CN112972694A - 一种具有细胞选择性的抗体修饰zif-8纳米材料及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有细胞选择性的抗体修饰ZIF‑8纳米材料，所述抗体修饰ZIF‑8纳米材料以沸石咪唑酸酯骨架8为载体，将蛋白包封在载体中，再在包封蛋白的载体表面吸附抗体制备而成，达到细胞选择性递送蛋白的目的。该材料制备方法简单，条件温和，细胞选择性高，递送蛋白效率提高，并保持了蛋白的生物活性，可进一步应用于疾病的精准治疗，在临床治疗方面具有应用价值。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种具有细胞选择性的抗体修饰ZIF-8纳米材料及其制备方法与应用。
(二)背景技术
现有技术中，利用蛋白质进行疾病治疗也越来越普遍，但由于蛋白质细胞低渗透性、存放条件苛刻，为了保证蛋白质的生理和生化性能，常常需要使用载体。其中已报道的沸石咪唑酸酯骨架8(ZIF-8)，以锌离子配位甲基咪唑形成的一种金属-有机框架(MOFs)，具有高比表面积、高空隙率、高稳定性，是一种优异的高效包封蛋白质的纳米载体。最近报道ZIF-8在有效递送蛋白质的同时，也能对细胞中pH响应，从而增强其溶酶体逃逸能力，促进蛋白质的有效释放。然而，尚未开发出精准靶向癌细胞的ZIF-8材料。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种具有细胞选择性的抗体修饰的ZIF-8纳米材料及其制备方法与应用，以沸石咪唑酸酯骨架8(ZIF-8)为载体包封蛋白，再通过吸附作用将抗体吸附到载体的表面，最终获得了具有细胞选择性的抗体修饰的ZIF-8纳米材料，用作蛋白递送载体。通过实例验证了该材料能够靶向特定的细胞进行蛋白递送，并利用递送蛋白的特性达到细胞毒性或基因编辑目的。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种具有细胞选择性的抗体修饰ZIF-8纳米材料，所述抗体修饰ZIF-8纳米材料以沸石咪唑酸酯骨架8(ZIF-8)为载体，将蛋白包封在载体中(记为蛋白@ZIF-8)，再在包封蛋白的载体表面吸附抗体制备而成(记为抗体@蛋白@ZIF-8)，达到细胞选择性递送蛋白的目的。所述抗体通过电荷吸附到包封蛋白的载体的表面，所述抗体的选择主要以靶向细胞外膜上的过表达抗原为靶点，包括特异性靶向细胞外膜上的过表达抗原EGFR的西妥昔单抗(Cetuximab，Cet)。
所述蛋白包括牛血清蛋白(BSA)、核糖核酸酶A(RNase A)或Cas9/sgRNA，但不仅仅局限于以上三种蛋白。其中Cas9蛋白选用氮末端含有一段核定位序列，所述核定位序列可以靶向细胞核并进行基因编辑，优选为Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val；优选Cas9通过表达质粒(pET-NLS-Cas9-6xHis，购于Addgene Cat：62934)(参考以下文献表达蛋白J.A.Zuris,D.B.Thompson,Y.Shu,J.P.Guilinger,J.L.Bessen,J.H.Hu,M.L.Maeder,J.K.Joung,Z.Y.Chen and D.R.Liu,Nat.Biotechnol.,2015,33,73-80.)制备，sgRNA以XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU模板定制，其中20个X碱基根据目的基因和CRISRP剪切条件设计，优选为CACGCCCGAUACGCUGAGUG。优选靶向GPX4的sgRNA(CACGCCCGAUACGCUGAGUGGUUUUAGAGCUAGAA
AUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU。将Cas9与sgRNA按物质的量之比为1：1混合，获得Cas9/sgRNA。
本发明所述抗体修饰ZIF-8纳米材料按如下方法制备：(1)包封蛋白的载体：在搅拌(优选390rpm)下，将蛋白添加到2-甲基咪唑(2-MIM)水溶液中，并在30℃下搅拌10分钟；滴加硝酸锌六水合物水溶液，在30℃下搅拌1小时，在6000rpm下离心10分钟，得到固体沉淀，用去离子水洗涤3次，即得到所述包封蛋白的载体溶液(优选以2mg/mL浓度保存在去离子水中)。所述蛋白与硝酸锌六水合物水溶液中硝酸锌六水合物质量比为1：7.4，所述蛋白与2-甲基咪唑的质量比为1：300～520。所述2-甲基咪唑(2-MIM)水溶液浓度为4.5mol/L，所述硝酸锌六水合物水溶液浓度为0.45mol/L；所述蛋白添加量以含有2-甲基咪唑和硝酸锌六水合物的水溶液总体积计为0.5mg/mL。
(2)抗体修饰ZIF-8纳米材料：包封蛋白的载体溶液中，缓慢加入抗体溶液，在4℃下持续搅拌孵育2小时，得到抗体修饰ZIF-8纳米材料。所述包封蛋白的载体溶液浓度为2mg/mL；所述抗体溶液中抗体与包封蛋白的载体溶液中包封蛋白的载体质量比为1：80。
本发明所述抗体利用AmershamTMQuickstain试剂盒进行了Cy5荧光基团标记，以实现细胞内的可视化观察，制备方法：取5mg/mL的抗体溶液于500mM NaHCO3水溶液中，然后加入Cy5-NHS(50mM，购自Amersham)，在4℃下反应3小时后，加入PBS溶液(pH7.4)，随后用微型离心柱(Spin Columns，7K MWCO，cat 89882，Thermo ScientificTM)离心(1500G，2min)，收集溶液，得到修饰的抗体溶液；所述抗体溶液与NaHCO3水溶液体积比为1:4，所述抗体溶液与Cy5-NHS体积比为1:0.05。
本发明还提供一种所述抗体修饰ZIF-8纳米材料在细胞选择性递送蛋白中的应用。所述细胞包括过表达EGFR的细胞系，更优选人皮肤鳞癌细胞A431。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明以ZIF-8材料为载体包裹蛋白，通过物理吸附作用，将抗体修饰在载体表面，具有以下优点：1)该材料制备方法简单，条件温和，细胞选择性高，递送蛋白效率提高，并保持了蛋白的生物活性，可进一步应用于疾病的精准治疗，在临床治疗方面具有应用价值。2)该材料的组装可任意改变装载蛋白，如实例中的BSA、RNase A和CRISPR/Cas9系统，材料具有普适性。3)该材料的组装可改变表面抗体，从而实现不同的靶向性；3)该材料对pH敏感，在pH<7的条件下，锌离子与咪唑基团的配位键断开，将包裹蛋白的释放。5)因外表面的抗体特异性，该材料能够特异性靶向相应抗原过表达的细胞系，比如西妥昔单抗特异性靶向过表达EGFR的A431细胞系，从而更进一步达到精准治疗。
(四)附图说明
图1为抗体@CC@ZIF-8纳米材料用于细胞选择性递送蛋白原理图。
图2为实施例2合成的FBSA@ZIF-8纳米材料的TEM表征图。a为FBSA@ZIF-8；b为Cet@FBSA@ZIF-8；c为IgG@FBSA@ZIF-8。
图3为Cet@FBSA@ZIF-8在不同pH下的体外释放图。
图4为不同浓度的BSA@ZIF-8对人皮肤鳞癌细胞A431的细胞活度图。
图5为不同浓度的BSA@ZIF-8对人宫颈癌细胞HeLa的细胞活度图。
