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Die Erfindung betrifft einen H+-K+-ATPase-Assay
und insbesondere ein Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes,
welcher eine enzymatische Eigenschaft eines Wirkortkomplexes modifiziert,
welcher einen Typ eines H+-K+-ATPase-Proteins
enthält.
Die Erfindung betrifft ferner einen Wirkstoffkomplex, der gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren
identifiziert ist oder wurde, ein Verfahren zum Herstellen eines
Arzneimittels, einen Testkit zum Durchführen des erfindungsgemäßen Verfahrens, ein
Screeningverfahren sowie die Verwendungen des erfindungsgemäßen Verfahrens,
des erfindungsgemäßen Testkits
sowie des Arzneimittels.
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Der Säugetiermagen und insbesondere
der Magen des Menschen besitzen mehrere Funktionen. Zunächst nimmt
der Magen zerkaute und geschluckte Speisen auf, sezerniert Magensaft,
welcher sich mit dem Mageninhalt vermischt und ihn chemisch verändert. Des
Weiteren wird der Mageninhalt physikalisch zerkleinert und nach
weiteren chemischen und physikalischen Umwandlungsvorgängen zur weiteren
Verdauung und Resorption in den Bereich des Duodenums überführt.
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Der Magen des Menschen sezerniert
täglich etwa
2 bis 3 Liter Magensaft in das Lumen. Dieser Magensaft enthält Ionen,
Makromoleküle,
Schleim und insbesondere – neben
bestimmten Hormonen – Säure. Die
Säure des
Magens wird im Wesentlichen gebildet von Chlorwasserstoffsäure oder
HCl und führt
zu einer bemerkenswerten Wasserstoffionenkonzentration des Magensafts
im Bereich von pH = 1. Die Magensäure dient der Denaturierung
von Eiweißen
unter Aktivierung von Pepsinogen zu Pepsin zur Hydrolyse der Eiweiße. Zusätzlich wirkt
der niedrige pH-Wert bakterizid.
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Die Magensäure wird von den sogenannten Belegzellen
oder Parietalzellen der Mucosa oder Schleimhaut des Magens in das
Lumen des Magens abgegeben. Aufgrund der physiologischen Bedeutung
der Magensäure
für den
Verdauungsvorgang besteht seit langem ein In teresse daran, den endogen
aufgrund von Krankheit oder exogen aufgrund von Stress oder anderen
Umweltbedingungen abnormal sich entwickelnden Sezernierungsvorgang
der Säure
untersuchen oder gar steuern zu können.
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Bekannt ist, dass bei der Sezernierung
von Salzsäure
oder Chlorwasserstoffsäure
im Magen die sogenannte H+-K+-ATPase
wesentlich ist. Diese transportiert Protonen H+ aus
der Belegzelle der Magenschleimhaut in das Magenlumen und führt dabei zu
einer Aufnahme von Kaliumkationen K+ aus
dem Magenlumen in die Belegzelle hinein. Durch die H+-K+-ATPase wird ein aktiver Transportprozess
gegen einen bestehenden Ionengradienten vermittelt. Dieser Prozess
erfordert Energie, welche aus der Hydrolyse von Adenosintriphosphat
ATP zu Adenosindiphosphat ADP unter Abspaltung anorganischen Phosphats
Pi gewonnen wird: ATP → ADP + Pi.
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Gegebenenfalls ist die H+-K+-ATPase in einen übergeordneten Wirkortkomplex
integriert. Dies kann eine Anordnung mehrerer H+-K+-ATPase-Proteinmoleküle zu einem
Oligomer sein. Es können
aber auch andere, ggf. enzymatische Komponenten vorhanden sein,
die in Kooperation mit der H+-K+-ATPase
vorliegen. Diese können
auch räumlich
beabstandet vorliegen.
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Eine genaue Kenntnis der stofflichen
und energetischen Bedingungen ist wünschenswert, um regulierende
Maßnahmen
für die
Steuerung der Säureproduktion
und Sezernierung im Magen auffinden zu können, und es wurden bereits
verschiedene Untersuchungs- und Testmöglichkeiten ersonnen, um das Problem
des Auffindens geeigneter Wirkstoffe wie Inhibitoren oder Modulatoren
für die
H+-K+-ATPase und den damit
im Zusammenhang stehenden Wirkortkomplex zu lösen.
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Entsprechend sind im Stand der Technik
unterschiedliche Verfahren und Messeinrichtungen bekannt, mit denen
Eigenschaften bestimmter Wirkstoffe quantitativ und qualitativ analysiert
und beschrieben werden können.
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Auch ist es wünschenswert, vorgegebene und
bekannte Wirkstoffe am Wirkortkomplex zu applizieren, z.B. an der
H+-K+-ATPase, an
einer Zelle, einem Gewebe oder dergleichen, um die Funktionsweise
dieses Wirkortes zu beeinflussen und/oder zu untersuchen.
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Übliche
Experimente am Gesamtorganismus sind aufgrund der Komplexität der Organismen
und ferner aufgrund ethischer und moralischer Umstände oft
bedenklich, und die damit erzielten Ergebnisse haben eine nur beschränkte Aussagekraft.
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Folglich wurden Verfahren und Einrichtungen
entwickelt, mit deren Hilfe eine isolierte Betrachtung der Wirkungsweise
zu testender Wirkstoffe auf isolierte Wirkzentren oder eine Untersuchung
der Wirkzentren selbst möglich
ist. Dabei werden bestimmte Gewebe, isolierte Zellen und/oder andere
biologische Einheiten, zum Beispiel Proteine oder dergleichen, in
isolierter Art und Weise einer Betrachtung zugänglich gemacht. Es sind zum
Beispiel Techniken bekannt, die unter Verwendung von Farbstoffen
oder radioaktiven Stoffen arbeiten und sich ändernde Transport- und/oder Bindungsspezifitäten ausnutzen
und darstellen. Falls diese Vorgehensweise überhaupt möglich ist, ist sie aber dahingehend nachteilig,
dass ihr oft nur ein geringes Auflösungsvermögen und eine geringe Empfindlichkeit
dabei aber eine hohe Fehleranfälligkeit
zukommen.
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Es sind aber auch elektrophysiologische
Methoden bekannt, zum Beispiel die sogenannten Patch Clamp-Technik
oder Voltage Clamp-Technik,
bei welchen zum Beispiel Zellen isoliert einer elektrophysiologischen
Untersuchung zugänglich
sind. Bei diesem Vorgehen werden native Zellen unterschiedlichen Bedingungen
ausgesetzt und es werden bestimmte elektrische Aktivitäten, die
durch die Zellen über
die darin enthaltenen Organellen und/oder Proteine oder dergleichen
vermittelt werden, gemessen. Trotz der dabei erzielbaren hohen Genauigkeit
sind diese bekannten elektrophysiologischen Methoden dahingehend
nachteilig, dass sie oft eine nur geringe Reproduzierbarkeit der
Ergebnisse liefern, aufgrund ihres hohen messtechnischen Aufwandes
und ihrer Störanfälligkeit
für einen
schnellen, automatisierbaren und/oder breiten Einsatz ungeeignet
sind und aufgrund der in der Regel nativen Umgebung der zu untersuchenden
Objekte gewisse Probleme bei der Diskriminierung unerwünschter
Signalanteile aufweisen. Außerdem
ist die Anwendung der Patch Clamp-Technik oder Voltage Clamp-Technik bei der H+-K+-ATPase auf Grund
der Elektroneutralität
des durch die H+-K+-ATPase
vermittelten Transports kaum oder nicht möglich.
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde,
einen H+-K+-ATPase-Assay zu schaffen,
bei welchem auf besonders einfache und gleichwohl zuverlässige Art
und Weise eine rasche Wirkstofftestung, insbesondere im Massenbetrieb,
unter vertretbaren Kosten möglich
ist.
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Gelöst wird die Aufgabe bei einem
Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes erfindungsgemäß durch
die kennzeichnenden Merkmale des Anspruchs 1. Weiterhin sind Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ein Wirkstoff oder Wirkstoffkomplex gemäß Anspruch
23, ein Verfahren zum Herstellen eines Arzneimittels gemäß Anspruch
24, ein Testkit zur Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens
gemäß Anspruch
25, ein Screeningverfahren zum Identifizieren gemäß Anspruch
26, sowie Verwendungen des Verfahrens, des Testkits sowie des Arzneimittels
gemäß den Ansprüchen 27,
28 bzw. 29. Vorteilhafte Weiterbildungen sind Gegenstand der jeweiligen
abhängigen
Unteransprüche.
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Die Erfindung betrifft ein Verfahren
zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes, welcher eine enzymatische
Eigenschaft eines Wirkortkomplexes, welcher einen Typ eines H+-K+-ATPase-Proteins
enthält,
oder eines Teils davon modifiziert. Das erfindungsgemäße Verfahren
weist folgende Schritte auf:
- (a) Bereitstellen
einer Mehrzahl Primärträger, welche
den Wirkortkomplex, insbesondere in einer Mehrzahl im Bereich einer
Membran des jeweiligen Primärträgers enthalten,
- (b) Anlagern oder In-Kontakt-Bringen der Primärträger am oder
im Oberflächenbereich
eines Isolationsbereichs einer als Sekun därträger dienenden Biosensorelektrode
in einem Messmedium, wobei der Sekundärträger gegenüber dem Messmedium und gegenüber den
Primärträgern mittels des
Isolationsbereichs mechanisch und elektrisch isoliert ist oder wird,
- (c) Bereitstellen mindestens eines potenziellen Wirkstoffkomplexes
(W),
- (d) In-Kontakt-Bringen und insbesondere In-Wechselwirkung-Bringen
des potenziellen Wirkstoff komplexes (W) mit dem Wirkortkomplex der
Primärträger oder
Teilen davon, und
- (e) Bestimmen des qualitativen und/oder quantitativen Einflusses
des potenziellen Wirkstoffkomplexes (W) oder eines Teils davon auf
enzymatische Eigenschaften des Wirkortkomplexes oder eines Teils
davon durch Detektieren einer elektrischen Aktion des Wirkortkomplexes
oder eines Teils davon oder eine Änderung dieser elektrischen
Aktion über
die Biosensorelektrode als Sekundärträger.
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Es ist somit ein Kerngedanke der
vorliegenden Erfindung, die Wirkungsweise eines potenziellen Wirkstoffes
oder Wirkstoffkomplexes dadurch zu identifizieren, dass der qualitative
Einfluss und/oder der quantitative Einfluss des potenziellen Wirkstoffes oder
Wirkstoffkomplexes durch Detektieren einer elektrischen Aktion bestimmt
werden, welche durch den Wirkortkomplex oder eines Teils davon und
insbesondere durch die H+-K+-ATPase
vermittelt werden, oder jeweils eine Änderung der elektrischen Aktion über die
Biosensorelektrode als Sekundärträger detektiert
werden.
