CN115825418A - 一种检测外泌体pd-l1的试剂组合、试剂盒和检测平台 - Google Patents

Abstract

本发明属于医学检测技术领域，具体涉及一种检测外泌体PD‑L1的试剂组合、试剂盒和检测平台。本发明提供了一种检测外泌体PD‑L1的试剂组合、定量检测试剂盒，包括1.PD‑L1抗体修饰的磁珠，可以直接从样品中特异性富集PD‑L1阳性Exo；2.5’修饰有胆固醇的DNA探针，可通过疏水相互作用靶向Exo的磷脂膜并实现信号的转化；3.末端脱氧核苷酸转移酶反应体系，用于信号放大。本发明实施例中，利用所述试剂组合或定量检测试剂盒成功检测到源自血浆和原代肿瘤细胞上清中Exo‑PD‑L1，有望在预测PD‑L1免疫疗法的受益者或判断其预后方面显示出巨大的潜力。

Description

一种检测外泌体PD-L1的试剂组合、试剂盒和检测平台

技术领域

本发明属于医学检测技术领域，具体涉及一种检测外泌体PD-L1的试剂组合、试剂盒和检测平台。

背景技术

PD-L1(又名CD274)因可以与活性T细胞上的受体((PD-1)结合并抑制其活化而越来越受到关注。在癌症环境下，PD-L1经常在肿瘤细胞上过表达，从而逃避免疫监视，而且据报道，PD-L1过表达可使肿瘤细胞对PD-1/PD-L1抑制剂更敏感。因此，PD-L1的表达水平可以反映肿瘤免疫治疗的敏感性，通过PD-L1检测筛选免疫治疗的受益者具有重要意义。在目前的临床环境中，PD-L1水平是通过基于免疫组织化学(IHC)的检测来确定的。然而，一方面，IHC的检测需要侵入性操作并给患者带来伤害，另一方面，检测结果受肿瘤时空异质性的影响，导致检测准确率低，难以反映整个肿瘤的全貌。此外，据报道，一些IHC结果较低的患者也能够从免疫治疗中获益，这一原因尚不清楚，但有研究指出肿瘤细胞也会释放PD-L1来发挥作用，因此检测不同形式的细胞外PD-L1，如外泌体表面PD-L1(Exo-PD-L1)或游离可溶性PD-L1蛋白(sPD-L1)，并希望以此作为现有IHC测定的补充以提高诊断准确性。与sPD-L1相比，Exo-PD-L1不易被细胞外蛋白酶降解，也可以作为货物在不同细胞中运输，因此检测Exo-PD-L1的表达更具意义。

目前常用的Exo-PD-L1定量方法是酶联免疫吸附试验(ELISA)，但PD-L1在外泌体表面的丰度并不如标志性蛋白(如CD63)，所以该方法灵敏度较低，难以实现少量样品的检测，还发展了一些灵敏度更高的检测方法如表面等离子体共振，虽然极大的降低了检测限，但这些方法必须通过超离等方法提前分离纯化外泌体，否则易受到样本中游离PD-L1的影响。为了克服这一缺陷，发展了大量的双抗体夹心定量方法，这类方法通常利用CD63、CD81、CD9等去捕获外泌体，然后添加PD-L1抗体或适配体靶标PD-L1蛋白并通过电学、荧光、比色法等检测。为了实现信号的放大，发展了一些PD-L1适配体介导滚动圆扩增(RCA)和杂交链式反应(HCR)等方法，尽管可以通过这些方法来实现令人满意的分析性能，也避免了游离PD-L1蛋白的干扰，但双抗体夹心法在早期的外泌体的捕获中可能会损失含PD-L1的Exo亚群(PD-L1⁺Exo亚群)而导致不准确的结果。因此发展一种不损失PD-L1⁺Exo亚群及不受游离PD-L1蛋白影响的检测方法极具意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测外泌体PD-L1的试剂组合、试剂盒和检测平台，可以直接从样品中特异性富集和检测PD-L1⁺Exo，有望在预测PD-L1免疫疗法的受益者或判断其预后方面显示出巨大的潜力。

