CN115290883A - 多种外泌体蛋白的同步检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种多种外泌体蛋白的同步检测方法，包括步骤：形成免疫磁珠MBs2@Ab1、形成多种Ab2‑W、形成MBs3 Track、形成双抗夹心复合物、形成多种核酸短链P、形成待测荧光液和荧光检测等七个步骤。该同步检测方法主要是先利用DNAzyme将外泌体蛋白转换为核酸，再利用CRISPR/Cas系统检测核酸，两者结合实现双重信号放大，然后通过荧光进行信号区分，最终实现多种外泌体蛋白浓度的同步定量检测，该同步检测方法灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单，而且有利于临床上实现同步定量检测多种外泌体蛋白。

Description

多种外泌体蛋白的同步检测方法

技术领域

本发明属于外泌体检测技术领域，具体涉及一种多种外泌体蛋白的同步检测方法。

背景技术

外泌体是活细胞主动分泌到体液中粒径为30～150nm的细胞外囊泡(Extracellular vesicles，EVs)，其不仅体液含量高(可达1×10¹⁰particles/mL)、来源广、稳定性好、时效性强，还具有细胞来源特异性，或为理想的肿瘤标志物。研究表明外泌体蛋白广泛参与了上皮间质转化、诱导血管生成，促进转移前微环境形成、以及免疫逃逸等过程，在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。目前已报道的外泌体中肺癌蛋白标志物有细胞外基质蛋白1、程序性细胞死亡配体1、脂多糖结合蛋白、MUC1粘蛋白、富亮氨酸α2糖蛋白1、表皮生长因子受体和上皮细胞粘附分子等。然而，目前尚未发现一种能明确诊断肺癌的特异性蛋白标志物，对外泌体中多种蛋白标志进行联合检测是提高肺癌筛查准确性的有效方法。

目前常用的外泌体蛋白的检测方法有酶联免疫吸附试验、免疫印迹和液相色谱-质谱法等。其中酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)虽然可以检测单一外泌体蛋白，但是较低浓度的蛋白则难以检测到，而且还不适用于多种蛋白的同步检测。免疫印迹耗时长，无法对蛋白含量进行准确定量、且检测结果受到可溶性蛋白的干扰。液相色谱-质谱法需要昂贵的仪器，操作相对复杂，需要有专业的技术人员，难以在临床上应用。因此，目前亟需开发利于临床上使用的同步测定多种目标物的外泌体分析方法。

发明内容

鉴于此，本发明有必要提供一种灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单且有利于临床上实现同步测定多种外泌体蛋白的方法，以解决上述问题。

为此，本发明提供一种多种外泌体蛋白的同步检测方法，包括步骤：

形成免疫磁珠：将多种待测外泌体蛋白的捕获抗体Ab1同时偶联到羧基磁珠MBs2上形成免疫磁珠MBs2@Ab1；

形成多种Ab2-W：将所述多种待测外泌体蛋白中的每一种外泌体蛋白对应的检测抗体Ab2生物素化，形成生物素化检测抗体Ab2-Bio；将每一种生物素化检测抗体Ab2-Bio与对应的脱氧核酶W偶联形成偶联物Ab2-W；

形成链霉亲和素磁珠Track：将链霉亲和素磁珠MBs3与所述多种待测外泌体蛋白中的每一种外泌体蛋白的生物素化底物链T进行偶联，形成修饰有多种所述生物素化底物链T的MBs3 Track，将该MBs3 Track重悬于剪切反应液中形成MBs3 Track悬浮液，其中，所述剪切反应液中包括辅酶因子和RNase抑制剂；

形成双抗夹心复合物：将所述免疫磁珠MBs2@Ab1、含有所述多种待测外泌体蛋白的待测样品以及多种偶联物Ab2-W混合孵育，形成双抗夹心复合物；

形成多种核酸短链P：将所述MBs3 Track悬浮液加入所述双抗夹心复合物中进行再次孵育，使每一脱氧核酶W切割对应的生物素化底物链T产生核酸短链P，磁分离，收集含有多种核酸短链P的上清液；

形成待测荧光液：先将所述含有多种核酸短链P的上清液与信号溶液混合孵育，其中，所述信号溶液中包括每一核酸短链P对应的Cas蛋白、Cas-crRNA和荧光信号探针，使每一核酸短链P与其对应的Cas-crRNA杂交，激活对应的Cas蛋白以切割对应的荧光信号探针使其荧光基团恢复荧光，形成待测荧光液；

荧光检测：采用多功能微孔板读板机同步检测所述待测荧光液中的每一荧光基团的荧光强度，利用每一荧光基团的荧光强度与对应的待测外泌体蛋白的浓度之间的关系构建对应的回归方程。

基于上述，所述形成免疫磁珠的步骤包括：利用EDC/Sulfo-NHS法将SAA1的捕获抗体Ab1_SAA1和FV的捕获抗体Ab1_FV同时偶联到羧基磁珠MBs2上，并采用牛血清蛋白溶液封闭处理，得到所述免疫磁珠MBs2@Ab1，将所述疫磁珠MBs2@Ab1重悬于磷酸盐缓冲溶液中，形成免疫磁珠MBs2@Ab1悬浮液。

其中，本文中的“SAA1”是指血清淀粉样蛋白A，英文全称Serum amyloid A-1protein；“FV”是指凝血因子V，英文全称Coagulation factor V。

基于上述，所述形成多种Ab2-W的步骤包括：

将SAA1的检测抗体Ab2_SAA1溶液和Sulfo-NHS-LC-Biotin均匀混合，并于室温振荡反应，获得SAA1的生物素化检测抗体Ab2_SAA1-Bio溶液；先将所述生物素化检测抗体Ab2_SAA1-Bio溶液与链霉亲和素溶液于室温下反应，再加入脱氧核酶W1溶液并于室温反应，制得偶联物Ab2_SAA1-W1溶液；

将FV的检测抗体Ab2_FV溶液和Sulfo-NHS-LC-Biotin均匀混合，并于室温振荡反应，获得FV的生物素化检测抗体Ab2_FV-Bio溶液；先将所述生物素化检测抗体Ab2_FV-Bio溶液与链霉亲和素溶液于室温下反应，再加入脱氧核酶W2溶液并于室温反应，制得偶联物Ab2_FV-W2溶液。

基于上述，所述SAA1的捕获抗体Ab1_SAA1为鼠抗人SAA1单克隆捕获抗体，所述FV的捕获抗体Ab1_FV为兔抗人FV单克隆捕获抗体，所述SAA1的检测抗体Ab2_SAA1为鼠抗人SAA1单克隆检测抗体，所述FV的检测抗体Ab2_FV为绵羊抗人FV多克隆检测抗体。

基于上述，所述形成链霉亲和素磁珠Track的步骤包括：将底物链T1和T2的混合液与所述链霉亲和素磁珠MBs3在室温中震荡反应，使所述底物链T1和T2同时修饰在所述链霉亲和素磁珠MBs3上，磁分离，获得所述链霉亲和素磁珠MBs3 Track；将所述链霉亲和素磁珠Track重悬于所述剪切反应液中，形成MBs3 Track悬浮液；其中，所述剪切反应液的pH为7.0～8.0，且包括10～90mmol/L MgCl₂、0.6～1.2mmol/LDTT和0.8～1.6U/μL RNase抑制剂。

基于上述，所述脱氧核酶W1为SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，所述脱氧核酶W2为SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；所述底物链T1为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述底物链T2为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

基于上述，所述形成双抗夹心复合物的步骤包括：将所述免疫磁珠MBs2@Ab1悬浮液、含有SAA1和FV的待测样品、所述偶联物Ab2_SAA1-W1溶液和所述偶联物Ab2_FV-W2溶液于37℃混合孵育，磁分离，获得双抗夹心复合物。

基于上述，所述形成多种核酸短链P的步骤包括：将所述MBs3 Track悬浮液加入所述双抗夹心复合物中于37℃振荡反应，使脱氧核酶W1切割所述底物链T1并释放出短链RNAP1，脱氧核酶W2切割所述底物链T2并释放出短链DNA P2，磁分离，收集含有所述短链RNA P1和DNA P2的上清液。

