CN110530853B - 基于可视化bpe-ecl技术检测黄曲霉毒素b1的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了基于可视化BPE‑ECL技术检测黄曲霉毒素B1的方法，包括以下步骤：1）丝网印刷双极电极的制备；2）功能传感界面的构建；3）将未知浓度的AFB1和固定浓度的HRP‑AFB1混合后，与功能传感界面上的AFB1单克隆抗体作用；4）利用双极电极工作原理，检测信号采集界面上的电致化学发光信号。本发明利用BPE将化学反应的电化学信号转换成可灵敏检测的电致化学发光信号，解决了电化学无法区分法拉第电流和充电电流的困扰；利用BPE将功能传感界面与信号采集界面进行物理隔离，避免了光活性分子与复杂反应体系的直接接触，有效抑制了假阳性现象，拓展了分析检测的范围，简化了检测方法，本发明具有简便、敏感且特异性好的优点。

Description

基于可视化BPE-ECL技术检测黄曲霉毒素B1的方法

技术领域

本发明属于生物传感技术领域，涉及基于可视化BPE-ECL技术检测黄曲霉毒素B1的方法，具体涉及单克隆抗体功能化修饰到丝网印刷双极电极阴极端的金纳米粒子表面上，竞争法识别并结合AFB1或者HRP-AFB1，引起双极电极阴极端苯胺聚合的程度发生变化，在电致化学发光分析仪上观察到发光强度与发光电位的变化，从而定量检测农产品中的AFB1。

背景技术

真菌毒素是指曲霉菌属、镰刀菌属或青霉菌属生长繁殖过程中产生的有毒次级代谢产物，其种类繁多，现已被分离鉴定的有400余种，主要包括黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮/醇等，真菌毒素可通过污染谷物和那些来源于被真菌毒素污染了的饲料喂饲的动物性食物(如牛奶、肉和蛋)而进入食物链。真菌毒素对食品的污染不仅造成大量食品的浪费与严重的食物中毒，更由于其具有致癌、致畸、致突变等作用从而对人类的生存与健康构成巨大的威胁。由于许多真菌毒素具有很好的物理、化学与热稳定性，因此在食品加工过程中不易被清除。同时，产毒真菌可以在粮食与水果的生长、收获、储存、加工乃至运输的整个食物链阶段对食品造成污染，进而产生真菌毒素。因此真菌毒素的污染被认为是不可避免与不可预测的问题，并引起全球范围内的持续关注。

目前，我国食品中真菌毒素的检测方法主要包括，生物鉴定法，化学分析法，免疫分析法，仪器分析法。其中，生物鉴定法主要包括种子发芽试验和呕吐试验，但是这种方法不利于快速检测，且只能验证毒性部位和毒性机理，只能定性分析，已很少采用；化学分析法主要包括薄层色谱法，但这种方法操作过程较为复杂，样本预处理工作量大，检测过程中需要直接接触标准品，危险性高且精确度较差；免疫分析法主要包括ELISA 方法和胶体金免疫层析方法，但是这种方法的重现性差、无法准确定量、结果易出现假阳性、实验干扰因素多(温度、反应时间)；仪器分析法主要包括高效液相色谱法，这种方法的前处理复杂，实验仪器昂贵，无法对大量样品进行快速筛选。

双极电极(bipolar electrode，BPE)和外加电源之间无需导线相连，故检测装置的构建更简便。此外，BPE可以将反应体系与信号测量体系进行物理隔离，被分析物不需要参与阳极的电致化学发光(ECL)反应，避免了光活性分子与复杂反应体系的直接接触从而极大地拓宽了ECL的应用范围。同时，BPE还易于阵列化，利用电荷耦合元件(CCD)或者光电倍增管(PMT)捕获每一个传感界面上的ECL信号以实现高通量检测，可提高单次分析中所获得的信息量。BPE信号放大较传统三电极系统更佳，其阳极和阴极的分别修饰可实现高灵敏的ECL检测。BPE与ECL技术的完美结合有诸多以上优点，极适合成分比较复杂的农产品中真菌毒素的分析检测。

