CN116819077A - 外泌体检测试剂及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及外泌体检测试剂及检测方法。本发明,利用靶向外泌体的抗体捕获外泌体,再利用靶向外泌体的适配体识别外泌体,通过G4结构的DNA模拟酶催化和RCA两种方式放大外泌体浓度信息。最后通过G4‑Hemin结构催化TMB氧化显色或形成G4‑NMM结构产生荧光信号,从而完成对外泌体的检测。实验表明,比色法和荧光法对外泌体浓度的检测范围分别为4×103~4×108particles/mL和4×102~4×106particles/mL,检测限分别为7990particles/mL和33.18particles/mL。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及外泌体检测试剂及检测方法。
背景技术
外泌体(exosome)是通过细胞内多泡体融合到质膜和胞外分泌形成的,直径在30-150nm左右,由脂质双分子层组成。外泌体具有典型的囊泡结构,能够运输细胞内外的蛋白质、核酸、酶等物质,可通过细胞或各种生物体液,包括血液、唾液、尿液等分离出来。所有细胞都会释放外泌体,但应激状态下的细胞会产生比正常细胞更多的外泌体,如缺氧状态下的肿瘤细胞。研究发现,肿瘤分泌的外泌体能够通过调节肿瘤微环境,从而促进癌症的形成。外泌体成为一种优异的癌症生物标志物,可以在一定程度上反映癌症的发展。因此,基于外泌体在指示癌症相关的生理状态等方面具有重要作用,外泌体越来越多的被应用于癌症的诊断、治疗和监测中(Biosensors and Bioelectronics,2021,183,113176;Methodsin molecular biology 2022,2504,3-20)。
目前已经开发了多种外泌体检测方法,包括纳米颗粒跟踪分析(NTA)、ELISA、Western Blot、质谱分析等(Proteomics,2017,17,1600370;Analytical Chemistry,2019,91,13297-13305)。传统的ELISA和Western Blot等方法虽然可以定量外泌体表面丰富的蛋白,但它们的特异性较差,需要大量样本,成本高,稳定性差等缺点限制了它们在临床中的应用。相比之下,新兴的比色法、荧光光谱法、电化学检测、表面增强拉曼(SERS)和表面等离子体共振(SPR)等方法具有高灵敏度,但也容易受到其他信号干扰的影响。(Journal ofBiomedical Nanotechnology,2022,18,1084-1096;Nanoscale,2019,11,10106-10113;Frontiers in Bioengineering and Biotechnology,2022,9,808933;ACS Sensors,2018,3,1471-1479)因此,需要进一步优化这些新方法,以提高其特异性和准确性,从而更好地应用于临床实践中。
发明内容
有鉴于此,本发明要解决的技术问题在于提供外泌体检测试剂及检测方法。
外泌体的检测试剂,其包括:包被抗体的磁珠、适配体、G-Padlock和显色试剂;
所述包被抗体的磁珠中,抗体为靶向外泌体的抗体;
所述适配体靶向外泌体表面蛋白质,且修饰有荧光基团;
所述G-Padlock能够与所述适配体发生滚环扩增反应;
所述显色试剂包括紫外显色试剂和/或荧光显色液;
所述紫外显色液中包括Hemin和TMB,
所述荧光显色液中包括NMM。
G-四链体(G-quadruplex,G4)是一种由富含串联重复鸟嘌呤(G)的DNA或RNA折叠形成的高级结构。一些具有卟啉结构的小分子,如氯化血红素(Hemin)或N-甲基卟啉二丙酸IX(NMM)等,通过π-π作用在G4的末端堆叠。本发明提供的试剂,利用靶向外泌体的抗体捕获外泌体,再利用靶向外泌体的适配体识别外泌体,通过G4结构的DNA模拟酶催化和滚环扩增(RCA)两种方式放大外泌体浓度信息。最后通过G4-Hemin结构催化TMB氧化显色或形成G4-NMM结构产生荧光信号,从而完成对外泌体的检测。
本发明中,所述抗体和适配体都靶向外泌体表面的蛋白质。根据采用的抗体和适配体的不同,本发明所述的试剂,可以对所有的外泌体进行检测,也可以对不同细胞来源的外泌体进行区分和检测。
所述外泌体表面的蛋白质包括但不限于:热休克蛋白8(HSPA8)、CD63抗原(CD63)、β肌动蛋白(ACTB)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、烯醇化酶1α(ENO1)、细胞溶质热休克蛋白90α(HSP90AA1)、CD9、CD81、酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白、zeta多肽(YWHAZ)、肌肉丙酮酸激酶(PKM2),作为优选,本发明所述试剂中,抗体靶向CD63、CD81或CD9。