基于上述，所述形成待测荧光液的步骤包括：

所述信号溶液中包括30～180nmol/L Cas13a、30～180nmol/L Cas12a、150nmol/LCas13a-crRNA，150nmol/L Cas12a-crRNA、200～1000nmol/L SAA1荧光信号探针FQ1和200～1000nmol/L FV荧光信号探针FQ2，其中，所述SAA1荧光信号探针FQ1的核酸序列由5′到3′为：Cy5-rUrUrUrUrU-BHQ2，所述FV荧光信号探针FQ2的核酸序列由5′到3′为：FAM-TTATT-BHQ1；

将所述信号溶液加入所述含有所述短链RNA P1和DNA P2的上清液中在37℃孵育，使所述短链RNA P1与Cas13a-crRNA杂交并激活Cas13a以切割所述SAA1荧光信号探针FQ1使其中的Cy5荧光基团恢复荧光、使所述短链DNA P2与Cas12a-crRNA杂交并激活Cas12a以切割所述FV荧光信号探针FQ2使其中的FAM荧光基团恢复荧光，形成所述待测荧光液。

基于上述，所述荧光检测的步骤包括：

向所述待测荧光液中加入所述剪切反应液，并采用荧光光谱仪同步测定其中的Cy5荧光基团的荧光强度值FL_SAA1或FL_0(SAA1)、FAM荧光基团的荧光强度值FL_FV或FL_0(FV)；

在所述SAA1的浓度为0.1～30ng/mL的范围内，建立检测SAA1浓度的回归方程：Y_SAA1＝3682.77C_SAA1+49249.79，其中，Y_SAA1为相对应的荧光强度差值：FL_SAA1-FL_0(SAA1)，复相关系数R²＝0.982，C_SAA1代表SAA1的浓度；

在所述FV的浓度为1～50ng/mL的范围内，建立检测FV浓度的回归方程：Y_FV＝20262.48C_FV+663842.23，其中，Y_FV为相对应的荧光强度差值：FL_FV-FL_0(FV)，复相关系数R²＝0.999，C_FV代表FV的浓度。

本发明提供的多种外泌体蛋白的同步检测方法，将每一外泌体蛋白的捕获抗体Ab1同时偶联到羟基磁珠MBs2上形成免疫磁珠MBs2@Ab1，用于捕获标准样品或者外泌体裂解液中的待测外泌体蛋白；利用链霉亲和素和生物素之间的特异性相互作用，将每一外泌体蛋白的检测抗体Ab2与对应的脱氧核酶W进行连接形成偶联物Ab2-W，其可以与被免疫磁珠捕获的待测样品中的目标物结合，形成双抗夹心复合物；利用链霉亲和素磁珠MBs3表面的链霉亲和素可以与生物素结合的特征，将其与每一外泌体蛋白的生物素化底物链T进行偶联，形成MBs3 Track；将所述MBs3 Track加入所述双抗夹心复合物中，在辅酶因子的存在下进行再次孵育，使每一脱氧核酶W特异性切割对应的生物素化底物链T产生核酸短链P，通过此种方式，将每一外泌体蛋白的含量转换为了对应的核酸短链P的浓度，且一个蛋白分子可以转化为多条核酸，实现了第一次信号放大；通过磁分离，收集含有多种核酸短链P的上清液，并与信号溶液混合孵育，其中，所述信号溶液中包括每一核酸短链P对应的Cas蛋白、Cas-crRNA和荧光信号探针，且每一荧光信号探针的5′和3′端分别修饰有荧光基团和淬灭基团，正常情况下不发出荧光；利用CRISPR/Cas系统使每一核酸短链P与其对应的Cas-crRNA杂交激活对应的Cas蛋白，激活后的Cas蛋白可以连续不断地切割对应的荧光信号探针，荧光信号探针被切割后其中的荧光基团恢复荧光，可产生荧光信号，形成待测荧光液；如此，每一核酸短链P可以使多个荧光基团恢复荧光，实现第二次信号放大；利用荧光基团的荧光强度与外泌体蛋白浓度之间的线性关系，可以实现每一外泌体蛋白的定量检测。

所以，本发明提供的上述同步检测方法具有以下优点：

1)采用羧基磁珠MBs2作为分离介质以提高目标物捕获效率；

2)通过将多种捕获抗体同时偶联到MBs2上，制备了多功能免疫磁珠，实现了多种外泌体蛋白的特异性捕获、分离和富集；

3)采用了配对抗体识别目标物，只有在相应的捕获抗体和检测抗体均结合了目标物的基础上才能产生后续检测信号，保证了检测方法的特异性；

4)采用脱氧核酶(DNAzyme)和CRISPR/Cas技术实现了双重信号放大，提高检测灵敏度；同时，该检测体系普适性强，不仅可以用于外泌体非膜蛋白的检测，还适用于膜蛋白以及尚未明确定位的外泌体蛋白的检测；

5)与常见的单信号分析法相比，本发明提供的上述方法具有所需样本量小、操作步骤简便和高通量的优点；

6)上述同步检测方法可以成功应用于血浆外泌体中SAA1和FV的检测，且根据检测结果可以有效区分肺癌患者和健康对照。

因此，本发明提供的上述多种外泌体同步检测方法灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单，而且有利于临床上实现同步定量检测多种外泌体蛋白。

附图说明

图1是本发明实施例一提供的外泌体SAA1和FV浓度同步检测原理图。

图2是本发明实施例一提供的羧基磁珠MBs2和免疫磁珠MBs2@Ab1的表征图；其中，该图中的图A是MBs2透射电镜图，图B是MBs2@Ab1的水合粒径表征图。

图3是本发明实施例一提供的MBs3和MBs3 Track的表征图；其中，该图中的图A是MBs3透射电镜图，图B是MBs3 Track的水合粒径表征图，图C是MBs3和MBs3Track的Zeta电位表征图。

图4是本发明实施例一提供的W1和W2切割底物链T1和T2的凝胶电泳图，其中，该图中的泳道1：DNA分子量标准物，自下而上分子量分别为：50、100、150、200、250、300、400、500bp；泳道2：2μmol/L W1；泳道3：2μmol/L T1；泳道4：2μmol/L W1+2μmol/L T1；泳道5：2μmol/L W1+2μmol/L T1+Mg²⁺；泳道6：2μmol/LW2；泳道7：2μmol/L T2；泳道8：2μmol/L W2+2μmol/L T2；泳道9：2μmol/L W2+2μmol/L T2+Mg²⁺。

图5是本发明实施例一提供的Cas13a和Cas12a反式切割活性考察结果图；其中，该图中的图A是Cas13a的反式切割活性考察结果图，图B是Cas12a的反式切割活性考察结果图。

图6是本发明实施例一提供的Cas13a和Cas12a体系相互干扰考察结果图，其中，该图中的组1代表信号溶液；组2代表信号溶液+T1；组3代表信号溶液+T2；组4代表信号溶液+T1+T2。

图7是本发明实施例一提供的外泌体SAA1和FV浓度同步检测的标准曲线图，其中，该图中的图A为SAA1标准曲线图，图B为FV标准曲线图。

图8是本发明实施例一提供的共沉淀法提取血浆外泌体的表征图，其中，该图中的图A为血浆外泌体透射电镜图；图B为血浆外泌体WB(Western blotting)表征图。

图9是本发明实施例一提供的所建立方法检测不同目标物时的荧光信号对比图。

图10是采用本发明实施例一提供的方法检测血浆外泌体中SAA1和FV的结果图，其中，该图中图A为LC组及HC组血浆外泌体中SAA1和FV的对比图；图B为PCA分析结果图，图中每个点代表一个样品。