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Es ist ein weiterer Kerngedanke der
vorliegenden Erfindung, dass dabei Primärträger, welche den Wirkortkomplex
im Bereich einer Membran des jeweiligen Primärträgers enthalten, bereitgestellt
und verwendet werden, wobei die Primärträger mit den Wirkortkomplexen
an einem Sekundärträger, nämlich der
Biosensorelektrode und insbesondere mit deren Isolationsbereich
in Kontakt gebracht und dort insbesondere angelagert werden. Durch
die mechanische und elektrische Isolation der Biosensorelektrode
als Sekundär träger gegenüber dem
vorgesehenen Messmedium und gegenüber den Primärträgern mittels
des Isolationsbereiches findet zum einen keine direkte Wechselwirkung
der Elektrode mit dem zu untersuchenden Wirkortkomplex und insbesondere nicht
mit der H+-K+-ATPase statt. Zum
anderen ermöglicht
die elektrische Abdichtung der Biosensorelektrode gegenüber dem
Messmedium auf einfache Art und Weise das Ableiten eines elektrischen
Signals aufgrund der elektrischen Aktion des Wirkortkomplexes oder
eines Teils davon. Auch kann der Isolationsbereich der Biosensorelektrode
eine vergleichsweise natürliche
Umgebung für
die Primärträger und
insbesondere für
den Wirkortkomplex darstellen, im Gegensatz zu den meisten Elektrodenmaterialien.
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Bei der Ausgestaltung der Biosensorelektrode
als Sekundärträger bestehen
vielfältige
Möglichkeiten.
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Es wird aber besonders bevorzugt,
dass eine Biosensorelektrode als Sekundärträger verwendet wird, bei welcher
ein elektrisch leitfähiger
und festkörperartiger
Elektrodenbereich mit mindestens einer Elektrode vorgesehen wird,
welcher gegenüber
dem Messmedium und gegenüber
den Primärträgern elektrisch
und mechanisch isoliert wird durch Vorsehen eines Isolationsbereichs
in Form einer festkörperunterstützten Membran,
welche schichtartig aufgebaut wird aus einer Unterschicht einer
organischen Thioverbindung als unterster und der Elektrode jeweils
zugewandter Schicht und aus einer Oberschicht einer amphiphilen
organischen Verbindung.
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Bei einer anderen Ausgestaltungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist es vorgesehen, dass eine Biosensorelektrode als Sekundärträger verwendet
wird, bei welcher eine Elektrode aus Gold im Elektrodenbereich vorgesehen
wird mit einer Monoschicht eines langkettigen Alkanthiols als Unterschicht
darauf und einer Monoschicht eines Lipids als Oberschicht darauf.
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Bei einer weiteren vorteilhaften
Ausgestaltungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es vorgesehen,
dass eine Biosensorelektrode als Sekundärträger verwendet wird, bei welcher
der ei ne Elektrode der Biosensorelektrode als Sekundärträger abdeckende
Bereich des Isolationsbereichs als eine Membranstruktur nach Art
einer festkörperunterstützten Doppelschichtmembran
oder Bilayermembran – nachfolgend
synonym auch als Biosensormembran oder SSM (Solid Supported Membrane)
bezeichnet – ausgebildet
wird oder ist, insbesondere mit einer Fläche von etwa A = 0,1 – 50 mm2 und mit einer spezifischen elektrischen
Leitfähigkeit
von etwa Gm ≈ 1 – 100 nS/cm2 und/oder
mit einer spezifischen Kapazität
von etwa Cm ≈ 10 – 1000 nF/cm2.
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Im Hinblick auf die Primärträger, welche
den Wirkortkomplex und insbesondere die H+-K+-ATPase im Bereich ihrer Membran enthalten
sollen, ergeben sich unterschiedliche Möglichkeiten, wobei der jeweiligen
Zielsetzung des Verfahrens Rechnung getragen werden kann.
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Zum Beispiel bietet es sich gemäß einer
besonders vorteilhaften Ausgestaltungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
an, dass als Primärträger jeweils
eine eukariontische Zelle, eine prokariontische Zelle, ein Oozyt,
ein Bakterium, ein Virus, eine Organelle oder Bestandteile, insbesondere
Membranfragmente, oder Verbände
davon in nativer Form oder in abgewandelter Form, insbesondere in
gereinigter, mikrobiologisch und/oder molekularbiologisch geänderter
Form, verwendet wird.
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Es ist auch möglich, dass als Primärträger jeweils
ein Vesikel, ein Liposom oder eine mizelläre Struktur verwendet wird.
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In der Praxis wird eine Mehrzahl
oder Vielzahl Primärträger verwendet.
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Bevorzugt wird, dass als Wirkortkomplex oder
Teil davon ein Monomer oder ein Oligomer einer H+-K+-ATPase verwendet wird.
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Ferner ist es vorgesehen, dass ein
Wirkortkomplex oder ein Teil davon verwendet wird, welcher auf der
H+-K+-ATPase basiert,
die aus einem Gewebe eines Säugetiermagens
stammt oder genetisch aus einem solchen abgeleitet wird, insbesondere
aus den Parietalzellen der Magenschleimhaut.
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In vorteilhafter Weise ist es vorgesehen, dass
der Wirkortkomplex aus dem Organismus Schwein, Schaf oder Mensch
stammt oder aus diesen genetisch abgeleitet wird.
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Besonders vorteilhaft im Hinblick
auf eine Signaldetektion ist, wenn gemäß einer bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
der Wirkortkomplex oder ein Teil davon zumindest zum Teil im Primärträger eine
Membran durchspannend ausgebildet oder verwendet wird. Denkbar sind
aber auch membranständige,
die Membran aber nicht durchspannende Wirkortkomplexe.
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Im Hinblick auf das eigentliche Identifizierungsverfahren über die
Detektion einer elektrischen Aktion bieten sich vielfältige Möglichkeiten
an.
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So ist es vorgesehen, dass als elektrische Aktion
verwendet wird ein durch den Wirkortkomplex oder durch einen Teil
davon erzeugter elektrischer Strom oder ein davon erzeugtes elektrisches
Potenzial. Der erzeugte elektrische Strom oder das erzeugte elektrische
Potenzial werden jeweils erzeugt durch Ladungstransport, Stofftransport,
Ladungsverschiebung, Stoffverschiebung, Konformationsänderungen des
Wirkortkomplexes oder eines Teils davon, Ligandenbindung oder Ligandenfreigabe
durch den Wirkortkomplex oder eines Teils davon oder durch Ligandenanlagerung
oder Ligandenfreigabe durch den Wirkortkomplex oder eines Teils
davon. Denkbar sind auch beliebige Kombinationen dieser Prozesse
im Hinblick auf den Wirkortkomplex oder eines Teils davon.
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Auch bei den enzymatischen Eigenschaften ergeben
sich im Hinblick auf das erfindungsgemäße Verfahren vielfältige Möglichkeiten.
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So ist es vorgesehen, dass als enzymatische Eigenschaften
verwendet werden die Bindung, Anlagerung oder Freigabe des Wirkstoffkomplexes
oder eines Teils davon oder des Messmediums oder eines Teils davon
an den bzw. von dem Wirkortkomplex oder einen bzw. einem Teil davon,
der Transport oder die Verschiebung des Wirkstoffkomplexes oder
eines Teils davon oder des Messmediums oder eines Teils davon durch
den Wirkortkomplex oder einen Teil davon, die chemische Umsetzung
oder Reaktion des Wirkstoffkomplexes oder eines Teils davon oder
des Messmediums oder eines Teils davon, die Konformationsänderung
oder Bewegung des Wirkortkomplexes oder eines Teils davon sowie
mit diesen Prozessen im Zusammenhang stehende Funktionalitäten des
Wirkort komplexes oder eines Teils davon. Auch hier sind wieder
beliebige Unterkombinationen der zuvor beschriebenen Prozesse im
Hinblick auf den Wirkstoffkomplex, das Messmedium oder den Wirkortkomplex
oder Teile davon denkbar.
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Bevorzugt wird beim erfindungsgemäßen Verfahren
die Verwendung eines wässrigen
Messmediums und insbesondere einer wässrigen Elektrolytlösung als
Messmedium.
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Bei einer vorteilhaften Weiterbildung
des erfindungsgemäßen Verfahrens
zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes ist es vorgesehen, dass
die Verfahrensschritte (c) und/oder (d) durchgeführt werden durch:
- – Zumischen
oder Injizieren des Wirkstoffkomplexes, eines Teils und/oder einer
Vorstufe davon,
- – Austauschen
des Messmediums oder eines Teils davon und/oder
- – chemisches
oder physikalisches Umsetzen oder Reagieren des Messmediums oder
eines Teils davon oder des Wirkstoffs, eines Teils und/oder einer
Vorstufe davon.
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Das bedeutet, dass zum einen der
Wirkstoffkomplex oder ein Teil davon direkt durch Injizieren oder
Beimischen in das Messmedium hinein zum Ort des Wirkortkomplexes
transportiert werden kann. Besonders einfach gestaltet sich jedoch
ein derartiger Vorgang, wenn einfach das jeweilige Messmedium ausgetauscht
wird, vorzugsweise in kontinuierlicher Art und Weise. Des Weiteren
ist es denkbar, dass der Wirkstoff erst durch ein chemisches oder
physikalisches Umsetzen oder Reagieren im Messmedium freigesetzt wird.
Dies kann zum Beispiel auch durch Zuführen von Strahlung erfolgen.
Denkbar ist dabei auch, dass die Strahlung, insbesondere Licht,
selbst in Form eines Wirkstoffes eingesetzt wird und somit also
als treibende Kraft für
die im Wirkortkomplex ablaufenden Prozesse dient.
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Besonders vorteilhaft gestaltet sich
jedoch das erfindungsgemäße Verfahren
dann, wenn die Sensoranordnung aus Biosensorelektrode als Sekundärträger und
daran angelagerten Primärträgern in
einem Messraum, Messbereich oder Messgefäß vom Messmedium umströmt oder
angeströmt
wird. Auf diese Art und Weise lässt
sich durch Wechsel des Messmediums zum Beispiel ein Konzentrationssprung
im Hinblick auf den Wirkstoff komplex oder eines Teils davon leicht
realisieren. Auch lassen sich durch ein derartiges Messen im Rahmen
eines Fließsystems
auf leichte Art und Weise und zuverlässig mit hoher Zeitauflösung verschiedene
Versuchsbedingungen einstellen.
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Vorzugsweise wird dabei eine Strömungsgeschwindigkeit
oder Fließgeschwindigkeit
des Messmediums im Bereich von etwa v ≈ 0,1 – 2 m/s verwendet.
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Besonders ökonomisch und für eine statistische
Auswertung zugänglich
gestaltet sich das erfindungsgemäße Verfahren
dann, wenn aufeinanderfolgend eine Mehrzahl von Tests durchgeführt wird,
insbesondere durch aufeinanderfolgendes Austauschen des Messmediums,
ggf. mit zwischengeschaltetem Waschen oder Spülen des Messraums.
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Wichtig ist bei dem vorliegenden
erfindungsgemäßen Verfahren
ggf. das Vergleichen der Aktion des Wirkortkomplexes bei vorliegendem
Wirkstoffkomplex mit einer Situation, bei welcher der potenzielle
Wirkstoffkomplex nicht zugegen ist. Für ein derartiges Vorgehen bieten
sich verschiedene Verfahrensprotokolle an.
