CN112285172A - 一种基于不同结构适配体放大线性范围双比率生物传感器的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种基于线性适配体‑发夹适配体放大双比率电化学适配体传感器线性范围的制备方法及应用；通过AQ与rGO的非共价作用形成AQ‑rGO复合材料；AuNPs将巯基修饰的发夹适配体‑线性适配体固定在传感界面；发夹适配体的一部分包括适配体序列，携带电化学分子亚甲基蓝，线性适配体携带二茂铁电化学信号分子，从而构建新型双比率电化学适配体传感器；与发夹适配体相比，线性适配体与其目标物AFB1的结合作用更容易发生，因此，导致发夹适配体携带MB信号分子发生变化的目标物AFB1浓度可作为AFB1定性分析的浓度点，实现对食品中AFB1的定性分析，检测灵敏度高、稳定性好。

Description

一种基于不同结构适配体放大线性范围双比率生物传感器的 制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种基于线性适配体-发夹适配体放大双比率电化学适配体传感器线性范围的制备方法及应用，可用于对花生中黄曲霉毒素B1(AFB1)的检测分析。

背景技术

黄曲霉毒素B1(AFB1)是最为严重的致癌物质，诱变剂和致畸剂，已广泛存在于许多农作物中，例如花生，玉米和棉花。AFB1被国际癌症研究机构归为第一类。AFB1耐热处理和化学处理，在农业生产和食品加工中普遍存在。许多国家或地区设定了食品和饲料中AFB1的最大容许水平，通常为2ng mL^-1-20ng mL^-1。因此，迫切需要开发一种简单而灵敏的策略来检测AFB1以确保食品安全。高效液相色谱与串联质谱联用(HPLC-MS/MS)和薄层色谱(TLC)通常用于检测AFB1。尽管这些方法提供了良好的灵敏度，但仍然存在一些缺点，包括成本高以及需要训练有素的操作员。最近，已经开发了包括电化学，荧光和比色传感器在内的适配体传感测定方法，用于AFB1的快速检测。比如，Wu等人开发了用于AFB1分析的电化学适体传感器，基于靶标诱导的构象变化或固定在电极表面的氧化还原标记适体的结构转换引起电化学信号的变化而实现检测。然而，此类传感器仍然存在潜在的重大局限性：单位点结合产生固定的线性曲线，限制了其有用的线性范围。

因此，期望开发一种通过在有限的空间中仅使用多种类型的捕获探针来调节线性范围的新方法。

发明内容

本文旨在发明一种准确性、选择性、稳定性良好的基于线性适配体-发夹适配体放大双比率电化学适配体传感器，线性范围定性检测食品中的AFB1；首先制备一种无标记信号探针-蒽醌与还原氧化石墨烯(AQ-rGO)复合材料，通过蒽醌(AQ)与还原氧化石墨烯(rGO)的非共价作用形成；金纳米粒子(AuNPs)将巯基修饰的发夹适配体-线性适配体固定在传感界面；发夹适配体的一部分包括适配体序列，携带电化学分子亚甲基蓝(MB)，线性适配体携带二茂铁电化学信号分子，从而构建新型双比率电化学适配体传感器。与发夹适配体相比，线性适配体与其目标物AFB1的结合作用更容易发生，因此，导致发夹适配体携带MB信号分子发生变化的目标物AFB1浓度可作为AFB1定性分析的浓度点。

通过如下技术方案实现本发明的目的：

本发明首先提供一种基于不同结构适配体放大线性范围双比率生物传感器的制备方法，步骤如下：

(1)无标记电化学探针AQ-rGO复合材料的制备：

首先将蒽醌(AQ)与还原氧化石墨烯(rGO)分别用超纯水溶解，得到AQ分散液、rGO分散液；然后使用细胞粉碎机处理rGO分散液，再将处理后的rGO分散液与AQ分散液混合，经磁力搅拌、离心、水洗，得到AQ-rGO复合材料，并将其分散在超纯水中，得到AQ-rGO复合材料分散液，室温储存备用；

(2)取玻碳电极依次用不同粒径的三氧化二铝粉末打磨，打磨后的玻碳电极，分别在乙醇和水中超声后于空气中干燥，得到处理后的玻碳电极；

(3)将步骤(1)制备的无标记电化学探针AQ-rGO复合材料分散液修饰到步骤(2)所处理后的玻碳电极表面，在室温下自然晾干，修饰后的玻碳电极记为AQ-rGO/GCE；

