CN113552103B - 一种基于CRISPR-Cas系统的检测外泌体的荧光生物传感器 - Google Patents

一种基于CRISPR-Cas系统的检测外泌体的荧光生物传感器 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物传感器技术领域，涉及一种基于CRISPR‑Cas系统的检测外泌体的荧光生物传感器。当目标物存在时，PTK‑7 Apt和CD63 Apt与其特异性结合，从而释放Trigger，而trigger与linker链结合，fuel链进一步与linker链结合，被置换下来的trigger链重新进入循环，从而触发HCR反应，极大提高了其检测的灵敏度；利用Cas12a的“附属切割”活性切割体系中的荧光报告基团，产生可定量的信号。该传感器的构建简单，具有操作简单、反应速度快、性能稳定等优势；检测原理的主要过程均是在均相中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测。适用于肿瘤外泌体的检测和生物传感器产业化的实际应用。

Description

一种基于CRISPR-Cas系统的检测外泌体的荧光生物传感器
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，涉及一种基于CRISPR-Cas系统的检测外泌体的荧光生物传感器。
背景技术
外泌体（Exosome）是一种细胞来源的纳米级的细胞外囊泡，直径大多介于30～100nm之间，具有脂质双层膜结构，可以通过转运其来源细胞的活性物质，发挥调控靶细胞的作用。外泌体蛋白质介导的肿瘤细胞间的信号转导在肿瘤的早期发生和其发展中起重要的作用。随着蛋白质组学技术的普及，更多的外泌体蛋白质的组成和功能相继被揭示。多项研究表明外泌体携带的蛋白质在不同肿瘤中存在差异性表达，检测这些特征性外泌体蛋白质可能对各种肿瘤的诊断和治疗有非常重要的价值。
传统的外泌体蛋白质鉴定方法主要包括Western blotting（WB）、酶联免疫吸附测定法（Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA） 和色谱质谱联用技术等。但是这些方法需要繁琐的样品前处理，因此限制了它们快速筛选外泌体的应用。由此，发展快速、便携、灵敏、特异和高通量的外泌体表面蛋白检测技术仍面临巨大的挑战。
CRISPR/Cas技术作为一种革命性的基因编辑工具，被广泛应用于基因编辑、基因组成像等领域。因其独特的精准识别能力，具有的模块化和可编程的特点，再加上该技术的易用性和抗干扰性，CRISPR/Cas系统在生物传感领域也展现出广阔的应用前景。
发明内容
解决以上现有技术检测外泌体的繁琐的样品前处理过程的问题，本发明提供了一种特异性和灵敏度高、检测速度快的基于CRISPR/Cas技术检测外泌体的生物传感器。
本发明的另一目的是提供一种上述生物传感器在检测外泌体中的应用与方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种基于CRISPR-Cas系统的检测外泌体的荧光生物传感器，包括：适配体PTK-7和适配体CD63，Linker链，Trigger链，S链，Fuel链，crRNA、FQ链， cas12a蛋白；
所述的适配体PTK-7的碱基序列为SEQ ID No:1；具体为：5’-GTTTATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA -3’；
所述的适配体CD63的碱基序列为SEQ ID No:2；具体为：5’- CACCCCACCTCGCTCCCGTGACACTAATGCTATAGACA -3’；
所述的Trigger链的碱基序列为SEQ ID No:3；具体为：5’-AGTTAGATAAACTGTCTATAGCATTA -3’；
所述的S链的碱基序列为SEQ ID No:4；具体为：5’- GATCTATTGCATTATTCCAT -3’；
所述的Linker链的碱基序列为SEQ ID No:5；具体为：5’-ATGGAATAATGCAATAGAATGGAATAATGCTATAGACAGTT -3’；
所述的Fuel链的碱基序列为SEQ ID No:6；具体为：5’-AGCATTATTCCATTCTATTGCATTAT -3’；
所述的crRNA的碱基序列为SEQ ID No:7；具体为：5’- UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAUGGAAUAAUGCAAUAGAUC -3’；
所述的FQ的碱基序列为SEQ ID No:8；具体为：5’- FAM-TTATT-BHQ-3’。
上述荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤:
