CN115825417A - 一种基于CDs@ZIF-8的无酶荧光免疫分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于CDs@ZIF‑8的无酶荧光免疫分析方法，包括以下步骤：步骤S1，制备复合材料CDs@ZIF‑8；步骤S2，将CDs@ZIF‑8溶于PBS缓冲溶液中，搅拌加入Ab2，得到CDs@ZIF‑8@Ab2；步骤S3，取单克隆一抗溶液孵育；步骤S4，用PBS洗涤后，加入牛血清白蛋白；孵育后，用PBS去除游离的牛血清白蛋白；步骤S5，将含有不同DBP浓度的溶液孵育；步骤S6，PBS去除游离DBP后，加入CDs@ZIF‑8@Ab2孵育；步骤S7，冲洗后加入醋酸缓冲溶液水解释放MOF内部的CDs。
Description
技术领域
本发明属于酶联免疫分析技术领域，具体涉及基于CDs@ZIF-8的无酶荧光免疫分析方法。
背景技术
碳基纳米材料因其低成本、环保的合成方式而备受研究人员的关注。其中，碳点(CDs)表现出优异的过氧化物酶样活性，因其成本相对较低、制备工艺简单温和、生物相容性好、光学性能优异、毒性较低而受到广泛关注。此类材料已广泛应用于离子检测、生物成像、传感、防伪、催化、超级电容器等领域。
沸石咪唑酯骨架结构材料(ZIFs)是一类金属有机骨架材料，ZIF-8是ZIFs材料中最具有代表性的一种，具有较高的比表面积和较好的热稳定性和化学稳定性。因而现有技术提出用ZIF-8负载催化剂。
邻苯二甲酸酯是一种化合物，用于不同材料的添加剂，使其更灵活。许多种类的邻苯二甲酸酯已经被开发出来，人类接触这些化学物质的风险很高。邻苯二甲酸二丁酯(DBP)是一种邻苯二甲酸酯，广泛用作儿童玩具、医疗器械、营养补充剂和各种包装的增塑剂。已有研究表明，DBP具有发育和生殖毒性，如减少雌激素与特定受体的结合和抑制雌激素的转录活性。目前，DBP的检测方法中，以气相色谱和液相色谱等仪器方法为主。这些方法在灵敏度、选择性和重现性方面具有不可否认的优势，但需要长时间的样品制备，以及训练有素的专家使用特殊的昂贵设备工作。然而，日常的污染监测需要有足够的灵敏度和可靠性的快速和有效的分析方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题就在于：针对现有技术存在的技术问题，本发明提供一种基于CDs@ZIF-8的无酶荧光免疫分析方法，构建了一种新型免疫分析方法，提高了DBP的检测限。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
一种基于CDs@ZIF-8的无酶荧光免疫分析方法，包括以下步骤：
步骤S1，制备复合材料CDs@ZIF-8；
步骤S2，将CDs@ZIF-8溶于PBS缓冲溶液中，搅拌加入Ab2，得到CDs@ZIF-8@Ab2；
步骤S3，取单克隆一抗溶液移至孔板中孵育；
步骤S4，每孔用PBS洗涤后，在孔中加入牛血清白蛋白以阻断孔表面的非特异性结合位点；孵育后，用PBS去除游离的牛血清白蛋白；
步骤S5，将含有不同DBP浓度的溶液移至孔中孵育；
步骤S6，PBS去除游离DBP后，加入CDs@ZIF-8@Ab2孵育；
步骤S7，冲洗后加入醋酸缓冲溶液水解释放MOF内部的CDs。
作为上述技术方案的进一步改进为：
优选地，所述步骤S1中，复合材料CDs@ZIF-8的制备方法，具体包括以下步骤：
S1-1，碳量子点和六水合硝酸锌溶于甲醇形成溶液a，2-甲基咪唑溶于甲醇形成溶液b；
S1-2，在搅拌情况下将溶液a加入溶液b；
S1-3，溶液进行离心处理，除去上清液，将沉淀清洗后取固相真空干燥，得到复合材料CDs@ZIF-8。