(4)将金纳米粒子(AuNPs)修饰在步骤(3)所制得AQ-rGO/GCE的传感界面，修饰后的材料，记为AuNPs/AQ-rGO/GCE；

(5)放大线性范围的双比率电化学传感器的构建：

二茂铁(Fc)标记的线性适配体，记为Fc-apt、亚甲基蓝(MB)标记的发夹适配体，记为MB-HR，两者混合后在一定温度条件下反应，反应后的溶液记为Fc-apt-MB-HR；再将Fc-apt-MB-HR修饰在步骤(4)制备AuNPs/AQ-rGO/GCE的传感界面上，孵育固定后获得基于Fc-apt-MB-HR的双比率电化学适配体传感器，即为基于不同结构适配体放大线性范围双比率生物传感器，记为Fc-apt-MB-HR/AuNPs/AQ-rGO/GCE。

进一步地，步骤(1)中，所述AQ分散液的浓度为0.5mg·mL^-1，rGO分散液的浓度为0.05mg·mL^-1；所述细胞粉碎机处理rGO分散液的时间为30min；所述AQ分散液与rGO分散液的体积比为3:10；所述磁力搅拌的时间为18h；所述离心的转速为8000rpm，时间为15min。

进一步地，步骤(1)中，所述AQ-rGO复合材料与超纯水的用量比为(0.02-00.5)mg:(2-3)ml。

进一步地，步骤(2)中，所述玻碳电极的直径d＝3mm；所用的三氧化二铝粉末的粒径依次为0.3μm、0.05μm。

进一步地，步骤(3)中，所述AQ-rGO复合材料修饰的用量为6μL。

进一步地，步骤(4)中，所述AuNPs修饰的用量为6μL。

进一步地，步骤(5)中，所述Fc-apt浓度为2.0-6.0μM，MB-HR浓度为2.0-6.0μM，Fc-apt与MB-HR按照1:1体积比混合，所述一定温度条件为4℃，反应时间为1h。

进一步地，步骤(5)中，所述Fc-apt-MB-HR修饰的用量为6μL，浓度为2.0μM；所述孵育固定的时间为12h，温度为4℃。

所述AQ、rGO购买自上海国药集团化学试剂有限公司；Fc-apt、MB-HR、AuNPs购买自上海生工生物工程股份有限公司。

本发明还涉及一种基于不同结构适配体放大线性范围双比率生物传感器检测黄曲霉毒素B1的用途，步骤如下：

(1)在上述制得的Fc-apt-MB-HR/AuNPs/AQ-rGO/GCE传感器表面依次修饰V1体积不同浓度的AFB1溶液；室温下孵育时后用Tris-HCl(pH＝7.4)溶液对电极进行清洗，一个浓度的AFB1溶液对应修饰一个电化学生物传感器，浓度和电化学生物传感器呈一一对应关系；

(2)标准曲线的构建：以步骤(1)修饰后传感器为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，由型号为CHI750E的电化学工作站记录与检测电化学信号；在0.1M PBS(pH＝7.0)缓冲溶液中进行测试；扫描电压范围-0.8-0.8V，振幅为0.025V，频率为25Hz；每一个浓度的AFB1会对应一个电流值，根据电流值和AFB1浓度的对数构建得到标准曲线；

(3)样品中AFB1的检测：首先获取样品液，修饰V1体积的样品液于传感器表面，通过电化学测试得到相应的电流值；将电流值代入步骤(2)构建的标准曲线，即可获知样品中AFB1的浓度；实现未知样品中AFB1检测的用途。

进一步地，步骤(1)中，所述AFB1溶液的浓度为0.01pg mL^-1-1000ng mL^-1；孵育时间为80min。

进一步地，步骤(1)和(3)中V1修饰的体积为6μL。

双比率电化学适配体传感器检测实际样品花生中AFB1时，使MB信号变化的AFB1浓度为100pg·mL^-1，国家对于花生中AFB1的限量标准为20ng·mL^-1,因此，我们将被测溶液稀释200倍观察MB信号是否发生变化，从而获得AFB1是否符合国家限量标准的信息，实现对花生中AFB1的快速定性分析。

本发明的有益效果：

(1)本发明提出的基于线性适配体-发夹适配体的双比率电化学适配体传感器，通过发夹适配体携带信号分子MB的信号变化点获得引起双比率电化学适配体传感器MB信号变化的AFB1浓度，可实现对食品中AFB1的定性分析。

(2)本发明提出的基于线性适配体-发夹适配体的双比率电化学适配体传感器，通过将电化学探针修饰在电极表面作为传感器的内标分子，提高了传感器的精准度。

(3)本发明提出的双比率电化学生物传感器可同时获得三个检测信号，信息量大，精准度、可信度高。

(4)本发明构建的比率电化学生物传感器用于AFB1的检测，灵敏度高、选择性好、稳定性好，线性范围宽，为0.01-1000000pg·mL^-1。

附图说明

图1为线性适配体与发夹适配体的设计结构图。

图2中(A)为发夹适配体的检测示意图；(B)为线性适配体-发夹适配体检测的示意图。

图3中(A)为发夹适配体传感检测不同浓度AFB1标准液的线性图；(B)为线性适配体-发夹适配体传感检测不同浓度AFB1标准液的线性图。

具体实施方式：

下面结合附图对本发明的实施例作详细说明：实施例在本发明的技术方案为前提下进行，给出了详细实施步骤和具体操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：