本发明提供了一种检测外泌体PD-L1的试剂组合，包括独立包装的PD-L1抗体修饰的磁珠、5’端修饰胆固醇的DNA探针和末端脱氧核苷酸转移酶；

所述DNA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述PD-L1抗体修饰的磁珠的制备方法，包括利用链霉亲和素-磁珠与生物素标记的PD-L1抗体混合孵育，得PD-L1抗体修饰的磁珠。

优选的，所述链霉亲和素-磁珠与生物素标记的PD-L1抗体的质量比为50:1～200:1。

优选的，所述末端脱氧核苷酸转移酶以TdT反应液形式存在；

所述TdT反应液包括末端脱氧核苷酸转移酶、dTTP和TdT反应缓冲液；

所述TdT反应缓冲液包括0.025M Tris、0.2M二甲胂酸钾、体积百分含量为0.01％的Triton X-100和1mM CoCl₂。

优选的，每20μL所述TdT反应液中，包括2～6UTdT、300～600nM dTTP和余量的TdT反应缓冲液。

本发明还提供了上述试剂组合在构建定量检测外泌体PD-L1的试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种定量检测外泌体PD-L1的试剂盒，包括上述试剂组合。

本发明还提供了一种基于上述试剂组合或上述试剂盒的外泌体PD-L1的定量检测平台，包括免疫磁性分离、脂质膜修饰、DNA信号放大和荧光检测；

所述免疫磁性分离包括将包含外泌体的待测物与PD-L1抗体修饰的磁珠混合后孵育，得MB-外泌体缀合物；

所述脂质膜修饰包括将所述MB-外泌体缀合物与5’端修饰胆固醇的DNA探针(简称P)混合孵育，得MB-外泌体-P夹心结构；

所述DNA信号放大包括将所述MB-外泌体-P夹心结构与TdT反应液孵育，形成polyT尾偶联物；

所述荧光检测包括将所述polyT尾偶联物与大量的荧光探针标记的A₂₅序列杂交孵育，去除掉多余荧光探针后将复合物煮沸10min并在荧光分光计中测量。

优选的，所述包含外泌体的待测物包括肿瘤细胞上清液、血液和粘液。

优选的，所述测量包括用495nm波长的光激发并在520nm处记录荧光强度。

有益效果：本发明提供了一种检测外泌体PD-L1的试剂组合和定量检测试剂盒，包括PD-L1抗体修饰的磁珠(MB)，可以直接从样品中特异性富集和检测PD-L1⁺Exo；在5’修饰有胆固醇(Cho)的DNA探针，旨在通过疏水相互作用靶向Exo的磷脂膜并实现信号的转化，因此可以极大的降低游离PD-L1蛋白的影响；末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的核酸扩增用于信号放大；在dTTP存在的情况下，TdT可以通过产生长的poly(T)尾来有效地延伸每个DNA探针，该poly(T)尾可以与大量的荧光探针标记的A₂₅序列杂交，而且荧光强度与Exo-PD-L1表达水平呈正相关(图1)。本发明实施例中，利用所述试剂组合或定量检测试剂盒成功检测到源自血浆和原代肿瘤细胞上清中Exo-PD-L1，有望在预测PD-L1免疫疗法的受益者或判断其预后方面显示出巨大的潜力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明所提出的检测方法示意图；

图2为外泌体表征示意图，其中a为TEM电镜照片，b为NTA检测结果图，c为WB结果图；

图3为有无外泌体时磁珠的荧光显微镜表征图；

图4为TdT放大与未放大的对比图，虚线代表空白，实线代表外泌体样品；

图5为不同浓度外泌体的荧光信号与线性检测图；

图6为原代肿瘤细胞上清中外泌体PD-L1和CD63表达水平及比较，图中1和2表示肺癌，3表示乳腺癌，4表示胃癌；

图7为为血浆样品的信号图，P代表癌症，H代表健康。

具体实施方式

本发明提供了一种检测外泌体PD-L1的试剂组合，包括独立包装的PD-L1抗体修饰的磁珠、5’端修饰胆固醇的DNA探针和末端脱氧核苷酸转移酶；

所述DNA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明所述PD-L1抗体修饰的磁珠的制备方法，优选包括利用链霉亲和素-磁珠与生物素标记的PD-L1抗体混合孵育，得PD-L1抗体修饰的磁珠，所述链霉亲和素-磁珠与生物素标记的PD-L1抗体的质量比优选为50:1～200:1，更优选为50:1。本发明在将所述混合前，优选还包括对所述链霉亲和素-MB用PBS缓冲液洗涤3次，洗涤后，再与生物素标记的PD-L1抗体混合，使用HulaMixer^TM样品混合器(Thermos Fisher)在室温(RT)下孵育30min，用PBST缓冲液洗去未结合的抗体。