因此发展先进的真菌毒素高效快检方法，并实现检测仪器的小型化、集成化和多通道检测显得尤为重要。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了基于可视化BPE-ECL技术检测黄曲霉毒素B1的方法，本发明中在双极电极阴极端镀金后，利用竞争免疫方法，构建功能传感界面，利用样品中有无AFB1而引起电致化学发光分析仪上观察到发光强度与发光电位的变化，从而建立可视化BPE-ECL技术用于检测农产品中黄曲霉毒素B1的方法，它具有原理简单、实验周期短、所用原料成本较低，特异性高、快速灵敏等优点。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了基于可视化BPE-ECL技术检测黄曲霉毒素B1的方法，包括以下步骤：

1)丝网印刷双极电极的制备，所述双极电极包括阴极端和阳极端；

2)功能传感界面的构建：在步骤1)制备的丝网印刷双极电极的阴极端镀金后浸泡在巯基-聚乙二醇-羧基溶液里，室温密闭过夜；清洗后，将阴极浸泡在含有1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液中；清洗后，在阴极端加入AFB1单克隆抗体构建功能传感界面；

3)将已知浓度的AFB1标准品和固定浓度的HRP-AFB1混合后，与功能传感界面上的AFB1单克隆抗体作用，构建AFB1浓度与发光强度的标准曲线；

4)将未知浓度的AFB1待测样品和固定浓度的HRP-AFB1混合后，与功能传感界面上的AFB1单克隆抗体作用，组装在功能传感界面上的HRP催化苯胺原位聚合生成聚苯胺；

5)利用双极电极工作原理，检测丝网印刷双极电极阳极端的电致化学发光信号得到发光强度，利用已知AFB1浓度与发光强度的线性关系得出待测样品中AFB1的浓度。

其中，所述步骤1)的丝网印刷双极电极的制备步骤如下：首先选用聚对苯二甲酸乙二醇酯电惰性材料为基底，然后在基底的两端利用油墨印制两条工作电极引线得到基片；接着烘干基片，在两条工作电极引线中间印制碳电极并烘干，得到双极电极的阴极端和阳极端；再接着采用光固绝缘浆印制电极规范层并用紫外光固化；最后采用光固绝缘浆印制电极绝缘层并用紫外光固化。丝网印刷电极整体长约3cm，宽约1cm，双极电极导线长约12mm。

其中，所述步骤2)的功能传感界面的构建步骤具体如下：①在双极电极的阴极端加入含有氯金酸的PBS缓冲溶液，阳极端加入PBS缓冲溶液，通过电化学工作站给丝网印刷双极电极两端施扫描电压，随着氯金酸在双极电极的阴极端得电子，阴极端逐渐变黄，金纳米粒子沉积到阴极端，将制备好的双极电极用超纯水清洗干净，空气中干燥；②将上述双极电极的阴极端浸泡在巯基-聚乙二醇-羧基溶液里，室温密闭过夜；③PBS 清洗后，将阴极浸泡在含有1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液中2h；④PBS清洗后，在阴极端加入AFB1单克隆抗体，室温下避光孵育2h。

具体的，上述步骤3)功能传感界面的构建步骤如下：①在双极电极的阴极端加入20μL含有1％氯金酸的10×PBS缓冲溶液，阳极端加入20μL 10×PBS缓冲溶液。通过电化学工作站给丝网印刷双极电极两端施加一定的扫描电压(3.0V-6.0V)，随着氯金酸在双极电极的阴极端得电子，阴极端逐渐变黄，说明金纳米粒子(AuNPs)沉积到阴极端。将制备好的双极电极用超纯水清洗干净，空气中干燥。②将上述双极电极的阴极端浸泡在1mM的巯基-聚乙二醇-羧基(SH-PEG-COOH)溶液里，室温密闭过夜；③ PBS清洗后，将阴极端浸泡在含有1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)，N- 羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合溶液中2h(室温、密闭)；④PBS清洗后，在阴极端加入20μL 100ng mL^-1的AFB1单克隆抗体，室温下避光孵育2h。此时，功能传感界面 (双极电极阴极端)构建完成。

