CN111426834B - 基于双适配体检测外泌体的生物传感器及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于核酸适配体检测外泌体的生物传感器，包括适配体PTK‑7 Apt、CD63 Apt、connector、发夹探针H1、发夹探针H2、CCRF‑CEM。还涉及其制备方法与应用，基于核酸适配体与目标物的特异性识别，通过connector的连接，使得PTK‑7 Apt、CD63 Apt两条链相互邻近，从而形成trigger，而trigger进一步打开H1，H1继而打开H2，触发HCR反应，实现化学发光强度信号的放大，从而构建了适配体生物传感器。该传感器具有检测速度快、操作简单、价格低廉、检测限低、特异性高等优点。

Description

基于双适配体检测外泌体的生物传感器及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于核酸适配体检测外泌体的生物传感器，还涉及其制备方法。
背景技术
外泌体是一种由细胞分泌的膜性囊泡小体，直径通常为30~100 nm，密度为1.10~1.18 Kg/L。外泌体广泛存在于各种体液中，可携带脂类、蛋白质、信使RNAs、非编码RNAs等多种重要的生物功能分子，能够参与细胞间物质交换和信息交流。外泌体中所含有的与肿瘤相关的蛋白，核酸，小分子等，都有潜力成为潜在的生物标志物。肿瘤细胞分泌的外泌体的含量在血液中的含量很高，每毫升血液中含有超过109个外泌体，以利用外泌体作为生物标志物进行检测会有更高的灵敏度，有助于癌症的早期检测。
外泌体在作为生物标志物在癌症早期诊断方面具有广阔的应用前景，目前报道的检测外泌体的方法包括质谱和免疫分析，包括western blot和酶联免疫试验（ELISA）,都可以鉴定大量的外泌体蛋白，但是这些方法需要繁琐的样品前处理，因此限制了它们快速筛选外泌体的应用。因此急需一种快速、准确、简便、微量的分析方法，以对外泌体进行检测。近几年，DNA生物传感检测技术凭借其高灵敏性和特异性得到广泛的关注。其中，化学发光技术的基础理论研究日益成熟，它在生物学、医学等领域所扮演的角色越来越重要。相对于其他检测手段，化学发光技术具有显著的优势，灵敏度高、特异性强、价格低廉。
发明内容
为了解决以上现有技术检测外泌体的繁琐的样品前处理过程的问题，本发明提供了一种特异性和灵敏度高、成本低、检测速度快的基于化学发光检测外泌体的生物传感器。
本发明的另一目的是提供一种上述生物传感器在检测外泌体中的应用与方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案.
基于双适配体检测外泌体的生物传感器，包括适配体PTK-7 Apt、CD63 Apt、connector、发夹探针H1、发夹探针H2、CCRF-CEM、血红素、鲁米诺、H2O2；
PTK-7Apt碱基序列如SEQ No.1所示；具体为:ATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAA AATACTGTACGGTTAGATTTTTTTTTTTTTTTCATCATCTTACGTGGGGTCTTGCAGTA；
CD63Apt碱基序列如SEQ No.2所示；具体为:CGGAGAAGAAGCAGACTGACA CTAGGTTTTTTTTTTTTTTTCACCCCACCTCGCTCCCGTGACACTAATGCTA；
Connector碱基序列如SEQ No.3所示；具体为:CCTAGTGTCAGTCTGCCCACGTAAGATGATG；
H1碱基序列如SEQ No.4所示；具体为:AGGGCGGGTGGGTCTTGCAGTTGGAG AATTGTACTGCAAGACCTTCTTCTCCGTGGGT；
H2碱基序列如SEQ No.5所示；具体为:TGGGTCAATTCTCCAACTGCAA GTCGGAGAAGAAGGTCTTGCAGTTGGGTAGGGCGGG。
上生物传感器检测外泌体的方法，包括以下步骤：
（1）外泌体提取；
（2）均相反应：将外泌体与PTK-7 Apt、CD63 Apt 加入到5×PBS buffer中，同时加入Connector、H1、H2，混合均匀后孵育；
（3）加入血红素、鲁米诺、H2O2，荧光检测。
所述的步骤（1）外泌体提取的步骤如下：
CCRF-CEM细胞培养在37 °C包含5 % CO2 潮湿空气中，每四天传代一次，培养基为RPMI-1640 4.5g/L、10%特级胎牛血清FBS、1%抗生素，将细胞碎片以2000×g离心20 min，将细胞碎片从培养基中移除，在10000×g离心45 min，0.20 μm注射器过滤器过滤，10000×g（40000 rpm）离心150 min获取外泌体，然后将外泌体加入PBS，-80 °C储存待用。
