies an enzymatic property and / or the transport behavior of a site complex containing one type of PATI protein or a part thereof.
  • the inventive method comprises the following steps:
  • step (h) introducing the secondary carrier with the primary carriers into a third or activating measurement medium and detecting an electrical action according to or in the sense of process step (e), wherein the third or activating medium corresponds to the second or non-activating medium, but in addition a substrate and / or cosubstrate of the type PATl protein and / or a concentration of a substrate and / or cosubstrate which is varied with respect to the non-activating medium, in particular instead of a non-substrate optionally present in the second or non-activating medium.
  • steps (f), (g), (h) according to the invention are preferably carried out in the given order, if necessary with repetitions.
  • the expression "enzymatic property" of the type PAT1 protein always also means the transport behavior, for example in relation to the amino acid, amino acid analog, proton and / or ion transport mediated by these proteins, and decreases This also means that, wherever there is reference to the modification of the enzymatic properties of the protein, investigations are also included according to the invention which are intended to show whether a particular protein has an effect on the bioavailability of potential active ingredients Substance is transported by the type PATl protein.
  • the potential drug may be present in all media.
  • the potential active substance should be present in the activating medium, but not in the resting medium or in the non-activating medium.
  • the active site complex or part thereof used is preferably a monomer or an oligomer of a PAT1 protein.
  • a site complex or portion thereof based on a type PAT1 protein derived from a tissue of a mammal e.g. from the intestine, neuronal tissue or CNS, kidney, lung or liver, or derived therefrom.
  • the type PAT1 protein is derived from mammalian cell lines and is present in cloned form.
  • the site complex - containing the type-PATI protein - comes from the organism rat, Scnwem, mouse, rabbit or human origin or is derived from these genetically.
  • Meßlosung or measuring medium which are referred to as resting medium, non-activating and activating solutions or media.
  • All of the malt solutions used contain a pH stabilizing agent known to those skilled in the art, preferably selected from the list: MOPS, HEPES, MES, Tris, PIPES, and the like, as described e.g. in "Buffers, Calbiochem", but can also be taken with ease from other publications and textbooks in biochemistry or organic chemistry According to the invention, these agents are known per se in the range of pH 6 to 8, preferably approximately in the range of pH 6 The choice of the appropriate pH range and agent can depend on the substrate (active substance complex) and can be easily determined by the skilled worker by means of routine experiments.
  • a pH stabilizing agent known to those skilled in the art, preferably selected from the list: MOPS, HEPES, MES, Tris, PIPES, and the like, as described e.g. in "Buffers, Calbiochem", but can also be taken with ease from other publications and textbooks in biochemistry or organic chemistry According to the invention, these agents are known per se in the range of pH 6 to 8, preferably approximately in the
  • the active substance complex or a part thereof can be transported directly into the site of the site complex by injection or admixing into the measuring medium.
  • a process is particularly simple, if simply the respective measuring medium exchanged wirri, for example in a continuous manner.
  • the active substance is released only by a chemical or physical reaction or reacting in the measuring medium. This can also be done for example by supplying radiation.
  • the qualitative influence and / or the quantitative influence of the potential active substance or active ingredient complex is determined according to the invention by detecting an electrical action which is mediated by the active site complex or a part thereof and in particular by the type PAT1 protein.
  • this electrical action is determined with and without potential drug, and by comparing both sets of measurements, it is examined whether the potential drug affects the enzymatic properties of the type PAT1 protein.
  • the primary carriers are brought into contact with the active site complexes at a secondary carrier, namely the biosensor electrode and in particular with its isolation region, where they are in particular deposited.
  • a biosensor electrode is used as a secondary carrier, in which an electrically conductive and festkorperianor electrode portion is provided with at least one electrode which is electrically and mechanically isolated from the measuring medium and with respect to the primary carriers by providing an isolation region in the form of festkorperunterstutzten Membrane which is built up in layers from an underlayer of an organic thio compound as the lowest and the electrode respectively facing layer and an upper layer of an amphiphilic organic compound.
  • a biosensor electrode as Secondary carrier in which a gold electrode is provided in the electrode region F 1 It mu ⁇ oscnicht a long-chain alkanethiol as a lower layer thereon and a monolayer of a lipid as a top layer on it.
  • the primary carriers which are to contain the site complex and in particular the type PATI proteme in the region of their membrane, there are different possibilities, whereby the respective objective of the method can be taken into account.
  • each primary cell is a eukaryotic cell, a prokaryotic cell, in particular an oocyte, a bacterium, a virus, an organelle or constituents thereof, in particular membrane fragments, or dressings thereof m native form and / or m modified form, in particular in purified and / or modified form, is used.
  • a vesicle, a liposome or a micellar structure is used as the primary carrier.
  • the membrane fragments can also deposit planar, i. as a non-spherical structure.
  • the erfmdungsge64e method is particularly advantageous if the sensor assembly of biosensor electrode as a secondary carrier and attached thereto Primartragern in a measuring chamber, measuring range or measuring vessel flows around the measuring medium or is flowed.
  • a change in concentration with respect to the active substance complex or a part thereof can be easily achieved by changing the measuring medium.
  • the experiment conditions according to the invention can advantageously be established in an easy manner and reliably with high time resolution.
  • the inventive method can be advantageously carried out.
  • the method according to the invention is designed when a plurality of tests are carried out in succession, in particular by successively exchanging the measured medium, possibly with intervening washing or winding of the measuring space.
  • Potential active substances to be tested may include, in particular, monoclonal antibodies, antibody fragments, polyclonal antibodies and peptides. However, other substances that are suspected of having an effect can also be added. These substances are preferably administered in dissolved form.
  • Substances which can be tested as test substances in the test system according to the invention can be low molecular weight compounds.
  • the low molecular weight substances can be small peptides, amino acids and amino acid analogs, steroids, nucleosides, nucleotides.
  • amino acids or amino acid analogs can be used as test substances.
  • a washing step is carried out between steps (f) and (g) by introducing the Se Kundartragers with the primary carriers in a fourth or washing medium, which is preferably identical to the non-activating medium, and / or into or into the resting medium.
  • step (f) is carried out repeatedly.
  • step (f) is initiated before the beginning of the actual measurement series, i. before steps (g) and (h) are carried out for the first time, for at least 5 minutes, preferably for at least 10 minutes, more preferably for at least 15 minutes, even more preferably for at least 20 minutes and more preferably for at least 30 minutes becomes.
  • the steps (g) and (h) are erfmdungsgelaut for at least 0.2 s, but at most 5 s and preferably for about 1 to 2 s performed.
  • step (f) is carried out for at least 1 s to at most 120 s, preferably for at least 30 s to 90 s.
  • the media ie the resting medium, the non-activating medium and the activating medium, have potassium ions in concentrations in the range of about 10 mmol / l to about 300 mmol / l, preferably in the range of about 100 mmol / l.
  • the activating medium contains a substrate of the PATI proteme, preferably glycine.
  • substrates include other amino acids, amino acid analogues, or other substances that may or may be transported by PATI.
  • the concentration may vary depending on the application.
  • glycine can be used in the range of about one or a few hundred ⁇ mol / l to tens of mmol / l, eg, in the range of about 5 mmol / l to about 50 mmol / l.
  • at Active agent tests for activation and / or inhibition of the TYP-PAT1 protein may also make sense in the range above, for example in the range from about 1 mmol / l to about 100 mmol / l.
  • a medium is used with 100 mmol / l KCl, 2 mmol / l MgCl 2 , 30 mmol / l MES pH 6 / KOH and glycine in the range of about 2 mmol / 1 to about 80 mmol / l.
  • the present invention provides an active ingredient or a drug complex which modifies an enzymatic property of a type of active site complex containing a type of PATI proteme or a part thereof and which is identified according to the inventive method for identifying a drug complex is or has been.
  • the present invention provides a method for producing a medicament comprising the steps of:
  • an active substance and / or an active ingredient complex which suitably modifies an enzymatic property of an active substance complex, which contains one type of PAT1 proteme, or a part thereof or a plurality of properties, with the aid of the erfm- dungsgespecializeden method, Preparing and / or isolating the active substance, the active substance complex, a part and / or a derivative thereof,
  • test kit for carrying out the erfmdungsgeschreiben method for identifying a drug complex. This test kit points to:
  • the method according to the invention for identifying an active substance complex is used for finding inhibitors, activators, partial or temporary inhibitors or modulators of an enzymatic property of a site complex containing a type PAT1 protein and of active substance complexes which represent a substrate for PAT1.
  • the erfmdungsge4e test kit is used to find inhibitors, activators, partial or temporary inhibitors or modulators of a type of PATl-ms ms containing complex active site and / or active substance complexes that represent a substrate for PAT.
  • the medicament according to the invention is used for the inhibition, partial or temporary inhibition, activation or other modulation of a type PATl proteme-containing active substance complex or a part thereof, or the medicament is transported by PAT.
  • the electrode area is preferably isolated as far as possible electrically with respect to the measuring medium, the primary carriers and with respect to the biological units.
  • the electrode area has e.g. at least one electrode.
  • this can itself be designed as a mechanically stable material region, in particular as a plate, as a wire and / or the like.
  • the electrode is essentially designed as a material layer deposited on the surface of the carrier. It may be a vapor-deposited or sputtered material. Al harsh act.
  • the material layer for forming the electrode preferably has a layer thickness of about 10 to 200 nm.
  • the type-PAT1 proteme can in each case be provided in essentially native form and / or in modified, in particular purified, microbiologically and / or molecularly modified form.
  • certain native properties can be tested and pharmacologically examined.
  • molecular-biological or genetically-engineered changes are also suitable for analyzing certain aspects, for example the transport or the pharmacological mode of action of an active substance.
  • active site complexes provided in the nuclear carrier and the type PAT1 protein.