其中,CD63是外泌体的检测标志物,利用靶向CD63的抗体和适配体能够实现对外泌体良好的检测和识别,从而实现对外泌体的定性检测。配合标准曲线法或者其他方法,也可以实现对外泌体的良好定量检测。根据检测得到的外泌体含量,依据不同组织来源的外泌体浓度的不同(例如,癌细胞来源的外泌体浓度较正常细胞来源的高),可以实现对样本来源的判断。
为了区分不同来源或种类的外泌体,所述试剂中的抗体靶向CD63蛋白,而适配体靶向待测外泌体的特异性表达的标志物(例如,肿瘤细胞外泌体表面的特异性标志物蛋白)。从而实现对不同来源或种类外泌体的鉴别。
在一些实施例中,抗体靶向CD63蛋白,适配体也靶向CD63蛋白。
本发明中,所述磁珠也可以被其他微球载体替换,例如:可以为聚乙烯微球、乳胶微球、淀粉微球、明胶微球等。本发明中,所述抗体可以直接包被在磁珠上,也可以通过链霉亲和素-生物素连接在磁珠上,本发明对此不做限定。为了提高抗体利用率简化制备工艺,本发明通过链霉亲和素-生物素将抗体连接在磁珠上。
本发明中,所述适配体和所述G-padlock都为单链DNA。其中,G-padlock的5’端经磷酸化,能够与其3’端连接成环。适配体能够与G-padlock发生部分杂交,形成双链结构。
本发明中,所述适配体的核酸序列为:CACCCCACCTCGCTCCCGTGAC ACTAATGCTA(SEQID NO:1)。相对于其他适配体,其能够更好的识别外泌体,实现更良好的检测效果。
本发明中,所述适配体的末端修饰有荧光基团,所述荧光基团选自FITC、FAM、Cy3、Cy5、BODIPY、罗丹明、AFC、AMC、Rox、Sulforhodamine 101、5-TAMRA、EDANS Texas Red、5-Tamra、5-lodoacetamido fluorescein中任一种。一些实施例中,所述适配体的3’端修饰FAM。
本发明中,所述含有G4和适配体互补序列的(G-padlock)根据CD63适配体序列(SEQ ID NO:1)和G4序列设计,其包括片段1、An、片段2、Am、片段3;其中n和m的数量独立的选自8~12中任意整数,作为优选,n和m为10。
片段1的长度为10~25bp,优选为15bp;片段3与CD63适配体的5’端反向互补。
片段2的长度为15~20bp,其中含有重复的串联的C,一些实施例中,该片段为CCCAACCCGCCCTACCC。
片段3的长度为10~20bp,优选为15bp。片段3与CD63适配体的3’端反向互补。
一些具体实施例中,所述含有G4互补序列的G-padlock具有如SEQ IDNO:2所示的核酸序列,且其5’端磷酸化。
本发明所述的试剂中,所述紫外显色液中Hemin的浓度为100~500nM,TMB的浓度为0.5~5mM
本发明实施例中,所述紫外显色试剂包括:300nM Hemin、2.5mM TMB、1M H2O2和缓冲液,所述缓冲液为HEPES缓冲液、柠檬酸-磷酸缓冲液和PBS缓冲液;
一些具体实施例中,所述HEPES缓冲液中包括:25mM HEPES,20mM Kcl,200mMNacl,0.05%w/v Triton,1%v/v DMSO;所述PBS缓冲液为10mM PBS(pH 7.4)缓冲液、所述柠檬酸-磷酸缓冲液包括:0.1M柠檬酸、0.2M Na2HPO4和20mM KCl。更具体的,HEPES缓冲液、柠檬酸-磷酸缓冲液和PBS缓冲液的体积比为68:130:2。
一些实施例中,所述显色反应液中具有卟啉结构的小分子化合物的浓度为0.05~1μM,其缓冲液为TE缓冲液,pH值为5.0。
一些实施例中,所述荧光显色液为含有1~10μM NMM的TE缓冲液。
一些具体实施例中,所述荧光显色液为含有7μM NMM的TE缓冲液。
一些实施例中,所述检测试剂还包括滚环扩增反应的缓冲液、BSA、dNTPs和phi29DNA聚合酶。
进一步的,本发明还提供了外泌体的检测方法,其包括以如前所述的检测试剂进行检测。
具体的,所述方法包括:
将样品与包被抗体的磁珠混合、孵育,
所述适配体与G-Padlock互补、成环后,进行RCA反应;
所述RCA反应的产物、所述孵育的产物与显色试剂混合,检测信号。
所述孵育的产物为孵育后经过磁吸分离的磁珠,在对含有外泌体的样品进行检测的过程中,其为磁珠-抗体-外泌体的复合物。
更具体的,本发明所述的外泌体检测方法:首先,将生物素修饰的CD63抗体与修饰了链霉亲和素的磁珠结合,以利用CD63抗体的特异性捕获外泌体。然后,将含有G4互补序列的锁式探针与CD63适配体引物退火结合,通过特定聚合酶催化发生RCA反应,产生含有G4重复序列和CD63核酸适配体的RCA产物。RCA产物中的CD63适配体可识别外泌体,利于与磁珠和外泌体形成三明治的结构。最后,在磁珠-外泌体-RCA体系中加入显色反应液或荧光反应液,形成G4-Hemin结构催化TMB氧化显色或形成G4-NMM结构产生荧光信号,从而完成对外泌体浓度的比色和荧光双信号输出的灵敏检测。