图6为IgG@FBSA@ZIF-8(A)和Cet@FBSA@ZIF-8(B)在人皮肤鳞癌细胞A431中的荧光共聚焦显微镜成像图。BR表示明场下拍的细胞图；FITC表示在488nm激发，520nm发射下收集的荧光信号；Cy5表示在638nm激发，660nm发射下收集的荧光信号。
图7为IgG@FBSA@ZIF-8(A)和Cet@FBSA@ZIF-8(B)在人宫颈癌细胞HeLa中的荧光共聚焦显微镜成像图。BR表示明场下拍的细胞图；FITC表示在488nm激发，520nm发射下收集的荧光信号；Cy5表示在638nm激发，660nm发射下收集的荧光信号。
图8为不同浓度的IgG@RNase@ZIF-8和Cet@RNase@ZIF-8对人皮肤鳞癌细胞A431的细胞活度图。
图9为不同浓度的IgG@RNase@ZIF-8和Cet@RNase@ZIF-8对人宫颈癌细胞HeLa的细胞活度图。
图10为A431细胞中IgG@CC@ZIF-8和Cet@CC@ZIF-8对GPX4影响的蛋白质印迹图。
图11为HeLa细胞中IgG@CC@ZIF-8和Cet@CC@ZIF-8对GPX4影响的蛋白质印迹图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。本发明所述室温是指25-30℃。
实施例1、异硫氰基荧光素修饰BSA(FBSA)和Cy5修饰抗体的制备
1、异硫氰基荧光素修饰的BSA(FBSA)的制备
利用异硫氰基荧光素(FITC)标记牛血清蛋白(BSA)，得到FBSA，以实现细胞内的可视化观察，制备方法：称取20mg牛血清蛋白(BSA，购自Kehbio)溶于4mL的100mM NaHCO3水溶液中，随后加入溶于0.1mL二甲基亚砜(DMSO)的异硫氰基荧光素(FITC，1.2mg)，在4℃下反应2小时，反应结束后，加入80μL 1M的水合肼水溶液终止反应。最后在0.1M的PBS缓冲液中用透析膜(MWCO 14kDa)透析以除去游离的FITC，取截留液，采用考马斯亮蓝法检测蛋白浓度，再用0.1M PBS缓冲液稀释得到浓度为4.5mg/mL FBSA溶液，并保存在4℃冰箱里。
2、Cy5-IgG的制备
抗体利用AmershamTMQuickstain试剂盒进行了Cy5荧光基团标记，以实现细胞内的可视化观察，制备方法：取5mg/mL的免疫球蛋白G(IgG，购自InvitrogenTM)溶液10μL于40μL的NaHCO3水溶液(500mM)中，然后加入0.5μL的Cy5-NHS(50mM，购自Amersham)，在4℃下反应3小时后，加入50μL的PBS溶液(pH7.4)，随后用微型离心柱(Spin Columns，7K MWCO，cat89882，Thermo ScientificTM)离心(1500G，2min)，收集溶液，得到修饰的抗体溶液，采用考马斯亮蓝法检测蛋白浓度后，再用0.1M PBS缓冲液稀释获得0.5mg/mL抗体Cy5-IgG溶液，保存在4℃冰箱里。
3、Cy5-Cet的制备
将步骤2中免疫球蛋白G(IgG，购自InvitrogenTM)溶液替换为等量的5mg/mL的西妥昔单抗(Cet，购自Merck)溶液，其他操作相同，获得浓度为0.5mg/mL抗体蛋白Cy5-Cet溶液。
实施例2、蛋白@ZIF-8纳米材料的制备
1、FBSA@ZIF-8纳米材料
(1)ZIF-8
在390rpm剧烈搅拌下，将0.45M硝酸锌六水合物的水溶液0.1mL(硝酸锌六水合物添加量0.045mmol)缓慢滴加进含3.5M的2-甲基咪唑(2-MIM，添加量3.15mmol)的0.9mL水溶液中，并在30℃下搅拌1小时，6000rpm下离心10分钟，沉淀用去离子水洗涤3次除去残留物后，再在40℃过夜烘干得到8mg固体(即为ZIF-8纳米材料)，用去离子水配制成2mg/mL的ZIF-8纳米材料溶液4mL。