（1）复合探针Q1、Q2的构建：所述复合探针Q1由PTK-7 Apt、CD63 Apt和Trigger链杂交而成；所述复合探针Q2由S链和Linker链杂交而成；
（2）均相反应：将Cas12a蛋白，crRNA，FQ链，复合探针Q1、Q2、Fuel链加入到均相中，混合均匀后孵育；
（3）荧光仪检测化学发光强度。
优选地，所述步骤（1）中PTK-7 Apt、CD63 Apt和Trigger的比例为2：2：1。
优选地，所述步骤（1）中S链和Linker的比例为2：1。
本发明的检测原理如下：
PTK-7 Apt和CD63 Apt中部分碱基与Trigger链分别互补配对形成三链体。当目标物存在时，目标物与PTK-7 Apt和CD63 Apt特异性结合，释放Trigger链去触发HCR反应（DNA的杂交链式反应）。S链部分碱基与Linker部分链互补配对，两条S链与Linker链形成三链体。Trigger链部分与Linker链中部分互补配对，将对应部分的S链置换下来。Fuel链与Linker链中部分碱基互补配对，将第二条S链与Trigger链置换下来。crRNA可以与S链结合，激活Cas12a的反式切割活性，切割FQ链，产生荧光信号，而Trigger链再次进入循环，实现指数放大，产生大量的S链触发CRISPR/Cas 系统，从而实现信号放大，通过荧光仪变化检测外泌体的量。
本发明具有以下优点：
本发明提供的生物传感器检测限低，利用核酸适配体与外泌体的“双靶标识别”实现了对目标物的高特异性检测；当目标物存在时，PTK-7 Apt和CD63 Apt与其特异性结合，从而释放Trigger，而trigger与linker链结合，fuel链进一步与linker链结合，被置换下来的trigger链重新进入循环，从而触发HCR反应，极大提高了其检测的灵敏度；利用Cas12a的“附属切割”活性切割体系中的荧光报告基团，产生可定量的信号。该传感器的构建简单，具有操作简单、反应速度快、性能稳定等优势；检测原理的主要过程均是在均相中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测。适用于肿瘤外泌体的检测和生物传感器产业化的实际应用。
该传感器具有检测速度快、操作简单、检测限低、特异性高等优点，可以弥补外泌体现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速、准确的定量检测。
附图说明
图1为本发明生物传感器的原理图；
图2为Cas12a蛋白浓度优化检测结果图
图3为反应时间优化检测结果图；
图4为生物传感器对不同浓度外泌体的荧光扫描；
图5为不同浓度外泌体的标准曲线。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例 1 Cas12a浓度变化对外泌体检测的影响
所述光学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
外泌体的制备过程：
CEM细胞培养在37℃包含5 %CO2 潮湿空气中，培养基为MEM、10%的小牛血清、1%抗生素，每两天传代一次：用移液器吸出培养基，加入培养基2-3mL，吹打成单细胞悬液，分瓶即可。
将CEM细胞培养三天，吸出培养基，以2000×g离心20 min，将细胞碎片从培养基中移除， 使用外泌体提取试剂盒进行提取，获取外泌体，-80℃储存待用。
复合探针Q1、Q2的构建步骤如下：
复合探针Q1：将灭菌水、NEB buffer2.1、不同比例的PTK-7 Apt、CD63 Apt和Trigger链（2:2:1）加入到预先准备好的灭菌的EP管中，震荡30s，在95℃下孵育5min，缓慢冷却至室温杂交为探针，储存于-20 ℃备用。
复合探针Q2：将灭菌水、NEB buffer2.1、S链和Linker链（2：1）加入到预先准备好的灭菌的EP管中，震荡30s，在95℃下孵育5min，缓慢冷却至室温杂交为探针，储存于-20 ℃备用。
均相反应操作步骤如下：
将复合探针Q1（3μL，100nM）、Q2（3μL，100nM）、Fuel链（3μL，100nM）、不同浓度的Cas12a蛋白（3μL，终浓度为25nM、50nM、75 nM、100nM、125nM、150nM）、crRNA（3μL，100nM）、FQ链（1μL，1μM）、3μL外泌体（88个/μL）、NEB buffer2.1（3 μL）水（8μL）加入离心管中，震荡30s，于37℃下水浴60 min。
荧光仪检测化学发光强度主要步骤如下：
将均相反应后的溶液（30 μL）稀释至100 μL，用荧光仪在520 nm处检测化学发光峰值强度。荧光仪激发波长设置为485nm，电压为670V，读取化学发光信号变化，检测目标物。