一些实施例中,
所述孵育的条件包括37℃,1小时;
所述互补、成环的反应条件包括95℃加热10分钟后,以0.1℃/s的速率降温至室温,然后在含有T4 DNA连接酶的体系中,25℃孵育3小时,再60℃加热10分钟;
所述RCA反应的条件包括:37℃反应1.5小时;
所述加入显色试剂后,37℃反应15分钟;
所述检测信号包括检测荧光发射光谱或紫外可见吸收光谱。
更具体的,
适配体与G-Padlock互补、成环的具体过程包括:
将G-Padlock与适配体加入至T4 DNA连接缓冲液中,DEPC水定容。在95℃加热10分钟,然后以0.1℃/s的速率降温至室温,完成退火。在这个过程中,G-Padlock与适配体反向互补的部分,形成双链结构。
接下来,在上述退火产物中加入T4 DNA连接酶,25℃孵育3小时后,65℃加热10分钟灭活连接酶,得到环状模板。在这个过程中,G-Padlock的3’端和5’端发生连接,形成环状结构。
RCA反应的具体过程包括:
将环状模板、dNTPs、phi29 DNA聚合酶反应缓冲液、phi29 DNA聚合酶和BSA混合,以DEPC水定容。37℃反应1.5小时,然后65℃加热15分钟灭酶,经纯化后获得RCA反应产物。
本发明所述的方法可用于临床样本分析,以区分健康人和癌症患者的血清。此外,本发明所述方法也可以用于非人体或动物体来源的样品进行的检测,例如植物外泌体、微生物的外泌体等的检测。其采用多种信号输出的检测策略可提高外泌体传感器的准确性,并满足两种仪器检测的需求。因此,该策略有望应用于癌症早期诊断。
本发明提供了外泌体检测的试剂和方法,利用靶向外泌体的抗体捕获外泌体,再利用靶向外泌体的适配体识别外泌体,通过RCA反应放大外泌体浓度信息。最后,通过G4-Hemin结构催化TMB氧化显色或形成G4-NMM结构产生荧光信号,从而完成对外泌体的检测。实验表明,比色法和荧光法对外泌体浓度的检测范围分别为4×103~4×108particles/mL和4×102~4×106particles/mL,检测限分别为7990particles/mL和33.18particles/mL。
附图说明
图1示外泌体以及磁珠捕获外泌体可行性的表征。(a)外泌体的TEM表征图,标尺:500nm;(b)外泌体的NTA表征;(c)Western Blot分析外泌体与PANC-1细胞裂解液中几种标志蛋白的表达情况;(d)磁珠、磁珠-CD63抗体和磁珠-CD63抗体-外泌体的水合粒径分析;(e)磁珠、磁珠-CD63抗体和磁珠-CD63抗体-外泌体的Zeta电位分析;
图2示RCA产物的表征。(a)RCA反应过程示意图(T4 Ligase:T4连接酶);(b)RCA产物的TEM表征,标尺:2μm;(c)琼脂糖凝胶(0.8%)电泳图验证RCA产物的生成;其中泳道M代表DNA Marker;泳道1:CD63-Primer;泳道2:G4序列的锁式探针(G-Padlock);泳道3:primer和G-padlock配对产物;泳道4:RCA产物;
图3示磁珠捕获外泌体可行性验证。(a)磁珠通过CD63抗体捕获外泌体并经由Dio染料标记过程示意图;(b)不存在与存在外泌体情况下经由Dio染料标记的磁珠-外泌体复合体的共聚焦荧光图像;标尺:5μm;
图4示磁珠捕获外泌体进而结合CD63 aptamer-FAM的表征。(a)磁珠通过CD63抗体捕获外泌体后结合CD63 aptamer-FAM过程示意图;(b)不存在与存在外泌体情况下,磁珠-外泌体-CD63 aptamer-FAM复合体的共聚焦荧光图像,标尺:5μm;
图5示双信号输出的可行性验证。(a)不同条件下反应后溶液的紫外-可见吸收光谱:(1)TMB,(2)H2O2,(3)TMB+H2O2,(4)TMB+H2O2+G4-Hemin,(5)TMB+H2O2+Hemin,(插图:反应后溶液颜色的变化);(b)磁珠与外泌体结合前后的紫外吸收峰的变化,(插图:加入外泌体前后溶液颜色的变化);(c)NMM与RCA产物结合前后的荧光发射光谱;(d)结合NMM前后溶液荧光强度的变化;
图6示反应条件的优化实验。(a)pH的优化;(b)反应时间的优化;(c)Hemin浓度的优化;(d)反应缓冲液和温度的优化;(e)NMM浓度的优化;(f)加入RCA产物体积的优化;
图7示G4-Hemim过氧化物酶活性的稳态动力学分析和双倒数图。(a)1M H2O2与不同浓度的TMB和(b)1mM TMB与不同浓度的H2O2的Michaelis-Menten曲线;Michaelis-Menten曲线相应的TMB(c)和H2O2(d)对催化反应速度(v)的双倒数图;