其中，所述步骤3)具体步骤如下：①将10μL未知浓度的AFB1和10μL、100ng mL^-1的HRP-AFB1混合液滴加在双极电极的阴极端，室温下避光孵育2h；②PBS清洗后，在阴极端加入20μL、0.1M醋酸/醋酸钠缓冲溶液(200mM苯胺、20mM过氧化氢，0.5μM DNA，pH 4.3)，室温下避光孵育2h。所述DNA为A59，具体是有59个碱基a的DNA，该DNA的作用是为苯胺聚合提供模板。

其中，所述步骤4)具体步骤为：在双极电极的阳极端加入共反应剂，利用双极电极工作原理，检测信号采集界面上(双极电极的阳极端)的电致化学发光信号：具体的，使用电致化学发光分析仪在丝网印刷双极电极两端施加一定的电压，检测信号传感界面的电致化学发光信号。

其中，所述共反应剂包括10mM Ru(bpy)₃(Cl)₂·6H₂O和50mM TPA。

本发明通过一种可视化BPE-ECL技术用于检测农产品中AFB1的方法，在双极电极阴极端镀金后，利用竞争免疫方法，构建功能传感界面，利用样品中有无AFB1而引起电致化学发光分析仪上观察到发光强度与发光电位的变化，从而建立可视化BPE-ECL 技术用于检测农产品中AFB1的方法。本发明先将黄曲霉毒素B1(100ng/mL)的抗体固定到双极电极的阴极端，然后用已知浓度的HRP标记的黄曲霉毒素B1去结合抗体，然后再加入浓度梯度的黄曲霉毒素B1与HRP-AFB1竞争，由于HRP会催化苯胺聚合，会引起发光电压和发光信号的变化，然后得到不同浓度AFB1与发光强度的关系，得到标准曲线，再利用待测样品中未知浓度的AFB1和已知固定浓度的HRP-AFB1混合后，与功能传感界面上的单克隆抗体竞争结合，组装在界面上的HRP催化苯胺原位聚合生成电化学活性物质聚苯胺，从而引起电化学体系中氧化还原电位，峰电流和ECL强度的变化，利用标准曲线得到待测样品中AFB1的浓度。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下的特色及优点：

(1)双极电极(bipolar electrode，BPE)和外加电源之间无需导线相连，故检测装置的构建更简便。

(2)BPE可以将反应体系与信号测量体系进行物理隔离，被分析物不需要参与阳极的电致化学发光(ECL)反应，避免了光活性分子与复杂反应体系的直接接触从而极大地拓宽了ECL的应用范围。

(3)BPE还易于阵列化，利用电荷耦合元件(CCD)或者光电倍增管(PMT)捕获每一个传感界面上的ECL信号以实现高通量检测，可提高单次分析中所获得的信息量。

(4)BPE信号放大较传统三电极系统更佳，其阳极和阴极的分别修饰可实现高灵敏的ECL检测。

附图说明

图1、显示了可视化BPE-ECL技术用于检测农产品中AFB1的方法的实验流程图；

图2、显示了丝网印刷双极电极制备的设计图(A)，成品图正面(B左)、成品图背面(B右)，裸电极的CV信号(C)，裸电极的ECL信号(D)；

图3、显示了功能传感界面构建中双极电极阴极镀金(A)，镀金0次(a)、2次(b)、 4次(c)、6次(d)的扫描电镜图(B)，镀金0次、2次、4次、6次的电致化学发光强度图(C)、 C中插图为双极电极镀金效果图；

图4、实验原理验证：清洗，无模板(A)、清洗，有模板(B)、不洗，无模板(C)、不洗，有模板(D)；

图5、对DNA浓度(A)、苯胺浓度(B)、双氧水浓度(C)、聚合反应时间(D) 的优化；

图6、标准曲线的建立；不同浓度AFB1对应的电压与电化学发光强度图(A)、浓度与电化学发光强度图(B)、浓度对数与电化学发光强度图(C)；

图7、该免疫传感器对AFB1的选择性和特异性。具体实施方式

下面通过具体的实施例和附图对本发明进一步说明，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。

本实验中用到的试剂和仪器：

黄曲霉毒素B1鼠单抗(mAb)，黄曲霉毒素B1-HRP(AFB1-HRP)，黄曲霉毒素 B1-BSA(AFB1-BSA)，氯金酸(HAuCl₄·3H₂O)，三联吡啶氯化钌六水合物 (Ru(bpy)₃(Cl)₂·6H₂O)，三正丙基胺(TPA)，DNA(A59，具体是有59个碱基a的DNA，该DNA的作用是为苯胺聚合提供模板。

