CN103901187A - 纳米金靶向标记抗体复合物及其制备方法 - Google Patents

纳米金靶向标记抗体复合物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种纳米金靶向标记抗体复合物及其制备方法。本发明采用特定的连接子间接媒介，将抗体定向共价连接到纳米金粒子核上，从而提高了抗体的利用率，提高了复合物的特异性和稳定性。

Description

纳米金靶向标记抗体复合物及其制备方法
【技术领域】
本发明涉及生物免疫技术领域，具体涉及一种靶向标记抗体的纳米金复合物及其制备方法。
【背景技术】
纳米金是指金的微小颗粒，通常在水溶液中以胶体的形态存在。目前最经典的制备胶体金的方法是柠檬酸钠还原法。根据还原剂的种类和浓度的不同，可以在实验室条件下制备出不同粒径的胶体金，而且方法简单、原料价廉。胶体金在其粒径为510~550nm的可见光谱范围内有一吸收峰，吸收波长随着金颗粒的直径增大而增加。当粒径从小到大时，表观颜色依次呈现出淡橙黄色（＜5nm）、葡萄酒红色、深红色和蓝紫色（通常为金颗粒的聚集体）的变化。
胶体金的性质主要取决于金颗粒的直径及其表面特性。由于其直径在1~100nm之间，而大多数的生物分子（如蛋白质、核酸等）的尺寸都在这一尺度内，因此可以利用纳米金作为探针进入生物组织内部探测生物分子的生理功能，进而在分子水平上揭示生命过程，或对特异性的靶标进行检测，或利用其作靶向药物的载体等。而它独特的颜色变化也是其应用于生物化学的重要基础。
目前，许多科研单位和公司都致力于发展更精确，更灵敏，更高效，更价廉的纳米金定量或半定量的快速免疫层析技术。其原理是：利用金纳米粒子作为探针，通过抗原抗体反应，使检测信号得到放大，从而实现对抗原快速灵敏检测。
在对单细胞的研究中，尽管荧光和比色原位杂交测试已经被广泛使用，但相比于其它细胞着色方法，纳米金检测为光镜观察提供了一种优良的黑色着色方法。与荧光法相比，它不需要昂贵的荧光仪器，也不会随着观察时间的延长而漂白或退色。
而将纳米颗粒作为药物的携带载体是纳米金颗粒的另一项优势：将药物分子包裹在纳米颗粒之中或吸附在其表面。若同时结合靶向药物技术即在颗粒表面偶联特异性的靶向分子（如特异性配体和单克隆抗体等），通过靶向分子与细胞表面特异性受体结合，并在细胞摄粒作用下将药物分子引入到细胞内，就可以实现安全有效的靶向给药。
此外，随着载药纳米微粒定位问题的解决，不仅可以减少对药物不良反应，而且还可将一些特殊药物输送到机体天然的生物屏障部位，来治疗以往只能通过手术治疗的疾病。近年来，国内外学者对纳米载体在靶向药物制备中的应用进行了大量的研究。
在纳米金的应用治疗方面，有报到显示可使用纳米壳、纳米棒和球型纳米对癌细胞进行选择性的光热疗法。在研究一些特定分子时，可用探针分子靶向标定一些生物标记，并利用有生物标记的探针来研究这些特定分子。这些生物标记主要包括：小肽、寡核苷酸适配子、抗体或抗体片段。
其中，抗体被广泛的应用于这些识别部分，主要由于在大量已建立的生物标记中抗体具有高度的亲和性和稳定性。这其中关键的步骤即是合成分子特异性的纳米颗粒，即将探针分子与纳米颗粒结合。
纳米金抗体复合物基本上是利用抗体在其等电点处，在静电作用力下能够轻易的吸附于纳米颗粒表面，而使用高浓度的抗体与纳米金颗粒溶液共孵育来制备。然而这种方式有很多的缺陷。主要包括：在纳米金抗体复合物的制备中，抗体的浓度要求高（~50ug/ml）用量大，成本高；由于是利用金颗粒表面的静电作用力，故抗体在金表面的取向随机，不能保证是抗体的Fc端与纳米金粒子结合，暴露Fab端；由于抗体是以非共价键的方式吸附于纳米颗粒的表面，所以它们很容易被生物样品中其他的分子所代替。
也有利用共价策略将媒介连接子（linker）或通过抗生物素蛋白系统直接将抗体连接于纳米金颗粒表面。然而，这些技术都没有提供能够使IgG分子定向连接于纳米颗粒表面。但是，定向连接却是抗体至靶目标使其可用的功能最大化的关键。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种纳米金粒子靶向标记抗体复合物，能够以共价方式，将抗体定向连接到纳米金粒子表面。