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Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist es vorgesehen, dass in den Verfahrens schritten (c), (d) und/oder
(e) einer oder mehrere der folgenden Unterschritte durchgeführt werden:
- (f) Einbringen des Sekundärträgers mit den Primärträgern in
ein erstes oder nicht-aktivierendes Messmedium und Detektieren einer
elektrischen Aktion gemäß dem oder
im Sinne von Verfahrensschritt (e),
- (g) Einbringen des Sekundärträgers mit
den Primärträgern in
ein zweites oder aktivierendes Messmedium und Detektieren einer
elektrischen Aktion gemäß dem oder
im Sinne von Verfahrensschritt (e),
- (h) Einbringen des Sekundärträgers mit
den Primärträgern in
ein drittes oder Test-Messmedium und Detektieren einer elektrischen
Aktion gemäß dem oder
im Sinne von Verfahrensschritt (e), wobei das dritte oder Test-Messmedium
dem zweiten oder aktivierenden Messmedium entsprechend gewählt wird
und der Wirkstoff komplex (W), ein Teil oder eine Vorstufe davon
hinzugefügt und/oder
freigesetzt werden.
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Beliebige Kombinationen der Schritte
(f), (g), (h) ggf. mit Wiederholungen sind denkbar.
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Es kann der Wirkstoff komplex auch
sowohl im aktivierenden als auch im nicht-aktivierenden Messmedium
zugesetzt oder dort freigesetzt werden.
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Auch ist als Zwischenschritt eine
Inkubation der Wirkortkomplexe oder der sie tragenden Primärträger mit
dem Wirkstoff komplex denkbar.
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Des Weiteren ist es denkbar, dass
zwischen den Schritten (g) und (i) ein Waschschritt durchgeführt wird
durch Einbringen des Sekundärträgers mit den
Primärträgern in
ein viertes und Waschmedium.
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Ferner ist es denkbar, dass direkt
vor dem Schritt (i) bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
der Schritt (f) wiederholt durchgeführt wird.
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Bei einer anderen alternativen Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist es vorgesehen, dass als Messmedium und insbesondere als das
erste oder nicht-aktivierende Messmedium, als zweites oder aktivierendes
Messmedium und/oder als drittes oder Test-Messmedium Messmedien
verwendet werden, welche in wässriger
Lösung enthalten:
- – etwa
25 mM Imidazol,
- – etwa
3 mM MgCl2,
- – etwa
pH=6,
wobei insbesondere kaliumfreie Messmedien verwendet
werden.
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Des Weiteren ist es vorgesehen, dass
bei einer anderen alternativen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
als Messmedium und insbesondere als zweites oder aktivierendes Messmedium
und als drittes oder Test-Messmedium Medien mit Adenosintriphosphat
oder ATP verwendet werden, insbesondere mit einer Konzentration
im Bereich von etwa 15 μM.
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Gemäß einem weiteren Aspekt schafft
die vorliegende Erfindung einen Wirkstoff oder einen Wirkstoff komplex,
welcher eine enzymatische Eigenschaft eines Typs einen Typ eines
H+-K+-ATPase-Proteins enthaltenden
Wirkortkomplexes oder eines Teils davon modifiziert und welcher
gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren
zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes identifiziert ist, wird
oder wurde.
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Des Weiteren schafft die vorliegende
Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines Arzneimittels mit den
Schritten:
- – Identifizieren eines Wirkstoffs
und/oder eines Wirkstoffkomplexes, welcher eine – ggf. bestimmte – enzymatische
Eigenschaft eines Wirkstoffkomplexes, welcher einen Typ eines H+-K+-ATPase- Proteins enthält, oder
eines Teils davon oder eine Mehrzahl von Eigenschaften geeignet
modifiziert, und zwar mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens,
- – Herstellen
und/oder Isolieren des Wirkstoffs, des Wirkstoffkomplexes, eines
Teils und/oder eines Derivats davon,
- – ggf.
Aufreinigen des Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils und/oder Derivats,
- – ggf.
Mischen und/oder Portionieren des Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes,
Teils und/oder Derivats mit einer pharmazeutisch verträglichen
Trägersubstanz.
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Des Weiteren schafft die vorliegende
Erfindung einen Testkit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens
zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes. Dieser Testkit weist
auf:
- – mindestens
einen Primärträger,
- – einen
Messbereich,
- – ein
erstes oder nicht-aktivierendes Messmedium, ein zweites oder aktivierendes
Messmedium, ein drittes oder Test-Messmedium zur Aufnahme eines
potenziellen Wirkstoffkomplexes und
- – mindestens
einen potenziellen Wirkstoffkomplex zur Zugabe zum dritten oder
Test-Messmedium.
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Erfindungsgemäß wird auch ein Screeningverfahren
zum Identifizieren geschaffen, und zwar zum Identifizieren:
- – eines
unbekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, eines Teils und/oder
Derivats davon,
- – des
Vorhandenseins eines unbekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes,
Teils und/oder Derivats davon,
- – des
Vorhandenseins eines bekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils
und/oder Derivats davon,
- – der
Konzentration eines unbekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes,
Teils und/oder Derivats davon,
- – der
Konzentration eines bekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils
und/oder Derivats davon.
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Gemäß einem weiteren Aspekt der
vorliegenden Erfindung wird das erfindungsgemäße Verfahren zum Identifizieren
eines Wirkstoffkomplexes verwendet zum Auffinden von Inhibitoren,
partiellen oder temporären
Inhibitoren oder Modulatoren einer enzymatischen Eigenschaft eines
Wirkortkomplexes, welcher einen Typ eines H+-K+-ATPase-Proteins
enthält,
und insbesondere der humanen H+-K+-ATPase.
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Des Weiteren wird das erfindungsgemäße Testkit
erfindungsgemäß verwendet
zum Auffinden von Inhibitoren, partiellen oder temporären Inhibitoren
oder Modulatoren eines Typs einen Typ eines H+-K+-ATPase-Proteins
enthaltenden Wirkortkomplexes und insbesondere der humanen H+-K+-ATPase .
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Des Weiteren wird das Arzneimittel
erfindungsgemäß verwendet
zur Inhibition, partiellen oder temporären Inhibition oder Modulation
eines Typs einen Typ eines H+-K+-ATPase-Proteins
enthaltenden Wirkstoffkomplexes oder eines Teils davon und insbesondere
der humanen H+-K+-ATPase.
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Auf der Grundlage der nachfolgenden
Bemerkungen werden die voranstehenden und weitere Aspekte der vorliegenden
Erfindung mit anderen Worten weiter erläutert:
Durch das erfindungsgemäße Vorgehen
kann eine amperometrische und/oder potenziometrische, pharmakologische
Wirkort- und/oder Wirkstofftestung durchgeführt werden. Dabei wird ein
Sekundärträger in Form
einer Biosensorelektrode vorgesehen, welcher z. B. einen elektrisch
leitfähigen
und festkörperartigen
Elektrodenbereich aufweist. Ferner wird eine Mehrzahl Primärträger vorgesehen,
welche in unmittelbarer räumlicher
Nachbarschaft des Sekundärträgers angeordnet
werden und welche die zu einer elektrischen Aktion aktivierbaren
und Wirkortkomplexe, basierend auf der H+-K+-ATPase aufweisen.
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Darüber hinaus ist ein z. B. wässriges
Messmedium vorgesehen, in welchem die Primärträger und die Sekundärträger angeordnet
werden. Der Elektrodenbereich wird gegenüber dem Messmedium, den Primärträgern und
gegenüber
den biologischen Einheiten elektrisch und mechanisch, also räumlich isoliert.
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Als Primärträger sind jeweils eukariontische Zellen,
prokariontische Zellen, Oozyten, Bakterien, Viren, Organellen oder
Bestandteile, Membranfragmente oder Verbände davon in nativer Form oder
in abgewandelter Form, in gereinigter, mikrobiologisch und/oder
molekularbiologisch geänderter
Form vorgesehen. Alternativ oder zusätzlich sind als Primärträger Vesikel,
Liposomen oder mizelläre
Strukturen vorgesehen.
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Maßgeblich beim erfindungsgemäßen Vorgehen
ist auch das Vorsehen einer Biosensorelektrode, auch als Sensoranordnung
bezeichnet. Diese bildet einen Sekundärträger, der im Folgenden auch
als Sensorelektrodeneinrichtung bezeichnet wird. Diese Sensorelektrodeneinrichtung
zur amperometrischen und/oder potenziometrischen, pharmakologischen Wirkort-
und/oder Wirkstofftestung selbst also weist mindestens einen elektrisch
leitfähigen
Elektrodenbereich auf. Die Sensorelektrodeneinrichtung ist ausgebildet,
im Betrieb in einem wässrigen
Messmedium angeordnet zu werden. Des Weiteren ist die Sensorelektrodeneinrichtung
ausgebildet, eine Mehrzahl oder Vielzahl Primärträger mit dem zu einer elektrischen
Aktion aktivierbaren Wirkort komplex, also mit der H+-K+-ATPase in unmittelbarer räumlicher
Nachbarschaft, insbesondere des Elektrodenbereichs, anzuordnen.
Dabei wird der Elektrodenbereich festkörperartig ausgebildet. Des
Weiteren ist der Elektrodenbereich ausgebildet, gegenüber dem
vorzusehenden Messmedium und gegenüber den Primärträgern elektrisch
und mechanisch isoliert zu sein. Das heißt, der Elektrodenbereich hat
keinen direkten mechanischen Kontakt zum Messmedium, zum Primärträger und
bei nicht membrangängigen
Wirkstoff komplexen auch nicht zum Wirkstoffkomplex.
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Es ist eine andere Kernidee der vorliegenden Erfindung,
einen Elektrodenbereich der Sensoranordnung und insbesondere der
Sen sorelektrodeneinrichtung zu verwenden, welcher festkörperartig
oder festkörperunterstützt ausgebildet
ist. Dadurch werden der Sensorelektrodeneinrichtung und insbesondere
dem vorgesehenen Elektrodenbereich davon eine besonders hohe mechanische
Stabilität
gegeben, wodurch ein besonders robuster und störunanfälliger Betrieb im Rahmen des
Verfahrens oder einer Wirkort- und/oder Wirkstofftestung möglich ist.
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Erst durch die Festkörperunterstützung wird eine
Aktivierung des Wirkortkomplexes und der H+-K+-ATPase durch einen Konzentrationssprung
auf einfache und zuverlässige
Art und Weise möglich. Dies
kann insbesondere im Rahmen eines schnellen und/oder kontinuierlichen
Lösungsaustauschs
erfolgen, wodurch – insbesondere
bei amperometrischen Messungen – ein
hoher Signalpegel und somit eine hohe Empfindlichkeit erreichbar
sind. Aufgrund der Robustheit durch die Festkörperunterstützung sind auch eine leichtere
Handhabung und ein bequemer Einbau möglich.