图11是本发明试验条件优化实施例提供的免疫磁珠用量优化图。

图12是本发明试验条件优化实施例提供的偶联物Ab2-W的稀释比优化图。

图13是本发明试验条件优化实施例提供的MBs3 Track稀释比优化图。

图14是本发明试验条件优化实施例提供的剪切反应液中Mg²⁺浓度优化图。

图15是本发明试验条件优化实施例提供的信号溶液中Cas13a和Cas12a的浓度优化结果图。

图16是本发明试验条件优化实施例提供的信号溶液中的FQ1和FQ2荧光探针的浓度优化结果图。

其中，序列表中：

SEQ ID No.1为本发明实施例采用的Track 1的核苷酸序列；

SEQ ID No.2为本发明实施例采用的Track 2的核苷酸序列；

SEQ ID No.3为本发明实施例采用的DNAzyme Walker 1的核苷酸序列；

SEQ ID No.4为本发明实施例采用的DNAzyme Walker 2的核苷酸序列；

SEQ ID No.5为本发明实施例采用的Cas12a-crRNA的核苷酸序列；

SEQ ID No.6为本发明实施例采用的Cas13a-crRNA的核苷酸序列。

具体实施方式

下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。若未特别指明，以下实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明提供一种多种外泌体蛋白的同步检测方法，包括步骤：形成免疫磁珠MBs2@Ab1、形成多种Ab2-W、形成MBs3 Track、形成双抗夹心复合物、形成多种核酸短链P、形成待测荧光液和荧光检测等七个步骤。该同步检测方法主要是先利用DNAzyme将外泌体蛋白转换为核酸，再利用CRISPR/Cas系统检测核酸，两者结合实现双重信号放大，然后通过荧光进行信号区分，最终实现多种外泌体蛋白浓度的同步定量检测。

下面以SAA1和FV为例，提供一种同步检测SAA1和FV的方法。本发明实施例采用的试剂与材料如下所示：

羧基磁珠(Magnetic beads 2，MBs2)、链霉亲和素磁珠(Magnetic beads 3，MBs3)均购自百运纳米科技有限公司；FV标准品、SAA1标准品、兔抗人FV单克隆捕获抗体(Ab1_FV)均购自Abcam；鼠抗人SAA1单克隆捕获抗体(Ab1_SAA1)、鼠抗人SAA1单克隆检测抗体(Ab2_SAA1)均购自上海墨迪斯医疗技术有限公司；绵羊抗人FV多克隆检测抗体(Ab2_FV)、Sulfo-NHS-LC-Biotin、总外泌体分离试剂盒(来自血浆)均购自美国赛默飞世尔科技有限公司；RNase抑制剂购自碧云天生物；链霉亲和素(Streptavidin，SA)购自默克生命科学；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(1-(3-(Dimethylamino)propyl)-3-ethylcarbodiimidehydrochloride，EDC)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐(N-Hydroxysulfosuccinimide sodiumsalt，Sulfo-NHS)、二硫苏糖醇(Dithiothreitol，DTT)均购自上海晶纯生化科技股份有限公司；ELISA显色液购自生工生物工程股份有限公司；96孔酶标板购自广州洁特生物过滤股份有限公司；96孔全黑微孔板购自上海晶安生物科技有限公司；LbuCas13a蛋白购自广州博徕斯生物科技有限公司；LbaCas12a蛋白(

20Lba Cas12a)、NEBuffer r2.1(10×)均购自英国NEB ENGLAND公司；神经元特异性烯醇化酶(Neuron specific enolase，NSE)购自美国Sigma-Aldrich；SAA1 ELISA试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；FVELISA试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司；癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen，CEA)购自北京科跃中楷生物技术有限公司；免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)购自索莱宝科技有限公司；外泌体专用裂解液购自上海宇玫博生物科技有限公司。

所用核酸购自生工生物工程股份有限公司，核酸序列如SEQ ID No.1～6以及表1所示；实验用水均为Milli-Q水(电阻率大于18.2MΩ·cm)。

表1实验所用核酸名称及碱基序列

注：下划线部分为Mg²⁺DNAzyme的切割位点；加粗部分为Mg²⁺DNAzyme的催化核心。

本发明实施例采用的主要仪器有：透射电子显微镜(JEM-2100，日本)；磁学测量系统(MPMS3，美国Quantum Design公司)；多功能微孔板读板机(SpectraMax M2e，SpectraMaxi3x，美谷分子仪器有限公司)；超微量紫外分光光度计(Thermo Nanodrop2000，美国赛默飞世尔科技有限公司)，凝胶成像系统(Amersham Imager 600，美国GE公司)，凝胶图像分析系统(Gel Doc XR+，美国BIO-RAD公司)，紫外可见分光光度计(UV 1601，日本岛津)；纳米粒度及Zeta电位分析仪(Zetasizer Nano-zs 90，英国Malvern公司)；超纯水装置(美国Millipore公司)。

本发明各实施例主要使用的配制溶液如下：

1)0.01mol/L PBS(Phosphate buffer solution，磷酸盐缓冲溶液pH 7.4)：将市售PBS粉末溶于2L Milli-Q水中，混匀，经高压灭菌后使用。

2)PBST(磷酸盐吐温缓冲液，pH 7.4)：含0.01mol/L PBS，0.05％Tween 20，pH7.4。向500mL 0.01mol/L PBS缓冲液中加入250μL Tween 20，充分混匀。

3)剪切反应液(pH 7.5)：含20mmol/L Tris-HCl，150mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，30mmol/L MgCl₂，1mmol/L DTT和1U/μL RNase inhibitor。

4)0.01mol/L吗啉乙磺酸(4-Morpholineethanesulfonic acid，MES)缓冲液：称取1.0g MES一水合物溶于Milli-Q水中，定容至500mL，用KOH调节pH为6。

5)信号溶液：含150nmol/L Cas13a，150nmol/L Cas12a，150nmol/L Cas13a-crRNA，150nmol/L Cas12a-crRNA，0.8μmol/L FQ1，0.8μmol/L FQ2，1×NE Buffer r2.1。

实施例一

本发明实施例一提供的一种SAA1和FV的同步检测方法，其同步检测原理如图1所示。

首先，利用EDC/Sulfo-NHS法将两种捕获抗体Ab1_SAA1和Ab1_FV同时偶联到MBs2上，形成免疫磁珠MBs2@Ab1，用于捕获标准样品或者外泌体裂解液中的SAA1和FV；

其次，利用链霉亲和素和生物素之间的特异性相互作用，将SAA1和FV的检测抗体Ab2_SAA1和Ab2_FV与两种DNAzyme W1和W2进行偶联，分别形成偶联物Ab2_SAA1-W1和Ab2_FV-W2；

再次，所述偶联物Ab2_SAA1-W1和Ab2_FV-W2分别与被免疫磁珠捕获的目标物SAA1和FV结合，形成双抗夹心复合物；

之后，利用MBs3表面的链霉亲和素可以与生物素结合的特征，将其与生物素化的两种底物链T1和T2进行偶联，形成MBs3 Track并加入所述双抗夹心复合物中；

随后，在辅酶因子Mg²⁺的存在下，所述双抗夹心复合物中的DNAzyme W1可以特异性切割底物链T1并释放出短链RNA P1，DNAzyme W1链随后对另一条底物链T1进行切割；同理，DNAzyme W2会对底物链T2进行循环切割产生短链DNA P2；如此，实现了将SAA1和FV的含量转换为了核酸短链P1和P2的浓度，且一个蛋白分子可以转化为多条核酸，实现了第一次信号放大；

接着，通过磁分离，收集含有核酸短链RNA P1和DNA P2的上清液，向溶液中加入信号溶液，该信号溶液中含有Cas12a、Cas13a、Cas12a-crRNA、Cas13a-crRNA、SAA1荧光信号探针FQ1以及FV荧光信号探针FQ2；荧光信号探针FQ1和FQ2的5′和3′端分别修饰有荧光基团Cy5和FAM以及淬灭基团BHQ2和BHQ1，正常情况下不发出荧光，当RNA P1和DNA P2分别与Cas13a-crRNA和Cas12a-crRNA发生杂交后，可激活Cas13a和Cas12a两种Cas蛋白；激活后的Cas13a可对溶液中的SAA1荧光信号探针FQ1进行连续不断的切割，而激活后的Cas12a可对溶液中的FV荧光信号探针FQ2进行切割。荧光信号探针FQ1和FQ2被切割后，荧光基团Cy5和FAM荧光恢复，能产生荧光信号，形成待测荧光液。通过这种方式，一条P1/P2的存在，可以使多个Cy5/FAM荧光基团恢复荧光，实现第二次信号放大；