  • active site complexes and type PAT1 protons of a substantially uniform type are provided, in particular with regard to their geometric, physical, chemical, biological and molecular-biological properties.
  • the biological entities should advantageously be approximately uniform in terms of their orientation and / or their ability to be activated relative to the particular nuclear carrier.
  • the object of the invention is inter alia to make the effect of substances on the function of type PAT1 proteins available to a study.
  • Substances that modulate the action of this transport protein are of potential commercial interest.
  • substrates of the protein transported by this were important new molecules.
  • the erfmdungsgedorfe approach offers the following advantages:
  • the measurement of enzyme activity according to the method proposed according to the invention requires no mediators or labeled substrates. A single measurement only takes a few seconds. The measurement is sensitive to all substrates. If a substance does not irreversibly inhibit the reaction, several measurements can be taken with an enzyme-loaded sensor. Substrates do not have to be chemically modified because the current response or potential response of the protein is induced by a rapid change of the solution.
  • the signal quality is better, in the sense of a better signal-to-noise ratio.
  • the gold surface of an underlying sensor chip was mercaptanformat in ethanol by immersion in a 1 mmol / 1 Octadecylmercaptansoaking or hydrophobized, made hydrophobic, rinsed with 2-propanol or ethanol (absolute) or water and dried. It was then covered with diphytanoylphosphatidylcholine (in decane) and overlaid with an add buffer buffer (100 mmol / l KCl, 2 mmol / l MgCl 2 , 30 mmol / l Mes, pH 6 / KOH).
  • the membrane fragments were prepared according to the following protocol: per 1 g cell pellet 1 ml sucrose buffer from 0.25 mol / l sucrose, 5 mmol / l Tris, pH 7.5, about 2 mmol / l DTT, PMSF (50 ⁇ l PMSF as saturated ethanolic solution to 100 ml buffer) Complete (from Roche, one tablet per 50 ml buffer).
  • the flow cell with integrated protembeladenem sensor chip was with non-activating solution with 100 mmol / 1 KCl, 2 mmol / 1 MgCl 2 , 30 mmol / 1 MES pH 6 / KOH, 40 mmol / 1 to 80 mmol / 1 VaIm spooled.
  • electromechanical 3/2-way valve was then switched to activating solution with 100 mmol / 1 KCl, 2 mmol / 1 MgCl 2 , 30 mmol / 1 MES pH 6 / KOH, 2.5 mmol / 1 to 80 mmol / 1 glycine.
  • Membranes are performed, but on membranes, in relation to the PATI conditions did not contain or show any test relevant amount and / or activity to PATI.
  • ZR kar.v. a deraxiiges control experiment on membranes or membrane fragments are performed, which overexpress a protein other than PATI, eg NCX. By specific activity measurement with respect to this other protein, the attachment of the membranes or membrane fragments can first be detected. Then the specific tests for PATI can be performed for control.
  • FIG. 1 shows, in the form of a graph, the electric current I (t) measured according to an embodiment of the method according to the invention with a biosensor electrode as a function of time t, which is caused in part by a PATI proteme
  • Transport stream as a measurable electrical action is based.
  • FIG. 2 shows, in the form of a graph, the electrical energy measured with a biosensor electrode according to another embodiment of the method according to the invention
  • FIG. 3 shows, in the form of a graph, the measured maximum electric current I (t) normalized with a biosensor electrode according to another embodiment of the method according to the invention as a function of the set pH value.
  • FIG. 1 shows in the form of a graph the according to an embodiment of the inventive method with a Biosensorelektro- the measured electric current I (t) as a function of time t, which is based in part on a transport current called by the PAT1 protein as a measurable electrical action.
  • the electric current I (t) represented by the ordinate becomes manifest as current of transported ions as a function of time t, which is recorded on the ordinate.
  • the ordinate thus denotes the measured electrical current I (t), as a function of the time t, which is measured via the biosensor electrode.
  • FIG. 1 Shown in FIG. 1 are four measurement tracks A, B, C and D, which correspond to different measurement conditions m with respect to the substrate concentration of glycine.
  • the primary carriers eg via membrane fragments or vesicles
  • FIG. 2 likewise shows, in the form of a graph, the electric current I (t) measured according to another embodiment of the method according to the invention with a biosensor electrode as a function of time t, which is partly due to a transport current produced by the PAT1 proteme as a measurable electrical action in the case of a control extender, in which glycine is now replaced by leucine.
  • the primary carriers eg via membrane fragments or vesicles, moving towards the biosensor membrane and electrode.
  • net positive electrical charge is again shifted across the membrane, which leads to a positive current signal. This can be recognized by the measured positive electric current I (t).
  • the basic advantages of the present invention are the high mechanical stability of the intended sensor arrangement and, associated therewith, the high operational readiness, the simple handling availability and low susceptibility to interference.
  • the use of the sensor arrangement results in a long service life, high reliability, low susceptibility to interference and, in particular, a significantly increased test throughput compared to conventional methods, whereby corresponding test methods can be worked out and carried out inexpensively.
  • the signal quality is better, in the sense of a better signal-to-noise ratio.

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Abstract

Vorgeschlagen wird ein Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffes, welcher eine enzymatische Eigenschaft des PAT1-Proteins modifiziert. Es werden Primärträger bereitgestellt, welche das PAT1-Protein im Bereich ihrer Membranen enthalten. Die Primärträger werden im Oberflächenbereich einer als Sekundärträger dienenden Biosensorelektrode angelagert. Es wird ein potenzieller Wirkstoff bereitgestellt. Der potenzielle Wirkstoff wird mit dem PAT1-Protein zur Wechselwirkung gebracht. Bestimmt wird der qualitative und/oder quantitative Einfluss des potenziellen Wirkstoffes, z.B. auch als Substrat, durch Detektieren einer elektrischen Aktion des PAT1-Proteins oder deren Änderung über die Bio-sensorelektrode als Sekundärträger, z.B. mittels einer elektrischen Strommessung oder Spannungsmessung.

Description

Typ-PATl-Protein-Assay
Die Erfindung betrifft einen Typ-PATl-Protein-Assay und insbesondere ein Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes , welcher eine enzymatische Eigenschaft eines Wirkortkomplexes modifiziert, der einen Typ eines PATl-Protems enthalt.
Die Erfindung betrifft ferner einen Wirkstoffkomplex, der gemäß dem erfmdungsgemaßen Verfahren identifiziert ist oder wurde, ein Verfahren zum Herstellen eines Arzneimittels, einen Testkit zum Durchfuhren des erfmdungsgemaßen Verfahrens, ein Screeningver- fahren sowie die Verwendungen des erfmdungsgemaßen Verfahrens, des erfmdungsgemaßen Testkits sowie des Arzneimittels.
Die Proteine vom Typ PAT gehören zu der Familie SLC36 (SLC : so- lute carrier) entsprechend dem Human Genom Organisation (HUGO) Nomenklaturkomitee und umfassen unter anderem auch protonengekoppelte und somit protonenabhangige Aminosauretransporter (PAT : proton coupled ammo acid transporter) . Es handelt sich dabei im Transmembranproteine. In Saugern wurden bisher zwei protonenabhangige Aminosauretransporter nachgewiesen, die mit PATl und PAT2 bezeichnet werden. Es gehören noch zwei weitere orphane Transporter zur Familie SLC36, die mit PAT3 und PAT4 bezeichnet werden.
PATl ist hauptsächlich m der Plasmamembran von Enterozyten und in lysosomalen Membranen von Neuronen zu finden, aber auch m Niere, Lunge und Leber nachweisbar.
PAT2 wurde hauptsächlich m Herz und Lunge nachgewiesen, aber auch in Neuronen, die den N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor Subtyp NRl exprimieren .
Generell hat PATl ein breiteres Substratspektrum als PAT2, dafür zeigt PAT2 die höhere Affinitat. Physiologisch sind PATl und PAT2 für die Aufnahme von kleinen neutralen Aminosäuren aus dem Darm, Primarharn bzw. Blut verantwortlich. Darüber hinaus ist möglicherweise der neuronal-exprimierte PAT2 zusammen mit GIyTl und GlyT2 für die Regulation der Glycin-Konzentration verantwortlich, die modulierend die glycmerge und glutamaterge neuronale Signal- Übertragung beeinflusst. Darüber hinaus gibt es experimentelle Hinweise, dass PATl und PAT2 auch kurzkettige Fettsauren in einem elektroneutralen Prozess transportieren.
Die Lokalisation von PATl in Lysosomen von Neuronen deutet dar- aufhin, dass PATl möglicherweise für den Export von kleinen neutralen Aminosäuren nach lysosomaler Proteolyse verantwortlich ist.
Die treibende Kraft für den Transport sind der Protonengradient und im Falle des elektrogenen Aminosauretransportes auch das Membranpotential über die Membran.
Hinsichtlich der Struktur der PAT-Familie geht man ]e nach Hydropathieanalyse davon aus, dass PATl und PAT2 aus 9 bzw. 11 Trans- membrandomanen aufgebaut sind. Die Tatsache, dass in Neuronen PATl lysosomal und PAT2 endosomal sowie im ER exprimiert ist, konnte darauf hindeuten, dass sie für die neuronale Aktivität von großer Bedeutung sind und für den ZNS-Bereich zukunftige Targets darstellen .
Wahrscheinlich ist ein Gendefekt bei PATl verantwortlich für die erblich bedingte Iminoglycmurie , bei der der Transport von Prolin, Hydroxyprolm und Glycin in Darm und Niere nicht funktioniert .
In Bezug auf die Pharmakologie von PATl ist bemerkenswert, dass PATl therapeutisch relevante Prolinderivate sowie D-Serin und D- Cycloserin transportiert, die bei Krebs und Gemutskrankheiten eingesetzt werden. PATl ist daher bei oraler Medikamentengabe ein Kandidat für die Absorption von pharmazeutisch wirksamen Substan- zen.