苯胺，过氧化氢(30％)双氧水)，巯基-聚乙二醇-羧基(SH-PEG-COOH)，1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，电化学工作站(CHI750E)，透射电镜(JEM-2010，Hitachi，Japan)，混合涡旋仪(IKAGerman)，离心机(EppendorfGerman)，数码相机(Canon IXUS 115，Japan)，MPI-E电致化学发光分析仪(MPI-EAnalysis Client System)

实施例1

基于可视化BPE-ECL技术用于检测农产品中AFB1的方法，检测步骤是：

1、丝网印刷双极电极的制备：首先选用聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)廉价电惰性材料为基质，然后在基质的两端利用银油墨印制两条工作电极引线；接着烘干基片，在两条工作电极中间用碳糊浆料印制碳电极并烘干，得到双极电极的阳极和阴极；再接着采用光固绝缘浆(紫外光固化绝缘油墨等)印制电极规范层并用紫外光固化；最后采用光固绝缘浆印制电极绝缘层并用紫外光固化。丝网印刷电极整体长约3cm，宽约1cm，双极电极导线长约12mm。如2图所示，双极电极的正面图2(B)左、双极电极的背面图2(B)右。

原理验证步骤：分别取20μL 1×PBS加入到双极电极的阳极、阴极，将双极电极用连接器连接到电化学工作站上，利用循环伏安法对电极进行扫描，如图2(C)所示，说明在一定的电压作用下，在双极电极的表面产生了电流，说明所制备的双极电极有氧化还原回路；取20μL 1×PBS加入到双极电极的阴极端，在双极电极的阳极端加入20μL 共反应剂(10mMRu(bpy)₃(Cl)₂·6H₂0，50mM TPA)，将双极电极利用连接线连接到电致化学发光分析仪(ECL)上，如图2(D)所示，说明在一定的电压作用下，在双极电极的阳极产生了化学发光信号，这也说明了所制备的双极电极有氧化还原回路，可以被后续的实验所利用。

2、功能传感界面的构建步骤如下：①在双极电极的阴极端加入20μL含有1％氯金酸的10×PBS缓冲溶液，阳极端加入20uL10×PBS缓冲溶液。通过电化学工作站给丝网印刷双极电极两端施加一定的扫描电压(3.0V-6.0V)，随着氯金酸在双极电极的阴极端得电子，阴极端逐渐变黄，说明金纳米粒子(AuNPs)沉积到阴极端。将制备好的双极电极用超纯水清洗干净，空气中干燥。②将上述双极电极的阴极端浸泡在1mM的巯基-聚乙二醇-羧基(SH-PEG-COOH)溶液里，室温密闭过夜；③PBS清洗后，将阴极端浸泡在含有1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)，N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)的混合溶液中2h(室温、密闭)；④PBS清洗后，在阴极端加入20μL，100ng mL^-1的AFB1单克隆抗体--黄曲霉毒素B1鼠单抗(mAb)，室温下避光孵育2h。此时，功能传感界面(双极电极阴极端)构建完成。

原理验证步骤：①在阴极端加入20μL 10×PBS缓冲溶液，阳极端加入20μL 10×PBS 缓冲溶液，通过电化学工作站采用循环伏安法给丝网印刷电极施加一定的扫描电压(0V -6.0V)，扫描速度0.2V s^-1，扫描圈数为20圈，采样间隔为0.001V，对电极进行清洗；然后在闭合式BPE的阴极端沉积金纳米粒子，在阴极端加入20μL含有1％氯金酸的PBS 缓冲溶液，阳极端加入20μL 10×PBS缓冲溶液。通过电化学工作站给丝网印刷电极施加一定的恒电压(3.0V-6.0V)，随着氯金酸在双极电极的阴极端得电子，阴极端逐渐变黄，说明金纳米粒子(AuNPs)修饰到了阴极上。实验流程如图3(A)所示。将制备好的双极电极用超纯水清洗干净，空气中干燥。并对裸电极和镀金电极进行扫描电镜表征，对镀金次数进行优化，随着镀金次数的增多，金纳米粒子的密度越来越大，但是镀金次数大于4次会导致AU膜的不均匀，不利于金膜的稳定存在，会影响重复性也不利于后续的实验(图3B)。然后分别在镀金电极和裸双极电极阳极上进行ECL信号测量(图3C)。通过对镀金电极表面的表征和ECL信号的测量，发现镀金4次既能形成匀密的金膜又有较强的ECL强度，所以选择镀金4次来进行后续的实验。镀金后的双极电极(如图3插图)所示。

