DE102004048396B4

DE102004048396B4 - Typ-EAAC1-Protein-Assay

Info

Publication number: DE102004048396B4
Application number: DE200410048396
Authority: DE
Inventors: Natalie Dr. Watzke; Renate Dr. Gauß; Maarten Dr. Ruitenberg; Béla Dr. Kelety; Wolfgang Dr. Dörner; Robin Krause
Original assignee: Iongate Biosciences GmbH
Current assignee: Iongate Biosciences GmbH
Priority date: 2004-10-01
Filing date: 2004-10-01
Publication date: 2007-08-16
Anticipated expiration: 2024-10-02
Also published as: DE102004048396A1; WO2006037569A1

Abstract

Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes, welcher eine enzymatische Eigenschaft eines Wirkortkomplexes modifiziert, welcher einen Typ eines EAAC1-Proteins enthält,
mit den Schritten:
(a) Bereitstellen einer Mehrzahl Primärträger, welche den das Typ-EAAC1-Protein enthaltenden Wirkortkomplex in einer Mehrzahl im Bereich einer Membran des jeweiligen Primärträgers enthalten,
(b) Anlagern oder In-Kontakt-Bringen der Primärträger am oder im Oberflächenbereich eines Isolationsbereichs einer als Sekundärträger dienenden Biosensorelektrode in einem Messmedium, wobei der Sekundärträger gegenüber dem Messmedium und gegenüber den Primärträgern mittels des Isolationsbereichs mechanisch und elektrisch isoliert ist oder wird,
(c) Bereitstellen mindestens eines potenziellen Wirkstoffkomplexes,
(d) In-Kontakt- und In-Wechselwirkung-Bringen des potenziellen Wirkstoffkomplexes mit dem Wirkortkomplex der Primärträger oder Teilen davon und
(e) Bestimmen des qualitativen oder quantitativen Einflusses des potenziellen Wirkstoffkomplexes oder eines Teils davon auf enzymatische Eigenschaften des Wirkortkomplexes oder eines Teils davon durch Detektieren einer elektrischen Aktion des Wirkortkomplexes oder eines Teils davon oder Änderung der elektrischen Aktion...

Description

Die Erfindung betrifft einen Typ-EAAC1-Protein-Assay und insbesondere ein Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes, welcher eine enzymatische Eigenschaft eines Wirkortkomplexes modifiziert, der einen Typ eines EAAC1-Proteins enthält.
Die Erfindung betrifft ferner einen Wirkstoffkomplex, der gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert ist oder wurde, ein Verfahren zum Herstellen eines Arzneimittels, einen Testkit zum Durchführen des erfindungsgemäßen Verfahrens, ein Screeningverfahren sowie die Verwendungen des erfindungsgemäßen Verfahrens, des erfindungsgemäßen Testkits sowie des Arzneimittels.

Das murine Protein EAAC1, das auch als exzitatorischer Aminosäuretransporter 1 (excitatory amino acid carrier 1) bezeichnet wird, ist ein Transmembranprotein und der am häufigsten auftretende neuronale Glutamattransporter, welcher die Wiederaufnahme von Glutamat in die Neuronen vermittelt und so zusammen mit anderen glialen Glutamattransportern für die Aufrechterhaltung einer geringen extrazellulären Glutamatkonzentration sorgt, die für die Aufrechterhaltung der synaptischen Erregbarkeit der Neuronen notwendig ist. Der Glutamattransport erfolgt unter Cotransport von Natriumkationen und ggf. Gegentransport von Kaliumkationen. Das Typ-EAAC1-Protein liegt möglicherweise nativ als Homopentamer vor. Erfindungsgemäß wird synonym von Typ-EAAC1-Proteinen und vom EAAC1 gesprochen, um zum Ausdruck zu bringen, daß alle Mitglieder der Proteinfamilie gemeint sind, und insbesondere auch das nahe verwandte humane EAAT3-Protein. Mit EAAC1 ist erfindungsgemäß also nicht nur das murine Protein, sondern auch die anderen Äquivalente, und insbesondere das humane Äquivalent EAAT3 gemeint.

Gegebenenfalls ist das EAAC1-Protein in einen übergeordneten Wirkortkomplex integriert. Dies kann eine Anordnung mehrerer EAAC1-Einheiten oder -Proteinmoleküle zu einem Oligomer sein. Es können aber auch andere, ggf. enzymatische Komponenten vorhanden sein, die in Kooperation mit dem EAAC1-Protein vorliegen. Diese können auch räumlich beabstandet vorliegen.

Weiterhin wird das Typ-EAAC1-Protein auch im Darm und der Niere von Mäusen exprimiert. EAAC1-Knockout-Mäuse zeigen einen erhöhten Aspartat- und Glutamat-Spiegel im Urin. Damit ist dieser Transporter auch ganz allgemein verbunden mit dem Aminosäurestoffwechsel und der Ausscheidung von Aminosäuren. Es wird auch diskutiert, dass dieser Transporter möglicherweise pharmakologisch aktive Wirkstoffe aktiv aus dem Darm oder dem Primärharn resorbiert und damit deren Bioverfügbarkeit verbessert.

Typ-EAAC1-Proteine gehören zur Glutamattransporterfamilie, die fünf Subtypen enthält. Die Subtypen unterscheiden sich in ihrer Lokalisation und ihrem Verhältnis zwischen Glutamattransport und glutamatinduzierter Anionenleitfähigkeit, d. h. der Kanalfunktion der Glutamattransporter. Abgesehen von Retina und Kleinhirn, wo hauptsächlich gewebespezifische Transporter (EAAT5 bzw. GLAST und EAAT4) zu finden sind, ist im übrigen Gehirn GLT-1 der häufigste gliale und EAAC1 der häufigste neuronale Glutamattransporter. Außerdem ist EAAC1 zusätzlich in Niere und Darm exprimiert.

Glutamat ist der wichtigste exzitatorische Neurotransmitter im menschlichen zentralen Nervensystem. Es wird in der präsynaptischen Nervenendigung in Vesikeln gespeichert und bei der Reizweiterleitung in den synaptischen Spalt ausgeschüttet. An der postsynaptischen Membran bindet Glutamat an Rezeptoren, die als ligandengesteuerte Kationenkanäle zu einer Depolarisierung der postsynaptischen Nervenzelle und damit zur Signalübertragung führen. Glutamattransporter vermitteln die (Wieder-) Aufnahme von Glutamat in Nervenzellen sowie in benachbarte Gliazellen. Die rasche Entfernung des Glutamats aus dem synaptischen Spalt aufgrund von aktiver Aufnahme und Diffusion führt zum Abklingen der Erregung an der postsynaptischen Zelle. Glutamattransporter sind daher essentiell für die Aufrechterhaltung synaptischer Erregbarkeit.