所述的抗生素为100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素。
所述的步骤（2）均相反应操作步骤如下：
S1 将外泌体与PTK-7 Apt、CD63 Apt、5×PBS buffer混合，反应30 min；
S2加入Connector、H1、H2，反应90 min。
所述步骤（3）的过程为：加入血红素，鲁米诺37 °C反应30 min；之后加入H2O2，立即用于化学发光信号的检测，化学发光信号采集时间间隔是1.5 s，化学发光光谱测量范围是350 nm到550 nm。
上述的生物传感器用于检测非疾病诊断上的肿瘤外泌体的应用。
本发明所用的碱基序列为：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
其中PTK-7 Apt单下划线部分是PTK-7的aptamer，CD63 Apt单下划线部分是CD63的aptamer。PTK-7 Apt斜体部分、CD63 Apt斜体部分分别是connector斜体部分和单下划线部分的互补序列。当目标物存在时，目标物与PTK-7 Apt和CD63 Apt特异性结合，connector与PTK-7 Apt和CD63 Apt互补配对，将两条链拉近，PTK-7 Apt和CD63 Apt双下划线部分作为trigger去触发HCR反应。H1和H2单下划线部分是劈开的G四联体序列。PTK-7 Apt和CD63Apt双下划线部分是H1斜体部分的互补序列，将H1打开，H1双下划线与H2的双下划线部分互补，将H2打开，H2的斜体部分与H1的斜体部分互补，又将H1打开，进而触发HCR。通过上述无限次循环实现指数放大，产生大量的G四联体从而实现信号放大。从而通过测量化学发光强度来定量检测外泌体。
本发明中外泌体的检测是在均相溶液中实现的，通过HCR等温放大方式来实现信号的放大，从而实现外泌体的高灵敏检测，并获得较低的检测下限。该发明的检测方式是化学发光检测，在trigger的作用下利用碱基互补配对将H1打开，H1又会将H2打开，从而触发HCR反应，暴露出G四联体，加入血红素，相当于类过氧化物酶，在H2O2存在时，进行氧化还原反应，催化鲁米诺发光。
本发明基于核酸适配体与目标物的特异性识别，通过connector的连接，使得PTK-7 Apt、CD63 Apt两条链相互邻近，从而形成trigger，而trigger进一步打开H1，H1继而打开H2，触发HCR反应，实现化学发光强度信号的放大，从而构建了适配体生物传感器。该传感器具有检测速度快、操作简单、价格低廉、检测限低、特异性高等优点，可以弥补外泌体现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速、准确的定量检测。
本发明的有益效果：
1、检测限低
利用核酸适配体的特异性识别，利用适配体与外泌体的结合实现了对目标物的高特异性检测；利用connector的连接，使得PTK-7 Apt、CD63 Apt两条链相互邻近，从而形成trigger，而trigger进一步打开H1，H1继而打开H2，触发HCR反应，实现了指数放大，放大检测信号，提高了检测的灵敏度，实现对目标物外泌体的超灵敏检测；检测限可达到1 ug/mL。
2、方法简单，性能稳定
该传感器的构建简单，有效避免了多步加入样品可能带来的污染、繁琐的样品前处理过程，具有操作简单、反应速度快等优势；检测原理的主要过程均是在均相中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测；
3、检测肿瘤外泌体
制作该生物传感器的工艺成本低，适用于产业化中低廉的要求。适用于肿瘤外泌体的检测和生物传感器产业化的实际应用。
附图说明
图1为该实验的原理图；
图2为实施例1 H1浓度优化检测结果图；
图3为实施例2 H2浓度优化检测结果图；
图4为实施例3 H2O2浓度优化检测结果图；
图5为实施例4反应时间优化检测结果图；
图6为实施例5外泌体浓度检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1
所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
外泌体提取的操作步骤如下：