3、实验原理的验证及实验条件的优化

将AFB1的标准品(100ng/mlAFB1)和固定浓度的HRP-AFB1混合后，与功能传感界面上的单克隆抗体作用，组装在界面上的HRP催化苯胺原位聚合生成聚苯胺步骤如下：①将20μL(10μL 100ng/ml的AFB1和10μL、100ng mL^-1的HRP-AFB1)混合液滴加在双极电极的阴极端，室温下避光孵育2h。②PBS清洗后，在阴极端加入20μL、 0.1M醋酸/醋酸钠缓冲溶液(200mM苯胺、20mM过氧化氢，0.5μM DNA，pH 4.3)，室温下避光孵育2h。③不清洗，且在阳极加入20μL共反应剂(10mM Ru(bpy)₃(Cl)₂·6H₂O，50mM TPA)，将双极电极利用连接器连接到电致化学发光分析仪 (ECL)上测量。

原理验证步骤：对于上述100ng/ml的AFB1和固定浓度的HRP-AFB1混合后，与功能传感界面上的单克隆抗体作用，组装在界面上的HRP催化苯胺原位聚合生成聚苯胺，将苯胺聚合后的溶液是否进行清洗，以及是否有DNA模板将会对实验结果产生的影响(图4)。如图4A所示，若在苯胺聚合时不加入DNA，且聚合反应后用PBS清洗，实验组和空白组有0.03V的电位差，且只有100左右的ECL强度差别，无法将实验组与空白组区分开来；如图4B所示，若在苯胺聚合时加入DNA，但聚合反应后用PBS 清洗，实验组和空白组有0.18V的电位差，且只有1000左右的ECL强度差别，无法将实验组与空白组区分开来；如图4C所示，若在苯胺聚合时不加入DNA，但聚合反应后不清洗，实验组和空白组有0.23V的电位差，有3000左右的ECL强度差别，实验组与空白组区有一定的差别；如图4D所示，若在苯胺聚合时加入DNA，但聚合反应后不清洗，实验组和空白组有0.5V的电位差，有10000左右的ECL强度差别，可以将实验组与空白组区分开来；综上，我们在苯胺聚合过程中加入一定浓度的DNA，并且在聚合反应后不清洗，实验组和空白组有较大的电位和ECL强度的差别，可以将实验组与空白组有效的区分出来；接着，我们对DNA的浓度、苯胺的浓度、双氧水的浓度、聚合反应的时间分别进行了优化；如图5A所示，通过将不同浓度的DNA(0、0.1、0.5、1.0、 5.0、10μM)加入到醋酸钠缓冲溶液中，并对实验组和空白组的电位分别进行测量，以ΔE(空白组与实验组的电位差)来表示苯胺聚合的程度，发现在0.5μM时电位差最大，所以最优的DNA浓度是0.5μM；如图5B所示，通过将不同浓度的苯胺(50、100、150、 200、250mM)加入到醋酸钠缓冲溶液中，以空白组ECL的强度来表示苯胺聚合的程度，随着苯胺浓度的增加，ECL强度逐渐降低，当苯胺浓度达到200mM时，ECL强度不再变化，说明最优的苯胺浓度是200mM；如图5C所示，通过将不同浓度的双氧水(0、10、20、35、50mM)加入到醋酸钠缓冲溶液中，以空白组ECL的强度来表示苯胺聚合的程度，随着双氧水浓度的增加，ECL强度逐渐降低，当苯胺浓度超过20mM 时，ECL强度有一定的增加现象，说明最优的双氧水浓度是20mM；如图5D所示，通过不同时间的聚合反应(0、15、30、45、60、90、120、240、300min)，以空白组ECL 的强度来表示苯胺聚合的程度，随着聚合反应时间的增加，ECL强度逐渐降低，当聚合反应时间达到120min后，ECL强度不再变化，说明最优的聚合反应时间是120min；综上，最优的DNA浓度是0.5μM，最优的苯胺浓度是200mM，最优的双氧水浓度是 20mM，最优的聚合反应时间是120min。