Bei den eukaryotischen Glutamattransportern handelt es sich um glykosylierte Proteine mit einem Molekulargewicht von ca. 65 kDa (ca. 570 Aminosäuren), siehe auch 1. Allen Topologiemodellen gemeinsam ist die intrazelluläre Lokalisation des N-Terminus, die anschließenden ersten 6 hydrophoben Transmembrandomänen mit vermutlich α-helikaler Struktur und eine große extrazelluläre Schleife zwischen der dritten und vierten Transmembrandomäne. Im Gegensatz dazu ist der Hydropathieplot sowie Versuche mit Markierung bestimmter Aminosäuren des C-terminalen Endes nicht eindeutig, sodass verschiedene Strukturen mit unterschiedlicher Anzahl an weiteren Transmembrandomänen postuliert wurden. Allerdings ist die Sequenz der ca. 150 C-terminalen Aminosäuren in allen Subtypen streng konserviert und dieser Bereich spielt eine wichtige Rolle sowohl für die Funktion als auch die subtypischen Eigenschaften der Glutamattransporter gegenüber Inhibitoren.

Als Quartärstruktur von Glutamattransportern wurde für Typ-EAAC1-Proteine mit Hilfe von Elektronenmikroskopie an Gefrierbruchflächen von Xenopus Oozyten Membranen ein Homopentamer nachgewiesen, das eine pyramidenartige Struktur mit einer zentralen Kanal-artigen Aushöhlung zeigte. Dabei wird vermutet, dass die einzelnen Untereinheiten für den Glutamattransport verantwortlich sind, während der zentrale Kanal mit der Anionenleitfähigkeit assoziiert ist.

Unter pathophysiologischen Bedingungen wie Ischämie können die extra- und intrazelluläre Protonenkonzentration auf Werte von 6 μM ansteigen. Damit nimmt die Wahrscheinlichkeit zu, dass die Protonenbindungsstelle auf der zytosolischen Seite von EAAC1, die einen pK-Wert von ≤ 6,5 aufweist, protoniert ist und EAAC1 den Auswärtstransport von Glutamat katalysiert. Bei einer künstlich induzierten Energieunterversorgung konnte bereits nachgewiesen werden, dass ein großer Teil des extrazellulären Glutamats im synaptischen Spalt aus dem Auswärtstransport von Glutamattransportern stammt. D.h. die Inhibition der Glutamattransporter unter ischämischen Bedingungen hätte neuroprotektive Wirkung.

Glutamatneurotoxizität in Gehirnregionen nach Ischämie wird hauptsächlich durch den reversen Transport von neuronalen Glutamattransportern wie EAAC1 verursacht. Da Neuronen einen höheren Glutamatgehalt haben als Gliazellen, können sie mit einer höheren Wahrscheinlichkeit im „reverse mode" laufen und damit zum Anstieg der extrazellulären Glutamatkonzentration zu zytotoxischen Levels im synaptischen Spalt beitragen. Selektive Inhibitoren für neuronale Glutamattransporter wie EAAC1 können daher von therapeutischen Interesse sein, Glutamattransporter am „reverse transport mode" zu hindern, ohne damit gliale Glutamattransporter zu beeinflussen, um insgesamt den Anstieg der extrazellulären Glutamatkonzentration zu minimieren.

Für EAAC1 gibt es einen spezifischen Inhibitor, TBOA = DL-threo-α-Benzyloxyaspartat. Wird die Glutamataufnahme nach Freisetzung im ZNS inhibiert, wird dies wahrscheinlich nicht ohne Risiken sein, da Inhibitoren für Glutamattransporter Anfälle und Krämpfe auslösen können. Auf der anderen Seite sind die Glutamattransporter eine komplexe Familie mit 5 Subtypen. Es ist möglich, dass die selektive Inhibition eines oder mehrerer Mitglieder der Familie zu nützlichen Effekten, z. B. kognitive Verstärkung, mit geringen Risiken führen kann.

Ein Datenbankabgleich von EAAC1 mit bekannten Proteinsequenzen zeigt, dass eine Familie hochkonservierter Transportmoleküle in den unterschiedlichsten Vertebraten vorkommt, zu der EAAC1 zählt. Beispielsweise zeigt die entsprechende Aminosäuresequenz eine Übereinstimmung bei 383 von 447 Aminosäuren mit dem humanen EAAT3-Protein [Arriza, J.L. et al., „Functional comparisons of three glutamate transporter subtypes cloned from human motor cortex.", J. Neurosci. 14 (9), 5559-5569 (1994)].

Es sind aus einer großen Vielzahl weiterer Wirbeltiere ähnliche Proteine bekannt, denen ähnliche Funktionen zugeordnet werden.

Die Kenntnis der Möglichkeiten der Beeinflussung der Funktion und der Aktivität von Typ-EAAC1-Proteinen kann daher bei der Erkennung, Linderung und Heilung pathologischer Zustände und Krankheiten von großem Nutzen sein. Eine genaue Kenntnis der stofflichen und energetischen Bedingungen ist also wünschenswert, um regulierende Maßnahmen für die Steuerung des Glutamattransports durch EAAC1 bzw. den extrem nahe verwandten humanen Transportern wie z.B. EAAT3 auffinden zu können, und es wurden bereits verschiedene Untersuchungs- und Testmöglichkeiten ersonnen, um das Problem des Auffindens geeigneter Wirkstoffe wie Inhibitoren, Aktivatoren oder weiteren Modulatoren für Typ-EAAC1-Proteine und den damit im Zusammenhang stehenden Wirkortkomplex zu lösen.

Entsprechend sind im Stand der Technik unterschiedliche Verfahren und Messeinrichtungen bekannt, mit denen Eigenschaften bestimmter Wirkstoffe quantitativ und qualitativ analysiert und beschrieben werden können.

Auch ist es wünschenswert, vorgegebene und bekannte Wirkstoffe am Wirkortkomplex zu applizieren, z.B. am EAAC1-Protein, an einer Zelle, einem Gewebe oder dergleichen, um die Funktionsweise dieses Wirkortes zu beeinflussen und/oder zu untersuchen.

Übliche Experimente am Gesamtorganismus sind aufgrund der Komplexität der Organismen und ferner aufgrund ethischer und moralischer Umstände oft bedenklich, und die damit erzielten Ergebnisse haben eine nur beschränkte Aussagekraft.

Folglich wurden Verfahren und Einrichtungen entwickelt, mit deren Hilfe eine isolierte Betrachtung der Wirkungsweise zu testender Wirkstoffe auf isolierte Wirkzentren oder eine Untersuchung der Wirkzentren selbst möglich ist. Dabei werden bestimmte Gewebe, isolierte Zellen und/oder andere biologische Einheiten, zum Beispiel Proteine oder dergleichen, in isolierter Art und Weise einer Betrachtung zugänglich gemacht. Es sind zum Beispiel Techniken bekannt, die unter Verwendung von Farbstoffen oder radioaktiven Stoffen arbeiten und sich ändernde Transport- und/oder Bindungsspezifitäten ausnutzen und darstellen. Falls diese Vorgehensweise überhaupt möglich ist, ist sie aber dahingehend nachteilig, dass ihr oft nur ein geringes Auflösungsvermögen und eine hohe Fehleranfälligkeit zukommen.