最后，利用Cy5/FAM荧光基团的荧光强度与SAA1/FV浓度之间的线性关系，构建线性回归方程，实现SAA1和FV的定量检测。

下面将具体地进一步详细解释说明本发明实施例一提供的SAA1和FV的同步检测方法。

步骤一、形成免疫磁珠MBs2@Ab1

所述免疫磁珠MBs2@Ab1的制备方法包括以下步骤：

(1)缓冲溶液置换：采用超滤法将Ab1_SAA1的缓冲液置换为PBS；将一定体积Ab1_SAA1加入50KDa超滤管，加入PBS至其体积为0.5mL。4℃12000g离心7min，弃去滤液；再加入PBS至总体积为0.5mL并进行第二次离心，离心条件同第一次，共超滤4次，得到置换缓冲液后的Ab1_SAA1；

(2)洗涤磁珠：取800μL 10mg/mL MBs2加入低吸附离心管中，磁分离并弃去上清，用MES缓冲液洗涤磁珠3次，每次1mL；

(3)活化磁珠：向上述步骤(2)的低吸附离心管中依次加入200μL 0.6mol/LSulfo-NHS溶液和0.3mol/L EDC溶液，室温振荡反应15min后，磁分离弃去上清，其中，Sulfo-NHS溶液和溶液均以MES缓冲液为溶剂；

(4)加入捕获抗体：向上述步骤(3)的低吸附离心管中加入400μL捕获抗体溶液，37℃振动反应2h，其中，所述捕获抗体溶液包括0.01mol/L PBS、0.05mg/mL Ab1_SAA1和0.05mg/mL Ab1_FV组成；磁分离得到免疫磁珠，将上清液另存；用400μL PBS清洗免疫磁珠2次；

(5)封闭：向上述步骤(4)的低吸附离心管中加入2mL 5％牛血清白蛋白(Bovinealbumin，BSA)封闭液，室温振荡反应1h；反应结束后，磁分离弃上清，用PBS清洗免疫磁珠3次，得到BSA封闭的免疫磁珠，用MBs2@Ab1表示；

(6)保存：加入4mL PBS重悬免疫磁珠，形成免疫磁珠MBs2@Ab1悬浮液，于4℃保存备用。

免疫磁珠MBs2@Ab1表征

1)采用TEM对MBs2的形貌进行表征，结果如图2A所示。由图可见MBs2为近似球形，直径约为300nm。整个磁珠由两层构成，中间深色部分为磁核，边缘颜色较浅部分可能与MBs2表面的高分子材料有关。

2)采用水合粒径和Zeta电位仪对MBs2以及偶联Ab1_SAA1和Ab1_FV形成的免疫磁珠MBs2@Ab1的粒径进行测定，结果如图2B所示。MBs2的水合粒径为369.3nm。偶联抗体后，水合粒径增大至488.3nm，如此证明免疫磁珠MBs2@Ab1制备成功。

步骤二、形成多种Ab2-W

本实施例中，形成的Ab2-W有两种，分别为Ab2_SAA1-W1和Ab2FV-W2，具体制备方法如下：

2.1Ab2_SAA1和Ab2_FV的生物素化

(1)抗体缓冲溶液的置换：采用超滤法将Ab2_SAA1的缓冲液置换为PBS，将40μL5.1mg/mL的Ab2_SAA1加入50KDa的超滤管中，加入PBS缓冲液至其体积为0.5mL；4℃12000g离心7min，弃去滤液；向超滤管中再加入PBS至总体积为0.5mL并进行第二次离心，离心条件同第一次，共超滤4次；收集置换缓冲液后的抗体，加入PBS使抗体Ab2_SAA1终浓度为1mg/mL；

(2)向1mg Sulfo-NHS-LC-Biotin中加入180μL Milli-Q水，混匀，使Sulfo-NHS-LC-Biotin的终浓度为10mmol/L；

(3)按照体积比为1000:66.5的比例向上述浓度为1mg/mL的抗体Ab2_SAA1溶液中加入浓度为10mmol/L的Sulfo-NHS-LC-Biotin，涡旋混匀，室温振荡反应1h；

同时取40μL 9.9mg/mL Ab2_FV，加入PBS使Ab2_FV的终浓度为1mg/mL，按照体积比为1000:66.5的比例向1mg/mL的Ab2_FV溶液中加入Sulfo-NHS-LC-Biotin，涡旋混匀，室温振荡反应1h；

(4)参照上述步骤(1)中的超滤方法除去步骤(3)中未反应Sulfo-NHS-LC-Biotin，收集超滤后的溶液，分别得到Ab2_SAA1-Bio和Ab2_FV-Bio储存液。

(5)储存：将Ab2_SAA1-Bio和Ab2_FV-Bio储存液储存于-20℃备用。

2.2生物素化检测抗体Ab2_SAA1/Ab2_FV与DNAzyme W1/W2偶联

(1)制备Ab2_SAA1-W1母液：取6.4μL Ab2_SAA1-Bio储存液于低吸附离心管中，先加入16μL 20μmol/L SA溶液于室温反应30min，再加入8μL 200μmol/L W1溶液在室温反应30min，然后再加入1.6μL PBS，得到Ab2_SAA1-W1母液；

(2)制备Ab2_FV-W2母液：按照上述步骤(1)制备Ab2_SAA1-W1母液相同的步骤，制得Ab2_FV-W2母液。

步骤三、形成MBs3 Track

本实施例中MBs3 Track的制备方法包括以下步骤：

(1)清洗磁珠：取510μL 2mg/mL的MBs3于低吸附离心管中，磁分离，弃上清，用PBS缓冲液洗涤磁珠MBs3 3次；

(2)加入底物链T1和T2混合液：向上述低吸附离心管中加入1062.5μL 500nmol/L的含T1和T2的混合液，充分混匀，室温振荡反应30min使T1和T2偶联到磁珠MBs3上，形成MBs3 Track，磁分离；用PBS清洗磁珠MBs3 Track 2次，每次1062.5μL；其中，所述含T1和T2的混合液包括250nmol/L的底物链T1、250nmol/L的底物链T2和1U/μL的RNase抑制剂；

(3)重悬：将MBs3 Track重悬于1020μL所述剪切反应液中，形成MBs3 Track悬浮液。

MBs3 Track表征

TEM结果如图3A所示，MBs3呈现近似球形，粒径约为300nm。由中间黑色磁核以及边缘浅色部分构成。其中浅色部分可能与磁珠表面的高分子材料和链霉亲和素有关。

为表征T1和T2是否成功的修饰于MBs3表面，对偶联T1和T2前后的MBs3的水合粒径和Zeta电位分别进行测定，结果如图3B和3C所示。

从图3B中可以看出：MBs3的水合粒径为398.2nm，在结合T1和T2后，水合粒径增大为494.1nm。从图3C中可以看出，MBs3和MBs3 Track的Zeta电位分别为6.58mV和-33.4mV。在磁珠表面修饰T1和T2后电位向负方向偏离，表明T1和T2成功的偶联于MBs3表面。