优选地，所述步骤S1-1中，碳量子点的浓度为1mg/mL ，体积为1 mL；六水合硝酸锌的质量为3~5g；甲醇的体积为150 mL；2-甲基咪唑的质量为4.8g。
优选地，所述步骤S1-3中，采用甲醇对沉淀进行离心清洗；清洗后取固相真空干燥，干燥的温度为70～75 ℃，时间为24～26 h，得到复合材料CDs@ZIF-8。
优选地，所述步骤S1中还包括对复合材料CDs@ZIF-8稳定性的查验，取CDs@ZIF-8溶于不同pH的溶液中，反应后记录荧光变化。
优选地，所述步骤S2中， CDs@ZIF-8浓度为1～3mg/mL，体积为1～3 mL，Ab2的浓度为2～4μg/mL，体积为4～6μL。
优选地，所述步骤S4中，牛血清白蛋白的浓度为1%。
优选地，所述步骤S5中， DBP的浓度为1~50 ng/mL。
优选地，所述步骤S7中，醋酸缓冲溶液的pH为5。
本发明提供的基于CDs@ZIF-8的无酶荧光免疫分析方法，与现有技术相比有以下优点：
本发明的基于CDs@ZIF-8的无酶荧光免疫分析方法，可以简单有效地将CDs封装到ZIF-8中，制备CDs@ZIF-8纳米复合材料，而无需繁琐的合成和纯化过程。此外，ZIF-8良好的生物相容性和带正电荷的ZIF-8使其能够通过静电粘附锚定抗体，从而使检测抗体(Ab2)容易偶联到ZIF-8载体表面，而不需要额外的功能化。同时，由于ZIF-8具有较高的比表面积和高负载能力，可以负载大量的CDs，实现对信号的放大，提高了分析方法的灵敏度。本发明的分析方法具有较宽的动态范围和较高的灵敏度，检测限为2.78 ng/mL，比传统ELISA低3.39倍。本发明这种经济高效且稳定的荧光免疫分析方法为多种其他环境污染物的灵敏检测提供了通用性。
附图说明
图1是本发明实施例1中复合材料CDs@ZIF-8的TEM图。
图2是本发明实施例1中复合材料CDs@ZIF-8的SEM图。
图3是本发明实施例1中CDs@ZIF-8在不同pH下的荧光强度图。
图4是本发明实施例1中CDs@ZIF-8和CDs@ZIF-8@Ab2复合材料的Zeta电位图。
图5是本发明实施例1无酶免疫分析方法的标准曲线。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明提供了一种基于CDs@ZIF-8的无酶荧光免疫分析方法，包括以下步骤：
步骤S1，复合材料CDs@ZIF-8的制备方法，S1-1，碳量子点和六水合硝酸锌溶于甲醇形成溶液a， 2-甲基咪唑溶于甲醇形成溶液b；其中，碳量子点的浓度为1mg/mL ，体积为1mL；六水合硝酸锌的质量为3~5 g；甲醇的体积为150 mL；2-甲基咪唑的质量为4.8 g。
S1-2，在搅拌情况下将溶液a加入溶液b，搅拌速度为500 rpm，加入后溶液迅速开始逐渐呈现乳白色，继续搅拌两小时。
S1-3，再进行离心，除去上清液，收集沉淀，将沉淀用洗涤液反复离心清洗至少5次，洗涤液为甲醇；清洗后取固相真空干燥，空干燥的温度为70 ℃，时间为24 h，得到复合材料CDs@ZIF-8。
S1-4，查验复合材料CDs@ZIF-8稳定性，取50 μL，1 mg/mL的CDs@ZIF-8溶于1mL不同pH的溶液中，37 ℃下反应30 min后，利用酶标仪记录荧光变化。
步骤S2，CDs@ZIF-8溶于PBS缓冲溶液中，并在37 ℃磁力搅拌下，加入Ab2，得到CDs@ZIF-8@Ab2；其中，CDs@ZIF-8浓度为1 mg/mL，体积为1 mL，Ab2的浓度为2 μg/mL，体积为5 μL。
步骤S3，取1 μg/mL单克隆一抗（Ab1）溶液50 μL移至96孔板中，4 ℃孵育过夜。