Gegebenenfalls ist das PATl-Protein in einen übergeordneten Wirkortkomplex integriert. Dies kann eine Anordnung mehrerer PATl- Einheiten oder -Proteinmolekule zu einem Oligomer sein. Es können aber auch andere, z.B. enzymatische Komponenten vorhanden sein, die in Kooperation mit dem PATl-Protein vorliegen. Diese können auch raumlich beabstandet vorliegen.
Es sind im Stand der Technik unterschiedliche Verfahren und Mess- einrichtungen bekannt, mit denen Eigenschaften bestimmter Wirk- Stoffe quantitativ und qualitativ analysiert und beschrieben werden können.
Auch ist es wünschenswert, vorgegebene und bekannte Wirkstoffe am Wirkortkomplex zu applizieren, z.B. am PATl-Protein , an einer Zelle, einem Gewebe oder dergleichen, um die Funktionsweise dieses Wirkortes zu beeinflussen und/oder zu untersuchen.
Übliche Experimente am Gesamtorganismus sind aufgrund der Komple- xitat der Organismen und ferner aufgrund ethischer und moralischer Umstände oft bedenklich, und die damit erzielten Ergebnisse haben eine nur beschrankte Aussagekraft.
Folglich wurden Verfahren und Einrichtungen entwickelt, mit deren Hilfe eine isolierte Betrachtung der Wirkungsweise zu testender Wirkstoffe auf isolierte Wirkzentren oder eine Untersuchung der Wirkzentren selbst möglich ist. Dabei werden bestimmte Gewebe, isolierte Zellen und/oder andere biologische Einheiten, zum Beispiel Proteine oder dergleichen, in isolierter Art und Weise ei- ner Betrachtung zugänglich gemacht. Es sind zum Beispiel Techniken bekannt, die unter Verwendung von Farbstoffen oder radioaktiven Stoffen arbeiten und sich ändernde Transport- und/oder Bm- dungsspezifitaten ausnutzen und darstellen. Falls diese Vorgehensweise überhaupt möglich ist, ist sie aber dahingehend nachteilig, dass ihr oft nur ein geringes Auflösungsvermögen und eine hohe Fehleranfalligkeit zukommen.
Oft sind solche Methoden auch relativ unempfindlich.
Es sind ebenfalls elektrophysiologische Methoden bekannt, zum Beispiel die sogenannten Patch-Clamp-Technik oder Voltage-Clamp- Technik, bei welchen zum Beispiel Zellen isoliert einer elektro- physiologischen Untersuchung zuganglich sind. Bei diesem Vorgehen werden native Zellen unterschiedlichen Bedingungen ausgesetzt und es werden bestimmte elektrische Aktivitäten, die über die Zellmembran durch darin enthaltenen Proteine, Proteinkomplexe oder dergleichen vermittelt werden, gemessen.
Trotz der dabei erzielbaren hohen Genauigkeit sind diese bekann- ten elektrophysiologischen Methoden dahingehend nachteilig, dass sie aufgrund ihres hohen messtechnischen Aufwandes und ihrer Störanfälligkeit für einen schnellen, automatisierbaren und/oder breiten Einsatz ungeeignet sind und aufgrund der in der Regel na- tiven Umgebung der zu untersuchenden Objekte gewisse Probleme bei der Diskriminierung unerwünschter Signalanteile aufweisen. Darüber hinaus sind diese Methoden sehr kostenintensiv.
So wurden Bmdungs- bzw. Aufnahmestudien von radioaktiv markierten Substraten an Caco2-Zellen oder PATl exprimierende Zellen o- der Oozyten sowie Pat chclampmessungen und Zweielektrodenvoltagec- lampmessungen durchgeführt, die aber die oben beschriebenen Unzulänglichkeiten aufweisen.
Die Untersuchung der Wirkung von Substanzen bei radioaktiven Bm- dungs- und Aufnahmeassays lasst m der Regel keine Unterscheidung zu, ob ein Wirkstoff nur bindet oder auch transportiert wird, dafür mussten alle Wirkstoffe radioaktiv markiert sein.
Radioaktive Messungen bedürfen speziell ausgebildeten Personals sowie notwendiger Sicherheitseinrichtungen. Beide Methoden können nur offline durchgeführt werden und erfordern Vermittler in Form von Farbereagenzien oder radioaktiv markierten Substraten. Bestimmt wird nicht die unmittelbare Enzymaktivitat , sondern die Änderung einer Substratkonzentration nach dem Abschluss des Transportes. Sie erfassen die Transportaktivitat im Laufe von Minuten .
Die Untersuchung von Substanzen mit Hilfe der Patch- /Voltageclamptechnik enthalt die gleichen Informationen wie mit der hier beschriebenen Erfindung. Allerdings bieten die Patch- Messungen bzw. Zweielektrodenvoltageclampmessungen nur einen sehr geringen Durchsatz und man benotigt erfahrenes Personal für die Durchfuhrung. Zudem sind für die Patch-/Voltageclarapmethode eine Zellkultureinheit oder die Haltung entsprechender Tiere, z.B. von Fröschen (Xenopus laevis) , von denen entsprechende Zellen entnommen werden, notig.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, einen Typ-PATl-
Protein-Assay zu schaffen, bei welchem auf besonders einfache und gleichwohl zuverlässige Art und Weise eine rasche Wirkstofftes- tung, insbesondere im Massenbetrieb, unter vertretbaren Kosten möglich ist.
Der Erfindung liegt ferner die Aufgabe zu Grunde, die Wechselwir- kung von Substanzen mit PATl zu untersuchen. Wird z.B. eine Substanz von PATl transportiert, kann dies ein Indiz für eine hohe orale Absorptionsrate und damit für eine hohe Bioverfugbarkeit dieser Substanz sein. Die Bioverfugbarkeit von pharmazeutisch wirksamen Substanzen ist ein entscheidendes Merkmal für deren klinische Anwendung und damit kommerziellen Einsatz.
Gelost werden diese und weitere Aufgaben, die sich aus dem eingangs diskutierten Stand der Technik ergeben, bei einem Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes erfindungsgemaß mit den Merkmalen des unabhängigen Anspruchs 1. Vorteilhafte Weiterbildungen des erfindungsgemaßen Verfahrens sind Gegenstand der jeweiligen abhangigen Unteranspruche .
Weiterhin sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Wirk- stoff oder Wirkstoffkomplex gemäß Anspruch 20, ein Verfahren zum
Herstellen eines Arzneimittels gemäß Anspruch 21, ein Testkit zur
Durchfuhrung des erfindungsgemaßen Verfahrens gemäß Anspruch 22, ein Screenmgverfahren gemäß Anspruch 23, sowie Verwendungen des
Verfahrens, des Testkits und des Arzneimittels gemäß den Anspru- chen 24, 25 bzw. 26.
Im Transportzyklus von PATl werden Protonen zusammen mit Amino- sauremolekulen über die Membran verschoben.
Der Erfindung liegt unter anderem die Idee zu Grunde, diese ami- nosaureabhangige Ladungsverschiebung direkt, z.B. durch Anbindung von Enzympraparationen auf einer geeigneten Oberflache, die z.B. in ein Durchflusssystem integriert ist und/oder bei der ein Sub- stratkonzentrationssprung durchgeführt werden kann, als elektri- sehen Stromfluss, als elektrische Potentialanderung und/oder deren zeitlichem Verlauf zu messen und den Einfluss verschiedener Substanzen oder Wirksubstanzen auf die Messgroße Stromfluss, als elektrische Potentialanderung und/oder deren zeitlichem Verlauf zu untersuchen. Im Sinne der Erfindung ist dabei auch eine mögliche Untersuchung einer möglichen Protonenabhangigkeit , also eine Abhangi gkeit von dei Protonenkonzentration, z.B. auch im Rahmen eines Protonenkon- zentrations- oder pH-Wert-Sprungs, mitumfasst.
Es ist ferner eine alternative oder zusätzliche Idee, die sub- stratabhangige, aminosaureabhangige und/oder aminosaureanalogab- hangige Ladungsverschiebung - also den Protonen- oder allgemeiner einen Ionentransport - in der Messgroße Stromfluss, als elektn- sehe Potentialanderung und/oder in deren zeitlichem Verlauf zu untersuchen .