实施例2标准曲线的建立--检出限与检测范围的确定

分别取10μL不同浓度(0、0.1、0.5、1、5、10、20、50、100ng mL^-1)的AFB1 标准品与10μL100ng mL^-1HRP-AFB1混合，与实施例1构建功能传感界面上的单克隆抗体作用，室温密闭孵育2h后，PBS清洗后，在阴极端加入20μL、0.1M醋酸/醋酸钠缓冲溶液(200mM苯胺、20mM过氧化氢，0.5μM DNA，pH 4.3)，室温下避光孵育2h。不清洗，且在阳极端加入20μL共反应剂(10mM Ru(bpy)₃(Cl)₂·6H₂O，50mM TPA)，将双极电极利用连接器连接到电致化学发光分析仪(ECL)上测量。实验结果如图6所示，当AFB1浓度在0.1-100ng mL^-1之间，电化学发光强度与AFB1的浓度呈现良好的线性关系，检出限为0.033ng mL^-1，检测范围为0.1-100ng mL^-1。

实施例3特异性检测

取7个EP管每管分别加入HRP-AFB1和不同真菌毒素的溶液，以配得终浓度为100ng mL^-1HRP-AFB1抗原和100ng mL^-1真菌毒素，7管分别为100ng mL^-1HRP-AFB1抗原和10ngmL^-1BSA-AFB1、100ng mL^-1HRP-AFB1抗原和10ng mL^-1黄曲霉毒素M1 (AFM1)、100ng mL^-1HRP-AFB1抗原和100ng mL^-1玉米赤霉烯酮(ZEN)、100ng mL^-1 HRP-AFB1抗原和100ng mL^-1赭曲霉毒素A(OTA)、100ng mL^-1HRP-AFB1抗原和100 ng mL^-1脱氧镰刀雪腐烯醇(DON)、100ng mL^-1HRP-AFB1抗原和100ng mL^-1展青毒素(Patulin)，分别取20μL加入到实施例1构建的功能传感界面(双极电极的阴极端)，进行竞争反应2h后，PBS清洗后，在阴极端加入20μL、0.1M醋酸/醋酸钠缓冲溶液 (200mM苯胺、20mM过氧化氢，0.5μM DNA，pH 4.3)，室温下避光孵育2h。不清洗，且在阳极加入20μL共反应剂(10mM Ru(bpy)₃(Cl)₂·6H₂O，50mM TPA)，将双极电极利用连接器连接到电致化学发光分析仪(ECL)上测量。实验结果如图7所示，该免疫传感器对AFB1有很好的特异性和选择性。

实施例4实际样品检测

按照中国国家食品安全标准(GB 2761-2017)酶联免疫吸附筛查法处理的实际样品 (米、小麦、玉米、高粱、大麦、荞麦)，首先分别称取至少100g样品，用研磨机进行粉碎，粉碎后的样品过1mm～2mm孔径试验筛。分别取5.0g样品于50mL离心管中， 25.0mL准确加入甲醇水(1∶1)，振摇15min，过滤，弃去1/4初滤液，收集试样滤液，此液为样品提取液，用PBS于样品提取液(1∶1)稀释即得待测样液。

在实施例1构建的功能传感界面上，滴加20μL上述处理的实际样品(米、小麦、玉米、高粱、大麦、荞麦)和100ng mL^-1HRP-AFB1混合溶液，进行竞争反应2h后， PBS清洗后，在阴极端加入20μL、0.1M醋酸/醋酸钠缓冲溶液(200mM苯胺、20mM 过氧化氢，0.5μM DNA，pH4.3)，室温下避光孵育2h。不清洗，且在阳极端加入20μL 共反应剂(10mM Ru(bpy)₃(Cl)₂·6H₂O，50mM TPA)，将双极电极利用连接器连接到电致化学发光分析仪(ECL)上测量。按照相同的前处理方法，利用ELISA和我们所制备的生物传感器的检测方法，我们分别对六种谷物进行添加回收试验，通过两种方法的对比，发现所设计的生物传感器有更高的回收率，说明所制备的传感器更加准确，更加可靠。

实验结果如表1所示。

表1生物传感器和ELISA试剂盒在谷物样品中回收率对比.