步骤S4，每孔用PBS洗涤三次后，在孔中加入50 μL牛血清白蛋白以阻断孔表面的非特异性结合位点。在37℃孵育1小时后，用PBS去除游离的牛血清白蛋白。其中，牛血清白蛋白的浓度为1%。
步骤S5，将含有不同DBP浓度的50 μL溶液移至孔中，在37℃下孵育1h；其中，DBP的浓度为1~50 ng/mL。
步骤S6，PBS去除游离DBP后，加入 1 mg/mL体积为50 μL的CDs@ZIF-8@Ab2，在37℃孵育1 h。
步骤S7，用水冲洗三次，加入100 μL醋酸缓冲溶液水解释放MOF内部的CDs；其中，醋酸缓冲溶液的pH为5。
实施例1 。
步骤S1，复合材料CDs@ZIF-8的制备方法，S1-1，取1 mL、 1 mg/mL碳量子点和3g六水合硝酸锌溶于150 mL甲醇形成溶液a，4.8 g 2-甲基咪唑溶于150 mL甲醇形成溶液b。
S1-2，在搅拌下将溶液a加入溶液b，加入后溶液迅速出现乳白色且颜色不断加深，继续搅拌两小时。
S1-3，使用50mL离心管离心，除去上清液，收集沉淀，将沉淀用20 mL甲醇反复离心清洗5次。清洗后取固相在70 ℃下真空干燥24 h，得到复合材料CDs@ZIF-8。
对制备出的CDs@ZIF-8进行形貌表征，如图1（TEM），图2（SEM）所示，制成的CDs@ZIF-8晶体为六方，直径约为50 nm，与ZIF-8的形貌基本一致，证明了该复合材料的成功制备。
S1-4，验证复合材料CDs@ZIF-8的稳定性，取50 μL，1 mg/mL的CDs@ZIF-8溶于1mL不同pH的溶液中，37 ℃下反应30 min后，利用酶标仪记录荧光变化，优选pH为5、7、9的溶液。
图3为CDs@ZIF-8在不同pH下的荧光强度图，如图所示，当pH＞7时，荧光强度接近0，说明ZIF-8没有分解释放出碳量子点；当5＜pH≤7时，随着pH值减小，溶液荧光强度增强，说明ZIF-8没有完全释放出碳量子点；当pH≤时，荧光强度达到最大值并趋于稳定，说明碳量子点已被完全释放出，因此优选pH为5。
步骤S2，取1 mL，1 mg/mL的CDs@ZIF-8溶于PBS缓冲溶液中，并在37℃磁力搅拌下，加入5μL、2 μg/mL的Ab2，得到CDs@ZIF-8@Ab2。
图4为抗体偶联前后的ζ电位图，如图所示，CDs@ZIF-8的电位为24.77 mV, CDs@ZIF-8@Ab2的电位为-5.99 mV。由于Ab2与CDs@ZIF-8通过静电吸附固定在MOF表面，因此溶液前后的ζ电位发生变化，证明了CDs@ZIF-8@Ab2的成功制备。
步骤S3，取1 μg/mL单克隆一抗（Ab1）溶液50 μL移至96孔板中，4 ℃孵育过夜。
步骤S4，每孔用PBS洗涤三次后，在孔中加入50 μL的1%牛血清白蛋白以阻断孔表面的非特异性结合位点。在37 ℃孵育1小时后，用PBS去除游离的牛血清白蛋白。
步骤S5，将含有50 μL，1 ng/mL DBP溶液移至孔中，在37 ℃下孵育1 h。
步骤S6，PBS去除游离DBP后，加入 CDs@ZIF-8@Ab2(1 mg/mL,50 μL)， 37℃孵育1h。
步骤S7，用水冲洗三次，加入100 μL、pH=5醋酸缓冲溶液水解释放MOF内部的CDs。
图5是通过测定一系列标准DBP溶液的荧光强度所构建的标准曲线，荧光强度随DBP浓度的增加而增加，线性回归方程为：y= 300.95+203.43x，相关系数(R2)为0.998。根据3σ/S (σ为1 ng/mL DBP荧光强度的标准差，S为校正曲线的斜率)，计算得出该分析方法的检出限为2.78 ng/mL。相较于传统ELISA（检测限为9.43 ng/mL）,其灵敏度提高了3倍多。
步骤S8，选取市场所售卖的商品样本（奶茶，瓶装矿泉水，牛奶，咖啡），分别取2 mL样本进行离心，离心速度8,000 rpm，20 min，取上清液进行检测，设置3组平行。