Die Erfindung betrifft damit ein Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes , welcher eine enzymatische Eigenschaft und/oder das Transportverhalten eines Wirkortkomplexes, welcher einen Typ eines PATl-Proteins oder eines Teils davon enthalt, modifiziert. Das erfindungsgemaße Verfahren weist folgende Schritte auf:
(a) Bereitstellen einer Mehrzahl Primartrager, welche den Wirkortkomplex enthaltend das Typ-PATl Protein umfassen, insbesondere in einer Mehrzahl im Bereich einer Membran des jeweiligen Primartragers enthalten,
(b) Anlagern oder In-Kontakt-Bringen der Primartrager am oder im Oberflachenbereich eines Isolationsbereichs einer als Sekun- dartrager dienenden Biosensorelektrode in einem Messmedium, wobei der Sekundartrager bevorzugt gegenüber dem Messmedium und gegenüber den Primartragern mittels des Isolationsbe- reichs mechanisch und elektrisch isoliert ist oder wird,
(c) Bereitstellen mindestens eines potenziellen Wirkstoffkomplexes,
(d) In-Kontakt-Bringen und insbesondere In-Wechselwirkung-Bringen des potenziellen Wirkstoffkomplexes mit dem Wirkortkomplex der Primartrager oder Teilen davon, und
(e) Bestimmen des qualitativen und/oder quantitativen Einflusses des potenziellen Wirkstoffkomplexes oder eines Teils davon auf enzymatische Eigenschaften des Wirkortkomplexes oder eines Teils davon durch Detektieren einer elektrischen Aktion ües oder am Wirkortkomplex oder eines Teils davon oder eine Änderung dieser elektrischen Aktion über die Biosensorelekt- rode als Sekundartrager ,
dadurch gekennzeichnet, dass in den Verfahrensschritten (c), (d) und/oder (e) einer oder mehrere der folgenden Unterschritte durchgeführt werden:
(f) Einbringen des Sekundartragers mit den Primartragern in ein Ruhemedium und gegebenenfalls Detektieren einer elektrischen Aktion gemäß dem oder im Sinne von Verfahrensschritt (e) ,
(g) Einbringen des Sekundartragers mit den Primartragern in ein zweites nicht-aktivierendes Medium und gegebenenfalls Detektieren einer elektrischen Aktion gemäß dem oder im Sinne von Verfahrensschritt (e), wobei im zweiten oder nicht- aktivierenden Medium, insbesondere ein Nicht-Substrat von PATl vorgesehen ist,
(h) Einbringen des Sekundartragers mit den Primartragern in ein drittes oder aktivierendes Messmedium und Detektieren einer elektrischen Aktion gemäß dem oder im Sinne von Verfahrens- schritt (e), wobei das dritte oder aktivierende Medium dem zweiten oder nicht-aktivierenden Medium entspricht, jedoch zusatzlich ein Substrat und/oder Cosubstrat des Typ-PATl- Proteins enthalt und/oder eine gegenüber dem nicht- aktivierenden Medium variierte Konzentration eines Substrats und/oder Cosubstrats, insbesondere anstelle eines gegebenenfalls im zweiten oder nicht-aktivierenden Medium vorhandenen Nicht-Substrats.
Die erfindungsgemaßen Schritte (f), (g), (h) werden - gegebenen- falls mit Wiederholungen - bevorzugt in der vorgegebenen Reihenfolge durchgeführt.
Im Sinne der Erfindung können in der Abfolge der Schritte (d) ,
(e) und/oder (f), (g), (h) und deren Wiederholungen auch so ge- nannte Substratkonzentrationssprunge und Cosubstratkonzentrati- onssprünge, insbesondere in der H+-Konzentration, durchgeführt werden, wobei insbesondere immer bei einer ersten oder Startkon- zcntratiüπ - die auch null sein kann - begonnen und bei einer zweiten oder Endkonzentration - die auch null sein kann - geendet wird .
Im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck „enzy- matische Eigenschaft" des Typ-PATl-Proteins gleichzeitig auch immer das Transportverhalten, z.B. in Bezug auf den durch diese Proteine vermittelten Aminosäure-, Aminosäureanaloga-, Protonen- und/oder Ionentransport, und nimmt damit auch immer Bezug auf den eingangs diskutierten Einfluss des Proteins auf die Bioverfügbarkeit potentieller Wirkstoffe. Dies bedeutet, dass, wo immer von der Modifizierung der enzymatischen Eigenschaften des Proteins die Rede ist, auch Untersuchungen erfindungsgemäß mit umfasst sind, die zeigen sollen, ob ein bestimmter Stoff vom Typ-PATl- Protein transportiert wird.
Soll überprüft werden, ob ein potentieller Wirkstoff das Typ- PATl-Protein aktiviert /inhibiert , kann der potentielle Wirkstoff in allen Medien vorhanden sein.
Soll überprüft werden, ob ein potentieller Wirkstoff transportiert wird, sollte der potentielle Wirkstoff im aktivierenden Me- dium vorhanden sein, nicht jedoch im Ruhemedium bzw. im nicht- aktivierenden Medium.
Bevorzugt wird als Wirkortkomplex oder Teil davon ein Monomer o- der ein Oligomer eines PATl-Proteins verwendet.
Ferner ist es vorgesehen, dass ein Wirkortkomplex oder ein Teil davon verwendet wird, welcher auf einem Typ-PATl-Protein basiert, die aus einem Gewebe eines Säugetiers stammt, z.B. aus dem Darm, aus neuronalem Gewebe oder dem ZNS, der Niere, Lunge oder der Le- ber, oder hieraus abgeleitet ist.
Insbesondere stammt das Typ-PATl-Protein aus Säugetierzelllinien, und liegt kloniert vor. In vorteilhafter Weise ist es vorgesehen, dass der Wirkortkomplex - enthaltend das Typ-PATl-Protein - aus dem Organismus Ratte, Scnwem, Maus, Kaninchen oder Mensch stammt oder aus diesen genetisch abgeleitet wird.
Erfmdungsgemaß werden wassrige Messlosungen und insbesondere wassrige Elektrolyt losungen als Messlosung oder Messmedium verwendet, die als Ruhemedium, nicht aktivierende sowie aktivierende Losungen oder Medien bezeichnet werden.
Alle verwendeten Messlosungen enthalten ein dem Fachmann bekanntes pH-Wert stabilisierendes Mittel bevorzugt ausgewählt aus der Liste: MOPS, HEPES, MES, Tris, PIPES u.a., wie sie z.B. in „Buffers, Calbiochem" veröffentlicht sind, aber auch mit Leichtigkeit weiteren Veröffentlichungen und Lehrbuchern der Biochemie bzw. der organischen Chemie entnommen werden können. Erfmdungsgemaß sollen diese an sich bekannten Mittel im Bereich von pH 6 - 8, bevorzugt etwa im Bereich von pH 6 stabilisierend wirken. Die Wahl des geeigneten pH-Bereichs und Mittels kann dabei vom Sub- strat (Wirkstoffkomplex) abhangen und vom Fachmann durch Routineexperimente leicht ermittelt werden.
Erfindungsgemaß ist es möglich, die Verfahrensschritte (c) und/oder (d) , gegebenenfalls auch (f) bis (h) mittels
Zumischen oder Injizieren des Wirkstoffkomplexes, eines Teils und/oder einer Vorstufe davon,
Austauschen oder Zumischen des Messmediums oder eines Teils davon und/oder
chemisches oder physikalisches Umsetzen oder Reagieren des Messmediums oder eines Teils davon oder des Wirkstoffs, eines Teils und/oder einer Vorstufe davon
durchzufuhren .
Das bedeutet, dass zum einen der Wirkstoffkomplex oder ein Teil davon direkt durch Injizieren oder Beimischen in das Messmedium hinein zum Ort des Wirkortkomplexes transportiert werden kann. Besonders einfach gestaltet sich jedoch ein derartiger Vorgang, wenn einfach das jeweilige Messmedium ausgetauscht wirri, beispielsweise in kontinuierlicher Art und Weise. Des Weiteren ist es denkbar, dass der Wirkstoff erst durch ein chemisches oder physikalisches Umsetzen oder Reagieren im Messmedium freigesetzt wird. Dies kann zum Beispiel auch durch Zufuhren von Strahlung erfolgen .
Der qualitative Einfluss und/oder der quantitative Emfluss des potenziellen Wirkstoffes oder Wirkstoffkomplexes wird erfindungs- gemaß durch Detektieren einer elektrischen Aktion bestimmt, welche durch den Wirkortkomplex oder einen Teil davon und insbesondere durch das Typ-PATl-Protein vermittelt wird.
Insbesondere wird diese elektrische Aktion mit und ohne potentiellen Wirkstoff bestimmt, und durch Vergleichen beider Messreihen wird untersucht, ob der potentielle Wirkstoff Einfluss nimmt auf die enzymatischen Eigenschaften des Typ-PATl-Proteins .
Wie in der WO02/074983 beschrieben werden die Primartrager mit den Wirkortkomplexen an einem Sekundartrager , nämlich der Biosensorelektrode und insbesondere mit deren Isolationsbereich in Kontakt gebracht und dort insbesondere angelagert.
Bei der Ausgestaltung der Biosensorelektrode als Sekundartrager bestehen vielfaltige Möglichkeiten.
Es wird aber besonders bevorzugt, dass eine Biosensorelektrode als Sekundartrager verwendet wird, bei welcher ein elektrisch leitfahiger und festkorperartiger Elektrodenbereich mit mindestens einer Elektrode vorgesehen wird, welcher gegenüber dem Messmedium und gegenüber den Primärtragern elektrisch und mechanisch isoliert wird durch Vorsehen eines Isolationsbereichs in Form einer festkorperunterstutzten Membran, welche schichtartig aufge- baut wird aus einer Unterschicht einer organischen Thioverbindung als unterster und der Elektrode jeweils zugewandter Schicht und aus einer Oberschicht einer amphiphilen organischen Verbindung.
Bei einer bevorzugten Ausgestaltungsform des erfindungsgemaßen Verfahrens ist es vorgesehen, dass eine Biosensorelektrode als Sekundartrager verwendet wird, bei welcher eine Elektrode aus Gold im Elektrodenbereich vorgesehen wird F1It einer Muπoscnicht eines langkettigen Alkanthiols als Unterschicht darauf und einer Monoschicht eines Lipids als Oberschicht darauf.
Im Hinblick auf die Primartrager, welche den Wirkortkomplex und insbesondere die Typ-PATl-Proteme im Bereich ihrer Membran enthalten sollen, ergeben sich unterschiedliche Möglichkeiten, wobei der jeweiligen Zielsetzung des Verfahrens Rechnung getragen wer- den kann.
Zum Beispiel bietet es sich gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltungsform des erfmdungsgemaßen Verfahrens an, dass als Primartrager jeweils eine eukaryontische Zelle, eine prokaryonti- sehe Zelle, insbesondere ein Oozyt, ein Bakterium, ein Virus, eine Organelle oder Bestandteile hiervon, insbesondere Membranfragmente, oder Verbände davon m nativer Form und/oder m abgewandelter Form, insbesondere in gereinigter und/oder modifizierter Form, verwendet wird.