线性适配体-发夹适配体双比率电化学适配体传感器的制备方法包括以下步骤：

(1)无标记电化学探针AQ-rGO复合材料的制备：

首先将蒽醌(AQ)与还原氧化石墨烯(rGO)分别用超纯水溶解，得到AQ分散液、rGO分散液，AQ分散液的浓度为0.5mg·mL^-1，rGO分散液的浓度为0.05mg·mL^-1；并用细胞粉碎机处理rGO分散液30min，提高其在水中的分散性；然后将AQ分散液与rGO分散液以体积比为3:10混合，磁力搅拌18h并离心水洗，离心转速为8000rpm，每次15min，得到AQ-rGO复合材料，分散在超纯水中，得到AQ-rGO复合材料分散液，室温储存备用；

(2)取d＝3mm的玻碳电极(GCE)依次用0.3μm和0.05μm的三氧化二铝粉末打磨，分别在乙醇和水中超声后于空气中干燥，得到处理后的玻碳电极；

(3)将步骤(1)制备的无标记电化学探针AQ-rGO复合材料分散液修饰6μL到步骤(2)所处理后的玻碳电极表面，所得传感界面在室温下自然晾干；记为AQ-rGO/GCE；

(4)将6μL的AuNPs固定在步骤(3)所制得的传感界面，记为AuNPs/AQ-rGO/GCE；

(5)放大线性范围的双比率电化学传感器的构建：

Fc-apt浓度为4.0μM，MB-HR浓度为4.0μM，Fc-apt与MB-HR按照1:1体积比混合，在4℃条件下孵育1h，得到两者通过碱基互补配对作用的结构，记为Fc-apt-MB-HR；如图1所示，浓度为2.0μM，修饰在步骤(4)制备AuNPs/AQ-rGO/GCE的传感界面上，用量为6μL，反应温度为4℃的Fc-apt-MB-HR在电极表面的孵育时间为12h，通过Au-S共价作用而固定在传感界面上，获得基于线性适配体-发夹适配体的双比率电化学适配体传感器记为Fc-apt-MB-HR/AuNPs/AQ-rGO/GCE。

实施例2：

基于线性适配体-发夹适配体的双比率电化学适配体传感器检测AFB1的性能分析：

在基于发夹适配体的比率电化学适配体传感器(图2A)、线性适配体-发夹适配体的双比率电化学适配体传感器(图2B)表面依次修饰不同浓度的AFB1，室温下孵育时间为80min，之后用Tris-HCl(pH＝7.4)溶液对电极进行清洗，分别得到两类传感器的性能曲线，对比发现，引入线性适配体的传感器检测线性范围得到明显提高，如图3中A与B图所示；传感器为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，由型号为CHI750E的电化学工作站记录与检测电化学信号。在0.1M PBS(pH＝7.0)缓冲溶液中进行测试，扫描电压范围-0.8-0.8V，振幅为0.025V，频率为25Hz。

实施例3：

基于线性适配体-发夹适配体的双比率电化学适配体传感器检测花生中AFB1：

花生作为实际样品，将AFB1标准溶液喷洒在花生样品表面，剧烈振摇下60分钟，用10mL甲醇水溶液(60％)提取4g花生，然后8000rpm离心15分钟；取上层溶液并在室温下用0.22μm过滤器处理，以除去杂质，将得到的实际样品溶液储存备用；

不同浓度的实际样品溶液修饰在实施例1适配体传感器表面，室温下孵育时间为80min，之后用Tris-HCl(pH＝7.4)溶液对电极进行清洗，传感器为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，由型号为CHI750E的电化学工作站记录与检测电化学信号。在0.1M PBS(pH＝7.0)缓冲溶液中进行测试。扫描电压范围-0.8-0.8V，振幅为0.025V，频率为25Hz。表1所示。

表1：花生中AFB1的检测结果

利用国标的方法高效液相色谱串联荧光法(HPLC-FL)对我们提出的AFB1传感器的可靠性进行验证。由于国标方法对AFB1最低检测浓度为100pg·mL^-1，因此通过表1的数据观察，我们的传感器具有更好的灵敏度。

基于线性适配体-发夹适配体的双比率电化学适配体传感器检测花生中AFB1：实施例2中双比率电化学适配体传感器检测AFB1时，使MB信号变化的AFB1浓度为100pg·mL^-1，国家对于花生中AFB1的限量标准为20ng·mL^-1,因此，我们将被测溶液稀释200倍观察MB信号是否发生变化，从而获得AFB1是否符合国家限量标准的信息，实现对花生中AFB1的快速定性分析。