(2)FBSA@ZIF-8纳米材料
依据ZIF-8封装蛋白的典型合成中，首先在390rpm剧烈搅拌下，将0.11mL实施例1方法制备的4.5mg/mL FBSA溶液(FBSA添加量为0.5mg)添加到含3.5M的2-甲基咪唑(2-MIM，添加量3.15mmol)的0.9mL水溶液中，并在30℃下孵育10分钟，然后缓慢滴加0.45M硝酸锌六水合物的水溶液0.1mL(硝酸锌六水合物添加量0.045mmol)，并在30℃下搅拌1小时，6000rpm下离心10分钟，沉淀用去离子水洗涤3次除去残留物后，再在40℃过夜烘干得到8mg固体(即为FBSA@ZIF-8纳米材料)，用去离子水配制成2mg/mL的FBSA@ZIF-8纳米材料溶液4mL。使用透射电子显微镜(TEM，HITACHI HT7700)来观察FBSA@ZIF-8纳米材料尺寸和外形，结果见图2中a，平均粒径87±4nm，平均电位是16.2±0.3mV。
2、BSA@ZIF-8
将步骤1中的FBSA替换成BSA，其他操作相同，即可获得2mg/mL的BSA@ZIF-8纳米材料溶液4mL。
3、RNase@ZIF-8
将步骤1中的FBSA替换成RNase A(购自上海生工)，RNase A蛋白量改为0.05mg、2-MIM水溶液的体积改为0.09mL，硝酸锌六水合物水溶液体积改为0.01mL，其他操作相同，即可获得2mg/mL的RNase@ZIF-8纳米材料溶液0.4mL。
4、CC@ZIF-8
Cas9(pET-NLS-Cas9-6xHis，购买质粒Addgene Cat：62934，并参考以下文献表达蛋白J.A.Zuris,D.B.Thompson,Y.Shu,J.P.Guilinger,J.L.Bessen,J.H.Hu,M.L.Maeder,J.K.Joung,Z.Y.Chen and D.R.Liu,Nat.Biotechnol.,2015,33,73-80.)，sgRNA选择以靶向GPX4的sgRNA(CACGCCCGAUACGCUGAGUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUU
AAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU，订购于南京金斯瑞，参考文献：Hangauer MJ,Viswanathan VS,Ryan MJ,Bole D,Eaton JK,Matov A,Galeas J,Dhruv H,Berens ME,Schreiber SL,McCormic F,McManus MT.Nature,2017,551,247-250.)。
将Cas9与sgRNA按物质的量之比为1：1混合，获得Cas9/sgRNA。
将步骤1中的FBSA替换成Cas9/sgRNA，将Cas9/sgRNA蛋白量改为0.05mg、2-MIM水溶液的体积改为0.09mL，硝酸锌六水合物水溶液的体积改为0.01mL，其他操作相同，即可获得2mg/mL的CC@ZIF-8纳米材料溶液0.4mL。
实施例3、抗体@蛋白@ZIF-8纳米材料
1、Cet@蛋白@ZIF-8纳米材料
(1)Cet@BSA@ZIF-8
为了在载体表面吸附功能性抗体，将95μL实施例2方法制备的2mg/mL BSA@ZIF-8溶液，缓慢加入5μL实施例1方法制备的0.5mg/mL抗体蛋白Cy5-Cet溶液，在4℃持续搅拌下孵育2小时，得到100μL 2mg/mL Cet@BSA@ZIF-8纳米材料溶液。该产物无需进一步处理即可直接用于细胞实验。使用透射电子显微镜(TEM，HITACHI HT7700)来观察Cet@BSA@ZIF-8纳米材料的尺寸和外形，结果见图2中b，平均粒径69±2nm，平均电位是2.6±1.1mV。