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Ein weiterer Kernaspekt der vorliegenden
Erfindung besteht darin, einen Elektrodenbereich zu verwenden, welcher
im Betrieb gegenüber
dem Messmedium und gegenüber
den Primärträgern elektrisch
und mechanisch, also räumlich
isoliert ausgebildet ist. Durch diese Maßnahme wird erreicht, dass
die Sensorelektrodeneinrichtung zum Beispiel als kapazitiv gekoppelte
Elektrode eingesetzt werden kann. Dies hat insbesondere im Hinblick
auf das Signal-zu-Rauschverhältnis,
also im Hinblick auf die Nachweisgenauigkeit erhebliche Vorteile.
Des Weiteren ist bei der kapazitiven Kopplung der Elektrodenbereich
der Sensorelektrodeneinrichtung an keiner chemischen Umsetzung beteiligt,
wie das zum Beispiel bei einer typischen elektrochemischen Halbzelle
der Fall wäre.
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Ein weiterer Kernaspekt der Erfindung
sind die Auswahl und die Verwendung der den Wirkortkomplex und die
H+-K+-ATPase tragenden
Primärträger. Die
Primärträger können jeweils
eukariontische Zellen, prokariontische Zellen, Oozyten Bakterien,
Viren, Organellen oder Bestandteile, insbesondere Membranfragmente,
oder Verbände
davon sein, und zwar in nativer Form oder in abge wandelter Form, insbesondere
in gereinigter, molekularbiologisch und/oder mikrobiologisch geänderter
Form. Alternativ oder zusätzlich
sind als Primärträger Vesikel,
Liposomen oder mizelläre
Strukturen denkbar.
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Der Elektrodenbereich besitzt z.B.
mindestens eine Elektrode. Diese kann zum einen jeweils selbst als
mechanisch stabiler Materialbereich ausgebildet sein, insbesondere
als Platte, als Draht und/oder dergleichen.
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Andererseits kann der Elektrodenbereich
einen Träger
aufweisen, der insbesondere festkörperartig ausgebildet ist.
Dann ist es möglich,
dass die Elektrode jeweils als Materialbereich oder Materialschicht
auf einem Oberflächenbereich
oder der Oberfläche
dieses Trägers
ausgebildet ist, insbesondere in zusammenhängender Art und Weise. Dabei
ist es dann insbesondere vorgesehen, dass die Elektrode durch die
Festkörperunterstützung durch
den Träger mechanische
Stabilität
erlangt. Diese Vorgehensweise hat den Vorteil, dass gegebenenfalls
hochwertige Materialien zum Beispiel als dünne Schicht auf dem Träger aufgebracht
werden können,
so dass sich in betriebswirtschaftlicher Hinsicht die Möglichkeit
einer Einwegsensorelektrodeneinrichtung bietet, die zu erschwinglichen
Preisen herstellbar und auf dem Markt verwertbar ist. Gegebenenfalls
kann der Träger,
insbesondere der Elektrodenbereich, wiederverwendet werden, wobei
insbesondere ein erneuerter Isolationsbereich, z.B. eine neue Thiolschicht,
notwendig werden kann.
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Vorzugsweise weist die Elektrode
mindestens ein metallisches Material auf oder ist aus einem solchen
Material gebildet. Dabei wird vorteilhafterweise insbesondere ein
chemisch inertes Edelmetall verwendet, vorzugsweise Gold. Denkbar
sind insbesondere auch Platin oder Silber.
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Andererseits kann es auch vorteilhaft
sein, dass eine nicht oder nicht rein metallische Elektrode verwendet
wird, zum Beispiel aus mindestens einem leitfähigen Metalloxid. Es bietet
sich zum Beispiel Indiumzinnoxid an, weil dieses gegenüber Strahlung zu mindest
im sichtbaren Bereich und im UV-Bereich vergleichsweise unempfindlich
ist, insbesondere wegen der höheren
optischen Transparenz in diesem Bereich, zumindest im Vergleich
zu reinen Metallelektroden, welche einen starken Photoeffekt zeigen.
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Der Träger zur Aufnahme der Elektrode weist
also vorteilhafterweise ein elektrisch isolierendes Material auf
oder ist aus einem solchen gebildet. Des Weiteren oder alternativ
ist es von Vorteil, dass das Material des Trägers im Wesentlichen chemisch inert
ist. Vorteilhafterweise bietet sich als Material ein Glas oder dergleichen
an. Dabei kann die Form die einer Platte oder dergleichen sein.
Die chemische Inertheit verhindert eine Veränderung sowohl des Trägers als
auch eine Verunreinigung des Messmediums während des Messprozesses. Durch
die Wahl eines elektrisch isolierenden Trägers wird gewährleistet,
dass sämtliche
Messsignale im Wesentlichen aus dem Bereich der Elektrode stammen.
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Eine besonders einfache Anordnung
der Sensorelektrodeneinrichtung ergibt sich, wenn die Elektrode
im Wesentlichen als auf der Oberfläche des Trägers abgeschiedene Materialschicht
ausgebildet ist. Es kann sich dabei um eine aufgedampfte oder gesputterte
Materialschicht handeln. Die Materialschicht zur Ausbildung der
Elektrode hat vorzugsweise eine Schichtstärke von etwa 10 bis 200 nm.
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Zwischen der Materialschicht für die Elektrode
und der Oberfläche
des Trägers
kann gegebenenfalls eine Haftschicht von Vorteil sein. Insbesondere beim
Aufbringen einer Goldelektrode auf Glas ist eine zwischenliegende
Haftschicht z.B. aus Chrom oder Titan von Vorteil. Die Haftschicht
hat vorteilhafterweise eine vergleichsweise geringe Schichtdicke,
vorzugsweise von etwa 5 nm bis etwa 20 nm.
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Zur Ausbildung der kapazitiven Elektrode und
der dazu notwendigen Isolation des Elektrodenbereichs von Messmedium
und/oder von den Primärträgern ist
also vorzugsweise mindestens ein Isolationsbereich ausgebildet,
durch welchen im Betrieb der Elektroden bereich, insbesondere die
Elektrode, im Wesentlichen elektrisch isolierbar ist, insbesondere
in Bereichen davon, welche im Betrieb zum mechanischen Kontakt mit
dem Messmedium und/oder mit den Primärträgern vorgesehen sind.
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Bevorzugten wird der Isolationsbereich schichtartig
ausgebildet. Dabei besteht der Isolationsbereich zumindest zum Teil
aus einer Abfolge von Monoschichten, wobei die Monoschichten als
spontan selbstorganisierende Schichten ausgebildet sind.
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Es ist von Vorteil, dass als Unterschicht
des Isolationsbereichs eine Schicht aus einer organischen Thioverbindung
als unterster und der Elektrode zugewandter Bereich des Isolationsbereichs
vorgesehen ist, vorzugsweise aus einem langkettigen Alkanthiol,
insbesondere aus Oktadekanthiol. Ferner ist als Oberschicht des
Isolationsbereiches eine Schicht aus einer amphiphilen organischen
Verbindung, insbesondere aus einem Lipid, als oberster und von der
Elektrode abgewandter Bereich oder Oberflächenbereich des Isolationsbereichs
vorgesehen.
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Es kann also von Vorteil sein, den
Isolationsbereich zumindest teilweise schichtartig, insbesondere
mehrschichtig, auszubilden. Dadurch werden die Isolationswirkung
verstärkt
und die Herstellung vereinfacht. Um im Betrieb eine möglichst
hohe Rate angelagerter und/oder angeordneter Primärträger im Bereich
der Sensorelektrodeneinrichtung zu erhalten, ist es gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Sensorelektrodeneinrichtung
vorgesehen, dass zumindest der Oberflächenbereich des Isolationsbereichs
derart abgestimmt ausgebildet ist, dass eine Anlagerung und/oder
Anordnung von Primärträgern am
Oberflächenbereich
des Isolationsbereichs begünstigt
wird, insbesondere in mit der Oberfläche der Primärträger kompatibler
Art und Weise. Das bedeutet, dass je nach Oberflächenbeschaffenheit der Primärträger der
Oberflächenbereich
des Isolationsbereichs der Sensorelektrodeneinrichtung entsprechend
angepasst ausgebildet ist, so dass sich die Primärträger begünstigt am Oberflächenbereich
des Isolationsbereichs anlagern und dort auch verbleiben.
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Im Hinblick auf eine besonders ausgeprägte kapazitive
Kopplung der Sensorelektrodeneinrichtung im Messbetrieb ist es vorgesehen,
dass der Isolationsbereich zumindest teilweise als Monoschicht, Monolage
und/oder als Abfolge davon ausgebildet ist. In diesem Fall ist die
auf die Fläche
bezogene spezifische elektrische Kapazität der Elektrodengrenzschicht
besonders hoch. Besonders einfach gestaltet sich die Anordnung und
Ausbildung der erfindungsgemäßen Sensoranordnung,
wenn die Schicht oder die Schichten des Isolationsbereichs als sich spontan
selbstorganisierende Schichten oder als Self-Assembling-Schichten
ausgebildet sind oder werden. Dabei werden in vorteilhafter Art
und Weise die Neigung und das Bestreben bestimmter, im Wesentlichen
flüssiger
oder flüssig
gelöster
Ausgangsstoffe ausgenutzt, auf einer Oberfläche unter Einfluss der Wechselwirkung
mit der Struktur der Oberfläche spontan
und selbstorganisierend eine geordnete und/oder schichtartige Struktur
auszubilden, die unter bestimmten Umständen und bei bestimmten Stoffklassen
zur Ausbildung besonders dünner
und gegebenenfalls einlagiger Schichten oder Monoschichten, insbesondere
von Molekülen,
führt.
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Dabei ist es also von Vorteil, wenn
als Unterschicht oder als unterster und der Elektrode zugewandter
Bereich des Isolationsbereichs eine Schicht aus einer organischen
Thioverbindung vorgesehen ist. Im Hinblick auf die elektrischen
Eigenschaften bietet sich dabei vorzugsweise die Verwendung eines
langkettigen Alkanthiols und/oder an. Besonders bevorzugt ist dabei
die Zugrundelegung eines C18-Alkans, also Oktadekanthiol.
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Bei dieser Vorgehensweise wird ausgenutzt, dass
auf bestimmten Edelmetalloberflächen,
zum Beispiel Gold, Silber und Platin, aus einer organischen Lösung, welche
entsprechende Thioverbindung in Lösung enthält, aufgrund einer spezifischen Wechselwirkung
der Thiogruppe mit den Oberflächenatomen
der Edelmetallelektrode eine kovalent gebundene Monoschicht auf
der Elektrodenoberfläche
entstehen kann, die bei entsprechender Geometrie der Thioverbindung
eine hexagonal dichte Packung auszubilden vermag, wodurch eine besonders geringe
Restleitfähigkeit
der Edelmetalloberfläche
in Bezug auf das vorzusehende Messmedium realisierbar ist.