本发明所述探针的核苷酸序列优选为TTTGCCGTCGTGCCTTATTTCTGC，且在实施例中，为了验证所述探针能够通过疏水相互作用靶向Exo的磷脂膜并实现信号的转化，特提供了在3’端标记荧光素且5’端标记胆固醇的探针P1，在外泌体存在的情况下，MB表面产生亮绿色荧光，而没有外泌体时则没有可见的荧光，证明P1可以成功靶向外泌体；并且在正式进行后续实验时采用探针P2进行研究。

完整的标记探针P1：Cholesterol-TTTGCCGTCGTGCCTTATTTCTGC-FAM；

P2：Cholesterol-TTTGCCGTCGTGCCTTATTTCTGC。

本发明所述末端脱氧核苷酸转移酶优选以TdT反应液形式存在，且所述TdT反应液优选包括末端脱氧核苷酸转移酶、dTTP和TdT反应缓冲液。本发明所述TdT反应缓冲液，优选包括0.025MTris、0.2M二甲胂酸钾、体积百分含量为0.01％的Triton X-100和1mMCoCl₂。在本发明中，每20μL所述TdT反应液中，优选包括2～6U TdT、300～600nM dTTP和余量的TdT反应缓冲液，更优选的，其中TdT为4U，dTTP的浓度为500nM。

本发明基于胆固醇与外泌体磷脂膜的疏水结合，PD-L1⁺Exo的信号很容易转化为DNA探针的信号，也避免了sPD-L1的影响。TdT酶的使用有效地放大了DNA探针的信号，此外，由于TdT的独特特性，无需设计复杂的模板，大大简化了检测。同时，该方法还具有通用性，因为可以根据特定的外泌体标记物改变捕获抗体，从而可以识别明确定义的外泌体亚群。因此有望作为现有IHC检测的补充，并为筛选免疫治疗受益人群提供一些指导。

本发明还提供了上述试剂组合在构建定量检测外泌体PD-L1的试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种定量检测外泌体PD-L1的试剂盒，包括上述试剂组合。

本发明所述试剂盒中优选还包括FAM-A₂₅。

本发明还提供了一种基于上述试剂组合或上述试剂盒的外泌体PD-L1的定量检测平台，包括免疫磁性分离、脂质膜修饰、DNA信号放大和荧光检测；

所述免疫磁性分离包括将包含外泌体的待测物与PD-L1抗体修饰的磁珠混合后孵育，得MB-外泌体缀合物；

所述脂质膜修饰包括将所述MB-外泌体缀合物与5’端修饰胆固醇的DNA探针混合孵育，得MB-外泌体-P夹心结构；

所述DNA信号放大包括将所述MB-外泌体-P夹心结构与TdT反应液孵育，形成polyT尾偶联物；

所述荧光检测包括将所述成polyT尾偶联物与FAM-A₂₅孵育，将复合物煮沸10min，磁分离后在荧光分光计中测量。

本发明所述免疫磁性分离包括将包含外泌体的待测物与PD-L1抗体修饰的磁珠混合后孵育，得MB-外泌体缀合物。本发明优选将所述待测物与PD-L1抗体修饰的磁珠一起孵育，在室温(18～25℃)下轻轻旋转2小时，并用PBST缓冲液洗涤3次，以去除未反应的外泌体。本发明所述包含外泌体的待测物优选包括肿瘤细胞上清液或血浆。

本发明所述脂质膜修饰包括将所述MB-外泌体缀合物与5’端修饰胆固醇的DNA探针混合孵育，得MB-外泌体-P夹心结构。本发明优选将DNA探针(P2)添加到MB-外泌体缀合物中，并在室温下温和旋转孵育45分钟。本发明在所述孵育结束后，优选还包括去除未结合的P2，为了最大限度地去除未结合的P2，本发明用PBST缓冲液洗涤5次。