图8示G4-Hemin检测外泌体浓度的紫外吸收信号结果。(a)紫外吸收信号随不同浓度外泌体(4×103、4×104、4×105、4×106和4×108particles/mL)变化(ΔA)的柱状图;(b)在652nm处紫外吸光度随外泌体浓度的变化(ΔA):ΔA与不同外泌体浓度对数(lgC)形成的标准曲线(插图);
图9示G4-NMM检测外泌体浓度的结果。(a)在外泌体浓度为4×102、4×103、4×104、4×105和4×106particles/mL时的荧光变化值的柱状图(ΔF=F-F0,F和F0分别为外泌体存在或不存在时用流式细胞仪检测的溶液荧光值);(b)ΔF与不同外泌体浓度对数(lgC)的变化以及标准曲线(插图);
图10示不同浓度外泌体(1:4×104,2:4×106particles/mL)在PBS和10%FBS细胞培养液中外泌体浓度的检测结果;(a)紫外吸收检测结果对比;(b)荧光检测结果对比(ns:无显著性差异);
图11示实际血清样本检测的结果,(a)癌症患者(Cancer patients)与健康个体(Healthy subjects)的紫外吸收检测结果对比图;(b)癌症患者与健康个体荧光检测结果对比图(*P<0.05,***P<0.001)。
具体实施方式
本发明提供了外泌体检测试剂及检测方法,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
本发明涉及术语:
G-四链体:G-四链体(G-quadruplex,G4)是由富含串联重复鸟嘌呤(G)的DNA或RNA折叠形成的高级结构。
外泌体:是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡(30-150nm),其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体,经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。1983年,人类首次在绵羊网织红细胞中发现了外泌体。1987年,Johnstone将外泌体命名为“exosome”。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。
滚环扩增(RCA):RCA是一种恒温核酸扩增方法,它以环状DNA为模板,通过一个与部分环状模板互补的短DNA引物,在特定聚合酶(Phi29 DNA Polymerase)催化下将dNTPs转变成单链DNA,此单链DNA包含成百上千个重复的与模板序列互补的DNA片段。
本发明采用的试材皆为普通市售品,皆可于市场购得。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1
本实施例中涉及的原料包括:
链霉亲和素修饰的磁珠粒径约1.0~1.2微米。
CD63抗体来自于上海艾美特生物科技有限公司。
外泌体来源于PANC-1胰腺癌细胞。
涉及的引物或适配体序列如表1:
表1实验中使用的DNA序列:
1磁珠分离外泌体的验证
(1)磁珠与CD63抗体的连接:取4μL 10mg/mL链霉亲和素修饰的磁珠,用PBST缓冲液洗涤2~3次,重悬于PBS缓冲液中,然后在溶液中加入1mg/mL生物素修饰的CD63抗体0.5μL,放入混匀仪中,25℃反应1小时,即完成磁珠与CD63抗体的连接。
(2)CD63抗体与外泌体的识别:磁珠与CD63抗体连接后,反应溶液用PBS洗涤2~3次,加入100μL4×108particles/mL外泌体,放入混匀仪中,37℃反应1小时,即完成CD63抗体与外泌体的识别。
(3)外泌体染色:上述溶液中加入Dio染料200μL,用PBST缓冲液洗涤4~5次,以去除残留的染料,然后重悬于PBS缓冲液中。
(4)共聚焦成像:分别制备有外泌体与无外泌体存在的磁珠样品。将制备好的样品滴在载玻片上,并将盖玻片放置其上,放入共聚焦成像系统进行拍照。
(5)流式细胞仪检测:将制备好的样品置于流式细胞仪,每个样品收集30000个磁珠,设置激发光波长为488nm,进行荧光信号的检测。
2外泌体与CD63适配体结合的验证
(1)外泌体与适配体的连接:磁珠-CD63抗体与外泌体连接后,反应溶液用PBS缓冲液洗涤2~3次,加入FAM基团修饰的CD63适配体。
(2)共聚焦成像:分别制备有外泌体与无外泌体存在的磁珠样品。将制备好的样品滴在载玻片上,并将盖玻片放置其上,放入共聚焦成像系统进行拍照。
3双信号检测体系的可行性验证
3.1先进行RCA反应,然后以不同的体系验证信号
(1)制备环状模板:将1μM含有G4互补序列的锁式探针(G-Padlock)与1μM CD63适配体引物加入至10×T4 DNA连接缓冲液中,并充分混匀。然后,用DEPC水将体积补至20μL。将混合溶液放入PCR仪中,在95℃加热10分钟,然后以0.1℃/s的速率降温至室温,完成退火。接下来,在上述退火产物中加入0.5μLT4 DNA连接酶,并在25℃孵育3小时。之后,将混合物加热至65℃并保持10分钟,以使T4 DNA连接酶失活。最终得到环状模板。