Oft sind solche Methoden auch relativ unempfindlich.

Es sind ebenfalls elektrophysiologische Methoden bekannt, zum Beispiel die sogenannten Patch-Clamp-Technik oder Voltage-Clamp-Technik, bei welchen zum Beispiel Zellen isoliert einer elektrophysiologischen Untersuchung zugänglich sind. Bei diesem Vorgehen werden native Zellen unterschiedlichen Bedingungen ausgesetzt und es werden bestimmte elektrische Aktivitäten, die über die Zellmembran durch darin enthaltenen Proteine, Proteinkomplexe oder dergleichen vermittelt werden, gemessen.

Trotz der dabei erzielbaren hohen Genauigkeit sind diese bekannten elektrophysiologischen Methoden dahingehend nachteilig, dass sie aufgrund ihres hohen messtechnischen Aufwandes und ihrer Störanfälligkeit für einen schnellen, automatisierbaren und/oder breiten Einsatz ungeeignet sind und aufgrund der in der Regel nativen Umgebung der zu untersuchenden Objekte gewisse Probleme bei der Diskriminierung unerwünschter Signalanteile aufweisen. Darüberhinaus sind diese Methoden sehr kostenintensiv.

Ein besonders günstiges Verfahren zum Messen von elektrochemischen Vorgängen an beispielsweise Membranfragmenten wird in der WO 02/074983 beschrieben, auf die für die Zwecke der vorliegenden Anmeldung vollinhaltlich Bezug genommen wird. Eine Verwendung des dort offenbarten Verfahrens zur Testung an Typ-EAAC1-Proteinen wird nicht offenbart.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, einen Typ-EAAC1-Protein-Assay zu schaffen, bei welchem auf besonders einfache und gleichwohl zuverlässige Art und Weise eine rasche Wirkstofftestung, insbesondere im Massenbetrieb, unter vertretbaren Kosten möglich ist.

Gelöst wird diese und weitere Aufgaben, die sich zwanglos aus dem eingangs diskutierten Stand der Technik ergeben, durch ein Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes mit allen Merkmalen des Anspruchs 1.

Weiterhin sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Testkit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens gemäß Anspruch 20, ein Screeningverfahren gemäß Anspruch 21, sowie Verwendungen des Verfahrens und des Testkits gemäß den Ansprüchen 22 bzw. 23. Vorteilhafte Weiterbildungen sind Gegenstand der jeweiligen abhängigen Unteransprüche.

Im Transportzyklus von EAAC1 werden Natriumkationen und/oder Protonen zusammen mit Glutamat über die Membran verschoben und gegen ein Kaliumkation ausgetauscht. Der Erfindung liegt unter anderem die Idee zu Grunde, die glutamatabhängige Ladungsverschiebung – also den Ionentransport der Natriumkationen, Protonen und/oder Kaliumkationen – direkt durch Anbindung von Enzympräparationen auf einer geeigneten Oberfläche, die in ein Durchflusssystem integriert ist und/oder bei der ein Substratsprung durchgeführt werden kann, als elektrischen Strom oder als elektrische Potentialänderung zu messen und den Einfluss verschiedener Wirksubstanzen auf die elektrischen Messgrößen Strom oder Potenzial zu untersuchen.

Die Erfindung betrifft damit ein Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes; welcher eine enzymatische Eigenschaft und/oder das Transportverhalten eines Wirkortkomplexes, welcher einen Typ eines EAAC1-Proteins oder eines Teils davon enthält, modifiziert. Das erfindungsgemäße Verfahren weist folgende Schritte auf:

(a) Bereitstellen einer Mehrzahl Primärträger, welche den Wirkortkomplex enthaltend das Typ-EAAC1 Protein umfassen, insbesondere in einer Mehrzahl im Bereich einer Membran des jeweiligen Primärträgers enthalten,
(b) Anlagern oder In-Kontakt-Bringen der Primärträger am oder im Oberflächenbereich eines Isolationsbereichs einer als Sekundärträger dienenden Biosensorelektrode in einem Messmedium, wobei der Sekundärträger gegenüber dem Messmedium und gegenüber den Primärträgern mittels des Isolationsbereichs mechanisch und elektrisch isoliert ist oder wird,
(c) Bereitstellen mindestens eines potenziellen Wirkstoffkomplexes,
(d) In-Kontakt-Bringen und insbesondere In-Wechselwirkung-Bringen des potenziellen Wirkstoffkomplexes mit dem Wirkortkomplex der Primärträger oder Teilen davon, und
(e) Bestimmen des qualitativen und/oder quantitativen Einflusses des potenziellen Wirkstoffkomplexes oder eines Teils davon auf enzymatische Eigenschaften des Wirkortkomplexes oder eines Teils davon durch Detektieren einer elektrischen Aktion des oder am Wirkortkomplex oder eines Teils davon oder eine Änderung dieser elektrischen Aktion über die Biosensorelektrode als Sekundärträger,

dadurch gekennzeichnet, dass in den Verfahrensschritten (c), (d) und/oder (e) einer oder mehrere der folgenden Unterschritte durchgeführt werden:

(f) Einbringen des Sekundärträgers mit den Primärträgern in ein Ruhemedium und gegebenenfalls Detektieren einer elektrischen Aktion gemäß dem oder im Sinne von Verfahrensschritt (e),
(g) Einbringen des Sekundärträgers mit den Primärträgern in ein zweites nicht-aktivierendes Medium und gegebenenfalls Detektieren einer elektrischen Aktion gemäß dem oder im Sinne von Verfahrensschritt (e),
(h) Einbringen des Sekundärträgers mit den Primärträgern in ein drittes oder aktivierendes Messmedium und Detektieren einer elektrischen Aktion gemäß dem oder im Sinne von Verfahrensschritt (e), wobei das dritte oder aktivierende Medium dem zweiten oder nicht-aktivierenden Medium entspricht, jedoch zusätzlich ein Substrat des Typ-EAAC1-Proteins enthält.

Die erfindungsgemäßen Schritte (f), (g), (h) werden – ggf. mit Wiederholungen – bevorzugt in der vorgegebenen Reihenfolge durchgeführt.

Soll überprüft werden, ob ein potentieller Wirkstoff das Typ-EAAC1-Protein aktiviert/inhibiert, kann der potentielle Wirkstoff in allen Medien vorhanden sein.

Soll überprüft werden, ob ein potentieller Wirkstoff transportiert wird, sollte der potentielle Wirkstoff im aktivierenden Medium vorhanden sein, nicht jedoch im Ruhemedium bzw. im nicht-aktivierenden Medium.