说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。

Claims (10)

1.一种基于不同结构适配体放大线性范围双比率生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：

(1)无标记电化学探针AQ-rGO复合材料的制备：

首先将蒽醌与还原氧化石墨烯分别用超纯水溶解，得到AQ分散液、rGO分散液；然后使用细胞粉碎机处理rGO分散液，再将处理后的rGO分散液与AQ分散液混合，经磁力搅拌、离心、水洗，得到AQ-rGO复合材料，并将其分散在超纯水中，得到AQ-rGO复合材料分散液，室温储存备用；

(2)取玻碳电极依次用不同粒径的三氧化二铝粉末打磨，打磨后的玻碳电极，分别在乙醇和水中超声后于空气中干燥，得到处理后的玻碳电极；

(3)将步骤(1)制备的无标记电化学探针AQ-rGO复合材料分散液修饰到步骤(2)所处理后的玻碳电极表面，在室温下自然晾干，修饰后的玻碳电极记为AQ-rGO/GCE；

(4)将金纳米粒子修饰在步骤(3)所制得AQ-rGO/GCE的传感界面，修饰后的材料，记为AuNPs/AQ-rGO/GCE；

(5)放大线性范围的双比率电化学传感器的构建：

二茂铁标记的线性适配体，记为Fc-apt；亚甲基蓝标记的发夹适配体，记为MB-HR；两者混合后在一定温度条件下反应，反应后的溶液记为Fc-apt-MB-HR；再将Fc-apt-MB-HR修饰在步骤(4)制备AuNPs/AQ-rGO/GCE的传感界面上，孵育固定后获得基于Fc-apt-MB-HR的双比率电化学适配体传感器，即为基于不同结构适配体放大线性范围双比率生物传感器，记为Fc-apt-MB-HR/AuNPs/AQ-rGO/GCE。

2.根据权利要求1所述的基于不同结构适配体放大线性范围双比率生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述AQ分散液的浓度为0.5mg·mL^-1，rGO分散液的浓度为0.05mg·mL^-1；所述细胞粉碎机处理rGO分散液的时间为30min；所述AQ分散液与rGO分散液的体积比为3:10；所述磁力搅拌的时间为18h；所述离心的转速为8000rpm，时间为15min。

3.根据权利要求1所述的基于不同结构适配体放大线性范围双比率生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述AQ-rGO复合材料与超纯水的用量比为(0.02-00.5)mg:(2-3)mL。

4.根据权利要求1所述的基于不同结构适配体放大线性范围双比率生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述玻碳电极的直径d＝3mm；所用的三氧化二铝粉末的粒径依次为0.3μm、0.05μm。

5.根据权利要求1所述的基于不同结构适配体放大线性范围双比率生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述AQ-rGO复合材料修饰的用量为6μL。

6.根据权利要求1所述的基于不同结构适配体放大线性范围双比率生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述AuNPs修饰的用量为6μL。

7.根据权利要求1所述的基于不同结构适配体放大线性范围双比率生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述Fc-apt浓度为2.0-6.0μM，MB-HR浓度为2.0-6.0μM，Fc-apt与MB-HR按照1:1体积比混合，所述一定温度条件为4℃，反应时间为1h。

8.根据权利要求1所述的基于不同结构适配体放大线性范围双比率生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述Fc-apt-MB-HR修饰的用量为6μL，浓度为2.0μM；所述孵育固定的时间为12h，温度为4℃。

9.根据权利要求1-8任一项所述的双比率生物传感器用于检测黄曲霉毒素B1的用途，其特征在于，步骤如下：

(1)在上述制得的Fc-apt-MB-HR/AuNPs/AQ-rGO/GCE传感器表面依次修饰V1体积不同浓度的AFB1溶液；室温下孵育时后用Tris-HCl溶液对电极进行清洗，一个浓度的AFB1溶液对应修饰一个电化学生物传感器，浓度和电化学生物传感器呈一一对应关系；

(2)标准曲线的构建：以步骤(1)修饰后传感器为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，由型号为CHI750E的电化学工作站记录与检测电化学信号；在0.1M、pH＝7.0的PBS缓冲溶液中进行测试；扫描电压范围-0.8-0.8V，振幅为0.025V，频率为25Hz；每一个浓度的AFB1会对应一个电流值，根据电流值和AFB1浓度的对数构建得到标准曲线；

(3)样品中AFB1的检测：首先获取样品液，修饰V1体积的样品液于传感器表面，通过电化学测试得到相应的电流值；将电流值代入步骤(2)构建的标准曲线，即可获知样品中AFB1的浓度；实现未知样品中AFB1检测的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，步骤(1)中，所述AFB1溶液的浓度为0.01pg mL^-1-1000ng mL^-1；孵育时间为80min；步骤(1)和(3)中V1修饰的体积为6μL。

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