(2)RCA反应过程:取一定量的环状模板(终浓度:1μM),dNTPs(终浓度:1mM),10×phi29 DNA聚合酶反应缓冲液2μL,0.5μL phi29DNA聚合酶以及2μL浓度为2mg/mL的BSA,并将溶液的总体积用DEPC水补足至20μL。将混合物放入PCR仪中,在37℃条件下保持1.5小时。随后将反应体系加热至65℃并保持15分钟,以使phi29 DNA聚合酶失活。完成反应后,将所得的RCA产物进行离心处理,使用13,000rpm的速度离心并清洗6次。最后,将纯化的产物溶解于20μL DEPC水中,可以直接使用或保存在-20℃以备下次使用。
3.2信号验证
(1)G4-Hemin复合物模拟酶催化活性的测定:取150nM cDNA(RCA产物的模拟DNA)、300nM Hemin(终浓度,用HEPES缓冲液稀释)、2μL10×PBS缓冲液,加入到显色工作液中,该显色工作液由130μL C-P缓冲液(包含0.1M柠檬酸、0.2M Na2HPO4和20mM KCl,在其中含有2.5mM TMB和1M H2O2)组成,最终总体积为200μL。将混合物在37℃下孵育15分钟,然后分别测定TMB、H2O2、TMB+H2O2、TMB+H2O2+G4-Hemin以及TMB+H2O2+Hemin溶液的紫外可见吸收光谱。
(2)G4-NMM复合物的荧光测定:首先,将150nM cDNA、7μM NMM和73μLTE缓冲液混合,在最终体积为80μL的体系中。接下来,将混合物在37℃下孵育15分钟。最后,分别测定G4溶液、NMM溶液和G4-NMM复合物溶液的荧光发射光谱。
4优化实验条件
为提高传感平台的检测性能,对显色反应pH(2.6~7.0)、时间(5~55分钟)、Hemin的浓度(0.05~1μM)、缓冲条件(Tris或TE缓冲液)以及荧光反应中NMM浓度(0.2~10μM)、RCA体积(1~10μL)进行了一系列的优化。
5G4-Hemin的类过氧化物酶活性的稳态动力学分析
动力学分析采用如下体系:G4-Hemin(300nM Hemin、3μL RCA产物、2μL10×PBS)、2.5mM TMB与不同浓度的H2O2(0.2~3M)或固定浓度的H2O2(1M)与不同浓度的TMB(0.02~1.8mM),在pH为5.0的200μL柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中进行。在652nm处用紫外可见分光光度计对所有反应动力学进行监测。根据Michaelis-Menten方程计算动力学参数:v=Vmax[S]/(Km+[S]),其中v为反应速率;[S]为底物浓度;Vmax为最大反应速率,Km是米氏常数。计算催化常数(kcat):kcat=Vmax/[E]([E]为酶的浓度),以kcat/Km计算G4-Hemin模拟酶的催化效率,并与天然辣根过氧化物酶(HRP)的催化效率进行比较。
6外泌体浓度检测
将捕获的外泌体经过3次PBS缓冲液洗涤后,加入复合了Hemin或者NMM的RCA产物,并在37℃下孵育15分钟。随后,用PBS清洗3次,然后将磁珠/外泌体/G4-Hemin复合物置于含有2.5mM TMB和1M H2O2的C-P缓冲液中,在37℃下孵育15分钟,并通过测定反应体系的紫外可见吸收光谱来获得结果。对于磁珠/外泌体/G4-NMM复合物,使用TE缓冲液进行3次清洗,然后测量荧光发射光谱以获得结果。高通量测定外泌体浓度时,将上述检测体系分别放入酶标仪,测定不同浓度外泌体存在下反应体系在652nm的吸光值/615nm的荧光值。
7在实际样品中检测外泌体浓度
(1)对于复杂生物样品中特异性的评价:分别准备两组样品,第一组为外泌体加入含10%(v/v)FBS的细胞培养基;第二组为外泌体在PBS缓冲液中稀释样品,按照上述步骤分别对两组样品进行检测,包括将抗体包被的磁珠与样品接触,然后以适配体识别外泌体,形成磁珠-抗体-外泌体-适配体的复合物,然后以G-Padlock启动RCA反应,最后以紫外显色试剂和/或荧光显色液进行显色。
(2)使用该方法区分癌症患者与健康人:分别准备5组健康者与5组癌症患者的血浆以上述步骤操作(将不同浓度外泌体替换为血浆),进行比较。
8结果和分析
8.1外泌体表征和磁珠捕获外泌体验证
本发明基于RCA反应放大检测信号,采用G4-Hemin模拟酶催化TMB显色和G4-NMM荧光作用的设计策略,实现对外泌体浓度的检测。首先,我们制备RCA反应产物,通过将含CD63适配体序列的Primer与含G4互补序列的锁式探针(G-Padlock)结合,启动RCA过程。这将产生更多含G4重复序列的RCA产物,以便后续与Hemin或NMM结合。为构建一种高效的外泌体生物传感器检测体系,我们将链霉亲和素修饰的磁珠与生物素修饰的CD63抗体相结合。随后,加入不同浓度的外泌体,CD63抗体通过识别外泌体表面抗原作用,使得磁珠能够捕获外泌体。接着,使用CD63适配体识别并连接外泌体,加入Hemin催化TMB显色或加入NMM染料。测量外泌体浓度的紫外吸光度或荧光信号强度,二者呈正相关。