Bevorzugt wird als Wirkortkomplex oder Teil davon ein Monomer oder ein Oligomer eines EARC1-Proteins verwendet.

Ferner ist es vorgesehen, dass ein Wirkortkomplex oder ein Teil davon verwendet wird, welcher auf einem Typ-EAAC1-Protein basiert, die aus einem Gewebe eines Säugetiers stammt, z.B. aus dem Hirn, dem Darm oder der Niere, oder hieraus abgeleitet ist.

Insbesondere stammt das Typ-EAAC1-Protein aus Säugetierzelllinien, und liegt kloniert vor.

In vorteilhafter Weise ist es vorgesehen, dass der Wirkortkomplex (enthaltend das Typ-EAAC1-Protein) aus dem Organismus Schwein, Maus, Schaf oder Mensch stammt oder aus diesen genetisch abgeleitet wird.

Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck „enzymatische Eigenschaft" des Typ-EAAC1-Proteins gleichzeitig auch immer das Transportverhalten, z.B. den durch diese Proteine vermittelten Aminosäuretransport, und nimmt damit auch immer Bezug auf den eingangs diskutierten Einfluss des Proteins auf die Bioverfügbarkeit potentieller Wirkstoffe. Dies bedeutet, daß wo immer von der Modifizierung der enzymatischen Eigenschaften des Proteins die Rede ist, auch Untersuchungen erfindungsgemäß mit umfasst sind, die zeigen sollen, ob ein bestimmter Stoff vom Typ-EAAC1-Protein transportiert wird.

Erfindungsgemäß werden wässrige Messlösungen und insbesondere wässrige Elektrolytlösungen als Messlösung (= Messmedium) verwendet, die als Ruhemedium, nicht-aktivierende sowie aktivierende Lösung bezeichnet werden.

Alle verwendenten Messlösungen enthalten ein dem Fachmann bekanntes pH-Wert stabilisierendes Mittel bevorzugt ausgewählt aus der Liste: MOPS, HEPES, MES, Tris, PIPES u.a., wie sie z.B. in „Buffers, Calbiochem" veröffentlicht sind, aber auch mit Leichtigkeit weiteren Veröffentlichungen und Lehrbüchern der Biochemie bzw. der organischen Chemie entnommen werden können. Erfindungsgemäß sollen diese an sich bekannten Mittel im Bereich von pH 6-8, bevorzugt etwa 7 stabilisierend wirken. Die Wahl des geeigneten pH-Bereichs und Mittels kann dabei vom Substrat (Wirkstoffkomplex) abhängen und vom Fachmann durch Routineexperimente leicht ermittelt werden.

Erfindungsgmäß ist es möglich, die Verfahrensschritte (c) und/oder (d), gegebenenfalls auch (f) bis (h) mittels

– Zumischen oder Injizieren des Wirkstoffkomplexes, eines Teils und/oder einer Vorstufe davon,
– Austauschen oder Zumischen des Messmediums oder eines Teils davon und/oder
– chemisches oder physikalisches Umsetzen oder Reagieren des Messmediums oder eines Teils davon oder des Wirkstoffs, eines Teils und/oder einer Vorstufe davon

durchzuführen.

Das bedeutet, dass zum einen der Wirkstoffkomplex oder ein Teil davon direkt durch Injizieren oder Beimischen in das Messmedium hinein zum Ort des Wirkortkomplexes transportiert werden kann. Besonders einfach gestaltet sich jedoch ein derartiger Vorgang, wenn einfach das jeweilige Messmedium ausgetauscht wird, beispielsweise in kontinuierlicher Art und Weise. Des Weiteren ist es denkbar, dass der Wirkstoff erst durch ein chemisches oder physikalisches Umsetzen oder Reagieren im Messmedium freigesetzt wird. Dies kann zum Beispiel auch durch Zuführen von Strahlung erfolgen.

Der qualitative Einfluss und/oder der quantitative Einfluss des potenziellen Wirkstoffes oder Wirkstoffkomplexes wird erfindungsgemäß durch Detektieren einer elektrischen Aktion bestimmt, welche durch den Wirkortkomplex oder einen Teil davon und insbesondere durch das Typ-EAAC1-Protein vermittelt wird.

Insbesondere wird diese elektrische Aktion mit und ohne potentiellen Wirkstoff bestimmt, und durch Vergleichen beider Meßreihen wird untersucht, ob der potentielle Wirkstoff Einfluss nimmt auf die enzymatischen Eigenschaften des Typ-EAAC1-Proteins.

Wie in der WO02/074983 beschrieben werden die Primärträger mit den Wirkortkomplexen an einem Sekundärträger, nämlich der Biosensorelektrode und insbesondere mit deren Isolationsbereich in Kontakt gebracht und dort insbesondere angelagert.

Bei der Ausgestaltung der Biosensorelektrode als Sekundärträger bestehen vielfältige Möglichkeiten.

Es wird aber besonders bevorzugt, dass eine Biosensorelektrode als Sekundärträger verwendet wird, bei welcher ein elektrisch leitfähiger und festkörperartiger Elektrodenbereich mit mindestens einer Elektrode vorgesehen wird, welcher gegenüber dem Messmedium und gegenüber den Primärträgern elektrisch und mechanisch isoliert wird durch Vorsehen eines Isolationsbereichs in Form einer festkörperunterstützten Membran, welche schichtartig aufgebaut wird aus einer Unterschicht einer organischen Thioverbindung als unterster und der Elektrode jeweils zugewandter Schicht und aus einer Oberschicht einer amphiphilen organischen Verbindung.

Bei einer bevorzugten Ausgestaltungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es vorgesehen, dass eine Biosensorelektrode als Sekundärträger verwendet wird, bei welcher eine Elektrode aus Gold im Elektrodenbereich vorgesehen wird mit einer Monoschicht eines langkettigen Alkanthiols als Unterschicht darauf und einer Monoschicht eines Lipids als Oberschicht darauf.

Im Hinblick auf die Primärträger, welche den Wirkortkomplex und insbesondere die Typ-EAAC1-Proteine im Bereich ihrer Membran enthalten sollen, ergeben sich unterschiedliche Möglichkeiten, wobei der jeweiligen Zielsetzung des Verfahrens Rechnung getragen werden kann.

Zum Beispiel bietet es sich gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens an, dass als Primärträger jeweils eine eukariontische Zelle, eine prokariontische Zelle, insbesondere ein Oozyt, ein Bakterium, ein Virus, eine Organelle oder Bestandteile hiervon, insbesondere Membranfragmente, oder Verbände davon in nativer Form und/oder in abgewandelter Form, insbesondere in gereinigter und/oder modifizierter Form, verwendet wird.

Es ist auch möglich, dass als Primärträger jeweils ein Vesikel, ein Liposom oder eine mizelläre Struktur verwendet wird. Die Membranfragmente können sich auch planar anlagern, d.h. als nicht-sphärische Struktur.