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Andererseits ist es vorgesehen, dass
als Oberschicht oder als oberster und von der Elektrode abgewandter
Bereich oder Oberflächenbereich
des Isolationsbereichs eine Schicht einer amphiphilen organischen
Verbindung vorgesehen ist, insbesondere eines Lipids und/oder dergleichen.
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Durch dieses Vorgehen wird ebenfalls
eine Anordnung und Strukturierung der Oberfläche des Isolationsbereichs
erzwungen. Die amphiphilen Verbindungen besitzen zumindest einen
Bereich, der polar ausgebildet ist, so dass sich im Messmedium,
welches insbesondere wässrige
Natur besitzt, eine gewisse partielle Lösbarkeit ergibt. Andererseits
besitzen amphiphile organische Verbindungen einen unpolaren oder
hydrophoben Bereich, dessen Anordnung in einem wässrigen Messmedium energetisch weniger
bevorzugt ist. Durch diese Phänomene
bildet sich bevorzugt eine Schichtstruktur aus, bei welcher die
polaren oder wasserlöslichen
Bereiche der amphiphilen Verbindung dem wässrigen Messmedium zugeordnet
sind, wogegen sich die unpolaren oder hydrophoben Bereiche der amphiphilen
organischen Verbindung vom wässrigen
Messmedium abgewandt anordnen. Es kann sich somit eine Monoschicht
ausbilden, die insbesondere den Oberflächenbereich des Elektrodenbereichs
bildet. Dies geschieht bevorzugt in Kombination mit einer Alkanthiolmonoschicht
als Unterschicht, so dass sich als Isolationsbereich zumindest teilweise
eine Doppelschicht zweier Monoschichten oder Monolagen ergibt.
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Die so ausgebildete Abfolge zweier
Monoschichten hat gewisse strukturelle Ähnlichkeiten mit bestimmten
Membranstrukturen, die aus biologischen Systemen bekannt sind, so
dass man der so ausgebildeten Abfolge zweier Monoschichten – nämlich der
der Elektrode zugewandten Alkanthiolmonoschicht und der darüber angeordneten
Lipidmonoschicht – eine
gewisse Membranstruktur zuordnen kann. Aufgrund des zugrundeliegenden
Festkörperträgers bezeichnet
man diese Membranstruktur auch als festkörperunterstützte Membran SSM (SSM : Solid
Supported Membrane). Diese Membranstruktur oder Biosensormembran
hat im Hinblick auf die Anordnung und Eigenschaft der erfindungsgemäßen Sensorelektrodeneinrich tung
als kapazitiv gekoppelte Elektrode besonders günstige Eigenschaften.
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Insbesondere weist derjenige Bereich,
welcher durch den die Elektrode isolierenden und/oder abdeckenden
Bereich des Isolationsbereichs definiert wird, die eben beschriebene
Membranstruktur in vorteilhafter Weise auf. Dabei ist es von Vorteil,
dass diese Membranstruktur zumindest teilweise eine spezifische
elektrische Leitfähigkeit
von etwa Gm ≈ 1 – 100 nS/cm2 besitzt.
Des Weiteren ergibt sich in vorteilhafter Weise eine spezifische
elektrische Kapazität
von etwa Cm ≈ 10 – 1000 nF/cm2.
Schließlich
ist alternativ oder ergänzend
eine Fläche
für die
Membranstruktur von etwa A ≈ 0,1 – 50 mm2 vorgesehen.
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Die hohe spezifische Kapazität Cm ist von besonderem Vorteil im Hinblick
auf eine durchzuführende
amperometrische Wirkstofftestung, bei welcher initiierte elektrische
Aktionen der im Wesentlichen biologischen Einheiten als elektrische
Ströme,
nämlich als
Verschiebungsströme
oder kapazitive Ströme
gemessen werden.
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Im Hinblick auf das Signalrauschverhältnis ist
ein entsprechender Abdichtwiderstand im Bereich von wenigen Nanosiemens
von besonderem Vorteil.
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Dieser kann auch durch Aufbringen
einer Teflonschicht, zum Beispiel direkt auf die Metallelektrode,
erreicht werden. Ein derartiges Vorgehen ist zum Beispiel für potenziometrische
Wirkstofftestungen vollständig
ausreichend, da es hier nicht auf eine hohe elektrische Kapazität ankommt,
sondern wegen der Spannungsmessung auf den hohen Abdichtwiderstand.
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Besonders einfache geometrische Verhältnisse
ergeben sich, insbesondere im Hinblick auf die Reproduzierbarkeit
der Messergebnisse, wenn der Träger,
die Elektrode und/oder der Isolationsbereich und/oder deren Ober-
oder Grenzflächenbereiche zumindest
teilweise im Wesentlichen planar ausgebildet sind, insbesondere
auch auf mikroskopischer Ebene oder Skala. Die Planarität gewährleistet,
dass bestimmte Feldstärkeeffekte
an Kanten oder Spitzen, die zum Durchbruch des Abdichtwiderstands
führen könnten, ausbleiben.
Des Weiteren ergibt sich im Hinblick auf den Austausch des vorzusehenden Messmediums
im Betrieb der Vorteil einer homogenen Grenzflächenverteilung. Etwaige Protuberanzen oder
Kavitäten
würden
an der Grenzfläche
zwischen dem Isolationsbereich und dem Messmedium zu Konzentrationsinhomogenitäten führen, die
sich unter Umständen
nachteilig auf erreichte Nachweis- oder Messergebnisse auswirken könnten. Die
Planarität,
insbesondere der metallischen Grenzflächen, kann durch entsprechende
Herstellungsverfahren, zum Beispiel durch epitaktisches Aufwachsen,
Annealen oder dergleichen gewährleistet
werden.
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Zur externen Kontaktierung der Sensoranordnung,
zum Beispiel mit einem äußeren Messkreis oder
dergleichen, ist ein Kontaktbereich vorgesehen, wobei insbesondere
eine entsprechende Isolation zur Vermeidung sonstiger Kurzschlüsse, insbesondere
in Bezug auf das Messmedium, ausgebildet ist.
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Besonders vorteilhaft im Hinblick
auf einen hohen Durchsatz bei entsprechend durchzuführenden
Wirkort- und/oder Wirkstofftests ist es, wenn die erfindungsgemäße Sensoranordnung
so ausgebildet ist, dass sie, zumindest im Betrieb, gegenüber Flüssigkeitsströmungen mit
hohen Strömungsgeschwindigkeiten,
vorzugsweise im Bereich von etwa v ≈ 0,1 – 2 m/s im Wesentlichen konstante
mechanische, elektrische und/oder strukturelle Eigenschaften, insbesondere
im Bereich der Membranstruktur und/oder insbesondere im Hinblick
auf die Anlagerung und/oder Anordnung von Primärträgern, aufweist. Diese geforderte
und vorteilhafte Konstanz der mechanischen, elektrischen und/oder
strukturellen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Sensoranordnung und insbesondere
der darin vorgesehenen Membranstruktur ergibt sich bereits inhärent aus
den zuvor genannten Maßnahmen
zur Ausbildung der Elektrode und der die Elektrode abdeckenden Isolationsschichten,
insbesondere in Form von Self-Assembling-Monoschichten aus einem
Alkanthiol auf Gold mit einer entsprechenden Monoschicht aus Lipid
in einem wässrigen
Medium.
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Es ist vorgesehen, dass isolierte
und ganze Zellen als Primärträger entsprechender
Wirkort komplexe, welche zu einer elektrischen Aktion aktivierbar sind,
verwendet werden. Darüber
hinaus können auch
bestimmte Oozyten, Bakterien, Organellen oder Viren als Ganzes untersucht
werden. Ferner ist denkbar, durch bestimmte mikrobiologische oder
biochemische Maßnahmen
Bestandteile oder Fragmente von Zellen, Oozyten, Bakterien, Organellen
oder Viren, als Primärträger zu verwenden.
Weiterhin ist auch denkbar, Verbände
von Zellen, Bakterien oder dergleichen als Primärträger zu verwenden und diese
an die entsprechende Sensorelektrodeneinrichtung zur Ausbildung
einer erfindungsgemäßen Sensoranordnung
anzukoppeln.
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Des Weiteren besteht die Möglichkeit,
sämtliche
dieser vorgeschlagenen Primärträger in ihrer nativen
Form oder in einer abgewandelten Form zu verwenden. Dabei können zum
Beispiel eukariontische Zellen, prokariontische Zellen oder Bakterien verwendet
werden, die durch entsprechende Reinigungs-, mikrobiologische und/oder
molekularbiologische Verfahren abgeändert wurden, zum Beispiel
um bestimmte Proteine mit bestimmten gewünschten Eigenschaften bevorzugt
auszubilden.
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Neben den in natürlicher Form bereits bereitstehenden
Primärträgern in
Form von Zellen, Bakterien und dergleichen ist es auch denkbar,
künstliche Primärträger zu erzeugen,
zum Beispiel in Form von Vesikeln, Liposomen, mizellären Strukturen
und/oder dergleichen. Diese werden dann gegebenenfalls mit entsprechenden
biologischen Einheiten, welche zu einer elektrischen Aktion aktivierbar
sind, versehen und/oder angereichert. Entsprechende Verfahren zur Rekonstitution
von Membranproteinen oder dergleichen in Vesikeln oder Liposomen
sind bekannt und können
hier in vorteilhafter Art und Weise ausgenutzt werden, um besonders
vorteilhafte Ausführungsformen
der erfindungsgemäßen Sensoranordnung
zu schaffen.
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Die Wirkortkomplexe und insbesondere
die H+-K+-ATPase
können
jeweils in im Wesentlichen nativer Form und/oder in abgewandelter,
insbesondere gereinigter, mikrobiologisch und/oder molekularbio logisch
geänderter
Form vorgesehen sein. Zum einen können dadurch bestimmte native
Eigenschaften getestet und pharmakologisch untersucht werden. Andererseits
bieten sich auch molekularbiologische oder gentechnisch initiierte
Veränderungen
an, die bestimmten Aspekte, zum Beispiel des Transports oder der
pharmakologischen Wirkungsweise eines Wirkstoffes zu analysieren.
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Besonders vorteilhaft ist es, dass
Primärträger eines
jeweils im Wesentlichen einheitlichen Typs von Primärträgern vorgesehen
werden. Dies ist im Hinblick auf eine möglichst eindeutige Aussage
und Analyse eines Wirkstofftests von Bedeutung und bezieht sich
auf die geometrischen, physikalischen, chemischen, biologischen
und molekularbiologischen Eigenschaften der Primärträger.
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Das Nämliche gilt auch für die in
dem Primärträger vorgesehenen
Wirkortkomplexe und die H+-K+-ATPase.
Hier sind Wirkort komplexe und eine H+-K+-ATPase eines jeweils im Wesentlichen einheitlichen
Typs vorgesehen, insbesondere im Hinblick auf ihre geometrischen,
physikalischen, chemischen, biologischen und molekularbiologischen
Eigenschaften. Zusätzlich
sollen die biologischen Einheiten in vorteilhafter Weise im Hinblick
auf ihre Orientierung und/oder im Hinblick auf ihre Aktivierbarkeit
in Bezug auf den jeweiligen Primärträger in etwa
einheitlich sein.