为研究外泌体的大小形态及相对纯度,我们使用超速离心法从胰腺癌细胞(PANC-1)上清液中分离出外泌体,通过透射电子显微镜(TEM)以及纳米颗粒跟踪技术(NTA)对外泌体的外貌形态、大小及浓度进行表征。外泌体形貌如图1中a所示,外泌体具有典型的双层膜结构;图1中b显示,外泌体的平均直径为113.7±40.8nm,其浓度约为8.15×108particles/mL。此外,我们用Western Blot对PANC-1细胞裂解液与外泌体的五种外泌体标记蛋白(Alix、Flotillin、CD63、CD9、Calnexin)进行半定量检测。图1中c显示,Alix与Flotillin蛋白在外泌体提取物中与细胞裂解液中均表达,证明外泌体来源于PANC-1细胞。经检测发现,CD63与CD9蛋白仅存在于外泌体提取物中,而Calnexin蛋白仅存在于细胞裂解液中,这表明我们提取的外泌体纯度高且不含细胞成分。因此,我们得出结论,我们收集的外泌体适合用于后续传感器的构建。
为了评估磁珠与外泌体的连接情况,我们采用了水和粒径(DLS)和Zeta电位相结合的方法进行综合判断。如图1中d所示,我们测量了磁珠的水合动力学尺寸,结果为1431±16nm。当磁珠与CD63抗体偶联后,其水合粒径增大至1856±12nm。进一步地,当CD63成功捕获外泌体时,其水合粒径增大至2065±45nm。在图1中e图,我们比较了磁珠、磁珠-CD63抗体和磁珠-CD63抗体-外泌体之间的Zeta电位,发现它们之间存在显著差异:链霉亲和素修饰的磁珠带有负电荷(-8.76±0.43mV),而CD63抗体在PBS缓冲液(pH=7.4)中呈现负电荷,所以,当抗体与磁珠结合后,电位下降至-11.17±0.32mV。外泌体本身也带有负电荷,所以,当外泌体与磁珠-CD63抗体结合后,电势进一步下降至-15.6±0.26mV。这些结果表明,磁珠能够通过与CD63抗体捕获外泌体,为后续实验提供了可行性。
8.2RCA产物的表征
本发明中,RCA产物是双信号传感器中关键的生物识别元件,因此在整个传感器系统中扮演着重要的角色。图2中a展示了RCA反应的过程:首先,将CD63-Primer与G-Padlock连接,然后在聚合酶的催化下进行扩增反应,最终生成含有许多G4和CD63核酸适配体重复序列的RCA产物。经TEM表征,图2中b显示RCA反应产物形态为类球形,其边缘呈现多层片状花朵结构,大小约为4μm。为了进一步验证RCA产物的生成,我们采用了琼脂糖凝胶(0.8%)电泳技术。该技术能够验证primer与G-padlock是否经由RCA扩增途径而生成大分子量的DNA产物。图2中c展示了验证结果。在泳道1和泳道2中分别放置了primer和G-Padlock,当二者发生连接后,产生的条带如泳道3所示。这些条带的迁移率低于泳道1和泳道2,这表明primer和G-Padlock之间通过碱基互补配对形成了双链结构。在此基础上,进一步进行RCA反应,此时,在泳道4中出现了一条超过10kb分子量的条带,这证明了大分子量RCA产物的产生。
为验证外泌体与CD63适配体的结合,我们合成了修饰有FAM荧光基团的CD63适配体(CD63 aptamer-FAM),连接过程如图4中a所示。首先,将链霉亲和素修饰的磁珠与亲和素修饰的CD63抗体结合,通过外加磁力吸附纯化磁珠以去除抗体。然后,加入制备好的外泌体,抗体进一步捕获外泌体,然后外加磁力吸附纯化磁珠去除未被捕获的外泌体。接下来,我们在37℃下孵育了含有CD63 aptamer-FAM的样品1小时,并使用共聚焦显微镜进行成像。我们分别制备了有外泌体和无外泌体存在的两组样品。结果显示,在无外泌体存在的情况下,CD63 aptamer-FAM无处吸附,因而纯化的磁珠表面没有可见的荧光信号。而在有外泌体存在的情况下,CD63 aptamer-FAM能够特异性地识别并结合到外泌体的CD63蛋白上。由于FAM荧光基团的存在,我们可以清晰地观察到磁珠表面发出的绿色荧光信号,表明外泌体与CD63aptamer-FAM成功结合。
(2)双信号输出的可行性验证:
图5中a为TMB溶液在不同反应条件下的紫外-可见吸收光谱。与G4-Hemin相比,对照组(只有单独Hemin存在而无G4序列)溶液在652nm紫外波长处吸收峰信号较低,说明单独的Hemin过氧化物酶活性较低,不能有效催化TMB的氧化;G4序列形成的特殊DNA结构能够为Hemin提供活性位点,而且也能够提供轴向配位作用和疏水环境。因此,在Hemin与G4序列结合后,过氧化物模拟酶的活性大大增强。我们进行了外泌体存在与不存在情况下,紫外检测信号的比较和分析。结果显示(图5中b),存在外泌体时,磁珠能够结合外泌体,并进一步结合含有G4序列的RCA产物,最终形成具有过氧化物酶活性的G4-Hemin。加入Hemin后,G4-Hemin催化TMB显色,导致吸收峰的升高。相反,如果不存在外泌体,磁珠无法结合G4-Hemin,导致无法有效催化TMB显色,吸收峰变低。这一结果说明我们成功建立了反应体系中紫外信号检测部分。