Besonders vorteilhaft gestaltet sich das erfindungsgemäße Verfahren dann, wenn die Sensoranordnung aus Biosensorelektrode als Sekundärträger und daran angelagerten Primärträgern in einem Messraum, Messbereich oder Messgefäß vom Messmedium umströmt oder angeströmt wird. Auf diese Art und Weise lässt sich durch Wechsel des Messmediums zum Beispiel ein Konzentrationssprung im Hinblick auf den Wirkstoffkomplex oder eines Teils davon leicht realisieren. Auch lassen sich durch ein derartiges Messen im Rahmen eines Fließsystems vorteilhaft auf leichte Art und Weise und zuverlässig mit hoher Zeitauflösung die erfindungsgemäßen Versuchsbedingungen einstellen. Auch mithilfe einer automatisierten Pipettiervorrichtung kann das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhaft durchgeführt werden.

Besonders ökonomisch und für eine statistische Auswertung zugänglich gestaltet sich das erfindungsgemäße Verfahren dann, wenn aufeinanderfolgend eine Mehrzahl von Tests durchgeführt wird, insbesondere durch aufeinanderfolgendes Austauschen des Messmediums, ggf. mit zwischengeschaltetem Waschen oder Spülen des Messraums.

Wichtig ist bei dem vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahren das Vergleichen der Aktion des Wirkortkomplexes bei vorliegendem Wirkstoffkomplex mit einer Situation, bei welcher der potenzielle Wirkstoffkomplex nicht zugegen ist. Dies kann beispielsweise geschehen durch den Wechsel zwischen nicht-aktivierendem zu aktivierendem Medium in Gegenwart oder Abwesenheit des potentiellen Wirkstoffkomplexes und Vergleich der erhaltenen Messwerte.

Potentielle zu testende Wirkstoffe sind insbesondere bevorzugt monoklonale Antikörper, Antikörperfragmente, polyklonale Antikörper und Peptide. Es können jedoch auch andere Substanzen, von denen vermutet wird, daß sie eine entsprechende Wirkung entfalten können, zugesetzt werden. Diese Substanzen werden vorzugsweise in gelöster Form verabreicht.

Besonders bevorzugte Substanzen, die als Testsubstanzen in dem erfindungsgemäßen Testsystem untersucht werden können, sind niedermolekulare Verbindungen. Solche Verbindungen haben oft keine oder nur geringe Nebenwirkungen, wenn sie als aktives Prinzip in einer pharmazeutischen Zusammensetzung eingesetzt werden. Ein weiterer Vorteil solcher Substanzen ist die Möglichkeit der oralen Verabreichung.

Beispiele hierfür sind cyclische Pentapeptide, wie sie von Haubner et. al., J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 7641-7472, beschrieben wurden. Erfindungsgemäß werden den niedermolekularen Stoffen kleine Peptide, Aminosäuren und Aminosäureanaloga, Steroide, Nukleotide und weitere organisch-chemische Stoffe mit einem Molekulargewicht von ≤ 5000, bevorzugt ≤ 3000 und besonders bevorzugt ≤ 2000 zugerechnet.

Es kann der Wirkstoffkomplex sowohl im Ruhemedium, im nicht-aktivierenden als auch im aktivierenden Medium zugesetzt oder dort freigesetzt werden.

Auch ist als Zwischenschritt eine Inkubation der Wirkortkomplexe oder der sie tragenden Primärträger mit dem Wirkstoffkomplex denkbar.

Des Weiteren ist es denkbar, dass zwischen den Schritten (f) und (h) ein Waschschritt durchgeführt wird durch Einbringen des Sekundärträgers mit den Primärträgern in ein viertes und [Wasch]Medium, welches bevorzugt mit dem nicht-aktivierenden Medium identisch ist.

Ferner ist es denkbar, dass direkt vor dem Schritt (h) bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens der Schritt (f) wiederholt durchgeführt wird.

Es ist bevorzugt, wenn der Schritt (f) vor Beginn der eigentlichen Messreihe, d.h. bevor zum erstenmal die Schritte (g) und (h) durchgeführt werden, für mindestens 5 Minuten (min), bevorzugt für mindestens 10 min, besonders bevorzugt für mindestens 15 min, nach mehr bevorzugt für mindestens 20 min und insbesondere bevorzugt für mindestens 30 min durchgeführt wird. Die Schritte (g) und (h) werden erfindungsgemäß für mindestens 0,5 Sekunden (s), höchstens jedoch 5 s und bevorzugt für etwa 1-2 s durchgeführt. Nach der erstmaligen Durchführung der Schritte (g) und (h) wird Schritt (f) für mindestens 1 s bis höchstens 120 s durchgeführt, bevorzugt für mindestens 30 s bis 90 s, und besonders bevorzugt für 50 s bis 70 s.

Die Abk. „M", „mM" und „μM" stehen im Folgenden für die Einheit mol/l, mmol/l bzw. μmol/l. Das Ruhemedium umfasst Kaliumionen in Konzentrationen, die bevorzugt in etwa so hoch sind wie die Natrium Konzentration im nicht-aktivierenden und im aktivierenden Medium. Beispielsweise kann diese Kanzentration zwischen 1 μM und 1 M liegen, bevorzugt 10-200 mM, ganz besonders bevorzugt zwischen 120 mM und 160 mM.

Das nicht-aktivierende Medium enthält Natriumionen in Konzentrationen, die bevorzugt in etwa den Konzentrationen der Kaliumionen im jeweils verwendeten Ruhemedium entsprechen.

Das aktivierende Medium enthält Natriumionen in Konzentrationen, die bevorzugt in etwa den Konzentrationen der Kaliumionen im jeweils verwendeten Ruhemedium und/oder im nicht aktivierenden Medium entsprechen.

Desweiteren enthält es ein Substrat des EAAC1-Proteins, bevorzugt Glutamat. Weitere mögliche Substrate sind D- und L-Aspartat. Die Konzentration kann je nach Anwendung schwanken. Bei Kompetetionsuntersuchungen kann Glutamat im μM Bereich eingesetzt werden, z.B. 1-100 μM. Bei wirkstofftestungen auf Aktivierung und/oder Inhibierung des TYP-EAAC1-Proteins kann auch eine Konzentration im mM-Bereich sinnvoll sein, also etwa 0,1 bis 10 mM, bevorzugt etwa 1 mM.

Die entsprechenden Konzentrationen können vom Fachmann leicht ermittelt werden.

Generell ist es bevorzugt, wenn nicht-aktivierende und aktivierende Medien Kalium frei sind. Allerdings ist eine Konzentration von bis zu 20 mM Kalium vertretbar, und bei Verwendung einer automatisierten Pipettiervorrichtung auch gar nicht vermeidbar, da hier eine Entfernung des Ruhemediums nicht möglich ist.