本发明提供一种纳米金靶向标记抗体复合物，包括：纳米金粒子核；包覆纳米金粒子核并且Fab端暴露的一种或多种抗体；通过金硫醇键连接到纳米金粒子核表面的巯基聚乙二醇化合物；以及具有下式I结构的连接子，其中，所述连接子的巯基端通过金硫醇键吸附到纳米金粒子核表面，并且所述连接子的酰肼端与抗体的Fc端或非靶位点的糖基化部分共价连接。
Figure BDA00002645705500031
其中，纳米金粒子的粒径可以为10-25nm。
抗体可以为靶向于细胞表面或细胞内分子的IgG抗体。
巯基聚乙二醇化合物可以是分子量为5k Da的甲氧基-聚乙二醇-巯基。
本发明还提供一种制备纳米金靶向标记抗体复合物的方法，包括以下步骤：
S1氧化抗体：在抗体溶液中添加NaIO4，室温避光孵育，之后加入磷酸盐缓冲液停止反应，得到氧化抗体溶液，其中每10-15mg抗体添加0.1mmol的NaIO4，以使充分氧化。
S2抗体与连接子相连：在氧化抗体溶液中添加与抗体等摩尔量的式I的连接子，室温孵育，之后加入HEPES溶液停止反应，得到抗体-连接子溶液；
S3连接纳米金粒子：将抗体-连接子溶液加入纳米金粒子溶液，室温震荡孵育，添加聚乙二醇化合物溶液，室温震荡孵育，得到纳米金靶向标记抗体复合物的溶液。
步骤S1中，抗体溶液的pH可以在7-8之间，例如为7.5。
步骤S2还可以包括用10MWCO2000g4℃过滤离心，并以HEPES溶液重悬余下溶液，以保证抗体-连接子溶液中抗体的浓度为100ug/ml。
步骤S3还可以包括用10MWCO2000g-2500g4℃过滤离心10-20分钟，并以HEPES溶液重悬沉淀。
本发明利用特殊的连接子将抗体与纳米金颗粒相连，连接子的酰肼基与抗体Fc端，或非靶位点的糖基化部分反应连接，故不会破坏抗体Fab端的结合功能，且有效地实现了抗体与纳米金粒子的定向结合。同时还大大降低了抗体浓度的需求量，抗体的使用量也有所降低，节约了成本，提高了抗体结合的灵敏度。
而且，由于抗体Fc端与连接子相连是通过化学反应以共价键的方式与连接子相连，所以当抗体连接子这种复合体与金颗粒连接后，样品中的其他物质无法取代已连接上的抗体，从而保证了特异性，保证了产品质量。
此外，一个纳米金颗粒表面可以结合多种抗体，从而可以制备成多功能的纳米金抗体复合颗粒。
【附图说明】
图1为根据本发明的纳米金靶向标记抗体复合物的结构示意图。
图2为本发明实施例中所用纳米金粒子溶液的紫外-可见吸收光谱。
图3示出纳米金粒子在与抗体连接前后的紫外可见吸收光谱。
【具体实施方式】
针对现有技术中，利用静电作用力使抗体吸附于纳米金粒子表面，来合成纳米金抗体复合物的缺陷，本发明人采用了这样的技术方案。
利用一种特殊的连接子化合物，通过化学反应，以共价键的方式将抗体分子定向连接到纳米金表面。该化合物结构式如下（购自SensoPath Technologies，分子式C33H60N2O10S2，Mw708.97）：
Figure BDA00002645705500041
该化合物包括聚乙二醇链一端的酰肼，酰肼可以与抗体Fc端被氧化后得到的羟基，或与抗体非Fab部分的糖基化位点上的羟基发生化学反应，进而将该化合物与抗体的Fc端或糖基化位点共价连接。由于抗体的靶向结合位点在Fab端，因此，这样的化学反应不会影响Fab端的靶向活性。
化合物第二部分为连接烷烃一端的二硫化物，二硫化物一端可以通过类似于共价键的金硫醇键，吸附于纳米金颗粒。因此，利用该连接子，可以将抗体定向连接到纳米金粒子表面，且使Fab端暴露，以靶向结合抗原。
图1示出本发明的纳米金靶向标记抗体复合物的结构。从图中可见，复合物中心为纳米金粒子核。抗体通过连接子，而定向连接在纳米金粒子核的表面，抗体Fab端暴露于外，可用来靶向结合需要研究的特定分子，如细胞表面或细胞内的分子。
纳米金粒子核的大小通常为10-25nm，例如本发明中使用的为10-18nm粒径的纳米金粒子溶液。
本发明的抗体可以根据需要来确定，并且可以是一种抗体，或是两种或两种以上抗体的组合，并且可以通过调节混合抗体中每种抗体的比例，来实现更多功能。例如，可以使用靶向于细胞表面或细胞内分子的IgG抗体。