步骤四、形成双抗夹心复合物

本实施例中，所述双抗夹心复合物主要由以下步骤制得：

(1)加免疫磁珠MBs2@Ab1：将上述免疫磁珠MBs2@Ab1悬浮液按照每孔35μL加入96孔板中，用PBST洗涤免疫磁珠MBs2@Ab1一次；

(2)加含SAA1和FV的待测样品：将含SAA1和FV的混合溶液或外泌体裂解液加入96孔板中，每孔100μL；

(3)加Ab2_SAA1-W1和Ab2_FV-W2：所述Ab2_SAA1-W1母液与PBS按照1:4的体积比进行稀释形成Ab2_SAA1-W1稀释液，所述Ab2_FV-W2母液与PBS按照1:8的体积比进行稀释形成Ab2_SAA1-W1稀释液；将所述Ab2_SAA1-W1稀释液和所述Ab2_FV-W2稀释液进行混合，形成混合液；将该混合液加入上述96孔板中，每孔加入5μL上述混合液，37℃孵育90min形成双抗夹心复合物；磁分离，弃上清，用PBST洗涤3次，每次300μL；再用300μL所述剪切反应液洗涤1次，获得所述双抗夹心复合物。

步骤五、形成多种核酸短链P

本实施例中，多种核酸短链P由短链RNA P1和短链DNA P2组成，该步骤的具体制备方法如下：向“步骤四、形成双抗夹心复合物”中形成所述双抗夹心复合物的96孔板中加入上述MBs3 Track悬浮液，每孔加入30μL MBs3 Track悬浮液，37℃振荡反应60min，使得所述双抗夹心复合物中的DNAzyme W1和W2在MBs3 Track悬浮液中的辅酶因子Mg²⁺的作用下，分别切割MBs3 Track上的底物链T1和T2形成含核酸短链的混合物。具体地，在辅酶因子Mg²⁺的作用下，DNAzyme W1特异性循环切割底物链T1并释放出短链RNA P1，DNAzyme W2对底物链T2进行循环切割产生短链DNA P2，形成含核酸短链P1和P2的混合物。

DNAzyme对底物链T的切割活性验证试验

采用凝胶电泳法表征DNAzyme对底物链T的切割活性，具体试验方法如下：

按照下列分组进行溶液配制，将各组样品置于37℃振荡反应1h，采用聚丙烯酰胺凝胶实验对产物进行分析。配制15％的聚丙烯酰胺凝胶，上样量为每孔12μL样品，具体每孔加10μL反应产物和2μL Loading buffer；电泳仪电压为110V，电泳时间为2.5h。电泳结束后，将凝胶取出，浸入核酸染料Gold View染色液中，室温振荡反应30min，用凝胶成像分析系统进行凝胶成像，结果如图4所示。

分组如下：1)2μmol/L W1；2)2μmol/L T1；3)2μmol/L W1+2μmol/L T1；4)2μmol/LW1+2μmol/L T1+30mmol/L MgCl₂；5)2μmol/L W2；6)2μmol/L T2；7)2μmol/L W2+2μmol/LT2；8)2μmol/L W2+2μmol/L T2+30mmol/L MgCl₂。

从图4中可以看出：泳道4显示当无Mg²⁺时，将W1和T1混合并于37℃孵育后，未观察到W1和T1杂交和T1被切割；泳道5显示当Mg²⁺存在时，未观察到完整的T1条带，可在原T1条带的下方看到T1被切割后的短链产物。该结果表明在Mg²⁺存在时，W1链可以有效地切割T1链。同理，泳道8显示当无Mg²⁺时，将W2和T2混合并于37℃孵育后，未观察到W2和T2杂交和T2被切割；泳道9显示当Mg²⁺存在时，未观察到完整的T2条带，可在原T2条带的下方看到T2被切割后的短链产物。该结果表明在Mg²⁺存在时，W2链可以有效地切割T2链。因此，从图4中可以看出：W1/W2链可以有效切割T1/T2链。

步骤六、形成待测荧光液

本实施例中，该步骤采用Cy5荧光探针作为检测短链RNA P1的探针，采用FAM荧光探针作为检测短链DNA P2的探针，经CRISPR/Cas系统处理分别使Cy5和FAM荧光基团恢复荧光。具体实施步骤如下：

对由上述“步骤五、形成多种核酸短链P”得到的含核酸短链P1和P2的混合物进行磁分离处理，获得含核酸短链P1和P2的上清液，吸取20μL该核酸短链P1和P2的上清液至另一新的96孔全黑微孔板中，每孔加入10μL所述信号溶液，37℃孵育60min，使所述短链RNAP1与Cas13a-crRNA杂交并激活Cas13a以切割所述SAA1荧光信号探针FQ1使其中的多个Cy5荧光基团恢复荧光、使所述短链DNA P2与Cas12a-crRNA杂交并激活Cas12a以切割所述FV荧光信号探针FQ2使其中的多个FAM荧光基团恢复荧光，形成待测荧光液。

6.1Cas12a和Cas13a活性考察

(1)配制Cas12a反应体系和Cas13a反应体系，其中，该Cas12a反应体系包含150nmol/L Cas12a、150nmol/L Cas12a-crRNA和0.8μmol/L FQ2，该Cas13a反应体系包含150nmol/L Cas13a、150nmol/L Cas13a-crRNA和0.8μmol/L FQ1。

(2)向96孔全黑微孔板中加入不同浓度的T2或T1 20μL，再加入每孔10μL的Cas12a反应体系或Cas13a反应体系，37℃孵育60min。

(3)每孔加入70μL剪切反应液，用多功能微孔板读板机测定荧光强度，检测结果如图5所示。

从图5中可以看出：随着图5A中的T1和图5B中的T2浓度的增加，荧光强度逐渐增强，由此说明Cas13a和Cas12a均具有较强的反式切割活性。

6.2Cas12a和Cas13a反应体系相互干扰考察

Cas12a和Cas13a体系之间是否相互干扰直接影响后续实验结果，因此有必要进行考察。先向96孔全黑微孔板中加入20μL 5nmol/L的T2、T1或T1+T2溶液，再加入每孔10μL的信号溶液37℃孵育60min，然后每孔加入70μL剪切反应液，用多功能微孔板读板机在658nm和522nm处对FQ1和FQ2的荧光强度分别进行检测，结果如图6所示。

从图6中可以看出，当没有目标物存在时，FL₆₅₈和FL₅₂₂均较低，当只存在T1时，可在658nm处检测到明显荧光信号，而FL₅₂₂无明显荧光信号，提示T1可以有效激活Cas13a，而不激活Cas12a。同理，从组3可以看出，T2仅能激活Cas12a的活性而对Cas13a无明显影响。组4显示当T1和T2同时存在时，FL₆₅₈和FL₅₂₂均较强，且与组2中FL₆₅₈和组3中FL₅₂₂的信号强度相当，由此说明Cas12a和Cas13a体系之间无明显相互干扰。

步骤七、荧光检测

先向所述待测荧光液中加入所述剪切反应液，再利用荧光光谱仪同步测定其中的荧光信号的荧光强度值FL或FL₀，然后利用荧光强度与外泌体蛋白浓度之间的关系建立对应的回归方程。其中，该步骤中加入剪切反应液的主要目的是为了以增加待检测溶液的体积，减小因待检测溶液的体积小引起的检测误差，影响检测的准确性和灵敏度。

由于本实施例采用的FQ荧光探针由5nt的核酸及其5′和3′的荧光信号和淬灭基团构成，故难以直接测定其荧光光谱，所以本实施例采用Cas12a和Cas13a的反式切割活性对FQ2和FQ1探针进行切割，随后测定其荧光光谱。FQ1荧光探针中荧光基团Cy5的最大激发波长和最大发射波长分别为643nm和658nm，FQ2探针中的荧光基团FAM的最大激发波长和最大发射波长为499nm和522nm。优选地，本实施例选择633nm和658nm为测定FQ1信号时的激发波长和发射波长，选择480nm和522nm为测定FQ2探针荧光信号时的激发波长和发射波长。

具体地，先向“步骤六、形成待测荧光液”中形成有所述待测荧光液的96孔全黑微孔板中加入所述剪切反应液，每孔加入70μL所述剪切反应液；再用多功能微孔板读板机在658nm处检测FQ1的荧光强度FL_SAA1或FL_0(SAA1)、在522nm处检测FQ2的荧光强度FL_FV或FL_0(FV)；然后利用SAA1的浓度与FQ1的荧光强度、FV的浓度与FQ2的荧光强度之间的关系建立对应的回归方程。