结果见图2，从图中可以看出，检测到的化学发光强度峰值随着Cas12a蛋白浓度增加而减小，当浓度超过100 nM后，化学发光强度趋于稳定。所以Cas12a的最佳终浓度为100nM。
实施例 2 反应时间对外泌体检测的影响
所述光学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
外泌体的制备过程：
CEM细胞培养在37℃包含5 %CO2 潮湿空气中，培养基为MEM、10%的小牛血清、1%抗生素，每两天传代一次：用移液器吸出培养基，加入培养基2-3mL，吹打成单细胞悬液，分瓶即可。
将CEM细胞培养三天，吸出培养基，以2000×g离心20 min，将细胞碎片从培养基中移除， 使用外泌体提取试剂盒进行提取，获取外泌体，-80℃储存待用。
复合探针Q1、Q2的构建步骤如下：
复合探针Q1：将灭菌水、NEB buffer2.1、不同比例的PTK-7 Apt、CD63 Apt和Trigger链（2:2:1）加入到预先准备好的灭菌的EP管中，震荡30s，在95℃下孵育5min，缓慢冷却至室温杂交为探针，储存于-20 ℃备用。
复合探针Q2：将灭菌水、NEB buffer2.1、S链和Linker链（2：1）加入到预先准备好的灭菌的EP管中，震荡30s，在95℃下孵育5min，缓慢冷却至室温杂交为探针，储存于-20 ℃备用。
均相反应操作步骤如下：
将复合探针Q1（3μL，100nM）、Q2（3μL，100nM）、Fuel链（3μL，100nM）、不同浓度的Cas12a蛋白（3μL，100nM）、crRNA（3μL，100nM）、FQ链（1μL，1μM）、3μL外泌体（88个/μL）、NEBbuffer2.1（3 μL）水（8μL）加入离心管中，震荡30s，于37℃下水浴30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min。
荧光仪检测化学发光强度主要步骤如下：
将均相反应后的溶液（30 μL）稀释至100 μL，用荧光仪在520 nm处检测化学发光峰值强度。荧光仪激发波长设置为485nm，电压为670V，读取化学发光信号变化，检测目标物。
结果见图3，从图中可以看出，检测到的化学发光强度峰值随着时间增加而减少，当时间超过60min后，化学发光强度趋于稳定。所以最佳的均相反应时间为60min。
实施例 3 生物传感器对不同浓度外泌体的检测
所述光学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
外泌体的制备过程：
CEM细胞培养在37℃包含5 %CO2 潮湿空气中，培养基为MEM、10%的小牛血清、1%抗生素，每两天传代一次：用移液器吸出培养基，加入培养基2-3mL，吹打成单细胞悬液，分瓶即可。
将CEM细胞培养三天，吸出培养基，以2000×g离心20 min，将细胞碎片从培养基中移除， 使用外泌体提取试剂盒进行提取，获取外泌体，-80℃储存待用。
复合探针Q1、Q2的构建步骤如下：
复合探针Q1：将灭菌水、NEB buffer2.1、不同比例的PTK-7 Apt、CD63 Apt和Trigger链（2:2:1）加入到预先准备好的灭菌的EP管中，震荡30s，在95℃下孵育5min，缓慢冷却至室温杂交为探针，储存于-20 ℃备用。
复合探针Q2：将灭菌水、NEB buffer2.1、S链和Linker链（2：1）加入到预先准备好的灭菌的EP管中，震荡30s，在95℃下孵育5min，缓慢冷却至室温杂交为探针，储存于-20 ℃备用。
均相反应操作步骤如下：
将复合探针Q1（3μL，100nM）、Q2（3μL，100nM）、Fuel链（3μL，100nM）、不同浓度的Cas12a蛋白（3μL，100nM）、crRNA（3μL，100nM）、FQ链（1μL，1μM）、3μL不同浓度的外泌体（使浓度分别为0, 1.0×102 particle/μL, 1.0×103 particle/μL, 1.0×104 particle/μL,1.0×105 particle/μL, 1.0×106 particle/μL,）、NEB buffer2.1（3 μL）水（8μL）加入离心管中，震荡30s，于37℃下水浴60 min。
荧光仪检测化学发光强度主要步骤如下：
将均相反应后的溶液（30 μL）稀释至100 μL，用荧光仪在520 nm处检测化学发光峰值强度。荧光仪激发波长设置为485nm，电压为670V，读取化学发光信号变化，检测目标物。
结果如图4所示，从图中可以看出，检测到的荧光波长值随着外泌体增大红移逐渐增加。以不同外泌体下测定的吸光度值与不含外泌体的吸光值差值为纵坐标，以不同外泌体浓度为横坐标作图，如图5所示，获得回归方程为y = -316+ 205.9x，相关系数为0.9979，由此计算优化后的生物传感器的检测限为1.0×102 个/μL。
序列表
<110> 济南大学