Es ist auch möglich, dass als Primartrager jeweils ein Vesikel, ein Liposom oder eine mizellare Struktur verwendet wird. Die Membranfragmente können sich auch planar anlagern, d.h. als nicht sphärische Struktur.
Besonders vorteilhaft gestaltet sich das erfmdungsgemaße Verfahren dann, wenn die Sensoranordnung aus Biosensorelektrode als Sekundartrager und daran angelagerten Primartragern in einem Messraum, Messbereich oder Messgefaß vom Messmedium umströmt oder an- geströmt wird. Auf diese Art und Weise lasst sich durch Wechsel des Messmediums zum Beispiel ein Konzentrationssprung im Hinblick auf den Wirkstoffkomplex oder eines Teils davon leicht realisieren. Auch lassen sich durch ein derartiges Messen im Rahmen eines Fließsystems vorteilhaft auf leichte Art und Weise und zuverlas- sig mit hoher Zeαtauflosung die erfmdungsgemaßen Versuchsbedingungen einstellen. Auch mithilfe einer automatisierten Pipettlervorrichtung kann das erfmdungsgemaße Verfahren vorteilhaft durchgeführt werden. Besonders ökonomisch und für eine statistische Auswertung zugänglich gestaltet sich das erfindungsgemaße Verfahren dann, wenn dufeinandertolgend eine Mehrzahl von Tests durchgeführt wird, insbesondere durch aufeinanderfolgendes Austauschen des Messmedi- ums, ggf. mit zwischengeschaltetem Waschen oder Spulen des Messraums .
Wichtig ist bei dem vorliegenden erfmdungsgemaßen Verfahren das Vergleichen der Aktion des Wirkortkomplexes bei vorliegendem Wirkstoffkomplex mit einer Situation, bei welcher der potenzielle Wirkstoffkomplex nicht zugegen ist. Dies kann beispielsweise geschehen durch den Wechsel zwischen nicht-aktivierendem zu aktivierendem Medium m Gegenwart oder Abwesenheit des potentiellen Wirkstoffkomplexes und Vergleich der erhaltenen Messwerte.
Potentielle zu testende Wirkstoffe können insbesondere unter anderem sein monoklonale Antikörper, Antikorperfragmente , polyklo- nale Antikörper und Peptide. Es können jedoch auch andere Substanzen, von denen vermutet wird, dass sie eine entsprechende Wirkung entfalten können, zugesetzt werden. Diese Substanzen werden vorzugsweise in gelöster Form verabreicht.
Substanzen, die als Testsubstanzen in dem erfmdungsgemaßen Testsystem untersucht werden können, können niedermolekulare Verbm- düngen sein. Erfindungsgemali können den niedermolekularen Stoffen kleine Peptide, Aminosäuren und Aminosaureanaloga, Steroide, Nukleoside, Nukleotide.
Insbesondere können als Testsubstanzen Aminosäuren oder Aminosau- reanaloga verwendet werden.
Es kann der Wirkstoffkomplex sowohl im Ruhemedium, im nicht- aktivierenden als auch im aktivierenden Medium zugesetzt oder dort freigesetzt werden.
Auch ist als Zwischenschritt eine Inkubation der Wirkortkomplexe oder der sie tragenden Pπmartrager mit dem Wirkstoffkomplex denkbar . Des Weiteren ist es denkbar, dass zwischen den Schritten (f) und (g) ein Waschschritt durchgeführt wird durch Einbringen des Se- Kundartragers mit den Primartragern in ein viertes oder Waschme- dium, welches bevorzugt mit dem nicht aktivierenden Medium iden- tisch ist, und/oder in ein oder in das Ruhemedium.
Ferner ist es denkbar, dass direkt vor dem Schritt (h) bei einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform des erfmdungsgemaßen Verfahrens der Schritt (f) wiederholt durchgeführt wird.
Es ist bevorzugt, wenn der Schritt (f) vor Beginn der eigentlichen Messreihe, d.h. bevor zum erstenmal die Schritte (g) und (h) durchgeführt werden, für mindestens 5 Minuten, bevorzugt für mindestens 10 Minuten, besonders bevorzugt für mindestens 15 Minu- ten, noch mehr bevorzugt für mindestens 20 Minuten und insbesondere bevorzugt für mindestens 30 Minuten durchgeführt wird. Die Schritte (g) und (h) werden erfmdungsgemaß für mindestens 0,2 s, höchstens jedoch 5 s und bevorzugt für etwa 1 bis 2 s durchgeführt. Nach der erstmaligen Durchfuhrung der Schritte (g) und (h) wird Schritt (f) für mindestens 1 s bis höchstens 120 s durchgeführt, bevorzugt für mindestens 30 s bis 90 s.
Die Prozesse des Spulens, Waschens und/oder Ruhens in den jeweiligen Medien können auch für oder mit deutlich kürzeren Zeitspan- nen erfolgen.
Die Medien, also das Ruhemedium, das nicht aktivierende Medium und das aktivierende Medium, weisen Kaliumionen in Konzentrationen im Bereich von etwa 10 mmol/1 bis etwa 300 mmol/1 auf, bevor- zugt im Bereich von etwa 100 mmol/1.
Des Weiteren enthalt das aktivierende Medium ein Substrat des PATl-Protems, bevorzugt Glycin. Weitere mögliche Substrate sind andere Aminosäuren, Aminosaureanaloga oder andere Substanzen, die von PATl transportiert werden oder werden können.
Die Konzentration kann je nach Anwendung schwanken. Bei Kompete- tionsuntersuchungen kann Glycin im Bereich von etwa einem oder einigen hundert μmol/1 bis zu einigen zehn mmol/1 eingesetzt wer- den, z.B. im Bereich von etwa 5 mmol/1 bis etwa 50 mmol/1. Bei Wirkstofftestungen auf Aktivierung und/oder Inhibierung des TYP- PATl-Proteins kann auch eine Konzentration im Bereich darüber sinnvoll sein, z.B. im Bereich von etwa 1 mmol/1 bis etwa 100 mmol/1.
Bei einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform des erfmdungsge- maßen Verfahrens wird alternativ oder zusätzlich als nicht aktivierendes Medium ein Medium verwendet mit 100 mmol/1 KCl, 2 mmol/1 MgCl2, 30 mmol/1 MES pH 6/KOH und VaIm im Bereich von et- wa 2 mmol/1 bis etwa 80 mmol/1.
Ferner wird alternativ oder zusatzlich bei einer anderen bevorzugten Ausfuhrungsform des erfmdungsgemaßen Verfahrens als aktivierendes Medium ein Medium verwendet mit 100 mmol/1 KCl, 2 mmol/1 MgCl2, 30 mmol/1 MES pH 6/KOH und Glycin im Bereich von etwa 2 mmol/1 bis etwa 80 mmol/1.
Dabei sind auch immer Verfahrensweisen möglich, bei denen das eigentliche Substrat im Hintergrund, z.B. in konstanter Konzentra- tion, vorliegt und ein die Konzentration eines Cosubstrats und/oder die Protonenkonzentration - durch einen pH-Sprung - ändernder Konzentrationssprung durchgeführt wird.
Gemäß eines weiteren Aspekts schafft die vorliegende Erfindung einen Wirkstoff oder einen Wirkstoffkomplex, welcher eine enzyma- tische Eigenschaft eines Typs einen Typ eines PATl-Protems enthaltenden Wirkortkomplexes oder eines Teils davon modifiziert und welcher gemäß dem erfmdungsgemaßen Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes identifiziert ist, wird oder wurde.
Des Weiteren schafft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines Arzneimittels mit den Schritten:
- Identifizieren eines Wirkstoffs und/oder eines Wirkstoffkomple- xes, welcher eine - ggf. bestimmte - enzymatische Eigenschaft eines Wirkstoffkomplexes , welcher einen Typ eines PATl-Protems enthalt, oder eines Teils davon oder eine Mehrzahl von Eigenschaften geeignet modifiziert, und zwar mit Hilfe des erfm- dungsgemaßen Verfahrens, - Herstellen und/oder Isolieren des Wirkstoffs, des Wirkstoffkomplexes, eines Teils und/oder eines Derivats davon,
- ggf. Aufreinigen des Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes , Teils und/oder Derivats,
- ggf. Mischen und/oder Portionieren des Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils und/oder Derivats mit einer pharmazeutisch vertraglichen Tragersubstanz.
Des Weiteren schafft die vorliegende Erfindung einen Testkit zur Durchfuhrung des erfmdungsgemaßen Verfahrens zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes . Dieser Testkit weist auf:
- mindestens einen Primartrager mit dem Typ-PATl-Protein,
- einen Messbereich,
- gegebenenfalls ein erstes oder Ruhemedium, ein zweites oder nicht-aktivierendes Medium sowie ein drittes oder aktivierendes
Medium.
Erfindungsgemaß wird auch ein Screenmgverfahren zum Identifizieren geschaffen, und zwar zum Identifizieren:
- eines unbekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, eines Teils und/oder Derivats davon,
- des Vorhandenseins eines unbekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkom- plexes, Teils und/oder Derivats davon,
- des Vorhandenseins eines bekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils und/oder Derivats davon,
- der Konzentration eines unbekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils und/oder Derivats davon,
- der Konzentration eines bekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils und/oder Derivats davon. Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird das erfmdungsgemaße Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes verwendet zum Auffinden von Inhibitoren, Aktivatoren, partiellen oder temporaren Inhibitoren oder Modulatoren einer enzy- matischen Eigenschaft eines Wirkort komplexes, welcher ein Typ- PATl-Protein enthalt, und von Wirkstoffkomplexen, die ein Substrat für PATl darstellen.