为了减少非特异性的影响，本发明还进一步使用末端带巯基的聚乙二醇链通过巯基与纳米金粒子表面形成金硫醇键，来覆盖纳米金粒子的剩余空白表面。PEG还可以提高复合物的亲水性，使得复合物具有良好的生物相容性。
例如，本发明可以使用分子量为5K的MPEG-SH，甲氧基-聚乙二醇-巯基，作为覆盖纳米金粒子表面的聚乙二醇链。
这种定向连接方式可以大大提高抗体的利用率，每个抗体都是以定向的方式绑定于纳米金粒子上，而具有支持生物学标签的性能。因此，每个纳米金粒子上仅需要少量的抗体即可达到想要的靶向性效应，降低了对抗体浓度、使用量的需求，节约了成本，提高了抗体结合的灵敏度。
此外，由于抗体是以共价方式连接到连接子，进而与纳米金粒子相连接的，样品中的其他物质无法取代已连接上的抗体，从而保证了特异性和产品质量。
制备本发明的纳米金靶向标记抗体复合物可以包括以下步骤：
首先是步骤S1氧化抗体：在抗体溶液中添加NaIO4，室温避光孵育，之后加入磷酸盐缓冲液停止反应，得到氧化抗体溶液。其中每10-15mg抗体可以添加0.1mmol的NaIO4，以使充分氧化。孵育时间可以为30分钟。
该步骤使用NaIO4氧化抗体Fc端的羟基，或是抗体非Fab端非靶位点的糖基化部分中存在的羟基，以生成能够与酰肼基反应的醛基。反应可以在pH为7-8，例如为7.5的条件下进行。NaIO4可以作为溶液添加。
之后，在步骤S2使抗体与连接子相连：在氧化抗体溶液中添加与抗体等摩尔量的式（I）的连接子，室温孵育，之后加入HEPES溶液停止反应，得到抗体-连接子溶液。该步骤中孵育时间可以为1小时，HEPES的浓度可以为40mM。
该步骤中，抗体的Fc端或非靶位点的糖基化部分得以与连接子共价结合。
由于此时，反应混合体系中存在有抗体、抗体-连接子、连接子，NaIO4，磷酸盐缓冲液等物质，因此，该步骤还可以包括分离提纯的操作，把未反应的连接子及盐类去掉。具体地，可以在抗体-连接子混合反应体系中加入HEPES溶液，混匀后用10MWCO2000g4℃过滤离心，例如10-20分钟；再用40mM的HEPES重悬余下溶液，以保证抗体-连接子溶液中抗体的浓度为100ug/ml。
此步骤主要是去除混合体系中未连接的物质。离心后，保留在超滤管中的物质即制备的抗体连接子复合物。此时用HEPES溶液重悬，尽量保留留在超滤管中的物质。保证它的浓度为100ug/ml的原因为方便后续操作。在之后抗体-连接子与金颗粒连接过程中，只需保证共同孵育体系中抗体-连接子的终浓度为10ug/ml。
最后是步骤S3，连接纳米金粒子：将抗体-连接子溶液加入纳米金粒子溶液，室温震荡孵育，以使连接子的末端巯基与纳米金粒子表面通过金硫醇键结合，并且还可以随后再添加聚乙二醇-硫醇化合物，室温震荡孵育，将纳米金粒子的剩余空白表面覆盖以聚乙二醇链。最终得到纳米金靶向标记抗体复合物的溶液。
该步骤中，抗体-连接子溶液：聚乙二醇化合物溶液：纳米金粒子溶液的体积比为1：10：50-100。并且孵育时间均可以为20分钟。
步骤S3也可以包括用10MWCO2000g-2500g4℃过滤离心，并以40mM的HEPES溶液重悬沉淀。最终溶液为橙红色的具有靶向功能的纳米金抗体复合物溶液。
本发明公开的纳米金粒子靶向结合抗体的方法，以及由此制备得到的纳米金-抗体复合物，不仅可以用于靶向的细胞成像，及作为药物载体，而且在免疫诊断：如胶体金试纸条，胶体金免疫荧光试纸条，胶体金抗体筛选半固体培养基等，及生化分析，免疫诊断，生物探针的制备中都具有广泛的应用。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。
原料
抗体：单克隆糖基化靶向抗体，抗-肌动蛋白抗体，均购自：Sigma。
纳米金粒子溶液
采用柠檬酸三钠还原法制备。
将49ml超纯水置于100ml烧瓶中，伴随搅拌加热至沸腾，烧瓶上加冷凝柱防止水分蒸发。取1ml12.7mM氯金酸溶液溶于49ml超纯水中，并逐滴连续加入0.94ml38.8mM的柠檬酸三钠溶液。
此时溶液会在30秒内变为蓝色，之后150秒内变为酒红色。继续加热5分钟，冷却至室温。产生10-18nm球状分散的纳米金粒子。