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Zur Erzielung einer möglichst
hohen Signalqualität
ist es von Vorteil, dass die Oberflächen der Primärträger und/oder
der Sekundärträger so ausgebildet
werden, dass eine Anlagerung und/oder Anordnung der Primärträger am Sekundärträger begünstigt wird.
Dadurch erhält
man eine besonders hohe Anzahl angelagerter Primärträger und/oder einen besonders
innigen Kontakt der Primärträger am Sekundärträger, wodurch
die elektrische Kopplung und somit das Signal-zu-Rauschverhältnis gesteigert werden.
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Die Anlagerung kann z.B. über die
sogenannte Lipid-Lipid-Wechselwirkung
zwischen Primärträger, z.B.
Vesikel, und dem Sekundärträger, z.B.
Lipid-Thiol-Biosensormembran, gesteuert sein. Es ist auch eine kovalente
Bindung oder eine spezifische Wech selwirkung der Primärträger an oder
mit der Oberfläche
der Sekundärträger denkbar,
letztere z.B. in Form eines Biotin-Streptavidin-Schemas oder im Sinne einer
His-Tag-Kopplung.
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Dabei ist es von besonderem Vorteil,
wenn die Oberflächen
der Primärträger und
der Sekundärträger entgegengesetzt
polar zueinander ausgebildet wird. Dies fördert die Anlagerungsrate der
Primärträger am Sekundärträger sowie
die Stärke
des Kontakts zwischen diesen.
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Von besonderem Vorteil ist es, wenn
als Primärträger im Wesentlichen
gleich wirkende und/oder gleichartige Vesikel oder Liposomen, vorzugsweise aus
einem Lipid, verwendet werden, in und/oder an deren Membran Wirkortkomplexe
in vorzugsweise orientierter Form ein- und/oder angelagert sind.
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Durch die Verwendung der im erfindungsgemäßen Verfahren
zum Identifizieren eines Wirkstoff komplexes beschriebenen Sensoranordnung
ergibt sich in vorteilhafter Weise eine gegenüber der herkömmlichen
Vorgehensweise erheblich verlängerte Zeitspanne
für eine
Vielzahl von Testläufen
unter den verschiedensten Versuchsbedingungen, und zwar ohne Einbußen in der
Nachweisgenauigkeit, der Signalqualität oder sonstiger Eigenschaften
der Messsonde. Des Weiteren kann aufgrund der Robustheit der Sensoranordnung
mit höherer
Geschwindigkeit gearbeitet werden, dies betrifft sowohl die Handhabung
des eigentlichen Sensors als auch die Austauschgeschwindigkeit oder
Strömungsgeschwindigkeit
des fluiden Messmediums im Messbereich.
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Vorteilhafterweise sind, insbesondere über die
Austauscheinrichtung, über
das Messmedium die Messbedingungen, insbesondere die pharmakologischen
Bedingungen einstellbar und/oder änderbar, insbesondere in kontinuierlicher
Art und Weise, vorzugsweise nach Art eines kontinuierlichen Fließsystems.
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Erfindungsgemäß ergibt sich eine wohldefinierte
Einstellbarkeit und/oder Änderbarkeit
der Messbedingungen und aufgrund der Stabilität der verwendeten Sensoranordnung
ein Austausch und/oder eine Änderung
des Messmediums auf leichte Art und Weise. Durch den Austausch können auch
entsprechende Änderungen
im Hinblick auf die Substratbedingungen oder sonstige Eigenschaften der
Messumgebung auf einfache Art und Weise und in kürzerer Zeit erreicht werden.
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Insbesondere bietet es sich an, als
Austausch-/Mischeinrichtung ein Pumpensystem, Perfusorsystem und/oder
dergleichen zu verwenden, so dass die Sensorelektrodeneinrichtung
(der Sekundärträger) im
Rahmen eines Fließsystems
ständig vom
Messmedium umströmt
wird. In einem derartigen Fließsystem
können
dann durch externes Zumischen entsprechende zu untersuchende Messbedingungen
geschaffen werden.
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Dabei ist es insbesondere von Vorteil,
dass im Messbereich Fließgeschwindigkeiten
oder Strömungsgeschwindigkeiten
von etwa v ≈ 0,1 – 2 m/s
erzeugbar sind, insbesondere gerade im Bereich, Nahbereich oder
der Nachbarschaft der Sensorelektrodeneinrichtung (der Sekundärträger) und/oder
insbesondere durch die vorgesehene Austausch-/Mischeinrichtung.
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Der Vorteil der hohen Fließ- und/oder
Strömungsgeschwindigkeiten
ergibt sich zum einen aufgrund der mechanischen Stabilität der erfindungsgemäßen Sensoranordnung
und der ihr zugrundeliegenden Sensorelektrodeneinrichtung.
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Darüber hinaus ist es aber vorteilhaft,
dass neben der Verwendung von ganzen Zellen, Bakterien oder dergleichen,
welche vergleichsweise groß ausgebildet
sind, in vorteilhafter Weise auch Vesikel und Liposomen sowie Membranfragmente
als Primärträger für die biologischen
Einheiten, insbesondere Membranproteine, eingesetzt werden können. Vesikel,
Liposomen, Membranfragmente und dergleichen sind vergleichsweise
klein ausgebildet und besitzen im Verhältnis zu ihrer Größe oder
ihrer Oberfläche eine
vergleichsweise stärkere
Neigung zur Anlagerung oder Adsorption an der Oberfläche der
Messsonde. Darüber
hinaus erfahren sie aufgrund ihrer geringeren Oberfläche im Bereich
der Strömung
des Messmediums im Vergleich zu ganzen Zellen oder dergleichen sehr viel
geringere Scherkräfte,
so dass sie auch bei höheren
Fließ- und/oder Strömungsgeschwindigkeiten
an der Sensorelektrodeneinrichtung im Rahmen der erfindungsgemäßen Sensoranordnung
haften bleiben, so dass sich die Versuchsbedingungen oder Testbedingungen
nicht ändern.
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Als Messbereich kann einfach ein
im Wesentlichen geschlossenes Gefäß oder eine Gefäßeinrichtung
verwendet werden. Als Messraum kann zum Beispiel eine Art Kompartment
oder Küvette
verwendet werden, an deren Bodenbereich die Sensoranordnung in Form
einer erfindungsgemäß ausgebildeten
Sensoranordnung angeordnet ist.
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Es kann auch eine Mehrzahl integrierter
Sensoranordnungen, vorzugsweise in separaten, strömungsmäßig und
elektrisch voneinander entkoppelten und unabhängigen Vertiefungsbereichen
einer Mikroplatte oder Mikrotiterplatte vorgesehen sein, vorzugsweise
um 8, 12, 96 Messkanäle
auf einem Raster zu verwenden. Es ist also denkbar, dass eine Mehrzahl
von Sensoranordnungen vorgesehen wird, insbesondere um einen Parallelbetrieb
für mehrere unabhängige Testreihen
simultan durchzuführen.
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Darüber hinaus ist es vorgesehen,
dass eine Austausch-/Mischeinrichtung
und/oder ein Messraum verwendet werden, welche für die Mehrzahl von Sensoranordnungen
unabhängig
und/oder entkoppelt voneinander entsprechende Messbedingungen auf
definierte Art und Weise einstellen und ändern. Es kann sich bei dem
Messraum zum Beispiel um eine Anordnung voneinander strömungsmäßig getrennter
Küvetten
oder Kompartments handeln. Dabei kann auch eine gemeinsame Austausch-/Messeinrichtung
verwendet werden, über
welche für
alle Messräume
simultan dieselben Messbedingungen, zum Beispiel hinsichtlich des
Messmediums oder dergleichen, geschaffen werden. Wichtig dabei ist aber
die strömungsmäßige und
vor allem elektrische Entkopplung der voneinander getrennt zu betrachtenden
Messräume.
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Insbesondere ist es vorgesehen, eine
Messanordnung für
die erfindungsgemäße Vorrichtung zu
verwenden, bei welcher die Testvorgänge an Messsensoren in mehr
oder weniger miniaturisierter Form durchgeführt werden können. Zum
Beispiel kann ein Messraum verwendet werden, welcher dazu in Form
oder im Raster einer Mikroplatte oder Mikrotiterplatte oder dergleichen
ausgebildet ist, wobei eine Mehrzahl integrierter Sensoranordnungen,
vorzugsweise in separaten und strömungsmäßig und/oder elektrisch voneinander
entkoppelten, und/oder voneinander unabhängigen Vertiefungsbereichen
davon ausgebildet ist. Vorzugsweise können die Vertiefungsbereiche
und die darin vorgesehenen Sensoranordnungen in Form eines Rasters
auf einer derartigen Mikroplatte angeordnet sein, um eine Anordnung
von 4, 8, 12, 96 oder dergleichen parallelen Messkanälen zu realisieren.
Dabei können
dann entsprechend gängige
4-, 8- 12-, 96-kanalige Pipettierautomaten für die Probenzugabe zum Einsatz
kommen.
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Nachfolgend wird die vorliegende
Erfindung anhand einer schematischen Zeichnung auf der Grundlage
bevorzugter Ausführungsbeispiele
näher erläutert.
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1 zeigt
schematisch den Metabolismus der Parietalzelle der Magenschleimhaut.
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2A-B zeigen
histologische Aufnahmen einer Parietalzelle der Magenschleimhaut
im nicht aktiverten bzw. im aktivierten Zustand.
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3 zeigt
in Form eines Graphen schematisch den durch die H+-K+-ATPase hervorgerufenen Transportstrom I(t)
als durch die Biosensorelektrode messbare elektrische Aktion.
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4 zeigt
eine schematische und teilweise geschnittene Seitenansicht einer
Vorrichtung zur Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren.
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5 zeigt
eine Ausführungsform
einer Sensoranordnung mit einem Membranfragment als Primärträger.
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6A-D zeigen
in einer schematischen Seitenansicht eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens.
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7A-C zeigen
in einer schematischen Seitenansicht eine andere Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens.
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1 zeigt
in schematischer Form einen Teil des Metabolismus der Parietalzelle 10 oder
Belegzelle 10 – aufgefasst
als Primärträger 10 – der Magenschleimhaut
des Menschen. Die Parietalzelle 10 besitzt eine Zellmembran 11,
welche die intrazelluläre Seite 10b von
der extrazelluläre
Seite 10a der Zelle 10 zumindest teilweise isoliert.
In die Zellmembran eingebaut sind verschiedene als Transportsysteme dienende
Membranproteine. Es finden sich dort z.B. die Na+-K+-ATPase 101, ein Chloridtransporter 102, ein
Chlorid-Hydrogenkarbonat-Austauschsystem 103 sowie die
hier in Rede stehende H+-K+-ATPase 12.
Durch den Energie verbrauchenden Transport von Protonen H+ von der
intrazellulären
Seite 10b zur extrazellulären Seite 10a der
Zelle 10 wird im Lumen 30 des Magens der pH-Wert
angehoben, wodurch Verdauungsvorgänge aktiviert und durchgeführt werden.