CCRF-CEM细胞培养在37 °C包含5 % CO2 潮湿空气中。每四天传代一次。RPMI-16404.5g/L、特级胎牛血清（FBS）、1%抗生素（100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素）、被用来培养细胞。为了产生外泌体，细胞被培养在条件培养基（10% FBS和1%抗生素）三天，用不同的超速离心法分离。为了分离外泌体，首先将细胞碎片以2000×g离心20 min，将细胞碎片从培养基中移除。在10000×g离心45 min，细胞囊泡被分离。包含上清液的外泌体用0.20-μm注射器过滤器过滤。最后，外泌体通过10000×g（40000 rpm）离心150 min获取。这个外泌体被重新分布在PBS中，使用之前储存在-80 °C。
均相溶液中反应过程的主要步骤如下：
a、将4 μL外泌体与PTK-7 Apt (1 μL ,5 μM)、CD63 Apt (1 μL, 5 μM)、5×PBSbuffer混合，反应30 min。Connector ( 2.5μL ,2.5 μM) 、H1(终浓度分别为0.4 μM ,0.6μM , 0.8 μM ,1 μM ,1.2 μM ,1.4 μM ) 、H2(1 μL ,1 μM)加入，反应90 min。反应完成，加入血红素（1.1μL ,1 μM），鲁米诺（1μL,1mM）37 °C反应30 min。之后加入H2O2（10 mM），立即用于化学发光信号的检测。化学发光信号采集时间间隔是1.5 s，化学发光光谱测量范围是350 nm到550 nm。
b、荧光仪在420 nm处检测化学发光峰值强度。荧光仪化学发光光谱测量范围是350 nm到550 nm，读取化学发光信号变化，检测目标物。
上述过程中用到的溶液的制备方法：
1、超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将超纯水分别放置在锥形瓶中，然后用锡箔纸进行封口。在高压灭菌锅中在121 °C的温度下灭菌20 min。
结果见图2，从图中可以看出，检测到的化学发光强度峰值随着H1的浓度增大而增大，当浓度超过1.0 μM后，化学发光强度趋于稳定。所以H1的最佳浓度为1.0 μM。
实施例2
所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
外泌体提取的操作步骤如下：
CCRF-CEM细胞培养在37 °C包含5 % CO2 潮湿空气中。每四天传代一次。RPMI-16404.5g/L、特级胎牛血清（FBS）、1%抗生素（100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素）、被用来培养细胞。为了产生外泌体，细胞被培养在条件培养基（10% FBS和1%抗生素）三天，用不同的超速离心法分离。为了分离外泌体，首先将细胞碎片以2000×g离心20 min，将细胞碎片从培养基中移除。在10000×g离心45 min，细胞囊泡被分离。包含上清液的外泌体用0.20-μm注射器过滤器过滤。最后，外泌体通过10000×g（40000 rpm）离心150 min获取。这个外泌体被重新分布在PBS中，使用之前储存在-80 °C。
均相溶液中反应过程的主要步骤如下：
a、将4 μL外泌体与PTK-7 Apt (1 μL ,5 μM)、CD63 Apt (1 μL, 5 μM)、5×PBSbuffer混合，反应30 min。Connector ( 2.5μL ,2.5 μM) 、H1(1 μL ,1 μM) 、H2(终浓度分别为0.4 μM ,0.6 μM , 0.8 μM ,1 μM ,1.2 μM ,1.4 μM)加入，反应90 min。反应完成，加入血红素（1.1μL ,1 μM），鲁米诺（1μL,1mM）37 °C反应30 min。之后加入H2O2（10 mM），立即用于化学发光信号的检测。化学发光信号采集时间间隔是1.5 s，化学发光光谱测量范围是350 nm到550 nm。
b、荧光仪在420 nm处检测化学发光峰值强度。荧光仪化学发光光谱测量范围是350 nm到550 nm，读取化学发光信号变化，检测目标物。
上述过程中用到的溶液的制备方法：
2、超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将超纯水分别放置在锥形瓶中，然后用锡箔纸进行封口。在高压灭菌锅中在121 °C的温度下灭菌20 min。
结果见3，从图中可以看出，检测到的化学发光强度峰值随着H2的浓度增大而增大，当浓度超过1.0 μM后，化学发光强度趋于稳定。所以H2的最佳浓度为1.0 μM。
实施例3
所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
外泌体提取的操作步骤如下：