本发明所述DNA信号放大包括将所述MB-外泌体-P夹心结构与TdT反应液孵育，形成polyT尾偶联物。本发明所述孵育的温度优选为37℃，所述孵育的时间优选为1小时。

本发明所述荧光检测包括将所述polyT尾偶联物与大量的荧光探针标记的A₂₅序列杂交孵育，去除掉多余荧光探针后将复合物煮沸10min并在荧光分光计中测量，所述荧光探针优选包括FAM，实施例中优选利用上述polyT尾偶联物与FAM-A₂₅孵育，将复合物煮沸10min，磁分离后在荧光分光计中测量。本发明优选将上述polyT尾偶联物与过量的FAM-A₂₅(500nM)在室温下进一步孵育1h，然后用PBST缓冲液洗涤5次。本发明优选将复合物在100℃下煮沸10分钟以将FAM-A₂₅释放到上清液中，磁分离后在荧光分光计中测量。

本发明所述测量，优选包括用495nm波长的光激发并在520nm处记录荧光强度的变化，以荧光强度为纵坐标，外泌体浓度的对数为横坐标绘制标准曲线，从而实现外泌体的定量检测。利用本发明所述方法，随着细胞外囊泡的浓度增加，荧光强度不断增强，在其浓度为1.6×10⁵～1×10⁸个/μL时呈现良好的线性关系，且线性回归方程表示为：

其中F₀和F分别代表不存在和存在外泌体时的荧光信号。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种检测外泌体PD-L1的试剂组合、试剂盒和检测平台进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

在本发明实施例中，所用的缓冲液如下：

磷酸盐缓冲液(PBS)缓冲液，含有8mM Na₂HPO₄、2mM NaH₂PO₄、2.6mM KCl和136mMNaCl，pH7.4；

PBST缓冲液，含有0.1％Tween-20的PBS缓冲液；

1×TdT反应缓冲液，含有0.025M Tris(pH7.2)、0.2M二甲胂酸钾、0.01％(v/v)Triton X-100、1mM CoCl₂；

TdT反应液包括4U TdT、500nM dTTP、1×反应缓冲液，总体积为20μL。

实施例1

1、外泌体的表征

在Jeol JEM-1230仪器上进行Exo的透射电子显微镜(TEM)成像：将Exo样品轻轻滴在铜网上，并用1％磷钨酸钠进行负染色。洗去多余的染料后，用TEM观察制备好的样品。对于纳米粒子跟踪分析(NTA)，将溶解在PBS中的Exo注入zetaview仪器(Particle Metrix，德国)以分析它们的尺寸分布、浓度。

对于蛋白质印迹(WB)分析，Exo在裂解缓冲液中煮沸并通过凝胶电泳分离。将蛋白质转移到PVDF膜后，使用TBST中的5％脱脂牛奶封闭非特异性位点。然后将膜与TSG101或PD-L1一抗在4℃下孵育过夜，然后在室温下用相应的二抗处理1小时。最后，将膜与ECL发光试剂一起孵育并用化学发光成像系统曝光。

TEM成像结果如图2所示，这些Exo具有典型的杯状形状，直径约为100nm(图2中a)。使用纳米粒子追踪技术测试Exo的浓度和粒径分布，结果显示外泌体平均粒径在120nm左右，外泌体颗粒浓度为3.5×10¹¹个/mL(图2中b)。WB分析验证了PD-L1和其他标志物TSG101的表达(图2中c)，并在PVDF膜上观察到清晰的条带。这些结果证实了分离的Exo可用于下游分析和验证。

2、可行性验证

将10μL链霉亲和素-MB(10mg/mL)用200μLPBS缓冲液洗涤3次。洗涤后，加入2μg生物素标记的PD-L1抗体，并使用HulaMixer^TM样品混合器(Thermos Fisher)在室温(RT)下孵育30分钟，用PBST缓冲液洗去未结合的抗体。然后将外泌体与抗PD-L1偶联的MB一起孵育，在室温下轻轻旋转2小时，并用PBST缓冲液洗涤3次以去除未反应的外泌体。之后将DNA探针(P1)添加到MB-外泌体缀合物中，并在室温下温和旋转孵育45分钟。为了最大限度地去除未结合的P1，用PBST缓冲液洗涤5次，最后用PBS重悬磁珠。