此外,我们利用荧光光谱分析来研究NMM与G4序列结合时的荧光活性变化。结果显示,当NMM单独存在于水溶液中时,其倾向于聚集成低荧光胶束,荧光强度很弱。但当NMM插入G4序列中,由于π-π堆叠作用的影响,溶液的疏水环境发生改变,导致在615nm波长处观察到明显的荧光信号增强。图5中c展示了相应的结果。随后,我们研究了存在外泌体和不存在外泌体情况下,体系中荧光检测信号的差异。结果显示(图5中d),加入外泌体后,荧光信号明显增强。这是因为大量含有G4重复序列的RCA产物通过CD63适配体连接到外泌体表面蛋白上,从而稳定地结合至磁珠表面。随后加入NMM染料,形成G4-NMM复合体,充分发挥其光学作用,从而增强磁珠周围荧光信号。相反,在无外泌体存在时,磁珠无法结合G4-NMM,因此无法获得增强的荧光信号。这些实验证明了我们的基于荧光信号输出的检测方法成功建立。
8.3优化实验条件
为了优化该方法以检测外泌体,我们对紫外信号检测的pH、时间、Hemin浓度、缓冲条件,以及荧光信号检测的NMM浓度和RCA体积进行了一系列实验,旨在确定最佳实验条件。我们记录了652nm处紫外吸收信号在不同实验条件下的变化,并使用G4-Hemin(DNAzyme)与Hemin溶液的652nm吸收的比值(即DNAzyme/Hemin)来评估实验条件对实验的影响。首先,我们选取了pH值为2.6、3.4、4.4、4.6、5.0、6.0和7.0进行试验。根据图6中a的结果,5.0是催化反应的最佳pH。为了优化实验条件,我们在时间范围为5~55分钟内,每隔5分钟对紫外吸收值进行检测。实验结果显示,显色反应呈现时间依赖性,且在30分钟时吸收值达到峰值,如图6中b所示。因此,我们将30分钟确定为最佳反应时间,并在后续的显色反应中应用。经过考察,我们确定了Hemin的最佳使用浓度。从图6中c可以看出,在0.05~1μM的浓度范围内,当Hemin浓度为0.3μM时,G4-Hemin的过氧化物模拟酶活性最强。因此,我们选择0.3μM的Hemin作为后续研究的使用浓度。为了提高RCA与Hemin的结合效率,我们研究了缓冲条件(Tris和TE缓冲溶液)和反应温度(25℃和37℃)对体系的影响。结果显示,在TE缓冲溶液中且在37℃条件下孵育,G4-Hemin酶活性更强。因此,我们选择了TE缓冲溶液和37℃作为最佳的缓冲和温度条件。最后,我们优化了NMM浓度和加入RCA产物的体积。荧光强度在NMM浓度为7μM(图6中e)和RCA产物体积为3μL(图6中f)时最高,因此,我们确定这两个条件为最佳的检测条件。
8.4G4-Hemin模拟酶的稳态动力学分析
为了进一步评估G4-Hemin模拟过氧化物酶的性能,我们通过改变TMB和H2O2的浓度,测试了G4-Hemin模拟酶催化的反应动力学。由图7a和7b可知,随着TMB和H2O2浓度的升高,对应G4-Hemin的催化速率不断升高,最终趋于水平。因此,G4-Hemin模拟酶对应底物的动力学曲线符合典型的Michaelis-Menten模型。已知Michaelis-Menten的等式为ν=Vmax·[S]/(Km+[S]),应用Michaelis-Menten模型,对反应速率和底物浓度分别取倒数后,进行线性拟合,形成了各自的双倒数(Lineweaver-Burk)图(图7中c和d),可以计算得到对TMB和H2O2的最大反应速度(Vmax)为0.55×10-8M s-1和0.60×10-8M s-1,对应的米氏常数(Km)分别为0.293mM和446.8mM(表2)。以H2O2为底物的G4-Hemin的Km值显著高于辣根过氧化物酶(HRP)的Km值(3.70mM,Nature Nanotechnology,2007,2,577-583)。这一结果表明,本体系需要较高的H2O2浓度才能获得G4-Hemin模拟酶的最大反应速率。而以TMB为底物的G4-Hemin的Km值低于HRP的Km值(0.434mM,Nature Nanotechnology,2007,2,577-583),说明G4-Hemin对TMB的亲和力高于HRP。
表2G4-Hemin与HRP的动力学参数比较:
注:Catalyst为催化剂,Substrate为反应底物,Km为米氏常数,Vmax为最大反应速度。
8.5外泌体浓度检测