CCRF-CEM细胞培养在37 °C包含5 % CO2 潮湿空气中。每四天传代一次。RPMI-16404.5g/L、特级胎牛血清（FBS）、1%抗生素（100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素）、被用来培养细胞。为了产生外泌体，细胞被培养在条件培养基（10% FBS和1%抗生素）三天，用不同的超速离心法分离。为了分离外泌体，首先将细胞碎片以2000×g离心20 min，将细胞碎片从培养基中移除。在10000×g离心45 min，细胞囊泡被分离。包含上清液的外泌体用0.20-μm注射器过滤器过滤。最后，外泌体通过10000×g（40000 rpm）离心150 min获取。这个外泌体被重新分布在PBS中，使用之前储存在-80 °C。
均相溶液中反应过程的主要步骤如下：
a、将4 μL外泌体与PTK-7 Apt (1 μL ,5 μM)、CD63 Apt (1 μL, 5 μM)、5×PBSbuffer混合，反应30 min。Connector ( 2.5μL ,2.5 μM) 、H1(1 μL ,1 μM ) 、H2(1 μL ,1μM)加入，反应90 min。反应完成，加入血红素（1.1μL ,1 μM），鲁米诺（1μL,1mM）37 °C反应30 min。之后加入H2O2（7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11mM, 12 mM），立即用于化学发光信号的检测。化学发光信号采集时间间隔是1.5 s，化学发光光谱测量范围是350 nm到550 nm。
b、荧光仪在420 nm处检测化学发光峰值强度。荧光仪化学发光光谱测量范围是350 nm到550 nm，读取化学发光信号变化，检测目标物。
上述过程中用到的溶液的制备方法：
3、超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将超纯水分别放置在锥形瓶中，然后用锡箔纸进行封口。在高压灭菌锅中在121 °C的温度下灭菌20 min。结果见图4，从图中可以看出，检测到的化学发光强度峰值随着H2O2的浓度增大而增大，当浓度超过后，化学发光强度趋于稳定。所以H2O2的最佳浓度为10 mM。
实施例4
所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
外泌体提取的操作步骤如下：
CCRF-CEM细胞培养在37 °C包含5 % CO2 潮湿空气中。每四天传代一次。RPMI-16404.5g/L、特级胎牛血清（FBS）、1%抗生素（100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素）、被用来培养细胞。为了产生外泌体，细胞被培养在条件培养基（10% FBS和1%抗生素）三天，用不同的超速离心法分离。为了分离外泌体，首先将细胞碎片以2000×g离心20 min，将细胞碎片从培养基中移除。在10000×g离心45 min，细胞囊泡被分离。包含上清液的外泌体用0.20-μm注射器过滤器过滤。最后，外泌体通过10000×g（40000 rpm）离心150 min获取。这个外泌体被重新分布在PBS中，使用之前储存在-80 °C。
均相溶液中反应过程的主要步骤如下：
a、将4 μL外泌体与PTK-7 Apt (1 μL ,5 μM)、CD63 Apt (1 μL, 5 μM)、5×PBSbuffer混合，反应30 min。Connector ( 2.5μL ,2.5 μM) 、H1(1 μL ,1 μM ) 、H2(1 μL ,1μM)加入，反应（30 min、50 min、70 min、90 min、110 min、130 min）。反应完成，加入血红素（1.1μL ,1 μM），鲁米诺（1μL,1mM）37 °C反应30 min。之后加入H2O2（7 mM, 8 mM, 9 mM, 10mM, 11mM, 12 mM），立即用于化学发光信号的检测。化学发光信号采集时间间隔是1.5 s，化学发光光谱测量范围是350 nm到550 nm。
上述过程中用到的溶液的制备方法：
4、超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将超纯水分别放置在锥形瓶中，然后用锡箔纸进行封口。在高压灭菌锅中在121 °C的温度下灭菌20 min。结果见图5，从图中可以看出，检测到的化学发光强度峰值随着时间的增大而增大，当时间超过90 min后，化学发光强度趋于稳定。所以最佳的反应时间为90 min。
实施例5
所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