为了验证MB-外泌体-P1复合物的形成，用荧光显微镜进行成像。

结果如图3所示，在外泌体存在的情况下，MB表面产生亮绿色荧光，而没有外泌体时则没有可见的荧光，证明P1可以成功靶向外泌体。

实施例2 TdT介导的信号放大

设置TdT信号放大组和未放大组。

其中信号放大组：将10μL链霉亲和素-MB(10mg/mL)用200μLPBS缓冲液洗涤3次。洗涤后，加入2μg生物素标记的PD-L1抗体，并使用HulaMixer^TM样品混合器(Thermos Fisher)在室温(RT)下孵育30分钟，用PBST缓冲液洗去未结合的抗体。然后将外泌体与抗PD-L1偶联的MB一起孵育，在室温下轻轻旋转2小时，并用PBST缓冲液洗涤3次以去除未反应的外泌体。之后将DNA探针(P2)添加到MB-外泌体缀合物中，并在室温下温和旋转孵育45分钟。为了最大限度地去除未结合的P2，用PBST缓冲液洗涤5次。然后将MB-外泌体-P2夹心结构与TdT反应液在37℃下孵育1小时以形成polyT尾。磁分离后，将偶联物与50μL过量的FAM-A₂₅(500nM)在室温下进一步孵育1h，然后用PBST缓冲液洗涤5次。最后，将复合物在100℃下煮沸10分钟以将FAM-A₂₅释放到上清液中，磁分离后在荧光分光计中测量。用495nm波长的光激发并记录在520nm处的荧光强度。

未放大组：将10μL链霉亲和素-MB(10mg/mL)用200μL PBS缓冲液洗涤3次。洗涤后，加入2μg生物素标记的PD-L1抗体，并使用HulaMixer^TM样品混合器(Thermos Fisher)在室温(RT)下孵育30分钟，用PBST缓冲液洗去未结合的抗体。然后将外泌体与抗PD-L1偶联的MB一起孵育，在室温下轻轻旋转2小时，并用PBST缓冲液洗涤3次以去除未反应的外泌体。之后将DNA探针(P2)添加到MB-外泌体缀合物中，并在室温下温和旋转孵育45分钟。为了最大限度地去除未结合的P2，用PBST缓冲液洗涤5次。最后，将复合物在100℃下煮沸10分钟以将FAM-A₂₅释放到上清液中，磁分离后在荧光分光计中测量。用495nm波长的光激发并记录在520nm处的荧光强度。

结果如图4所示，在TdT存在的情况下，外泌体样品的荧光强度有了很大的提高，证明TdT用于信号放大的可行性。

实施例3线性检测

将10μL链霉亲和素-MB(10mg/mL)用200μL PBS缓冲液洗涤3次。洗涤后，加入2μg生物素标记的PD-L1抗体，并使用HulaMixer^TM样品混合器(Thermos Fisher)在室温(RT)下孵育30分钟，用PBST缓冲液洗去未结合的抗体。然后将不同浓度的外泌体与抗PD-L1偶联的MB一起孵育，在室温下轻轻旋转2小时，并用PBST缓冲液洗涤3次以去除未反应的外泌体。之后将DNA探针(P2)添加到MB-外泌体缀合物中，并在室温下温和旋转孵育45分钟。为了最大限度地去除未结合的P2，用PBST缓冲液洗涤5次。然后将MB-外泌体-P2夹心结构与TdT反应液在37℃下孵育1小时以形成polyT尾。

磁分离后，将偶联物与50μL过量的FAM-A₂₅(500nM)在室温下进一步孵育1h，然后用PBST缓冲液洗涤5次。最后，将复合物在100℃下煮沸10分钟以将FAM-A₂₅释放到上清液中，磁分离后在荧光分光计中测量。用495nm波长的光激发并在520nm处记录荧光强度的变化，以荧光强度为纵坐标，外泌体浓度的对数为横坐标绘制标准曲线，从而实现外泌体的定量检测。