7.1标准曲线的建立

用PBS缓冲溶液将SAA1和FV标准品配制成不同浓度并按照本实施例提供的方法进行荧光强度检测，分别用SAA1的浓度C_SAA1、FV的浓度C_FV作为自变量，对应的荧光信号强度FL_SAA1和FL_FV作为应变量，建立标准曲线，如图7所示。其中，FL_0(SAA1)和FL_0(FV)分别为SAA1的浓度C_SAA1、FV的浓度C_FV的空白试验对应的荧光强度。

从图7A中可以看出：在所述SAA1的浓度为0.1～30ng/mL的范围内，建立检测C_SAA1的线性回归方程：Y_SAA1＝3682.77C_SAA1+49249.79，其中，Y_SAA1为相对应的荧光强度差值：FL_SAA1-FL_0(SAA1)，复相关系数R²＝0.982。

从图7B中可以看出：在所述FV的浓度为1～50ng/mL的范围内，建立检测C_FV的线性回归方程：Y_FV＝20262.48C_FV+663842.23，其中，Y_FV为相对应的荧光强度差值：FL_FV-FL_0(FV)，复相关系数R²＝0.999。

7.2检出限

配制4个低浓度的标准溶液，其中含SAA1和FV浓度均为5、30、200、400pg/mL的混合溶液；然后按照本发明实施例提供的方法步骤进行实验；并同时测定溶剂空白的荧光强度，计算出

值(

为溶剂空白的荧光强度，SD为标准差)，混合溶液中的荧光强度大于

时的目标物浓度为所建立方法的检出限，结果如表2所示。

表2低浓度SAA1和FV的检测结果

C<sub>SAA1/FV</sub>(pg/mL)	5	30	200	400
					FL<sub>SAA1</sub>	421754	452308	482874	491862
FL<sub>FV</sub>	2008688	2337192	2598477	2607197

从表2中可以看出：当SAA1浓度为0时，空白溶液的

当SAA1浓度为30pg/mL时，其对应的荧光强度>448406.74，因此，该方法检测SAA1的检出限为30pg/mL。同理，FV蛋白的检出限为200pg/mL。

7.3精密度和加标回收率

采用共沉淀试剂盒提取血浆外泌体并进行裂解，具体步骤如下：

1)解冻血浆：将血浆从-80℃冰箱取出，37℃水浴直至全部融化；

2)血浆预处理：取200μL血浆于1.5mL离心管中，室温2000g离心20min；取上清至于新的离心管，室温10000g离心20min，取上清；

3)向血浆中加入100μL PBS缓冲液并涡旋混匀，向离心管中加入60μL共沉淀试剂，并涡旋混匀；

4)室温反应10min后进行10000g离心5min，弃上清；

5)室温10000g离心30s，再次弃上清；

6)加入50μL PBS缓冲液重悬沉淀，获得外泌体溶液，-80℃储存备用，其中，外泌体溶液的透射电镜和WB表征如图8所示。

图8A显示TEM视野下可以观察到尺寸在30～150nm之间的囊泡。从图8B中可以看出所提取的外泌体中含有Alix、HSP70、TSG101、CD63等蛋白质。因此，本实施例成功提取血浆外泌体。

取6.5μL上述外泌体溶液，再加入6.5μL外泌体专用裂解液，于冰上裂解10min，得到外泌体裂解液。进行外泌体裂解液中SAA1测定时，用PBS将外泌体裂解液稀释50倍。向稀释后的外泌体裂解液中加入不同量SAA1和FV，SAA1终浓度分别为5ng/mL和10ng/mL，FV终浓度分别为15ng/mL和30ng/mL。每个浓度3个平行，按照本发明实施例提供的方法步骤进行实验，根据标准曲线计算得出RSD和加标回收率，结果如表3所示。

从表3中可以看出：本实施例所建立的方法检测加标样本中SAA1和FV的回收率范围分别为93.20％～95.80％和94.20％～98.67％，对应的RSD分别为7.10％～9.33％和7.16％～9.41％。

表3检测SAA1和FV的精密度和加标回收率(n＝3)

7.4特异性

选择在实际样品中可能与SAA1和FV共存的IgG、CEA和NSE为阴性对照，用本实施例所建立的方法进行检测，同时测定SAA1和FV，比较检测结果，评价方法特异性，结果如图9所示。

从图9中可以看出：当只加入一种目标物SAA1时，可以在658nm检测到明显的荧光信号，而在522nm无明显信号。同样地，当目标物只有FV时，FL₅₂₂信号明显，而FL₆₅₈无明显信号。当SAA1和FV同时存在时，在658nm和522nm处均有明显的荧光信号。此外，CEA、NSE以及IgG组均无明显的荧光信号。因此，本实施例所建立的方法具有较强的特异性。

7.5方法学比较

为进一步考察本实施例所建立方法的准确性，将其与ELISA的测定结果相比较。具体步骤如下：

1)采用共沉淀法提取9例血浆样本中的外泌体，方法步骤同“7.3精密度和加标回收率”。

2)所建立方法检测：取6.5μL外泌体溶液，再加入6.5μL外泌体专用裂解液，冰上裂解10min，得到外泌体裂解液。将外泌体裂解液按照体积比1:50进行稀释，采用本实施例所建立的方法对其中SAA1和FV进行检测，检测结果如图10所示。

3)ELISA法检测：采用ELISA试剂盒对外泌体裂解液中的SAA1和FV进行检测，检测结果如图10所示。

图10表明：关联性分析显示所建立方法和ELISA检测SAA1的结果之间具有相关性(r＝0.960，P<0.001)；两种方法检测FV的结果之间也具有相关性(r＝0.981，P<0.001)，因此，本实施例所建立方法的准确性较强。

将所建立方法与ELISA试剂盒的检测目标物种类、检测时间等进行详细比较，结果见表4。表4显示本实施例所建立方法可在约3.5h内对两种蛋白质(SAA1和FV)进行同步检测，而ELISA仅能在相应时间内检测一种蛋白。此外，所建立方法的检出限明显低于ELISA试剂盒，提示其灵敏度高于ELISA法。

表4所建立方法与ELISA检测SAA1和FV比较

注：表中ELISA法检测SAA1和FV的时间、检出限和线性范围参考武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司和武汉华美生物工程有限公司生产的SAA1或FV商业化试剂盒。

7.6血浆外泌体中SAA1和FV的同步检测

经伦理学委员会审批及签署知情同意书下，采集某医院呼吸内科43例肺癌患者(LC组)和健康体检中心49例健康人(HC组)对照的血浆样品进行实验，采用共沉淀法提取血浆外泌体，提取步骤同“7.3精密度和加标回收率”；用裂解液对外泌体进行裂解释放出内容物，裂解步骤同“7.5方法学比较”中的步骤2)；采用本实施例提供的方法步骤对外泌体裂解液中的SAA1和FV进行检测，结果如图10所示。

图10A显示：LC组的SAA1信号强度高于HC组，但差异无统计学意义(Z＝-1.498，P＝0.134)；LC组的FV的荧光信号强度强于HC组，差异有统计学意义(t＝-2.664，P＝0.009)。图10B的PCA结果显示根据SAA1和FV的含量，可有效的区分肺癌患者与健康人，由此表明SAA1和FV或为潜在的肺癌标志物。

因此，本实施例提供的外泌体中SAA1和FV的同步检测方法主要是基于DNAzyme和CRISPR-Cas12a/Cas13a系统建立的，可以实现定量高灵敏度检测。该方法具有以下优点：1)采用羧基磁珠作为分离介质以提高目标物捕获效率；2)通过将两种捕获抗体同时偶联到MBs2上，制备了多功能免疫磁珠，实现了SAA1和FV的特异性捕获、分离和富集；3)采用了配对抗体识别目标物，只有在相应的捕获抗体和检测抗体均结合了目标物的基础上才能产生后续检测信号，保证了检测方法的特异性；4)采用DNAzyme和CRISPR-Cas12a/Cas13a实现了双重信号放大，提高检测灵敏度；5)该检测体系普适性强，不仅可以用于外泌体非膜蛋白的检测，还适用于膜蛋白以及尚未明确定位的外泌体蛋白的检测；6)与常见的单信号分析法相比，本研究采用的策略具有所需样本量小、操作步骤简便和高通量的优点。基于以上优点，所建立方法检测SAA1和FV的检出限分别低至30pg/mL和200pg/mL。此外，所建立方法可以成功应用于血浆外泌体中SAA1和FV的检测，且根据检测结果可以有效区分肺癌患者和健康对照。