(2)Cet@FBSA@ZIF-8
将步骤(1)中BSA@ZIF-8替换成实施例2方法制备的FBSA@ZIF-8，其他操作相同，获得100μL 2mg/mL Cet@FBSA@ZIF-8纳米材料溶液。
(3)Cet@RNase@ZIF-8
将步骤(1)中BSA@ZIF-8替换成实施例2方法制备的RNase@ZIF-8，其他操作相同，获得100μL 2mg/mL Cet@RNase@ZIF-8纳米材料溶液。
(4)Cet@CC@ZIF-8
将步骤(1)中的BSA@ZIF-8替换成实施例2方法制备的CC@ZIF-8，其他操作相同，获得100μL 2mg/mL Cet@CC@ZIF-8纳米材料溶液。
2、IgG@蛋白@ZIF-8纳米材料
(1)IgG@BSA@ZIF-8
将95μL实施例2方法制备的2mg/mL BSA@ZIF-8溶液，缓慢加入5μL实施例1方法制备的0.5mg/mL抗体蛋白Cy5-IgG溶液，在4℃持续搅拌下孵育2小时，得到100μL 2mg/mLIgG@BSA@ZIF-8纳米材料溶液。使用透射电子显微镜(TEM，HITACHI HT7700)来观察IgG@FBSA@ZIF-8纳米材料的尺寸和外形，结果见图2中c，平均粒径81±6nm，平均电位是9.2±1.0mV。
(2)IgG@FBSA@ZIF-8
将步骤(1)中BSA@ZIF-8替换成FBSA@ZIF-8，其他操作相同，获得100μL 2mg/mLIgG@FBSA@ZIF-8纳米材料溶液。
(3)IgG@RNase@ZIF-8
将步骤(1)中BSA@ZIF-8替换成RNase@ZIF-8，其他操作相同，获得100μL 2mg/mLIgG@RNase@ZIF-8纳米材料溶液。
(4)IgG@CC@ZIF-8
将步骤(1)中的BSA@ZIF-8替换成CC@ZIF-8，其他操作相同，获得100μL 2mg/mLIgG@CC@ZIF-8纳米材料溶液。
实施例3、Cet@FBSA@ZIF-8纳米材料的体外释放实验
将0.1mL实施例2制备的2mg/mL的Cet@FBSA@ZIF-8溶液，加入到不同pH(5.0、6.0和7.4)的0.9mL PBS溶液(0.1M)中。在37℃下孵育，每隔一小时，8000rpm离心5分钟，收集上清液，通过荧光光谱法(激发/发射波长：488nm/520nm)监测上清液和Cet@FBSA@ZIF-8溶液中释放的FBSA蛋白的荧光强度，并通过公式(1)计算得到材料的体外释放效率，结果见图3所示，抗体包裹的纳米颗粒Cet@FBSA@ZIF-8在pH 5.0和pH 6.0的酸性PBS溶液中随着时间的推移均快速降解，释放出蛋白，且pH 5.0比pH 6.0蛋白释放的速率更快，而pH7.4的中性PBS溶液不能引起材料降解释放出蛋白，说明Cet@FBSA@ZIF-8是酸性pH响应的，即在酸性pH下，会释放出包裹的蛋白，并且材料表面的抗体包裹不会影响材料的降解及包裹蛋白的释放。
公式(1)
公式(1)中FBSA@ZIF-8整体荧光强度是指实施例2方法制备的2mg/mL的Cet@FBSA@ZIF-8纳米材料溶液的荧光强度。
实施例4、纳米材料的细胞毒性实验
本发明实施例2制备的纳米材料针对人皮肤鳞癌细胞A431和人宫颈癌细胞HeLa的细胞增值影响评价采用一种标准CCK-8(2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐)方法。CCK-8溶液购自于ApexBio Technolog。
1、人皮肤鳞癌细胞A431