该纳米金粒子溶液的紫外-可见吸收光谱示于图2中，图中可见，在520nm附近有吸收峰，与文献报道一致。
实施例
氧化抗体：将抗体稀释至90ul水中，并于10ul1M的Na2HPO4溶液相混合，得到100ul混合抗体溶液，其中抗体浓度为1mg/ml。添加10ul100mM NaIO4溶液，于室温黑暗孵育30分钟后，添加500ul磷酸盐缓冲液停止反应。
抗体-连接子连接：以上溶液中添加2ul46.5mM的连接子水溶液，室温孵育60分钟后，添加1ml40mM HEPES（4-羟乙基哌嗪乙磺酸）缓冲溶液，混匀后用10MWCO2000g4℃过滤离心10分钟，此时超滤管中还余约25%的溶液；用40mM HEPES重悬余下溶液至终体积1ml，保证抗体浓度为100ug/ml，得到抗体-连接子悬液100ug/ml。
纳米金粒子连接：将100ul抗体-连接子溶液（100ug/ml）添加至1ml纳米金粒子溶液中，室温震荡孵育20分钟；再添加100ul mPEG-SH室温震荡孵育20分钟。
用10MWCO2500g4℃离心30分钟，弃去上清液；用磷酸盐缓冲液溶液重悬沉淀至990ul+10ul20%PEG溶液。
最终得到橙红色、具有靶向功能的纳米金抗体复合物溶液。
质量控制
抗体与纳米金粒子连接后，紫外-可见吸收峰与纳米金粒子相比有约3nm的红移，如图3所示。未连接抗体时，纳米金粒子溶液的吸收峰位于519nm处；连接抗体后，溶液的吸收峰位于525nm处。
若在约600nm处有吸收峰指示溶液中有聚集体，液体由红色变为蓝灰色，不可再使用。
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所作出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。

Claims (8)

1.一种纳米金靶向标记抗体复合物，包括：
纳米金粒子核；
包覆纳米金粒子核并且Fab端暴露的一种或多种抗体；
通过金硫醇键连接到纳米金粒子核表面的巯基聚乙二醇化合物；以及
具有下式I结构的连接子，
Figure FDA00002645705400011
其中，所述连接子的巯基端通过金硫醇键吸附到纳米金粒子核表面，并且所述连接子的酰肼端与抗体的Fc端或非靶位点的糖基化部分共价连接。
2.根据权利要求1所述的纳米金靶向标记抗体复合物，其特征在于，所述纳米金粒子的粒径为10-25nm。
3.根据权利要求1所述的纳米金靶向标记抗体复合物，其特征在于，所述抗体为靶向于细胞表面或细胞内分子的IgG抗体。
4.根据权利要求1所述的纳米金靶向标记抗体复合物，其特征在于，所述巯基聚乙二醇化合物是分子量为5k Da的甲氧基-聚乙二醇-巯基。
5.一种制备权利要求1-4中任一项所述的纳米金靶向标记抗体复合物的方法，包括以下步骤：
S1氧化抗体：在抗体溶液中添加NaIO4，室温避光孵育，之后加入磷酸盐缓冲液停止反应，得到氧化抗体溶液，其中每10-15mg抗体添加0.1mmol的NaIO4；
S2使抗体与连接子相连：在氧化抗体溶液中添加与抗体等摩尔量的式I的连接子，室温孵育，之后加入HEPES溶液停止反应，得到抗体-连接子溶液；
S3连接纳米金粒子：将抗体-连接子溶液加入纳米金粒子溶液，室温震荡孵育，添加的聚乙二醇化合物溶液，室温震荡孵育，得到纳米金靶向标记抗体复合物的溶液。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S1中，抗体溶液的pH为7-8。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S2还包括用10MWCO2000g4℃过滤离心，并以HEPES溶液重悬余下溶液，以保证抗体-连接子溶液中抗体的浓度为100ug/ml。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S3还包括用10MWCO2000g-2500g4℃过滤离心，并以HEPES溶液重悬沉淀。
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