试验条件优化实施例

依据本发明实施例一提供的外泌体蛋白SAA1和FV的同步检测方法，尤其是“步骤四、形成双抗夹心复合物”、“步骤五、形成多种核酸短链P”、“步骤六、形成待测荧光液”等方法步骤，其中的免疫磁珠MBs2@Ab1的用量、Ab2_SAA1-W1和Ab2_FV-W2稀释比、MBs3 Track的用量、Mg²⁺的浓度以及信号溶液中Cas13a/Cas12a和FQ1/FQ2的浓度等因素均对荧光强度有重要影响。下面根据荧光强度选择上述影响因素的最优条件。

1、免疫磁珠MBs2@Ab1的用量优化试验

免疫磁珠MBs2@Ab1的用量过少，会导致大量外泌体无法被捕获，从而影响检测灵敏度；用量过大，则会造成浪费。因此，采用单因素法对免疫磁珠MBs2@Ab1的用量进行优化。

采用的方法为：“步骤四、形成双抗夹心复合物”中的96孔板中的每孔加入免疫磁珠MBs2@Ab1悬浮液的用量分别为5μL、15μL、25μL、35μL、45μL，其它按照本发明实施例一提供的方法步骤进行实验，结果如图11所示。

从图11中可以看出：当免疫磁珠的用量低于35μL时，随着免疫磁珠用量的增加，荧光信号逐渐增强，这可能与目标物的捕获效率增加有关。当免疫磁珠用量进一步增加时，信号强度略降低；其原因可能是高浓度的免疫磁珠聚沉明显，影响了免疫磁珠对目标物的捕获。因此，MBs2@Ab1悬浮液的最佳用量为35μL。

2、Ab2_SAA1-W1和Ab2_FV-W2的稀释比优化试验

Ab2_SAA1-W1的稀释比优化试验采用的方法为：“步骤四、形成双抗夹心复合物”之“加Ab2_SAA1-W1和Ab2_FV-W2”的分步骤中，以PBS为溶剂，Ab2_SAA1-W1的稀释比分别为1:32、1:16、1:8、1:4、1:2，其它按照本发明实施例一提供的方法步骤进行实验，结果如图12中FL₆₅₈-FL₀曲线所示。

Ab2_FV-W2的稀释比优化试验采用的方法为：步骤“四、形成双抗夹心复合物”之“加Ab2_SAA1-W1和Ab2_FV-W2”的分步骤中，以PBS为溶剂，Ab2_FV-W2的稀释比分别为1:64、1:32、1:16、1:8、1:4，其它按照本发明实施例一提供的方法步骤进行实验，结果如图12中FL₅₂₂-FL₀曲线所示。

从图12中可以看出当Ab2_SAA1-W1的稀释比为1:4时，FL₆₅₈-FL₀最大；当Ab2_FV-W2稀释比为1:8时，FL₅₂₂-FL₀信号强度较强。当其稀释比继续缩小时，两者对应的荧光信号无明显变化。因此，Ab2_SAA1-W1的最优稀释比为1:4，Ab2_FV-W2的最优稀释比为1:8。

3、MBs3 Track的用量优化试验

试验采用的方法：“步骤三、形成MBs3 Track”中，2mg/mL的MBs3的用量与用于重悬MBs3 Track的剪切反应液的用量分别为1:1、1:2、1:4、1:8、1:16，其它按照本发明实施例一提供的方法步骤进行实验，结果如图13所示。

当MBs3 Track的用量较少时，会影响W1和W2的切割效率，而浓度过高又会造成试剂浪费。从图13中看出：当MBs3 Track的稀释比为1:2时，FL₅₂₂-FL₀最大，且FL₆₅₈-FL₀也较大。因此，MBs3 Track的最优稀释比为1:2。

4、Mg²⁺的浓度优化选择试验

由于DNAzyme W1/W2对底物链T1/T2的切割依赖Mg²⁺的存在，故对其浓度进行优化。试验采用的方法：所述剪切溶液中的MgCl₂的浓度分别为10、30、50、70、90mmol/L，其它按照本发明实施例一提供的方法步骤进行实验，结果如图14所示。

从图14中可以看出：当MgCl₂浓度从10mmol/L增加至30mmol/L时，FL₅₂₂-FL₀增强，而FL₆₅₈-FL₀略降低。随着Mg²⁺浓度的进一步增加，荧光信号显著降低。因此，Mg²⁺的最优浓度为30mmol/L。

5、信号溶液优化试验

信号溶液中Cas13a、Cas12a、FQ1、FQ2的浓度直接影响荧光信号强度，故对其进行优化。以下优化试验中采用的信号溶液中Cas13a和Cas12a与相应的crRNA的摩尔比为1:1。

5.1Cas13a/Cas12a的浓度优化试验

Cas13a和Cas12a的浓度优化试验采用的方法：1)所述信号溶液中的Cas13a的浓度分别为30、60、90、120、150、180nmol/L，其它按照本发明实施例一提供的方法步骤进行实验，结果如图15中FL₆₅₈-FL₀曲线所示。2)所述信号溶液中的Cas12a的浓度分别为30、60、90、120、150、180nmol/L，其它按照本发明实施例一提供的方法步骤进行实验，结果如图15中FL₅₂₂-FL₀曲线所示。

从图15中可以看出：当Cas13a和Cas12a的浓度均为150nmol/L时，FL₆₅₈-FL₀较大，且FL₅₂₂-FL₀最强，故，信号溶液中的Cas12a和Cas13a的最优浓度均为150nmol/L。

5.2FQ1和FQ2探针的浓度优化试验

FQ1和FQ2的浓度优化试验采用的方法：1)所述信号溶液中的FQ1的浓度分别为30、60、90、120、150、180nmol/L，其它按照本发明实施例一提供的方法步骤进行实验，结果如图16中FL₆₅₈-FL₀曲线所示。2)所述信号溶液中的FQ2的浓度分别为30、60、90、120、150、180nmol/L，其它按照本发明实施例一提供的方法步骤进行实验，结果如图16中FL₅₂₂-FL₀曲线所示。

从图16中可以看出：随着FQ1和FQ2探针浓度的增加，荧光信号强度逐渐增加。其中，当FQ1和FQ2探针的浓度大于800nmol/L时，信号强度增加幅度较小。因此，为节约成本，FQ1和FQ2探针的最佳浓度为800nmol/L。

最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。

序列表

<110> 郑州大学

<120> 多种外泌体蛋白的同步检测方法

<130> 2021.10.9

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列()

<220>

<221> rRNA

<222> (15)..(45)

<400> 1

tttttttttt ttttucuagg aagguugcgu cacuauacgu cggca 45

<210> 2

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列()

<220>

<221> rRNA

<222> (19)

<400> 2

tttttttttt ttttaccgac tataggttgt gttactcgtt gactgaaact 50

<210> 3

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

tttttttttt tttttttttt tttttttttt gtgacgcaag gctagctaca acgacttcct 60

aga 63

<210> 4

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

tttttttttt tttttttttt tttttttttt aacacaactc cgagccggtc gaaatagtcg 60

gt 62

<210> 5

<211> 41

<212> RNA

<213> 人工序列()

<400> 5

uaauuucuac uaaguguaga uagucaacga guaacacaac c 41

<210> 6

<211> 51

<212> RNA

<213> 人工序列()

<400> 6

gaccacccca aaaaugaagg ggacuaaaac agccgacgua uagugacgca a 51

Claims (10)