实验组：将人皮肤鳞癌细胞A431用DMEM培养基制成100000/ml的悬液，悬液以100μL/孔接种于96孔板，37℃，5％CO2培养箱孵育24小时。然后移去原有的培养基，并分别加入不同浓度(60，80，100μg/mL，最终浓度)的BSA@ZIF-8纳米材料的DMEM培养基100μL，每组3个平行组。将96孔板置于37℃，5％CO2培养箱与材料孵育24小时。孵育完毕后，加入10μL CCK-8试剂(5mg/ml)，继续孵育2小时。随后将96孔板置于振荡器摇晃至橙色溶液均匀，然后使用酶标仪测量460nm处的吸光度，并通过以下公式(2)计算得到细胞活度。
对照组：以等量不含BSA@ZIF-8纳米材料的DMEM培养基为对照组(即ZIF-8)。
空白组：含有等量DMEM培养基，不加细胞和药物。
公式(2)
同样条件下，用Cet@BSA@ZIF-8和IgG@BSA@ZIF-8分别替换BSA@ZIF-8。细胞活度见图4所示，在浓度为60，80，100μg/mL的BSA@ZIF-8，Cet@BSA@ZIF-8和IgG@BSA@ZIF-8的影响下，A431细胞的存活度没有明显的降低，说明所合成的材料对生物的细胞毒性低，生物相容性高。
2、人宫颈癌细胞HeLa
将步骤1中人皮肤鳞癌细胞A431替换为人宫颈癌细胞HeLa，其他操作相同，结果见图5所示，在浓度为60，80，100μg/mL的BSA@ZIF-8，Cet@BSA@ZIF-8和IgG@BSA@ZIF-8的影响下，HeLa细胞的存活度没有明显的降低，说明所合成的材料对生物的细胞毒性低，生物相容性高。
实施例5、纳米材料的细胞选择性实验
1、人皮肤鳞癌细胞A431
将人皮肤鳞癌细胞A431用DMEM培养基配制成50000/ml悬液。悬液分别以500μL/孔接种于4孔的生物成像皿中，37℃，5％CO2培养箱孵育24小时。然后移去原有的培养基，加入DMEM培养基和实施例2制备的2μg/mL Cet@FBSA@ZIF-8纳米材料溶液使其在培养基中的终浓度为60μg/mL，将4孔的生物成像皿置于37℃，5％CO2培养箱与材料孵育4个小时。孵育完毕后，用PBS清洗三次，然后用共聚焦荧光显微镜进行生物成像，结果见图6中B所示，Cet@FBSA@ZIF-8料在A431细胞中的荧光强度更高，说明含有Cet的FBSA@ZIF-8可以更加快速靶向EGFR过表达的A431细胞，具有细胞选择性，从而实现更高效率的蛋白递送。
将Cet@FBSA@ZIF-8替换为IgG@FBSA@ZIF-8，其他操作相同，结果见图6中A所示，IgG@FBSA@ZIF-8材料在A431细胞中的荧光强度相对较低，说明含有IgG的FBSA@ZIF-8没有靶向EGFR过表达的A431细胞的能力，不能提高蛋白递送效率。
2、人宫颈癌细胞HeLa
将步骤1中人皮肤鳞癌细胞A431替换为人宫颈癌细胞HeLa，其他操作相同，结果见图7所示，IgG@FBSA@ZIF-8(图7中A)和Cet@FBSA@ZIF-8(图7中B)材料在HeLa细胞中的荧光强度相对较低，说明含有IgG和Cet的FBSA@ZIF-8不能特异性靶向EGFR低表达的HeLa细胞，不能提高蛋白递送效率。
实施例6、纳米材料的RNase A的选择性递送
根据实施例2方法制备的IgG@RNase@ZIF-8和Cet@RNase@ZIF-8，对人皮肤鳞癌细胞A431和人宫颈癌细胞HeLa的细胞增值影响评价采用一种标准的CCK-8(2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐)方法。CCK-8溶液购自于(ApexBio Technolog)。
1、人皮肤鳞癌细胞A431