Des Weiteren wird das erfmdungsgemaße Testkit erfmdungsgemaß verwendet zum Auffinden von Inhibitoren, Aktivatoren, partiellen oder temporaren Inhibitoren oder Modulatoren eines einen Typ eines PATl-Prote ms enthaltenden Wirkort komplexes und/oder von Wirkstoffkomplexen, die ein Substrat für PATl darstellen.
Des Weiteren wird das Arzneimittel erfmdungsgemaß verwendet zur Inhibition, partiellen oder temporaren Inhibition, Aktivierung oder sonstige Modulation eines Typ-PATl-Protems enthaltenden Wirkstoffkomplexes oder eines Teils davon, oder das Arzneimittel wird von PATl transportiert.
Auf der Grundlage der nachfolgenden Bemerkungen werden die voranstehenden und weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung mit anderen Worten weiter erläutert:
Es ist ein z. B. wassriges Messmedium vorgesehen, in welchem die Primartrager und die Sekundartrager angeordnet werden. Der Elektrodenbereich wird gegenüber dem Messmedium, den Primartragern und gegenüber den biologischen Einheiten bevorzugt weitestgehend e- lektrisch isoliert.
Der Elektrodenbereich besitzt z.B. mindestens eine Elektrode. Diese kann zum einen jeweils selbst als mechanisch stabiler Mate- rialbereich ausgebildet sein, insbesondere als Platte, als Draht und/oder dergleichen.
Eine besonders einfache Anordnung der Sensorelektrodeneinrichtung ergibt sich, wenn die Elektrode im Wesentlichen als auf der Oberflache des Tragers abgeschiedene Materialschicht ausgebildet ist. Es kann sich dabei um eine aufgedampfte oder gesputterte Mateπ- alschicht handeln. Die Materialschicht zur Ausbildung der Elektrode hat vorzugsweise eine Schichtstarke von etwa 10 bis 200 nrn.
Das Typ-PATl-Protem kann jeweils in im Wesentlichen nativer Form und/oder in abgewandelter, insbesondere gereinigter, mikrobiologisch und/oder molekularbiologαsch geänderter Form vorgesehen sein. Zum einen können dadurch bestimmte native Eigenschaften getestet und pharmakologisch untersucht werden. Andererseits bieten sich auch molekularbiologische oder gentechnisch initiierte Ver- anderungen an, die bestimmten Aspekte, zum Beispiel des Transports oder der pharmakologischen Wirkungsweise eines Wirkstoffes zu analysieren.
Besonders vorteilhaft ist es, dass Pnmartrager eines jeweils im Wesentlichen einheitlichen Typs von Pπmartragern vorgesehen werden. Dies ist im Hinblick auf eine möglichst eindeutige Aussage und Analyse eines Wirkstofftests von Bedeutung und bezieht sich auf die geometrischen, physikalischen, chemischen, biologischen und molekularbiologischen Eigenschaften der Pnmartrager.
Das Nämliche gilt auch für die in dem Pnmartrager vorgesehenen Wirkortkomplexe und das Typ-PATl-Protein. Hier sind Wirkortkomplexe und Typ-PATl-Protem eines jeweils im Wesentlichen einheitlichen Typs vorgesehen, insbesondere im Hinblick auf ihre geomet- rischen, physikalischen, chemischen, biologischen und molekularbiologischen Eigenschaften. Zusätzlich sollen die biologischen Einheiten in vorteilhafter Weise im Hinblick auf ihre Orientierung und/oder im Hinblick auf ihre Aktivierbarkeit in Bezug auf den jeweiligen Pnmartrager in etwa einheitlich sein.
Wie bereits ausgeführt, liegt der Erfindung unter anderem die Aufgabe zu Grunde, die Wirkung von Substanzen auf die Funktion von Typ-PATl-Proteinen einer Untersuchung zugänglich zu machen. Substanzen, welche die Wirkung dieses Transportproteins modulie- ren, sind als potentielle Wirkstoffe von gewerblichem Interesse. Auch waren Substrate des Proteins, die von diesem transportiert werden, wichtige neue Moleküle.
Das erfmdungsgemaße Vorgehen bietet folgende Vorteile: Die Messung der Enzymaktivitat gemäß dem erfindungsgemaß vorgeschlagenen Verfahren bedarf keiner Vermittler oder markierten Substrate. Eine Einzeimessung dauert lediglich wenige Sekunden. Die Messung ist sensitiv gegenüber allen Substraten. Sofern eine Substanz die Reaktion nicht irreversibel inhibiert, können mit einem mit Enzym beladenen Sensor mehrere Messungen durchgeführt werden. Substrate müssen nicht chemisch modifiziert vorliegen, da die Stromantwort oder Potentialantwort des Proteins durch einen schnellen Losungswechsel induziert wird.
Darüber hinaus ist im Gegensatz zu der Patch-Clamp-Technik die Signalqualitat besser, und zwar im Sinne eines besseren Signal- Rauschverhaltnisses .
BEISPIEL 1 Vorbereitung des Sensorchips
Die Goldoberflache eines zu Grunde liegenden Sensorchips wurde durch Einlegen in eine 1 mmol/1 Octadecylmercaptanlösung in Alkohol mercaptanisiert oder hydrophobisiert, also hydrophob gemacht, mit 2-Propanol oder Ethanol (absolut) oder Wasser gespült und getrocknet. Sie wurde dann mit Diphytanoylphosphatidylcholin (in Decan) bedeckt und mit einem Anlagerungspufferpuffer (100 mmol/1 KCl, 2 mmol/1 MgCl2, 30 mmol/1 Mes, pH 6/KOH) ύberschichtet .
BEISPIEL 2 Herstellung proteinhaltiger Membranfraqmente- suspension
Die Membranfragmente wurden nach folgendem Protokoll präpariert: Pro 1 g Zellpellet 1 ml Sucrosepuffer aus 0,25 mol/1 Sucrose, 5 mmol/1 Tris, pH 7,5, ca. 2 mmol/1 DTT, PMSF (50 μl PMSF als gesattigte ethanolische Losung auf 100 ml Puffer), Complete (Fa. Roche, eine Tablette pro 50 ml Puffer) . Zellen aufbrechen bis homogene Masse entstanden ist, 10 min/680 g/4°C; 10 min/6100 g/4°C; Überstand 1 h/100.000 g/4°C zentrifugieren; Pellet in 5 mmol/1 Tris pH 7,5 aufnehmen, so dass sehr trübe Mischung entsteht; mit Zugabe von 70% Sucrose (in 5 mmol/1 Tris) auf 51,3 % Sucrose einstellen, Zentrifugenröhrchen mit 44,4 %, 30,7 % und 8,6 % Sucrose in 5 mmol/1 Tris pH 7,5 uberschichten ; 1 h 40 min/100.000g/40C im Ausschwenkrotor zentrifugieren; Banden mit Pasteurpipette abneh- men und pelletieren in Anlagerungspuffer (siehe oben); 30 min/150.000g/40C; Pellets in Anlagerungspuffer aufnehmen. Alternativ zum Sucrosegradienten wurde auch ein Percollgradient eingehetzt. Denkbar ist auch eine Zweiphasentrennung
BEISPIEL 3 Herstellung der PATl-Sensorchips
10 μl bis 50 μl der Membranfragmentesuspension mit einer Proteinkonzentration von ca. 0,1-1,0 mg/ml wurden auf einen vorbehandelten Sensorchip mit einer runden Goldelektrode (IonGate Bioscien- ces GmbH, Frankfurt am Main) mit z.B. etwa 3 mm Durchmesser aufgetragen und bei 2 Stunden oder über Nacht im Kühlschrank bei weniger als etwa 8°C inkubiert.
BEISPIEL 4 Aktivitatsmessung an PATl-exprimierenden Membran- fragmenten
Die Durchflusszelle mit integriertem protembeladenem Sensorchip wurde mit nicht aktivierender Losung mit 100 mmol/1 KCl, 2 mmol/1 MgCl2, 30 mmol/1 MES pH 6/KOH, 40 mmol/1 bis 80 mmol/1 VaIm ge- spult. Mittels elektromechanischem 3/2-Wegeventil wurde anschließend auf aktivierende Losung mit 100 mmol/1 KCl, 2 mmol/1 MgCl2, 30 mmol/1 MES pH 6/KOH, 2,5 mmol/1 bis 80 mmol/1 Glycin umgestellt.
Im Transportzyklus von PATl werden durch Cotransport von Protonen und Glycin netto positive elektrische Ladungen über die Membran und auf die Elektrode des Biosensors zu verschoben, was zu einem positiven Stromsignal fuhrt: Fig. 1.
BEISPIEL 5 Aktivitatsmes sung mit Leucin statt Glycin
Die Messungen wurden wie oben durchgeführt, allerdings wurden in nicht aktivierender und aktivierender Losung 50 mmol/1 Valin bzw. 50 mmol/1 Leucin (statt Glycin) verwendet. Da Leucin von PATl nicht transportiert wird, findet auch kein Cotransport von Proto- nen statt und es kann kein Ladestrom gemessen werden: Fig. 2.
BEISPIEL 6 Aktivitatsmessung an Kontrollmembranen
Die Kontrollmessungen wurden wie bei den PATl-exprimierenden
Membranen durchgeführt, aber an Membranen, die in Bezug auf die PATl-Bedingungen keine für den Test relevante Menge und/oder Aktivität an PATl enthielten bzw. zeigten. Z R kar.v. em deraxiiges Kontrollexperiment an Membranen oder Membranfragmenten durchgeführt werden, die ein anderes Protein als PATl uberexprimieren, z.B. NCX. Durch spezifische Aktivität smessung in Bezug auf dieses anderen Protein kann zunächst die Anlagerung der Membranen oder Membranfragmente nachgewiesen werden. Dann können die für PATl spezifischen Tests zur Kontrolle durchgeführt werden.