Es ist weiterhin bevorzugt, wenn in den erfindungsgemäßen Messlösungen Mg++ in einer Konzentration von > 0-5 mM vorhanden ist.

Des Weiteren schafft die vorliegende Erfindung einen Testkit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes. Dieser Testkit weist auf:

– mindestens einen Primärträger mit dem Typ-EAAC1-Protein,
– einen Messbereich,
– gegebenenfalls das erfindungsgemäße Ruhemedium, das nicht-aktivierende Medium sowie das aktivierendes Medium und
– weiterhin gegebenenfalls mindestens einen potenziellen Wirkstoffkomplex.

Erfindungsgemäß wird gemäß Anspruch 21 auch ein Screeningverfahren zum Identifizieren geschaffen, und zwar zum Identifizieren:

– eines unbekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, eines Teils und/oder Derivats davon,
– des Vorhandenseins eines unbekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils und/oder Derivats davon,
– des Vorhandenseins eines bekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils und/oder Derivats davon,
– der Konzentration eines unbekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils und/oder Derivats davon,
– der Konzentration eines bekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils und/oder Derivats davon.

Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird das erfindungsgemäße Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes verwendet zum Auffinden von Inhibitoren, Aktivatoren, partiellen oder temporären Inhibitoren oder Modulatoren einer enzymatischen Eigenschaft eines Wirkortkomplexes, welcher ein Typ-EAAC1-Protein enthält, und insbesondere ein humanes EAAT3-Protein.

Des Weiteren wird das erfindungsgemäße Testkit erfindungsgemäß verwendet zum Auffinden von Inhibitoren, Aktivatoren, partiellen oder temporären Inhibitoren oder Modulatoren eines einen Typ eines EAAC1-Proteins enthaltenden Wirkortkomplexes und insbesondere ein humanes EAAT3-Protein.

Auf der Grundlage der nachfolgenden Bemerkungen werden die voranstehenden und weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung mit anderen Worten weiter erläutert:
Darüber hinaus ist ein z. B. wässriges Messmedium vorgesehen, in welchem die Primärträger und die Sekundärträger angeordnet werden. Der Elektrodenbereich wird gegenüber dem Messmedium, den Primärträgern und gegenüber den biologischen Einheiten bevorzugt weitestgehend elektrisch isoliert.

Der Elektrodenbereich besitzt z.B. mindestens eine Elektrode. Diese kann zum einen jeweils selbst als mechanisch stabiler Materialbereich ausgebildet sein, insbesondere als Platte, als Draht und/oder dergleichen.

Eine besonders einfache Anordnung der Sensorelektrodeneinrichtung ergibt sich, wenn die Elektrode im Wesentlichen als auf der Oberfläche des Trägers abgeschiedene Materialschicht ausgebildet ist. Es kann sich dabei um eine aufgedampfte oder gesputterte Materialschicht handeln. Die Materialschicht zur Ausbildung der Elektrode hat vorzugsweise eine Schichtstärke von etwa 10 bis 200 nm.

Das Typ-EAAC1-Protein kann jeweils in im Wesentlichen nativer Form und/oder in abgewandelter, insbesondere gereinigter, mikrobiologisch und/oder molekularbiologisch geänderter Form vorgesehen sein. Zum einen können dadurch bestimmte native Eigenschaften getestet und pharmakologisch untersucht werden. Andererseits bieten sich auch molekularbiologische oder gentechnisch initiierte Veränderungen an, die bestimmten Aspekte, zum Beispiel des Transports oder der pharmakologischen Wirkungsweise eines Wirkstoffes zu analysieren.

Besonders vorteilhaft ist es, dass Primärträger eines jeweils im Wesentlichen einheitlichen Typs von Primärträgern vorgesehen werden. Dies ist im Hinblick auf eine möglichst eindeutige Aussage und Analyse eines Wirkstofftests von Bedeutung und bezieht sich auf die geometrischen, physikalischen, chemischen, biologischen und molekularbiologischen Eigenschaften der Primärträger.

Das Nämliche gilt auch für die in dem Primärträger vorgesehenen Wirkortkomplexe und das Typ-EAAC1-Protein. Hier sind Wirkortkomplexe und Typ-EAAC1-Protein eines jeweils im Wesentlichen einheitlichen Typs vorgesehen, insbesondere im Hinblick auf ihre geometrischen, physikalischen, chemischen, biologischen und molekularbiologischen Eigenschaften. Zusätzlich sollen die biologischen Einheiten in vorteilhafter Weise im Hinblick auf ihre Orientierung und/oder im Hinblick auf ihre Aktivierbarkeit in Bezug auf den jeweiligen Primärträger in etwa einheitlich sein.

Wie bereits ausgeführt, liegt der Erfindung unter anderem die Aufgabe zu Grunde, die Wirkung von Substanzen auf die Funktion von Typ-EAAC1-Proteinen einer Untersuchung zugänglich zu machen. Substanzen, welche die Wirkung dieses Transportproteins modulieren, sind als potentielle neuroprotektive Wirkstoffe von gewerblichem Interesse. Auch wären Substrate des Proteins, die von diesem transportiert werden, u.U. wichtige neue Moleküle.

Das erfindungsgemäße Vorgehen bietet folgende Vorteile:
Die Messung der Enzymaktivität gemäß dem erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahren bedarf keiner Vermittler oder markierten Substrate. Eine Einzelmessung dauert lediglich wenige Sekunden. Die Messung ist sensitiv gegenüber allen Substraten. Sofern eine Substanz die Reaktion nicht irreversibel inhibiert, können mit einem mit Enzym beladenen Sensor mehrere Messungen durchgeführt werden. Substrate müssen nicht chemisch modifiziert vorliegen, da die Stromantwort oder Potentialantwort des Proteins durch einen schnellen Lösungswechsel induziert wird.

Darüber hinaus ist im Gegensatz zu der Patch-Clamp-Technik ein höherer Durchsatz möglich.