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Die 2A und 2B zeigen histologische Aufnahmen einer
Parietalzelle 10 oder Belegzelle 10 der Magenschleimhaut
des Menschen im nicht aktiverten – 2A – bzw. im
aktivierten Zustand – 2B. Die Zellen 10 bestehen aus
einer Zellmembran 11, einem Kern N, Organellen – z.B. Vakuolen
V, Mitochondrien M und endoplasmatische Reticula R. Der Bürstensaummembranbereich
der Zellmembran 10 enthält eine
Vielzahl so genannter intrazellulärer Canaliculi C, welche in
das Drüsenlumen 30 oder
Magenlumen 30 münden
und über
welche der in 1 gezeigte Metabolismus
letztlich zur Protonenausschüttung
in das Magenlumen 30 hinein führt.
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Im inaktiven Zustand gemäß 2A ist die Canaliculistruktur C vergleichsweise
abschottet oder verschlossen gegenüber dem Drüsenlumen 30 oder Magenlumen 30.
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Im stimulierten oder aktivierten
Zustand gemäß 2B jedoch sind die Canaliculistrukturen
C und die Vakuolen V erweitert, und die Canaliculistrukturen C sind
gegenüber
dem Drüsenlumen 30 oder Magenlumen 30 für die Protonenausschüttung geöffnet.
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3 zeigt
in Form eines Graphen beim erfindungsgemäßen Verfahren gemessene elektrische Ströme I(t)
als Funktion der Zeit t, welche für die Transportströme der H+-K+-ATPase 12 repräsentativ sind.
Die Abszisse bezeichnet jeweils die Zeit t, wobei t=0 denjenigen
Zeitpunkt angibt, bei welchem das Messmedium von einem nicht aktivierendem
zu einem aktivierendem gewechselt wird. D.h., bei t=0 wird das Substrat
ATP, welches vor t=0 fehlte, zugesetzt. Die Ordinate bezeichnet
den gemessenen elektrischen Strom I(t), als Funktion der Zeit t,
welcher über
die Biosensorelektrode gemessen wird.
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Die Spur A der 3 zeigt eine Messung, bei welcher die
H+-K+-ATPase 12 durch
ATP-Zugabe zum Zeitpunkt t=0 normal aktiviert wird. Unter ATP-Hydrolyse
werden mittels der H+-K+-ATPase 12 über die
Primärträger 10,
z.B. über
Membranfragmente oder Vesikel, Protonen auf die Biosensormembran
und deren Elektrode zu bewegt. Dies wird am positiven elektrischen
Messstrom I(t) erkennbar.
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Die Spur B der 3 zeigt die gleiche Messung nach Gabe
eines potenziellen Wirkstoffes W in Form eines potenziellen Inhibitors.
Deutlich erkennbar ist, dass sich nach Gabe von ATP zum Zeitpunkt t=0
kein deutlicher Transport- oder Nachweisstrom I(t) einstellt. Dies
lässt darauf
schließen,
dass enzymatische Eigenschaften der H+-K+-ATPase 12, welche den Protonentransport über die
Zellmembran 11 vermitteln, durch den verwendeten Wirkstoff
W modifiziert oder inhibiert wurden. Somit ist der potenzielle Wirkstoff
W als eine Art Inhibitor klassifiziert.
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4 zeigt
in einer schematischen und teilweise geschnittenen Seitenansicht
eine Vorrichtung zur Identifizierung eines Wirkstoffkomplexes W.
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Ein Messraum, Messbereich oder Messgefäß 50 in
Form eines im Wesentlichen geschlossenen Gefäßes bildet zusammen mit einer
Austausch-/Mischeinrichtung 60, zum Beispiel in Form eines
Perfusorsystems oder einer Pumpenanlage, einen geschlossenen Flüssigkeitskreislauf.
Die Kommunikation der als Messmedium 30 dienenden Flüssigkeit
erfolgt über
entsprechende Zuführ-
und Abführeinrichtungen 51 bzw. 52.
Das Messmedium 30 kann dabei eine wässrige Elektrolytlösung sein,
die bestimmte Ionenanteile, eine gegebene Temperatur, einen bestimmten
pH-Wert usw. aufweist. Des Weiteren sind im Messmedium 30 gegebenenfalls
ATP als Substratstoff S und ein bestimmter potenzieller Wirkstoff
W oder Wirkstoffkomplex W enthalten, oder sie werden in späteren Verfahrensschritten
durch die Austausch-/Mischeinrichtung 60 hinzugefügt.
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Im Messbereich 50 ist eine
Sensoranordnung 1 vorgesehen. Die Sensoranordnung 1 besteht aus
Primärträgern 10,
welche am Oberflächenbereich 24a der
als Sekundärträger dienenden
Sensorelektrodeneinrichtung 20 oder Biosensorelektrode 20 angelagert
sind.
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In dem in 4 in schematischer und nicht maßstabsgetreuer
Form gezeigten Ausführungsbeispiel
ist nur ein einziger Primärträger 10 gezeigt.
Dieser besteht aus einem Lipidvesikel oder Liposom in Form einer
im Wesentlichen hohlkugelförmig
und geschlossen ausgebildeten Lipiddoppelschicht oder Lipidmembran 11.
In diese Lipiddoppelschicht 11 des als Primärträger 10 dienenden
Vesikels ist als biologische Einheit 12 oder als Wirkortkomplex
ein H+-K+-ATPase-Proteinmolekül membrandurchgreifend
eingelagert.
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Durch Umsetzung eines im Messmedium 30 vorhandenen
Substrats S in Form von ATP zu einem umgesetzten Substrat S' in Form von ADP
werden in der H+-K+-ATPase 12 bestimmte
Prozesse initiiert, die in dem in 4 gezeigten
Fall zu einem Stofftransport einer Spezies Q in Form von Protonen
H+ von der extravesikulären Seite oder Außenseite 10a des
Vesikels 10 zur intravesikulären Seite oder Innenseite 10b des
Vesikels 10 führt.
Da die Spezies H+ mit einer elektrischen
Ladung behaftet ist, führt der
Transport dieser Spezies H+ von der Seite
10a zur Seite 10b zu einem Nettola dungstransport, welcher mit einem
elektrischen Strom I(t) als Funktion der Zeit t von der Außenseite 10a des
Vesikels 10 zur Innenseite 10b des Vesikels 10 korrespondiert.
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Angedeutet ist zwar auch ein K+-Rücktransport
von der Innenseite 10b zur Außenseite 10a, dieser
entfällt
aber in K+-freien Messmedien, so dass dann
der Transport der H+-K+-ATPase 12 nicht
elektroneutral erscheint, sondern wegen des ausschließlich vorliegenden
H+-Transportzyklus' messbar ist.
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Zum einen sind in jedem Vesikel 10 in
der Regel eine Vielzahl im Wesentlichen identischer Membranproteinmoleküle oder
H+-K+-ATPase-Moleküle 12 – ggf. in
im Wesentlichen gleicher Orientierung – in der Membran 11 des
Vesikels 10 eingebaut. Werden diese im Wesentlichen simultan
aktiviert – z.B.
durch einen durch Mischen initiierten Konzentrationssprung in der
Konzentration des Substrats ATP von einem nicht aktivierenden Messmedium
N, 30 ohne Substrat ATP zu einem aktivierenden Messmedium
A, 30 mit Substrat ATP – so führt das zu einem messbaren
elektrischen Strom I(t).
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Dieser Ladungsträgertransport ist deshalb messbar,
weil eine Vielzahl von Primärträgern 10 oder
Vesikeln an der Oberfläche 24a der
Sensorelektrodeneinrichtung 20 angelagert ist, so dass
sich bei Aktivierung einer Vielzahl von Proteinmolekülen H+-K+-ATPase-Moleküle 12 in
einer Vielzahl von Vesikeln vor der Oberfläche 24a der Sensorelektrodeneinrichtung 20 eine
Raumladung bestimmter Polarität ausbildet.
Diese Raumladung wirkt dann auf die Elektrode 26, die in
dem in 4 gezeigten Fall
auf einem Träger 22 aus
Glas in Form einer Goldschicht aufgedampft ist und durch eine als
Isolationsbereich 24 dienende Doppelschicht aus einer unteren Schicht 24b und
einer als Oberfläche
dienenden Oberschicht 24a abgedeckt und gegenüber dem Messmedium 30 elektrisch
isoliert wird.
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Die Oberfläche oder obere Schicht 24a des Isolationsbereichs 24 ist
zum Beispiel ein zur Lipiddoppelschicht 11 des Vesikels 10 kompatible
Lipidmonoschicht, die mittels eines Self-Assembling- Vorgangs auf einer
die untere Schicht 24b bildenden Alkanthiolmonoschicht
ausgebildet ist, so dass die Abfolge der Schichten 24b und 24a,
nämlich
die Abfolge aus einer Alkanthiolmonoschicht und einer Lipidmonoschicht
auf einem festkörperartig
ausgebildeten Goldsubstrat als Elektrode 26 eine Membranstruktur SSM
bildet, die auch als festkörperunterstützte Membran
bezeichnet wird.
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Über
eine Anschlussleitung 48i ist die Sensoranordnung 1 und
insbesondere die Sensorelektrodeneinrichtung 20 mit einer
Datenerfassungs-/Steuereinrichtung 40 verbunden. Diese
weist einen Messeinrichtung 44 auf, in welchem in zeitlicher
Abhängigkeit
ein elektrischer Strom I(t) oder eine elektrische Spannung U(t)
gemessen werden kann. Des Weiteren ist eine Verstärkereinrichtung 42 vorgesehen,
in welcher die Messsignale gefiltert und/oder verstärkt werden. Über eine
Steuerleitung 48s wird die Wirkstofftestung durch Steuerung
der Austausch-/Mischeinrichtung 60 geregelt. Über eine weitere Leitung 48o wird
der elektrische Stromkreis mittels einer Gegenelektrode 46,
zum Beispiel in Form einer Pt/Pt-Elektrode oder mittels einer Ag/AgCl-Elektrode
geschlossen. Isolationen 28, 27 und 47 verhindern
Kurzschlüsse
der Biosensormembran bzw. der Gegenelektrode 46 gegenüber dem
Messmedium 30.
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5 zeigt
in schematischer und teilweise geschnittener Seitenansicht eine
Ausführungsform der
erfindungsgemäßen Sensoranordnung 1,
bei welcher als Primärträger 10 anstelle
eines Vesikels oder Liposoms ein Membranfragment 10 vorgesehen ist,
in welches in orientierter Art und Weise ein als biologische Einheit 12 dienendes
H+-K+-ATPase-Molekül 12 eingelagert
ist. Auch in Bezug auf die Ausführungsform
der 5 ist festzuhalten,
dass die Darstellung nicht maßstabsgetreu
ist, und zum anderen in der Regel eine große Mehrzahl von Membranfragmenten
gleichzeitig auf der Biosensormembran oder der Oberfläche 24a der
als Sekundärträger dienenden
Sensorelektrodeneinrichtung 20 angelagert oder adsorbiert
sind.