结果如图5所示，随着细胞外囊泡的浓度增加，荧光强度不断增强，在其浓度为1.6×10⁵～1×10⁸个/μL时呈现良好的线性关系，且线性回归方程表示为：

其中F₀和F分别代表不存在和存在外泌体时的荧光信号。

实施例4

1、原代肿瘤细胞上清液的检测

选取黄豆大小的肿瘤患者术后组织样本，使用PBS缓冲液清洗2～3次后剪成糊状，加相应的胰酶没过组织碎块，置于37℃恒温培养箱消化1h，直至样本消化至杂质纤维上无明显细胞团。终止液终止消化后过滤，300g离心10min。弃去上清，以10⁵/cm²的细胞密度接种在培养皿中。37℃，5％CO₂条件下进行培养。每2～3天更换一次培养基，并及时收集培养基。收集到的培养基10000g离心30min后取上清超滤浓缩，最后保存在-80℃冰箱备用。细胞上清-Exo的检测方法同实施例3。

结果如图6所示，在肺癌、乳腺癌和胃癌中很容易检测到PD-L1⁺Exo。同时还检测了这些样本中CD63的表达。如图6所示，CD63+外泌体也很容易被检测到，而且CD63的信号明显高于PD-L1，证明CD63+Exo的百分比高于PD-L1。

2、血浆样品检测

血浆样品通过3000rpm离心15分钟获得，随后以10000g离心30分钟以去除大的细胞外囊泡，接着用0.22μm滤膜过滤上清液，最后用商用试剂盒提取Exo。血浆-Exo的检测过程与实施例3一致。

结果如图7所示，利用本发明的检测试剂盒和检测方法成功检测到了血浆样品中的Exo-PD-L1，且癌症患者的荧光强度高于健康供体并存在个体差异。但由于血浆样本数量有限，距离实际临床应用仍有一定距离。因此，有必要确定大量血浆样本中外泌体PD-L1信号的检测阈值，以区分免疫受益人群和非受益人群。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种检测外泌体PD-L1的试剂组合，其特征在于，包括独立包装的PD-L1抗体修饰的磁珠、5’端修饰胆固醇的DNA探针和末端脱氧核苷酸转移酶；

所述DNA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述试剂组合，其特征在于，所述PD-L1抗体修饰的磁珠的制备方法，包括利用链霉亲和素-磁珠与生物素标记的PD-L1抗体混合孵育，得PD-L1抗体修饰的磁珠。

3.根据权利要求2所述试剂组合，其特征在于，所述链霉亲和素-磁珠与生物素标记的PD-L1抗体的质量比为50:1～200:1。

4.根据权利要求1所述试剂组合，其特征在于，所述末端脱氧核苷酸转移酶以TdT反应液形式存在；

所述TdT反应液包括末端脱氧核苷酸转移酶、dTTP和TdT反应缓冲液；

所述TdT反应缓冲液包括0.025M Tris、0.2M二甲胂酸钾、体积百分含量为0.01％的TritonX-100和1mM CoCl₂。

5.根据权利要求4所述试剂组合，其特征在于，每20μL所述TdT反应液中，包括2～6UTdT、300～600nM dTTP和余量的TdT反应缓冲液。

6.权利要求1～5任一项所述试剂组合在构建定量检测外泌体PD-L1的试剂盒中的应用。

7.一种定量检测外泌体PD-L1的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～5任一项所述试剂组合。

8.一种基于权利要求1～5任一项所述试剂组合或权利要求7所述试剂盒的外泌体PD-L1的定量检测平台，其特征在于，包括免疫磁性分离、脂质膜修饰、DNA信号放大和荧光检测；

所述免疫磁性分离包括将包含外泌体的待测物与PD-L1抗体修饰的磁珠混合后孵育，得MB-外泌体缀合物；

所述脂质膜修饰包括将所述MB-外泌体缀合物与5’端修饰胆固醇的DNA探针混合孵育，得MB-外泌体-P夹心结构；

所述DNA信号放大包括将所述MB-外泌体-P夹心结构与TdT反应液孵育，形成polyT尾偶联物；

所述荧光检测包括将所述polyT尾偶联物与大量的荧光探针标记的A₂₅序列杂交孵育，去除掉多余荧光探针后将复合物煮沸10min并在荧光分光计中测量。

9.根据权利要求8所述定量检测平台，其特征在于，所述包含外泌体的待测物包括肿瘤细胞上清液、血液和尿液。

10.根据权利要求8所述定量检测平台，其特征在于，所述测量包括用495nm波长的光激发并在520nm处记录荧光强度。

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