BEISPIEL 1 Herstellung des EAAC1-Sensorchips
10μl einer Membransuspension (Proteinkonzentration ca. 2-3 mg ml^–1) aus einer CHO-Plasmamembranpräparation wurden auf einen vorbehandelten Sensorchip mit einer runden Goldelektrode (3 mm Durchmesser, erhältlich von IonGate Biosciences GmbH, Frankfurt am Main) aufgetragen und über Nacht im Kühlschrank (bei < 8°C) inkubiert.
Die Kapazität der proteinbeladenen Membranen lag bei ca. 1000 nF cm^–2, die Leitfähigkeit G_ls bei ca. 10 nS cm^–2.
BEISPIEL 2 Aktivitätsmessung ohne Inhibitor
Die Durchflusszelle eines SurfE²R-Systems (IonGate Biosciences GmbH, Frankfurt am Main) mit integriertem proteinbeladenen Sensorchip wurde zunächst mit Ruhemedium (siehe oben) durchspült. Danach folgte das nicht-aktivierende Medium (140 mM NaCl, 2 mM MgCl₂, 30 mM Hepes-NaOH pH 7, 2mM DTT) und mittels elektromechanischem 3/2-Wegeventil wurde anschließend auf aktivierende Medium (140 mM NaCl, 2 mM MgCl₂, 30 mM Hepes-NMG pH 7, 2mM DTT + 10-1000μM Na-Glutamat) umgestellt.
BEISPIEL 3 Aktivitätsmessung mit Cholinchlorid
Die Messungen wurden wie oben durchgeführt, allerdings wurden bei den beiden Lösungen aktivierende und nicht aktivierende das Co-Substrat Natrium durch Cholin ersetzt.
1 zeigt schematisch die Topologie eines Typs einer EAAC1-Einheit.
2 zeigt in Form eines Graphen schematisch den durch das EAAC1-Protein hervorgerufenen Transportstrom I(t) als durch die Biosensorelektrode messbare elektrische Aktion. Die Abszisse bezeichnet jeweils die Zeit t, wobei t = 0 denjenigen Zeitpunkt angibt, bei welchem das Medium von einem nicht-aktivierendem zu einem aktivierendem gewechselt wird. D.h., ab t = 0 ist das Substrat Glutamat in Form von Natriumglutamat, welches vor t = 0 fehlte, im Messmedium vorhanden. Dadurch wird der elektrische Strom als Strom transportierter Ionen manifest, welcher auf der Ordinate aufgezeichnet ist. Die Ordinate bezeichnet also den gemessenen elektrischen Strom I(t), als Funktion der Zeit t, welcher über die Biosensorelektrode gemessen wird. Die Spur A der 2 zeigt eine Messung, bei welcher die EAAC1-Protein 12 durch Glutamat-Zugabe zum Zeitpunkt t = 0 normal aktiviert wird. Unter Glutamattransport werden mittels des EAAC1-Proteins 12 Ionen über die Primärträger 10, z.B. über Membranfragmente oder Vesikel, Protonen auf die Biosensormembran und deren Elektrode zu bewegt. Dies wird am positiven elektrischen Messstrom I(t) erkennbar.
Die Spur B der 2 zeigt die gleiche Messung, wobei aber statt Natriumchlorid in der Messlösung 30 – der nicht aktivierenden wie der aktivierenden – Cholinchlorid zu Grunde liegt. Trotz Aktivierung durch Anwesenheit von Glutamat ab dem Zeitpunkt t = 0 ist kein merklicher Strom I(t) messbar. Dadurch ist gezeigt, dass der gemessene elektrische Strom aus der Spur A den Transportstrom repräsentiert.
Grundsätzliche Vorteile der vorliegenden Erfindung sind die hohe mechanische Stabilität der vorgesehenen Sensoranordnung und damit einhergehend die große Einsatzbereitschaft, die einfache Handhabbarkeit und geringer Störanfälligkeit. In der Verwendung der Sensoranordnung ergeben sich im Rahmen von pharmakologischen Wirkstofftests eine lange Lebensdauer, eine hohe Zuverlässigkeit, eine geringe Störanfälligkeit sowie insbesondere ein gegenüber herkömmlichen Verfahren maßgeblich gesteigerter Testdurchsatz, wodurch entsprechende Testverfahren kostengünstig ausgearbeitet und durchgeführt werden können.