在优化实验条件下,我们使用G4-Hemin和G4-NMM作为外泌体双输出信号检测分析的探针。结果显示,在外泌体浓度逐渐增加的情况下,溶液的紫外吸光度逐渐上升(见图8中a)。在图8中b中,我们发现外泌体浓度在4×103~4×108particles/mL范围内时,吸光度变化与外泌体浓度呈线性相关。回归方程为ΔA=0.0086*lgC-0.011(ΔA=A-A0,A、A0分别为外泌体存在或不存在时在652nm处的紫外吸光度值;lgC表示外泌体浓度的对数),相应的检测限为7.99×103particles/mL(空白+3SD,SD:标准差,R2=0.997)。
图9展示了使用G4-NMM检测外泌体的荧光信号分析结果。从图9a中可以看出,随着外泌体浓度的增加,荧光值逐渐增加。在图9b中,浓度范围在4×102~4×106particles/mL荧光值与外泌体浓度呈线性相关,其回归方程为ΔF=17.307*lgC–17.489(ΔF=F-F0,F和F0分别为外泌体存在或不存在时在流式细胞仪检测得到的平均荧光值;lgC表示外泌体浓度的对数,R2=0.965),检测限为33.18particles/mL。上述实验结果说明我们的方法对外泌体浓度的检测具有高灵敏度。
8.6在血清样品中检测外泌体浓度
为评估该实验方法的实用性,我们将外泌体加入含有10%(v/v)胎牛血清(FBS)的细胞培养基中检测外泌体浓度,并与在PBS缓冲液中检测的结果进行对比。我们分别测定了不同浓度外泌体对应的紫外吸光度和荧光强度的变化。根据图10的实验结果显示,比色分析法(图10a)和荧光法(图10b)在PBS缓冲液和10% FBS细胞培养基中测得的外泌体浓度与标准NTA法测得的外泌体浓度值之间没有显著差异(P>0.05,no significance,ns),这表明该检测方法在复杂的生物样品中能够得到可靠的检测结果。接下来,我们将本发明的双信号检测系统用于临床实际生物样本中外泌体浓度的测定。我们对五名健康个体和五名胰腺癌患者的血清样本进行了外泌体的直接检测。结果显示,癌症患者的血浆中外泌体的紫外吸收信号强度和荧光强度均高于健康组(图11中a和b),与已发表的研究结果一致(FutureOncology 2021,17,907-919)。这表明癌细胞在癌症发展和转移过程中外泌体分泌率较高。经过分析,我们的双信号检测传感器在实际血清样本中成功区分了癌症患者和健康个体,表现出良好的稳定性能。因此,未来在临床检测方面,该传感器有着广阔的应用前景。
以上仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.外泌体的检测试剂,其包括:包被抗体的磁珠、适配体、G-Padlock,和显色试剂;
所述包被抗体的磁珠中,抗体为靶向外泌体的抗体;
所述适配体靶向外泌体表面蛋白质,且修饰有荧光基团;
所述G-Padlock能够与所述适配体发生滚环扩增反应;
所述显色试剂包括紫外显色试剂和/或荧光显色液;
所述紫外显色液中包括Hemin和TMB,
所述荧光显色液中包括NMM。
2.根据权利要求1所述的检测试剂,其特征在于,所述包被抗体的磁珠中,所述抗体为CD63抗体,所述抗体与磁珠通过链霉亲和素-生物素连接。
3.根据权利要求1所述的检测试剂,其特征在于,所述适配体为靶向CD63的适配体,其核酸序列如SEQ ID NO:1所示;所述荧光基团为FAM。
4.根据权利要求1或3所述的检测试剂,其特征在于,所述G-padlock具有如SEQ ID NO:2所示的核酸序列。
5.根据权利要求1所述的检测试剂,其特征在于,
所述紫外显色液中Hemin的浓度为100~500nM,TMB的浓度为0.5~5mM;
所述荧光显色液中,NMM的浓度为1~10μM。
6.根据权利要求5所述的检测试剂,其特征在于,
所述紫外显色试剂包括:300nM Hemin、2.5mM TMB、1M H2O2和缓冲液,所述缓冲液为HEPES缓冲液、柠檬酸-磷酸缓冲液和PBS缓冲液;
所述荧光显色液为含有7μM NMM的TE缓冲液。
7.根据权利要求1~6任一项所述的检测试剂,还包括滚环扩增反应的缓冲液、BSA、dNTPs和phi29 DNA聚合酶。
8.外泌体的检测方法,其特征在于,包括以权利要求1~7任一项所述的检测试剂进行检测。
9.根据权利要求8所述的检测方法,其特征在于,
将样品与包被抗体的磁珠混合、孵育,
所述适配体与G-Padlock互补、成环后,进行RCA反应;
所述RCA反应的产物、所述孵育的产物与显色试剂混合,检测信号。
10.根据权利要求9所述的检测方法,其特征在于,
所述孵育的条件包括37℃,1小时;
所述互补、成环的反应条件包括95℃加热10分钟后,以0.1℃/s的速率降温至室温,然后在含有T4 DNA连接酶的体系中,25℃孵育3小时,再60℃加热10min;
所述RCA反应的条件包括:37℃反应1.5小时;
所述加入显色试剂后,37℃反应15分钟;
所述检测信号包括检测荧光发射光谱或紫外可见吸收光谱。
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