外泌体提取的操作步骤如下：
CCRF-CEM细胞培养在37 °C包含5 % CO2 潮湿空气中。每四天传代一次。RPMI-16404.5g/L、特级胎牛血清（FBS）、1%抗生素（100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素）、被用来培养细胞。为了产生外泌体，细胞被培养在条件培养基（10% FBS和1%抗生素）三天，用不同的超速离心法分离。为了分离外泌体，首先将细胞碎片以2000×g离心20 min，将细胞碎片从培养基中移除。在10000×g离心45 min，细胞囊泡被分离。包含上清液的外泌体用0.20-μm注射器过滤器过滤。最后，外泌体通过10000×g（40000 rpm）离心150 min获取。这个外泌体被重新分布在PBS中，使用之前储存在-80 °C。
均相溶液中反应过程的主要步骤如下：
将（0 particles/mL、1.0×105 particles/mL、1.0×106 particles/mL、1.0×107particles/mL、1.0×108 particles/mL、1.0×109 particles/mL、1.0×1010 particles/mL）外泌体与PTK-7 Apt (1 μL ,5 μM)、CD63 Apt (1 μL, 5 μM)、5×PBS buffer混合，反应30 min。Connector ( 2.5μL ,2.5 μM) 、H1(1 μL ,1 μM ) 、H2(1 μL ,1 μM)加入，反应90 min。反应完成，加入血红素（1.1μL ,1 μM），鲁米诺（1μL,1mM）37 °C反应30 min。之后加入H2O2（7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11mM, 12 mM），立即用于化学发光信号的检测。化学发光信号采集时间间隔是1.5 s，化学发光光谱测量范围是350 nm到550 nm。
上述过程中用到的溶液的制备方法：
5、超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将超纯水分别放置在锥形瓶中，然后用锡箔纸进行封口。在高压灭菌锅中在121 °C的温度下灭菌20 min。当外泌体浓度从0到6 μg/mL时，分别测得的化学发光强度峰值如图6所示。计算回归方程y=80.1336+1029.42X，相关系数为0.991，由此计算该方案的检测限为1 ug/mL。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 济南大学
<120> 基于双适配体检测外泌体的生物传感器及其制备方法与应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 1
atctaactgc tgcgccgccg ggaaaatact gtacggttag attttttttt ttttttcatc 60
atcttacgtg gggtcttgca gta 83
<210> 2
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 2
cggagaagaa gcagactgac actaggtttt tttttttttt tcaccccacc tcgctcccgt 60
gacactaatg cta 73
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 3
cctagtgtca gtctgcccac gtaagatgat g 31
<210> 4
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 4
agggcgggtg ggtcttgcag ttggagaatt gtactgcaag accttcttct ccgtgggt 58
<210> 5
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 5
tgggtcaatt ctccaactgc aagtcggaga agaaggtctt gcagttgggt agggcggg 58

Claims (7)

1.基于双适配体检测外泌体的生物传感器，其特征在于，包括适配体PTK-7 Apt、CD63Apt、connector、发夹探针H1、发夹探针H2、CCRF-CEM、血红素、鲁米诺、H2O2；