Claims

Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes, welcher eine enzymatische Eigenschaft eines Wirkortkomplexes modifiziert, welcher einen Typ eines EAAC1-Proteins enthält, mit den Schritten: (a) Bereitstellen einer Mehrzahl Primärträger, welche den das Typ-EAAC1-Protein enthaltenden Wirkortkomplex in einer Mehrzahl im Bereich einer Membran des jeweiligen Primärträgers enthalten, (b) Anlagern oder In-Kontakt-Bringen der Primärträger am oder im Oberflächenbereich eines Isolationsbereichs einer als Sekundärträger dienenden Biosensorelektrode in einem Messmedium, wobei der Sekundärträger gegenüber dem Messmedium und gegenüber den Primärträgern mittels des Isolationsbereichs mechanisch und elektrisch isoliert ist oder wird, (c) Bereitstellen mindestens eines potenziellen Wirkstoffkomplexes, (d) In-Kontakt- und In-Wechselwirkung-Bringen des potenziellen Wirkstoffkomplexes mit dem Wirkortkomplex der Primärträger oder Teilen davon und (e) Bestimmen des qualitativen oder quantitativen Einflusses des potenziellen Wirkstoffkomplexes oder eines Teils davon auf enzymatische Eigenschaften des Wirkortkomplexes oder eines Teils davon durch Detektieren einer elektrischen Aktion des Wirkortkomplexes oder eines Teils davon oder Änderung der elektrischen Aktion über die Biosensorelektrode als Sekundärträger, wobei in mindestens einem der Verfahrensschritte (c), (d) und (e) ein oder mehrere der folgenden Unterschritte durchgeführt werden; (f) Einbringen des Sekundärträgers mit den Primärträgern in ein Ruhemedium und Detektieren einer elektrischen Aktion gemäß dem oder im Sinne von Verfahrensschritt (e), (g) Einbringen des Sekundärträgers mit den Primärträgern in ein zweites nicht-aktivierendes Medium und Detektieren einer elektrischen Aktion gemäß dem oder im Sinne von Verfahrensschritt (e), (h) Einbringen des Sekundärträgers mit den Primärträgern in ein drittes oder aktivierendes Messmedium und Detektieren einer elektrischen Aktion gemäß dem oder im Sinne von Verfahrensschritt (e), wobei das dritte oder aktivierende Medium dem zweiten oder nicht-aktivierenden Medium entspricht, jedoch zusätzlich ein Substrat des Typ-EAAC1-Proteins enthält, wobei als nicht-aktivierendes Medium ein Medium mit 140 mmol/l NaCl, 2 mmol/l MgCl₂, 30 mmol/l Hepes-NaOH pH 7, 2 mmol/l DTT verwendet wird und wobei als aktivierendes Medium ein Medium mit 140 mmol/l NaCl, 2 mmol/l MgCl₂, 30 mmol/l Hepes-NMG pH 7, 2 mmol/l DTT und 10 bis 1000 μmol/l Na-Glutamat verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem eine Biosensorelektrode als Sekundärträger verwendet wird, bei welcher ein elektrisch leitfähiger und festkörperartiger Elektrodenbereich mit mindestens einer Elektrode vorgesehen wird, welcher gegenüber dem Messmedium und gegenüber den Primärträgern bevorzugt elektrisch und mechanisch isoliert wird durch Vorsehen eines Isolationsbereichs in Form einer festkörperunterstützten Membran, welche schichtartig aufgebaut wird aus einer Unterschicht einer organischen Thioverbindung als unterster und der Elektrode jeweils zugewandten Schicht und aus einer Oberschicht einer amphiphilen organischen Verbindung.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem eine Biosensorelektrode als Sekundärträger verwendet wird, bei welcher eine Elektrode aus Gold im Elektrodenbereich vorgesehen wird mit einer Monoschicht eines langkettigen Alkanthiols als Unterschicht darauf und einer Monoschicht eines Lipids als Oberschicht darauf.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem eine Biosensorelektrode als Sekundärträger verwendet wird, bei welcher der eine Elektrode der Biosensorelektrode als Sekundärträger abdeckende Bereich des Isolationsbereichs als Membranstruktur nach Art einer festkörperunterstützten Doppelschichtmembran oder Bilayermembran ausgebildet wird oder ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem als Primärträger jeweils eine eukaryontische Zelle, eine prokaryontische Zelle, ein Oozyt, ein Bakterium, ein Virus, eine Organelle oder Bestandteile, Membranfragmente oder Verbände davon in nativer Form oder in abgewandelter Form, in gereinigter, mikrobiologisch oder molekularbiologisch geänderter Form verwendet wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem als Primärträger jeweils ein Vesikel, ein Liposom oder eine mizelläre Struktur verwendet wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem ein Typ-EAAC1-Protein verwendet wird, welcher auf dem EAAC1-Protein basiert, die aus einem Gewebe eines Säugetiers, bevorzugt Hirn, Darm oder Niere, stammt oder genetisch aus diesem abgeleitet wird oder ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem das Typ-EAAC1-Protein aus dem Organismus Schwein, Maus, Schaf oder Mensch stammt oder aus diesem genetisch abgeleitet wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem das Typ-EAAC1-Protein zumindest zum Teil im Primärträger eine Membran durchspannend ausgebildet oder verwendet ist oder wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem als elektrische Aktion verwendet wird ein durch den Wirkortkomplex oder einen Teil davon erzeugter elektrischer Strom oder ein davon erzeugtes elektrisches Potenzial, welches jeweils erzeugt werden durch Ladungs- oder Stofftransport oder -verschiebung, Konformationsänderungen, Ligandenbindung, -anlagerung oder -freigabe, oder einer Kombination davon.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem als enzymatische Eigenschaft verwendet wird: – die Bindung, Anlagerung oder Freigabe des Wirkstoffkomplexes oder eines Teils davon oder des Messmediums oder eines Teils davon, – der Transport oder die Verschiebung des Wirkstoffkomplexes oder eines Teils davon oder des Messmediums oder eines Teils davon, – die chemische Umsetzung oder Reaktion des Wirkstoffkomplexes oder eines Teils davon oder des Messmediums oder eines Teils davon, – eine Konformationsänderung oder Bewegung des Wirkortkomplexes oder eines Teils davon oder – eine beliebige Kombination dieser Prozesse.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem als Messmedium ein wässriges Messmedium oder eine wässrige Elektrolytlösung verwendet wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem mindestens einer der Verfahrensschritte (c) und (d) d – Zumischen oder Injizieren des Wirkstoffkomplexes, eines Teils oder einer Vorform davon, – Austauschen des Messmediums oder eines Teils davon oder – chemisches oder physikalisches Umsetzen oder Reagieren des Messmediums oder eines Teils davon oder des Wirkstoffkomplexes, eines Teils oder einer Vorform davon.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem eine Sensoranordnung aus Biosensorelektrode als Sekundärträger und daran angelagerten Primärträgern in einem Messraum, Messbereich oder Messgefäß vom Messmedium umströmt oder angeströmt wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem aufeinanderfolgend eine Mehrzahl von Tests durchgeführt wird durch aufeinanderfolgendes Austauschen des Messmediums, gegebenenfalls mit zwischengeschaltetem Waschen oder Spülen des Messraums.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei welchem zwischen den Schritten (g) und (h) ein Waschschritt durchgeführt wird durch Einbringen des Sekundärträgers mit den Primärträgern in ein viertes oder Waschmedium.
Verfahren nach einem der der vorstehenden Ansprüche, bei welchem direkt vor dem Schritt (h) der Schritt (f) wiederholt durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem das erste oder Ruhemedium – K⁺ – gegebenenfalls Mg⁺⁺, – pH 6-8, besonders bevorzugt etwa 7, das zweite oder nicht-aktivierende Medium – Na⁺, – gegebenenfalls Mg⁺⁺, – pH 6-8, besonders bevorzugt etwa 7, und das dritte oder aktivierende Medium – Na⁺, – gegebenenfalls ^Mg++, – pH 6-8, besonders bevorzugt etwa 7, – enthält, sowie – ein Substrat des Typ-EAAC1-Proteins, bevorzugt Glutamat zwischen 1 μmol/l und 10 mmol/l enthält.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem als Messmedium und insbesondere als zweites oder nicht-aktivierendes Medium oder als drittes oder aktivierendes Medium Medien mit Glutamat oder mit Natriumglutamat verwendet werden mit einer Konzentration von etwa 1 μmol/l bis 10 mmol/l.
Testkit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 19, mit: – mindestens einem Primärträger, – einem Messbereich, – einem ersten oder Ruhemedium, einem zweiten oder nicht-aktivierenden Medium, einem dritten oder aktivierenden Medium zur Aufnahme eines potenziellen Wirkstoffkomplexes und – weiterhin mindestens einem potenziellen Wirkstoffkomplex.
Screeningverfahren zum Identifizieren: – eines unbekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils oder Derivats davon, – des Vorhandenseins eines unbekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils oder Derivats davon, – des Vorhandenseins eines bekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils oder Derivats davon, – der Konzentration eines unbekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils oder Derivats davon, – der Konzentration eines bekannten Wirkstoffes, Wirkstoffkomplexes, Teils oder Derivats davon oder – einer beliebigen Kombination der zuvor genannten Größen oder Eigenschaften durch Verwenden eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 19 und/oder des Testkits gemäß Anspruch 20, wobei der Wirkstoff, der Wirkstoffkomplex, der Teil oder das Derivat davon eine enzymatische Eigenschaft eines Wirkortkomplexes, welcher einen Typ eines EAAC1-Proteins oder eines humanen EAAC1-Proteins enthält, oder eines Teils davon modifiziert.
Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 19, zum Auffinden von Inhibitoren, partiellen oder temporären Inhibitoren, Aktivatoren oder Modulatoren einer enzymatischen Eigenschaft eines Wirkortkomplexes, welcher einen Typ eines EAAC1-Proteins oder eines humanen EAAC1-Proteins enthält.
Verwendung des Testkits gemäß Anspruch 20, zum Auffinden von Inhibitoren, Aktivatoren, partiellen oder temporären Inhibitoren oder Modulatoren einer enzymatischen Eigenschaft eines Wirkortkomplexes, welcher einen Typ eines EAAC1-Proteins oder eines humanen EAAC1-Proteins enthält.