实验组：将人皮肤鳞癌细胞A431用DMEM培养基配制成100000/ml悬液。将悬液以100μL/孔的量接种于96孔板，37℃，5％CO2培养箱孵育24小时。然后移去原有的培养基，分别以100μL/孔的量加入含不同浓度(60，80，100μg/mL)RNase A的DMEM培养基，每组3个平行组。将96孔板置于37℃，5％CO2培养箱孵育24个小时后，加入10μL CCK-8试剂(5mg/ml)，继续孵育2小时。随后将96孔板置于振荡器摇晃至橙色溶液均匀，然后使用酶标仪测量460nm处的吸光度。同实施例4方法利用对照孔计算增值率，并最后不同浓度下拟合计算得到不同样品的细胞活度。
对照组：以100μL/孔的DMEM培养基为对照组。
空白组：含有等量DMEM培养基，不加细胞和药物。
同样条件下，将RNase A分别替换为IgG@RNase@ZIF-8和Cet@RNase@ZIF-8，结果见图8所示，在加入Cet@RNase@ZIF-8的不同浓度的组中，A431细胞的存活度相对于IgG@RNase@ZIF-8与RNase A更低，说明含有Cet的RNase@ZIF-8能够特异性靶向EGFR过表达的A431细胞，以更高效率将RNase A递送进入细胞，发挥RNase A的功效，而IgG@RNase@ZIF-8的递送蛋白效率相对于Cet@RNase@ZIF-8更低。
2、人宫颈癌细胞HeLa
将步骤1中人皮肤鳞癌细胞A431替换为人宫颈癌细胞HeLa，其他操作相同，结果见图9所示，IgG@RNase@ZIF-8和Cet@RNase@ZIF-8材料对HeLa细胞的存活度的影响差异不大，说明含有IgG和Cet的RNase@ZIF-8不能特异性靶向EGFR低表达的HeLa细胞，不能提高蛋白递送效率。
实施例7、纳米材料的Cas9/sgRNA的选择性递送及蛋白质印迹检测
1、人皮肤鳞癌细胞A431
将人皮肤鳞癌细胞A431以200000细胞/孔的量接种于含有1mL DMEM培养基的12孔板中，并置于37℃，5％CO2培养箱中过夜使细胞贴壁。然后移去原有的培养基，分别加入DMEM培养基和实施例2方法制备的2mg/mL的CC@ZIF-8N纳米材料溶液使终浓度为60μg/mL，以不添加纳米材料的等量DMEM培养基为对照。37℃，5％CO2培养箱孵育24小时后，将细胞用4℃冷PBS洗涤两次后，加入40μL含0.2％聚乙二醇单辛基苯基醚(Triton-X)和100μM苯甲基磺酰氟(PMSF)的PBS中裂解后，再加入10μL 5×SDS上样缓冲液，在95℃下加热10分钟后，将样品通过15％SDS-PAGE分离并转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)。在室温下用3％脱脂牛奶(在TBST缓冲液中)封闭膜1小时，然后与5mL稀释后的抗GPX4抗体(初始浓度0.2mg/mL，#ab125066，Abcam，用含3％BSA的TBST缓冲液稀释，1：7500稀释度，实验组)和5mL稀释后的HRP偶联的小鼠抗肌动蛋白抗体(初始浓度0.2mg/mL，#D190826，BBI，用含3％BSA的TBST缓冲液稀释，1：7500稀释度，对照组)，在4℃下孵育过夜，加入5mL HRP偶联的山羊抗兔IgG(初始浓度0.2mg/mL，#31460，Invitrogen，用含3％BSA的TBST缓冲液稀释，1：7500稀释度)，在室温下进一步孵育1小时，用Invitrogen iBright 1500记录蛋白印迹。
同样条件下CC@ZIF-8分别替换为Cet@CC@ZIF-8和IgG@CC@ZIF-8，结果见图10所示，Cet@CC@ZIF-8与CC@ZIF-8和IgG@CC@ZIF-8相比，能够以更高效率将Cas9/sgRNA系统递送进EGFR过表达的A431细胞中，从而快速发挥Cas9/sgRNA系统基因编辑的作用，从而敲低GPX4蛋白的表达水平。
2、人宫颈癌细胞HeLa