PTK-7Apt碱基序列如SEQ No.1所示；具体为:ATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAA AATACTGTACGGTTAGATTTTTTTTTTTTTTTCATCATCTTACGTGGGGTCTTGCAGTA；
CD63Apt碱基序列如SEQ No.2所示；具体为:CGGAGAAGAAGCAGACTGACA CTAGGTTTTTTTTTTTTTTTCACCCCACCTCGCTCCCGTGACACTAATGCTA；
Connector碱基序列如SEQ No.3所示；具体为:CCTAGTGTCAGTCTGCCCACGTAAG ATGATG；
H1碱基序列如SEQ No.4所示；具体为:AGGGCGGGTGGGTCTTGCAGTTGGAG AATTGTACTGCAAGACCTTCTTCTCCGTGGGT；
H2碱基序列如SEQ No.5所示；具体为:TGGGTCAATTCTCCAACTGCAA GTCGGAGAAGAAGGTCTTGCAGTTGGGTAGGGCGGG；
PTK-7 Apt序列中的ATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA是PTK-7的aptamer，CD63 Apt序列中的CACCCCACCTCGCTCCCGTGACACTAATGCTA是CD63的aptamer；PTK-7Apt序列中的CATCATCTTACGTGG、CD63 Apt序列中的GCAGACTGACACTAGG分别是connector序列中的CCACGTAAGATGATG和CCTAGTGTCAGTCTGC的互补序列；当目标物存在时，目标物与PTK-7 Apt和CD63 Apt特异性结合，connector与PTK-7 Apt和CD63 Apt互补配对，将两条链拉近，PTK-7 Apt序列中的GGTCTTGCAGTA和CD63 Apt序列中的CGGAGAAGAA作为trigger去触发HCR反应；H1序列中的AGGGCGGGTGGGT、TGGGT和H2序列中的TGGGT、TGGGTAGGGCGGG是劈开的G四联体序列；PTK-7 Apt 序列中的GGTCTTGCAGTA和CD63 Apt序列中的CGGAGAAGAA是H1序列中的TACTGCAAGACCTTCTTCTCCG的互补序列，将H1打开，H1序列中的CTTGCAGTTGGAGAATTG与H2序列中的CAATTCTCCAACTGCAAG部分互补，将H2打开，H2序列中的TCGGAGAAGAAGGTCTTGCAGT与H1序列中的TACTGCAAGACCTTCTTCTCCG互补，又将H1打开，进而触发HCR；通过上述反应循环实现指数放大，产生大量的G四联体从而实现信号放大；进而通过测量化学发光强度来定量检测外泌体。
2.权利要求1所述的生物传感器检测外泌体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）外泌体提取；
（2）均相反应：将外泌体与PTK-7 Apt、CD63 Apt 加入到5×PBS buffer中，同时加入Connector、H1、H2，混合均匀后孵育；
（3）加入血红素、鲁米诺、H2O2，荧光检测。
3.根据权利要求2所述的检测外泌体的方法，其特征在于，所述步骤（1）外泌体提取的步骤如下：
CCRF-CEM细胞培养在37°C包含5% CO2 潮湿空气中，每四天传代一次，培养基为RPMI-1640 4.5g/L、10%特级胎牛血清FBS、1%抗生素，将细胞碎片以2000g离心20min，将细胞碎片从培养基中移除，在10000g离心45min，0.20μm注射器过滤器过滤，10000g离心150min获取外泌体，然后将外泌体加入PBS，-80°C储存待用。
4.根据权利要求3所述的检测外泌体的方法，其特征在于，所述的抗生素为100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。
5.根据权利要求2所述的检测外泌体的方法，其特征在于，所述步骤（2）均相反应操作步骤如下：
S1 将外泌体与PTK-7 Apt、CD63 Apt、5×PBS buffer混合，反应30min；
S2加入Connector、H1、H2，反应90min。
6.根据权利要求2所述的检测外泌体的方法，其特征在于，所述的步骤（3）过程为：加入血红素，鲁米诺37°C反应30min；之后加入H2O2，立即用于化学发光信号的检测，化学发光信号采集时间间隔是1.5s，化学发光光谱测量范围是350nm到550nm。
7.权利要求1所述的生物传感器用于非疾病诊断目的的肿瘤外泌体检测的应用。
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