1.一种多种外泌体蛋白的同步检测方法，包括步骤：

形成免疫磁珠：将多种待测外泌体蛋白的捕获抗体Ab1同时偶联到羧基磁珠MBs2上形成免疫磁珠MBs2@Ab1；

形成多种Ab2-W：将所述多种待测外泌体蛋白中的每一种外泌体蛋白对应的检测抗体Ab2生物素化，形成生物素化检测抗体Ab2-Bio；将每一种生物素化检测抗体Ab2-Bio与对应的脱氧核酶W偶联形成偶联物Ab2-W；

形成链霉亲和素磁珠Track：将链霉亲和素磁珠MBs3与所述多种待测外泌体蛋白中的每一种外泌体蛋白的生物素化底物链T进行偶联，形成修饰有多种所述生物素化底物链T的MBs3 Track，将该MBs3 Track重悬于剪切反应液中形成MBs3 Track悬浮液，其中，所述剪切反应液中包括辅酶因子和RNase抑制剂；

形成双抗夹心复合物：将所述免疫磁珠MBs2@Ab1、含有所述多种待测外泌体蛋白的待测样品以及多种偶联物Ab2-W混合孵育，形成双抗夹心复合物；

形成多种核酸短链P：将所述MBs3 Track悬浮液加入所述双抗夹心复合物中进行再次孵育，使每一脱氧核酶W切割对应的生物素化底物链T产生核酸短链P，磁分离，收集含有多种核酸短链P的上清液；

形成待测荧光液：先将所述含有多种核酸短链P的上清液与信号溶液混合孵育，其中，所述信号溶液中包括每一核酸短链P对应的Cas蛋白、Cas-crRNA和荧光信号探针，使每一核酸短链P与其对应的Cas-crRNA杂交，激活对应的Cas蛋白以切割对应的荧光信号探针使其荧光基团恢复荧光，形成待测荧光液；

荧光检测：采用多功能微孔板读板机同步检测所述待测荧光液中的每一荧光基团的荧光强度，利用每一荧光基团的荧光强度与对应的待测外泌体蛋白的浓度之间的关系构建对应的回归方程。

2.根据权利要求1所述的同步检测方法，其特征在于，所述形成免疫磁珠的步骤包括：利用EDC/Sulfo-NHS法将SAA1的捕获抗体Ab1_SAA1和FV的捕获抗体Ab1_FV同时偶联到羧基磁珠MBs2上，并采用牛血清蛋白溶液封闭处理，得到所述免疫磁珠MBs2@Ab1，将所述疫磁珠MBs2@Ab1重悬于磷酸盐缓冲溶液中，形成免疫磁珠MBs2@Ab1悬浮液。

3.根据权利要求2所述的同步检测方法，其特征在于，所述形成多种Ab2-W的步骤包括：

将SAA1的检测抗体Ab2_SAA1溶液和Sulfo-NHS-LC-Biotin均匀混合，并于室温振荡反应，获得SAA1的生物素化检测抗体Ab2_SAA1-Bio溶液；先将所述生物素化检测抗体Ab2_SAA1-Bio溶液与链霉亲和素溶液于室温下反应，再加入脱氧核酶W1溶液并于室温反应，制得偶联物Ab2_SAA1-W1溶液；

将FV的检测抗体Ab2_FV溶液和Sulfo-NHS-LC-Biotin均匀混合，并于室温振荡反应，获得FV的生物素化检测抗体Ab2_FV-Bio溶液；先将所述生物素化检测抗体Ab2_FV-Bio溶液与链霉亲和素溶液于室温下反应，再加入脱氧核酶W2溶液并于室温反应，制得偶联物Ab2_FV-W2溶液。

4.根据权利要求3所述的同步检测方法，其特征在于，所述SAA1的捕获抗体Ab1_SAA1为鼠抗人SAA1单克隆捕获抗体，所述FV的捕获抗体Ab1_FV为兔抗人FV单克隆捕获抗体，所述SAA1的检测抗体Ab2_SAA1为鼠抗人SAA1单克隆检测抗体，所述FV的检测抗体Ab2_FV为绵羊抗人FV多克隆检测抗体。

5. 根据权利要求3或4所述的同步检测方法，其特征在于，所述形成链霉亲和素磁珠Track的步骤包括：将底物链T1和T2的混合液与所述链霉亲和素磁珠MBs3在室温中震荡反应，使所述底物链T1和T2同时修饰在所述链霉亲和素磁珠MBs3上，磁分离，获得所述链霉亲和素磁珠MBs3 Track；将所述链霉亲和素磁珠Track重悬于所述剪切反应液中，形成MBs3Track悬浮液；其中，所述剪切反应液的pH为7.0～8.0，且包括10～90 mmol/L MgCl₂、0.6～1.2 mmol/L DTT和0.8～1.6 U/µL RNase 抑制剂。

6. 根据权利要求5所述的同步检测方法，其特征在于，所述脱氧核酶W1为SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，所述脱氧核酶W2为SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；所述底物链T1为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述底物链T2为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

7.根据权利要求6所述的同步检测方法，其特征在于，所述形成双抗夹心复合物的步骤包括：将所述免疫磁珠MBs2@Ab1悬浮液、含有SAA1和FV的待测样品、所述偶联物Ab2_SAA1-W1溶液和所述偶联物Ab2_FV-W2溶液于37℃混合孵育，磁分离，获得双抗夹心复合物。

8. 根据权利要求7所述的同步检测方法，其特征在于，所述形成多种核酸短链P的步骤包括：将所述MBs3 Track悬浮液加入所述双抗夹心复合物中于37℃振荡反应，使脱氧核酶W1切割所述底物链T1并释放出短链RNA P1，脱氧核酶W2切割所述底物链T2并释放出短链DNA P2，磁分离，收集含有所述短链RNA P1和DNA P2的上清液。

9.根据权利要求8所述的同步检测方法，其特征在于，所述形成待测荧光液的步骤包括：

所述信号溶液中包括30～180 nmol/L Cas13a、30～180 nmol/L Cas12a、150 nmol/LCas13a-crRNA，150 nmol/L Cas12a-crRNA、200～1000 nmol/L SAA1荧光信号探针FQ1和200～1000 nmol/L FV荧光信号探针FQ2，其中，所述SAA1荧光信号探针FQ1的核酸序列由5′到3′为：Cy5-rUrUrUrUrU-BHQ2，所述FV荧光信号探针FQ2的核酸序列由5′到3′为：FAM-TTATT-BHQ1；

将所述信号溶液加入所述含有所述短链RNA P1和DNA P2的上清液中在37℃孵育，使所述短链RNA P1与Cas13a-crRNA杂交并激活Cas13a以切割所述SAA1荧光信号探针FQ1使其中的Cy5荧光基团恢复荧光、使所述短链DNA P2与Cas12a-crRNA杂交并激活Cas12a以切割所述FV荧光信号探针FQ2使其中的FAM荧光基团恢复荧光，形成所述待测荧光液。

10.根据权利要求9所述的同步检测方法，其特征在于，所述荧光检测的步骤包括：

向所述待测荧光液中加入所述剪切反应液，并采用多功能微孔板读板机同步测定其中的Cy5荧光基团的荧光强度值FL_SAA1或FL_0(SAA1)、FAM荧光基团的荧光强度值FL_FV或FL_0(FV)；

在所述SAA1的浓度为0.1～30 ng/mL的范围内，建立检测SAA1浓度的回归方程：Y_SAA1 =3682.77 C_SAA1 + 49249.79，其中，Y _SAA1为相对应的荧光强度差值：FL_SAA1 - FL_0(SAA1)，复相关系数R ² =0.982，C_SAA1代表SAA1的浓度；

在所述FV的浓度为1～50 ng/mL的范围内，建立检测FV浓度的回归方程：Y_FV =20262.48 C_FV + 663842.23，其中，Y_FV为相对应的荧光强度差值：FL_FV - FL_0(FV)，复相关系数R ² =0.999，C_FV代表FV的浓度。

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