表1为各种饮料中DBP的检测结果，变异系数小于10%，证明了本发明所提供的无酶荧光免疫分析方法具有良好的准确性和稳定性。
表1DBP的检测结果
| 样品 | 传统ELISA(ng/mL) | 建立的方法（ng/mL） | 变异系数（%） |
| 奶茶 | 14.53 | 15.34 | 4.23 |
| 瓶装矿泉水 | 未检出 | 未检出 | — |
| 牛奶 | 未检出 | 3.16 | 3.64 |
| 咖啡 | 12.93 | 13.29 | 6.43 |
。
上述实施案例只是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应落在本发明技术方案保护的范围内。
Claims (9)
1.一种基于CDs@ZIF-8的无酶荧光免疫分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1，制备复合材料CDs@ZIF-8；
步骤S2，将CDs@ZIF-8溶于PBS缓冲溶液中，搅拌加入Ab2，得到CDs@ZIF-8@Ab2；
步骤S3，取单克隆一抗溶液移至孔板中孵育；
步骤S4，每孔用PBS洗涤后，在孔中加入牛血清白蛋白以阻断孔表面的非特异性结合位点；孵育后，用PBS去除游离的牛血清白蛋白；
步骤S5，将含有不同DBP浓度的溶液移至孔中孵育；
步骤S6，PBS去除游离DBP后，加入CDs@ZIF-8@Ab2孵育；
步骤S7，冲洗后加入醋酸缓冲溶液水解释放MOF内部的CDs。
2.根据权利要求1所述的一种基于CDs@ZIF-8的无酶荧光免疫分析方法，其特征在于，所述步骤S1中，复合材料CDs@ZIF-8的制备方法，具体包括以下步骤：
S1-1，碳量子点和六水合硝酸锌溶于甲醇形成溶液a，2-甲基咪唑溶于甲醇形成溶液b；
S1-2，在搅拌情况下将溶液a加入溶液b；
S1-3，溶液进行离心处理，除去上清液，将沉淀清洗后取固相真空干燥，得到复合材料CDs@ZIF-8。
3.根据权利要求2所述的一种基于CDs@ZIF-8的无酶荧光免疫分析方法，其特征在于，所述步骤S1-1中，碳量子点的浓度为1mg/mL ，体积为1 mL；六水合硝酸锌的质量为3~5g；甲醇的体积为150 mL；2-甲基咪唑的质量为4.8g。
4.根据权利要求2所述的一种基于CDs@ZIF-8的无酶荧光免疫分析方法，其特征在于，所述步骤S1-3中，采用甲醇对沉淀进行离心清洗；清洗后取固相真空干燥，干燥的温度为70～75 ℃，时间为24～26 h，得到复合材料CDs@ZIF-8。
5.根据权利要求2所述的一种基于CDs@ZIF-8的无酶荧光免疫分析方法，其特征在于，所述步骤S1中还包括对复合材料CDs@ZIF-8稳定性的查验，取CDs@ZIF-8溶于不同pH的溶液中，反应后记录荧光变化。
6.根据权利要求1所述的一种基于CDs@ZIF-8的无酶荧光免疫分析方法，其特征在于，所述步骤S2中， CDs@ZIF-8浓度为1～3mg/mL，体积为1～3 mL，Ab2的浓度为2～4μg/mL，体积为4～6μL。
7.根据权利要求1所述的一种基于CDs@ZIF-8的无酶荧光免疫分析方法，其特征在于，所述步骤S4中，牛血清白蛋白的浓度为1%。
8.根据权利要求1所述的一种基于CDs@ZIF-8的无酶荧光免疫分析方法，其特征在于，所述步骤S5中， DBP的浓度为1~50 ng/mL。
9.根据权利要求1所述的一种基于CDs@ZIF-8的无酶荧光免疫分析方法，其特征在于，所述步骤S7中，醋酸缓冲溶液的pH为5。
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