^a粗体斜体数据是食品中真菌毒素中每种谷物样品的限量值，中国国家食品安全标准(GB 2761-2017). ^b每个数据点五次独立测量。

Claims (7)

1.基于可视化BPE-ECL技术检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）丝网印刷双极电极的制备，所述丝网印刷双极电极包括阴极端和阳极端；2）功能传感界面的构建：在步骤1）制备的丝网印刷双极电极的阴极端镀金后浸泡在巯基-聚乙二醇-羧基溶液里，室温密闭过夜；清洗后，将阴极浸泡在含有1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液中；清洗后，在阴极端加入AFB1单克隆抗体构建功能传感界面；3）将已知浓度的AFB1标准品和固定浓度的HRP-AFB1混合后，与功能传感界面上的AFB1单克隆抗体作用，构建AFB1浓度与发光强度的标准曲线；4）将未知浓度的AFB1待测样品和固定浓度的HRP-AFB1混合后，与功能传感界面上的AFB1单克隆抗体作用，组装在功能传感界面上的HRP催化苯胺原位聚合生成聚苯胺；5）利用双极电极工作原理，检测丝网印刷双极电极阳极端的电致化学发光信号得到发光强度，利用已知AFB1浓度与发光强度的线性关系得出待测样品中AFB1的浓度。

2.根据权利要求1所述的基于可视化BPE-ECL技术检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，所述步骤1）的丝网印刷双极电极的制备步骤如下：首先选用聚对苯二甲酸乙二醇酯电惰性材料为基底，然后在基底的两端印制两条工作电极引线得到基片；接着烘干基片，在两条工作电极引线中间印制碳电极并烘干，得到双极电极的阴极端和阳极端；再接着印制电极规范层并固化；最后采用印制电极绝缘层并固化即得。

3.根据权利要求2所述的基于可视化BPE-ECL技术检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，所述步骤2）的功能传感界面的构建步骤具体如下：①在双极电极的阴极端加入含有氯金酸的PBS缓冲溶液，阳极端加入PBS缓冲溶液，通过电化学工作站给丝网印刷双极电极两端施扫描电压，随着氯金酸在双极电极的阴极端得电子，阴极端逐渐变黄，金纳米粒子沉积到阴极端，将制备好的双极电极用超纯水清洗干净，空气中干燥；②将上述双极电极的阴极端浸泡在巯基-聚乙二醇-羧基溶液里，室温密闭过夜；③PBS清洗后，将阴极浸泡在含有1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液；④PBS清洗后，在阴极端加入AFB1单克隆抗体，室温下避光孵育即得。

4.根据权利要求1所述的基于可视化BPE-ECL技术检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，所述步骤4）具体步骤如下：①将未知浓度的AFB1和100ngmL-1的HRP-AFB1混合液滴加在双极电极的阴极端，室温下避光孵育2h；②PBS清洗后，在阴极端加入醋酸/醋酸钠缓冲溶液室温下避光孵育2h。

5.根据权利要求4所述的基于可视化BPE-ECL技术检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，所述醋酸/醋酸钠缓冲溶液包括200mM苯胺、20mM过氧化氢，0.5μMDNA，pH4.3，所述DNA为A59，所述A59为59个碱基a的DNA。

6.根据权利要求1所述的基于可视化BPE-ECL技术检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，所述步骤5）具体步骤为：在双极电极的阳极端加入共反应剂，利用双极电极工作原理，检测电致化学发光信号。

7.根据权利要求6所述的基于可视化BPE-ECL技术检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，所述共反应剂包括10mMRu(bpy)3(Cl)2·6H2O和50mMTPA。

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