<120> 一种基于CRISPR-Cas系统的检测外泌体的荧光生物传感器
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 1
gtttatctaa ctgctgcgcc gccgggaaaa tactgtacgg ttaga 45
<210> 2
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 2
caccccacct cgctcccgtg acactaatgc tatagaca 38
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 3
agttagataa actgtctata gcatta 26
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 4
gatctattgc attattccat 20
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 5
atggaataat gcaatagaat ggaataatgc tatagacagt t 41
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 6
agcattattc cattctattg cattat 26
<210> 7
<211> 41
<212> RNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 7
uaauuucuac uaaguguaga uauggaauaa ugcaauagau c 41
<210> 8
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 8
ttatt 5

Claims (5)

1.一种基于CRISPR-Cas系统的检测外泌体的荧光生物传感器，其特征在于，包括：适配体PTK-7和适配体CD63，Linker链，Trigger链，S链，Fuel链，crRNA、FQ链， cas12a蛋白；
所述的适配体PTK-7的碱基序列为SEQ ID No:1；具体为：5’-GTTTATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA -3’；
所述的适配体CD63的碱基序列为SEQ ID No:2；具体为：5’- CACCCCACCTCGCTCCCGTGACACTAATGCTATAGACA -3’；
所述的Trigger链的碱基序列为SEQ ID No:3；具体为：5’-AGTTAGATAAACTGTCTATAGCATTA -3’；
所述的S链的碱基序列为SEQ ID No:4；具体为：5’- GATCTATTGCATTATTCCAT -3’；
所述的Linker链的碱基序列为SEQ ID No:5；具体为：5’-ATGGAATAATGCAATAGAATGGAATAATGCTATAGACAGTT -3’；
所述的Fuel链的碱基序列为SEQ ID No:6；具体为：5’- AGCATTATTCCATTCTATTGCATTAT-3’；
所述的crRNA的碱基序列为SEQ ID No:7；具体为：5’- UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAUGGAAUAAUGCAAUAGAUC -3’；
所述的FQ的碱基序列为SEQ ID No:8；具体为：5’- FAM-TTATT-BHQ-3’。
2.权利要求1所述的荧光生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:
（1）外泌体的制备过程：提取CEM细胞的外泌体；
（2）复合探针Q1、Q2的构建：所述复合探针Q1由PTK-7 Apt、CD63 Apt和Trigger链杂交而成；所述复合探针Q2由S链和Linker链杂交而成；
（3）均相反应：将Cas12a蛋白，crRNA，FQ链，复合探针Q1、Q2、Fuel链、步骤（1）的外泌体加入到均相中，混合均匀后孵育；
（4）荧光仪检测化学发光强度。
3.根据权利要求2所述的荧光生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中PTK-7 Apt、CD63 Apt和Trigger的比例为2：2：1。
4.根据权利要求2所述的荧光生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中S链和Linker的比例为2：1。
5.权利要求1所述的荧光生物传感器在检测外泌体上的应用。
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