将步骤1中人皮肤鳞癌细胞A431替换为人宫颈癌细胞HeLa，其他操作相同，结果见图11所示，IgG@CC@ZIF-8，Cet@CC@ZIF-8和CC@ZIF-8材料对HeLa细胞的GPX4表达水平影响不大，说明含有IgG和Cet的Cas9/sgRNA不能特异性靶向EGFR低表达的HeLa细胞，不能提高蛋白递送效率。这两组实验也验证了Cet@CC@ZIF-8对A431细胞具有很好的选择性。
Claims (10)
1.一种具有细胞选择性的抗体修饰ZIF-8纳米材料，其特征在于所述抗体修饰ZIF-8纳米材料以沸石咪唑酸酯骨架8为载体，将蛋白包封在载体中，再在包封蛋白的载体表面吸附抗体制备而成；所述抗体以细胞外膜上的过表达抗原为靶点；所述沸石咪唑酸酯骨架8记为ZIF-8。
2.如权利要求1所述的抗体修饰ZIF-8纳米材料，其特征在于所述抗体包括西妥昔单抗。
3.如权利要求1所述的抗体修饰ZIF-8纳米材料，其特征在于所述蛋白包括牛血清蛋白、核糖核酸酶A或Cas9/sgRNA。
4.一种权利要求1所述抗体修饰ZIF-8纳米材料的制备方法，其特征在于所述方法按如下步骤进行：(1)包封蛋白的载体：在搅拌下，将蛋白添加到2-甲基咪唑水溶液中，并在30℃下搅拌10分钟；滴加硝酸锌六水合物水溶液，在30℃下搅拌1小时，在6000rpm下离心10分钟，得到固体沉淀，用去离子水洗涤3次，并用去离子水悬浮，即得到所述包封蛋白的载体溶液；
(2)抗体修饰ZIF-8纳米材料：包封蛋白的载体溶液中，缓慢加入抗体溶液，在4℃下持续搅拌孵育2小时，得到抗体修饰ZIF-8纳米材料溶液。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于步骤(1)所述蛋白与硝酸锌六水合物水溶液中硝酸锌六水合物质量比为1：7.4，所述蛋白与2-甲基咪唑水溶液中2-甲基咪唑的质量比为1：300～520。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于步骤(1)所述2-甲基咪唑水溶液浓度为4.5mol/L，所述硝酸锌六水合物水溶液浓度为0.45mol/L。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于步骤(2)所述抗体溶液中抗体与包封蛋白的载体溶液中包封蛋白的载体质量比为1：80。
8.一种权利要求1所述抗体修饰ZIF-8纳米材料在细胞选择性递送蛋白中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述细胞过表达EGFR。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述细胞为人皮肤鳞癌细胞A431。
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| CN114129738A (zh) * | 2021-11-30 | 2022-03-04 | 广东省人民医院 | 一种肿瘤微环境响应的免疫治疗抗体复合材料及制备抗肿瘤药物的用途 |
| CN114410601A (zh) * | 2021-12-24 | 2022-04-29 | 山东大学 | 一种酶包埋的zif-8/dna纳米复合探针及其制备方法和应用 |
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| CN111643480A (zh) * | 2020-04-20 | 2020-09-11 | 武汉大学 | 具有靶向性及pH响应性的金属有机框架复合纳米材料及其制备方法与应用 |
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