Dabei ergaben sich keine Signale beim Wechsel von nicht aktivierendem Medium mit 100 mmol/1 KCl, 2 mmol/1 MgCl2, 30 mmol/1 MES pH 6/KOH, 80 mmol/1 VaIm auf aktivierendes Medium mit 100 mmol/1 KCl, 2 mmol/1 MgCl2, 30 mmol/1 MES pH 6/KOH, 80 mmol/1 Glycin anstelle von Valin.
Fig. 1 zeigt in Form eines Graphen den gemäß einer Ausfuhrungsform des erfindungsgemaßen Verfahrens mit einer Biosensorelektrode gemessenen elektrischen Strom I(t) als Funktion der Zeit t, der teilweise auf einem durch das PATl-Protem hervorgerufenen
Transportstrom als messbare elektrische Aktion beruht .
Fig. 2 zeigt in Form eines Graphen den gemäß einer anderen Ausfuhrungsform des erfindungsgemaßen Verfahrens mit einer Biosensorelektrode gemessenen elektrischen
Strom I(t) als Funktion der Zeit t, der teilweise auf einem durch das PATl-Protem hervorgerufenen Transportstrom als messbare elektrische Aktion beruht, und zwar bei einem Kontrollexperiment, bei welchem zwischenzeitlich Glycin durch Leucin ersetzt wird .
Fig. 3 zeigt in Form eines Graphen den gemäß einer anderen Ausfuhrungsform des erfindungsgemaßen Verfahrens mit einer Biosensorelektrode normierten gemessenen maximalen elektrischen Strom I(t) als Funktion des eingestellten pH-Werts.
Fig. 1 zeigt in Form eines Graphen den gemäß einer Ausfuhrungs- form des erfindungsgemaßen Verfahrens mit einer Biosensorelektro- de gemessenen elektrischen Strom I(t) als Funktion der Zeit t, der teilweise auf einem durch das PATl-Proteir hcrvo.gerufenen Transportstrom als messbare elektrische Aktion beruht.
Dabei bezeichnet die Abszisse die Zeit t, wobei t = 0 denjenigen Zeitpunkt t angibt, bei welchem das Medium effektiv, also für PATl wirksam von einem nicht aktivierendem zu einem aktivierendem gewechselt wird. D.h., ab t=0 ist das Substrat, hier Glycin, welches vor t=0 fehlte, effektiv, also für PATl wirksam im Messmedi- um vorhanden. Dadurch wird der elektrische Strom I(t), dargestellt durch die Ordinate als Strom transportierter Ionen als Funktion der Zeit t manifest, welcher auf der Ordinate aufgezeichnet ist. Die Ordinate bezeichnet also den gemessenen elektrischen Strom I(t), als Funktion der Zeit t, welcher über die Biosensorelektrode gemessen wird.
Dargestellt sind in Fig. 1 vier Messspuren A, B, C und D, die mit unterschiedlichen Messbedingungen m Bezug auf die Substratkonzentration an Glycin korrespondieren.
Spur A der Fig. 1 zeigt eine Messung, bei welcher die PATl- Protememheiten durch Glycmzugabe von 80 mmol/1 zum Zeitpunkt t = 0 normal aktiviert wird, und zwar in Anwesenheit von 100 mmol/1 K bei pH = 6. Unter Glycmtransport werden mittels des PATl- Proteins Protonen über die Primartrager, z.B. über Membranfragmente oder Vesikel, auf die Biosensormembran und die Elektrode zu bewegt. Im Transportzyklus von PATl wird dabei netto positive e- lektrische Ladung über die Membran verschoben, was zu einem positiven Stromsignal fuhrt. Dies ist am gemessenen positiven elekt- rischen Strom I(t) erkennbar.
Spur B in Fig. 1 zeigt eine Messung, bei welcher - unter sonst gleichen Bedingungen wie bei der Spur A - die Konzentration des bei tθ = 0 zugegebenen Glycins statt 80 mmol/1 nur 20 mmol/1 be- trug. Deutlich erkennbar ist die Absenkung des Maximums des gemessenen elektrischen Stroms I(t).
In den Spuren C und D der Fig. 1 ist die zugegebene Glycinkon- zentration auf 10 mmol/1 bzw. auf 2,5 mmol/1 eingestellt. Fig. 1 zeigt somit die Relevanz der Anwesenheit von Glycin für die Transportaktivitat der PATl-Einheiten
Fig. 2 zeigt ebenfalls in Form eines Graphen den gemäß einer an- deren Ausfuhrungsform des erfmdungsgemaßen Verfahrens mit einer Biosensorelektrode gemessenen elektrischen Strom I(t) als Funktion der Zeit t, der teilweise auf einem durch das PATl-Protem hervorgerufenen Transportstrom als messbare elektrische Aktion beruht, und zwar bei einem Kontrollexpenment, bei welchem zwi- schenzeitlich Glycin durch Leucin ersetzt wird.
Spur A der Fig. 2 entspricht hinsichtlich der Messbedingungen etwa der Spur A aus Fig. 1 und zeigt also eine Messung, bei welcher die PATl-Proteineinheiten durch Glycmzugabe von 40 mmol/1 zum Zeitpunkt t = 0 normal aktiviert werden, und zwar in Anwesenheit von 100 mmol/1 K bei pH = 6. Unter Glycmtransport werden mittels des PATl-Proteins wieder Protonen über die Primartrager , z.B. u- ber Membranfragmente oder Vesikel, auf die Biosensormembran und die Elektrode zu bewegt. Im Transport zyklus von PATl wird dabei wieder netto positive elektrische Ladung über die Membran verschoben, was zu einem positiven Stromsignal fuhrt. Dies ist am gemessenen positiven elektrischen Strom I(t) erkennbar.
Spur B der Fig. 2 zeigt eine Messung, bei welcher statt 40 mmol/1 Glycin in der nicht aktivierenden Messlosung nun 50 mmol/1 VaIm und 50 mmol/1 Leucm in der aktivierenden Messlosung vorliegen. Trotz des Vorhandenseins von Protonen bei pH = 6 bei tθ = 0 ist kein über das Rauschen hinausgehendes Signal messbar. Dadurch ist gezeigt, dass der gemessene elektrische Strom I(t) aus der Spur A den Transportstrom repräsentiert. Aus Messungen mit anderen Methoden ist bekannt, dass PATl Leucin nicht transportiert.
Fig. 3 zeigt die pH-Abhängigkeit des normierten maximalen Stroms als elektrische Aktion von PATl, und zwar normiert auf das Maxi- mum, das bei pH = 6 vorliegt, wobei die weiteren Bedingungen 100 mmol/1 K+ und 80 mmol/1 Valin-Glycin waren.
Grundsätzliche Vorteile der vorliegenden Erfindung sind die hohe mechanische Stabilität der vorgesehenen Sensoranordnung und damit einhergehend die große Einsatzbereitschaft, die einfache Handhab- barkeit und geringer Störanfälligkeit. In der Verwendung der Sensoranordnung ergeben sich im Rahmen von pharmakologischen Wirkstofftests eine lange Lebensdauer, eine hohe Zuverlässigkeit, eine geringe Störanfälligkeit sowie insbesondere ein gegenüber her- kommlichen Verfahren maßgeblich gesteigerter Testdurchsatz, wodurch entsprechende Testverfahren kostengünstig ausgearbeitet und durchgeführt werden können.
Darüber hinaus ist im Gegensatz zu anderen Techniken die Signal- qualitat besser, und zwar im Sinne eines besseren Signal- Rauschverhaltnisses .

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes , welcher eine enzymatische Eigenschaft eines Wirkortkomplexes modifiziert, welcher einen Typ eines PATl-Proteins enthält, mit den Schritten:
(a) Bereitstellen einer Mehrzahl Primärträger, welche den das Typ-PATl-Protein enthaltenden Wirkortkomplex in einer Mehrzahl im Bereich einer Membran des jeweiligen Primärträgers enthalten,
(b) Anlagern oder In-Kontakt-Bringen der Primärträger am oder im Oberflächenbereich eines Isolationsbereichs einer als Sekundärträger dienenden Biosensorelektrode in einem Messmedium, wobei der Sekundärträger gegenüber dem Messmedium und gegen- über den Primärträgern mittels des Isolationsbereichs mechanisch und elektrisch isoliert ist oder wird,
(c) Bereitstellen mindestens eines potenziellen Wirkstoffkomplexes,
(d) In-Kontakt- und In-Wechselwirkung-Bringen des potenziellen Wirkstoffkomplexes mit dem Wirkortkomplex der Primärträger oder Teilen davon und
(e) Bestimmen des qualitativen oder quantitativen Einflusses des potenziellen Wirkstoffkomplexes oder eines Teils davon auf enzymatische Eigenschaften des Wirkortkomplexes oder eines Teils davon durch Detektieren einer elektrischen Aktion des Wirkortkomplexes oder eines Teils davon oder Änderung der e- lektrischen Aktion über die Biosensorelektrode als Sekundärträger,
wobei in mindestens einem der Verfahrensschritte (c), (d) und (e) ein oder mehrere der folgenden Unterschritte durchgeführt werden:
(f) Einbringen des Sekundärträgers mit den Primärträgern in ein Ruhemedium und Detektieren einer elektrischen Aktion gemäß Verfahrensschritt (e),
(g) Einbringen des Sekundärträgers mit den Primärträgern in ein zweites nicht-aktivierendes Medium und Detektieren einer e- lektrischen Aktion gemäß Verfahrensschritt (e) , (h) Einbringen des Sekundärträgers mit den Primärträgern in ein drittes oder aktivierendes Messmedium und Detektieren einer elektrischen Aktion gemäß Verfahrens schritt (e), wobei das dritte oder aktivierende Medium dem zweiten oder nicht- aktivierenden Medium entspricht, jedoch zusätzlich ein Substrat oder Cosubstrat des Typ-PATl-Proteins enthält oder eine gegenüber dem nicht-aktivierenden Medium variierte Konzentration eines Substrats oder Cosubstrats des Typ-PATl-Proteins anstelle eines im zweiten oder nicht-aktivierenden Medium vorhandenen Nicht-Substrats.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem als nicht-aktivierendes Medium ein Medium verwendet wird mit 100 mmol/1 KCl, 2 mmol/1 MgCl2, 30 mmol/1 Mes pH 6/KOH und Valin im Bereich von etwa 2 mmol/1 bis etwa 80 mmol/1.
3. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem als aktivierendes Medium ein Medium verwendet wird mit 100 mmol/1 KCl, 2 mmol/1 MgCl2, 30 mmol/1 Mes pH 6/KOH und Glycin im Bereich von etwa 2 mmol/1 bis etwa 80 mmol/1.
4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem eine Biosensorelektrode als Sekundärträger verwendet wird, bei welcher ein elektrisch leitfähiger und fest körperarti- ger Elektrodenbereich mit mindestens einer Elektrode vorgesehen wird, welcher gegenüber dem Messmedium und gegenüber den Primärträgern bevorzugt elektrisch und mechanisch isoliert wird durch Vorsehen eines Isolationsbereichs in Form einer festkörperunterstützten Membran, welche schichtartig aufgebaut wird aus einer Unterschicht einer organischen Thioverbindung als unterster und der Elektrode jeweils zugewandten Schicht und aus einer Oberschicht einer amphiphilen organischen Verbindung.
5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem eine Biosensorelektrode als Sekundärträger verwendet wird, bei welcher eine Elektrode aus Gold oder Kohlenstoff im E- lektrodenbereich vorgesehen wird mit einer Monoschicht eines langkettigen Alkanthiols als Unterschicht darauf und einer Monoschicht eines Lipids als Oberschicht darauf.
6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem eine Biosensorelektrode als Sekundarträger verwendet wird, bei welcher der eine Elektrode der Biosensorelektrode als Sekundarträger abdeckende Bereich des Isolationsbereichs als Membranstruktur nach Art einer festkorperunterstutzten Doppel- schichtmembran oder Bilayermembran ausgebildet wird oder ist.
7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem als Primartrager jeweils eine eukaryontische Zelle, eine prokaryont ische Zelle, ein Oozyt, ein Bakterium, ein Virus, eine Organelle oder Bestandteile, insbesondere Membranfragmente, oder Verbände davon in nativer Form oder in abgewandelter Form, insbesondere in gereinigter, mikrobiologisch und/oder molekularbiologisch geänderter Form, verwendet wird.
8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem als Primartrager jeweils ein Vesikel, ein Liposom o- der eine mizellare Struktur verwendet wird.
9. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem ein Typ-PATl-Protein verwendet wird, welches auf einem PATl-Protein basiert, das aus einem Gewebe eines Saugetiers, bevorzugt aus dem Darm, aus neuronalem Gewebe, ZNS, Niere, Lunge oder Leber, stammt oder genetisch aus diesem abgeleitet wird oder ist.
10. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem das Typ-PATl-Protein aus dem Organismus Ratte, Schwein, Maus, Kaninchen oder Mensch stammt oder aus diesem gene- tisch abgeleitet wird.
11. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem das Typ-PATl-Protein zumindest zum Teil im Primärträger eine Membran durchspannend ausgebildet oder verwendet ist o- der wird.
12. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem als elektrische Aktion verwendet wird ein durch den
Wirkortkomplex oder einen Teil davon erzeugter elektrischer Strom oder ein davon erzeugtes elektrisches Potenzial, welche jeweils erzeugt werden durch mindestens einen der Prozesse Ladungstransport, Stofftransport , Ladungsverschiebung. Stoff"erεchiebung, Konformationsanderungen, Ligandenbmdung, Ligandenanlagerung und Ligandenfreigabe oder eine Kombination davon.
13. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem als enzymatische Eigenschaft verwendet wird:
- die Bindung, Anlagerung oder Freigabe des Wirkstoffkomplexes oder eines Teils davon oder des Messmediums oder eines Teils davon,
- der Transport oder die Verschiebung des Wirkstoffkomplexes oder eines Teils davon oder des Messmediums oder eines Teils davon,
- die chemische Umsetzung oder Reaktion des Wirkstoffkomplexes oder eines Teils davon oder des Messmediums oder eines Teils davon,
- eine Konformationsanderung oder Bewegung des Wirkort komplexes oder eines Teils davon oder
- eine beliebige Kombination dieser Prozesse.
14. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem als Messmedium ein wassπges Messmedium verwendet wird und insbesondere eine wassrige Elektrolytlosung .
15. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem die Verfahrensschritte (c) und/oder (d) durchgeführt werden durch:
- Zumischen oder Injizieren des Wirkstoffkomplexes , eines Teils oder einer Vorform davon,
- Austauschen des Messmediums oder eines Teils davon und/oder - chemisches oder physikalisches Umsetzen oder Reagieren des Messmediums oder eines Teils davon oder des Wirkstoffkomplexes , eines Teils oder einer Vorform davon.
16. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem eine Sensoranordnung aus Biosensorelektrode als Se- kundartrager und daran angelagerten Primartragern in einem Messraum, Messbereich oder Messgefaß vom Messmedium umströmt oder angeströmt wird.
17. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem aufeinanderfolgend eine Mehrzahl von Tests durchgeführt wird durch aufeinanderfolgendes Austauschen des Messmedi- ums, gegebenenfalls mit zwischengeschaltetem Waschen oder Spulen des Messraums.
18. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem zwischen den Schritten (f) und (g) ein Waschschritt durchgeführt wird durch Einbringen des Sekundartragers mit den Primartragern in ein viertes oder Waschmedium.
19. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem direkt vor dem Schritt (h) der Schritt (f) wiederholt durchgeführt wird.
20. Wirkstoff oder Wirkstoffkomplex,
- welcher eine enzymatische Eigenschaft eines Wirkortkomplexes, der ein Typ-PATl-Protem enthalt, oder eines Teils davon modifiziert ,
- welcher gemäß einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19 identifiziert ist, wird oder wurde.
21. Verfahren zum Herstellen eines Arzneimittels mit den Schritten :
- Identifizieren eines Wirkstoffs und/oder eines Wirkstoffkomple- xes, welcher eine bestimmte enzymatische Eigenschaft eines
Wirkortkomplexes, welcher ein Typ-PATl-Protem enthalt, oder eines Teils davon oder eine Mehrzahl von Eigenschaften geeignet modifiziert und/oder von PATl transportiert wird, mit Hilfe eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 19, - Herstellen und/oder Isolieren des Wirkstoffs, des Wirkstoffkomplexes, eines Teils und/oder eines Derivats davon,
- ggf. Aufreinigen des Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes , Teils oder Derivats,
- ggf. Mischen und/oder Portionieren des Wirkstoffs, des Wirk- stoffkomplexes, des Teils oder Derivats mit einer pharmazeutisch vertraglichen Tragersubstanz.
22. Testkit zur Durchfuhrung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 19, mit: - mindestens einem Pr imartrager ,
- einem Messbereich und
- gegebenenfalls einem ersten oder Ruhemedium, einem zweiten oder nicht-aktivierenden Medium und einem dritten oder aktivierenden Medium.
23. Screeningver fahren zum Identifizieren.
- eines unbekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes , Teils oder Derivats davon, - des Vorhandenseins eines unbekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils oder Derivats davon,
- des Vorhandenseins eines bekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils oder Derivats davon,
- der Konzentration eines unbekannten Wirkstoffs, Wirks toffkom- plexes, Teils oder Derivats davon,
- der Konzentration eines bekannten Wirkstoffes, Wirkstoffkomplexes, Teils oder Derivats davon oder
- einer beliebigen Kombination der zuvor genannten Großen oder Eigenschaften durch Verwenden eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 19 und/oder des Testkits gemäß Anspruch 22, wobei der Wirkstoff, der Wirkstoffkomplex, der Teil oder das Derivat davon eine enzymatische Eigenschaft eines Wirkortkomplexes, welcher einen Typ eines PATl-Prot eins enthalt, oder eines Teils davon modifiziert und/oder von PATl transportiert wird.
24. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 19, zum Auffinden von Inhibitoren, partiellen oder temporaren Inhibitoren, Aktivatoren oder Modulatoren einer enzymatischen Eigen- schaft eines Wirkortkomplexes, welcher einen Typ eines PATl- Proteins enthalt, und insbesondere des humanen PATl-Protems , und/oder von Wirkstoffkomplexen, die ein Substrat für das PATl- Protein darstellen.
25. Verwenden des Testkits gemäß Anspruch 22, zum Auffinden von Inhibitoren, Aktivatoren, partiellen oder temporaren Inhibitoren oder Modulatoren einer enzymatischen Eigenschaft eines Wirkortkomplexes, welcher einen Typ eines PATl- Proteins enthalt, und insbesondere des humanen PATl-Proteins, und/oder von Wirkstoffkomplexen, dxe ein Substrat für das PATl- Protein darstellen.
26. Verwenden eines Arzneimittels, - welches gemäß dem Verfahren nach Anspruch 21 hergestellt wurde, - zur Inhibition, partiellen oder temporaren Inhibition oder Modulation einer enzymatischen Eigenschaft eines Wirkortkomplexes, welcher einen Typ eines PATl-Protems enthalt, oder eines Teils davon und insbesondere des humanen PATl-Proteins , und/oder als Wirkstoffkomplex, der ein Substrat für das PATl- Protein darstellt.
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