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Auch hier ist wieder gezeigt, dass
durch Umsetzung des im Messmedium 30 vorgesehenen Substrats
ATP zu einem umgesetzten Substrat ADP ein Stofftransport der Spezies
H+ von einer Seite 10a des Membranfragments 10 zur
gegenüberliegenden
Seite 10b erfolgt, welcher über den entsprechenden Nettoladungstransport
und den damit verbundenen Verschiebungsstrom in zeitlich abhängiger Form
nachgewiesen werden kann.
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Die 6A bis 6D zeigen eine Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
zur amperometrischen und/oder potenziometrischen, pharmakologischen
Wirkort- und/oder Wirkstofftestung.
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In einem als Küvette ausgebildeten Messraum 50 ist
an einer als Sensorelektrodeneinrichtung 20 dienenden Biosensormembran
ein Ensemble von Vesikeln 10 mit einem dort eingelagerten
Membranprotein 12 in Form von H+-K+-ATPase-Molekülen 12 adsorbiert.
Die so ausgebildete Sensoranordnung 1 ist dabei im Messraum 50 in
einem vorgesehenen Messmedium 30 inkubiert.
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Der Messraum 50 ist über eine
Zuführleitung 51 über eine
vorgesehene erste Ventileinrichtung V1 steuerbar wahlweise mit einer
Mehrzahl von Vorratsgefäßen 53, 54 und 55 verbunden,
in welchen bestimmte Volumina des Messmediums 30 mit bestimmten
weiteren Inhaltsstoffen versehen, vorgesehen sind. So enthält das erste
Vorratsgefäß 53 der 6A bis 6D ein nicht aktivierendes Messmedium N,
welches so gewählt
ist, dass die in den Vesikeln 10 eingelagerten H+-K+-ATPase-Moleküle 12 durch
die Zusammensetzung des Messmediums des Typs N nicht zu einer elektrischen
Aktion aktiviert werden. Im zweiten Vorratsgefäß 54 der 6A bis 6D ist ein Messmedium A enthalten, durch
welches die H+-K+-ATPase-Moleküle 12 in
den Vesikeln 10 zu einer elektrischen Aktion, also zu einem
Ladungstransport oder dergleichen, aktivierbar sind. Im dritten
Vorratsgefäß 55 der 6A bis 6D schließlich ist dem aktivierenden
Messmedium A des Gefäßes 54 ein Wirkstoff
W hinzugefügt
worden, dessen Wirkung auf die Aktivität der H+-K+-ATPase 12 in
den Vesikeln 10 ermittelt werden soll.
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Über
eine Abführeinrichtung 52 oder
Abführleitung
ist der Messraum 50 oder die Küvette über eine zweite Ventileinrichtung
V2 zumindest mit einem Teil der Austausch-/Mischeinrichtung 60 verbunden. Des
Weiteren kann über
das Ventil V2 ein Entsorgungsgefäß E hinzugeschaltet
werden, zum Beispiel um die Austausch-/Mischeinrichtung 60 zu entleeren.
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In einer ersten Phase der pharmakologischen
Wirkstofftestung, welche in 6A gezeigt
ist, ist der Messraum 50 über die erste Ventileinrichtung V1
und die Zuführeinrichtung 51 mit
dem ersten Vorratsgefäß 53 verbunden.
Andererseits ist der Messraum 50 über die Abführeinrichtung 52 und über die zweite
Ventileinrichtung V2 mit der Austausch-/Mischeinrichtung 60 verbunden.
Durch Betrieb der Austausch-/Mischeinrichtung 60 wird eine Saugkraft über die
miteinander verbundenen Bereiche ausgeübt, so dass aus dem Vorratsgefäß 53 das nicht
aktivierende Messmedium N durch die Küvette des Messraums 50 strömt und die
Biosensormembran sowie die proteinhaltigen Vesikel 10 umspült oder umströmt. In diesem
Zustand kann keinerlei elektrische Aktivität der H+-K+-ATPase 12 gemessen
werden, und diese Phase dient der Equilibration der Biosensormembran
sowie der Aufnahme von Störsignalen
und dem Abgleich des Rauschens.
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In der in 6B gezeigten zweiten Testphase wird über die
Datenerfassungs-/Steuereinrichtung 40 die erste Ventileinrichtung
V1 so geschaltet, dass die Zuführeinrichtung 51 des
Messraums 50 mit dem zweiten Vorratsgefäß 54 kommunizierend
verbunden ist, so dass auf Betrieb der Austausch-/Mischeinrichtung 60 hin
das aktivierende Messmedium A durch die Küvette des Messbereichs 50 strömt, die
Biosensormembran sowie die proteinhaltigen Vesikeln strömt und umspült und somit
die in den Vesikeln 10 enthaltenen Membranproteine 12 zu
einem elektrogenen Ladungstransport anregt, welcher dann über die
in den 6A – 6D nicht gezeigte Datenerfassung
nachgewiesen werden kann.
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In einer in 6C gezeigten dritten Phase des Verfahrens
der pharmakologischen Wirkstofftestung wird die erste Ventileinrichtung
V1 derart geschaltet, dass der Messraum 50 mit dem dritten Vorratsgefäß 55 strömungsmäßig verbunden
ist, so dass auf Betrieb der Austausch-/Mischeinrichtung 60 hin nunmehr
das aktivierende Messmedium A unter Zusatz des Wirkstoffes W durch
die Küvette
des Messraums 50 strömt
und somit die Biosensormembran sowie die proteinhaltigen Vesikel 10 umspült.
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Durch Aufnahme etwaiger elektrischer
Signale unter dem Einfluss des hinzugefügten Wirkstoffes W kann im
Vergleich zu den während
der Phase der 6B aufgenommenen
Signale der Einfluss des Wirkstoffes auf die Aktivität der H+-K+-ATPase 12 in
den Vesikeln 10 im Wesentlichen ermittelt werden.
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In der Phase, welche in 6D gezeigt ist, wird die
in der Austausch-/Mischeinrichtung 60 aufgenommene Flüssigkeitsmenge
in das Entsorgungsgefäß E hin
entsorgt, wobei durch die zweite Ventileinrichtung V2 die Austausch-/Mischeinrichtung 60 ausschließlich mit
dem Entsorgungsgefäß E verbunden
ist.
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Selbstverständlich kann die in den 6A bis 6D gezeigte Anordnung bzw. das damit
in Zusammenhang stehende Testverfahren auch komplexer ausfallen
und weitere Messzwischenschritte, Spül- und Waschvorgänge enthalten.
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Grundsätzliche Vorteile der vorliegenden
Erfindung sind die hohe mechanische Stabilität der vorgesehenen Sensoranordnung
und damit einhergehend die große
Einsatzbereitschaft, die einfache Handhabbarkeit und geringer Störanfälligkeit.
In der Verwendung der Sensoranordnung ergeben sich im Rahmen von
pharmakologischen Wirkstofftests eine lange Lebensdauer, eine hohe
Zuverlässigkeit,
eine geringe Störanfälligkeit
sowie insbesondere ein gegenüber
herkömmlichen
Verfahren maßgeblich
gesteigerter Testdurchsatz, wodurch entsprechende Testverfahren
kostengünstig
ausgearbeitet und durchgeführt
werden können.
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Die 7A bis 7C beschreiben eine andere Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Vorgesehen sind dabei aber nur zwei Vorratsgefäße 53 und 54.
Das Vorratsgefäß 53 enthält wieder
eine nicht aktivierende Lösung
N. Das Vorratsgefäß 54 enthält als X
entweder in einem ersten Verfahrensschritt die aktivierende Lösung A und
in einem zweiten Verfahrensschritt eine aktivierende Lösung A +
W mit zu testendem Wirkstoff W. Im ersten Fall X = A wird die Aktivierung
der biologischen Einheit als Referenzsignal gemessen. Im zweiten
Fall X = A + W wird dann der Effekt des Wirkstoffes auf die Aktivierung
messbar.
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Im einfachsten Fall kann der Wirkstoff
W identisch sein mit dem Substrat ATP und/oder mit der Transportspezies
H+.
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- 1
- Sensoranordnung
- 10
- Primärträger, Vesikel,
Membranfragment
- 10a
- Oberfläche, Außenseite,
extravesikuläre Seite
- 10b
- Innenseite,
intravesikuläre
Seite
- 11
- Membran
- 12
- Wirkortkomplex,
Wirkort, H+-K+-ATPase
- 13
- Innenmedium
- 20
- Sekundärträger, Biosensorelektrode,
Sensorelektrodeneinrichtung
- 21
- Elektrodenbereich
- 22
- Träger
- 22a
- Oberflächenbereich
- 24
- Isolationsbereich
- 24a
- Oberschicht,
Oberflächenbereich,
Lipidmonoschicht
- 24b
- Unterschicht,
Thiol-/Mercaptanmonoschicht
- 24c
- Oberflächenbereich
- 26
- Elektrode
- 27
- Isolation
- 28
- Isolation
- 29
- Anschluss
- 30
- Messmedium
- 30-1
- erstes
und nicht-aktivierendes Messmedium
- 30-2
- zweites
und aktivierendes Messmedium
- 30-3
- drittes
und Test-Messmedium
- 30-4
- viertes
und Waschmedium
- 40
- Datenerfassungs-/Steuereinrichtung
- 42
- Verstärkereinrichtung
- 44
- Messeinrichtung
- 46
- Gegenelektrode
- 48i,o
- Anschlussleitungen
- 48s
- Steuerleitung
- 50
- Messbereich,
Gefäß, Küvette
- 51
- Zuführeinrichtung
- 52
- Abführeinrichtung
- 53
- Vorratsgefäß
- 54
- Vorratsgefäß
- 55
- Vorratsgefäß
- 60
- Austausch-/Mischeinrichtung
- 100
- Messvorrichtung
- 101
- Na+-K+-ATPase
- 102
- Chloridtransporter
- 103
- Chlorid-Hydrogenkarbonat-Austauscher
- A
- aktivierendes
Messmedium
- ADP
- Adenosindiphosphat
- ATP
- Adenosintriphosphat
- A
+ W
- aktivierendes
Messmedium mit Wirkstoff W
- C
- Canaliculi
- Cm
- spezifische
Kapazität
- E
- Entsorgung
- Gm
- spezifische
Leitfähigkeit
- H+
- Proton,
Wasserstoffion
- M
- Mitochondrium
- N
- nicht
aktivierendes Messmedium
- I(t)
- Stromsignal
- K+
- Kaliumkation
- N
- Zellkern
- 4
- Ladungsträger
- R
- endoplasmatisches
Reticulum
- S
- Substrat
- S'
- umgesetztes
Substrat
- SSM
- Membranstruktur,
festkörperunterstützte Membran,
Biosensormembran
- U(t)
- Spannungssignal
- V
- Fließgeschwindigkeit,
Strömungsgeschwindigkeit
- V
- Vakuole
- V1
- erste
Ventileinrichtung
- V2
- zweite
Ventileinrichtung
- W
- Wirkstoff,
Wirkstoffkomplex