CN109085220A - 检测孔雀石绿的核酸适配体电化学生物传感器及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测孔雀石绿的适配体电化学生物传感器，利用电极表面修饰技术，在电极表面修饰纳米金，再通过化学作用将核酸适配体1接在纳米金上，通过适配体与目标物的特异性结合作用将目标物结合到电极表面，然后再接上生物素标记的的核酸适配体2，最后通过亲和素与生物素的结合作用接上有生物素标记的辣根过氧化物酶，构成三明治夹心结构的生物传感器，当检测的溶液中含有目标物时，就能在电极表面固定一定量的目标物和相应的核酸适配体2，构成传感结构。本发明提高了检测精度，降低了检测成本。

Description

检测孔雀石绿的核酸适配体电化学生物传感器及制备方法

技术领域

本发明涉及一种生物传感器，具体涉及一种检测孔雀石绿的核酸适配体电化学生物传感器及制备方法。

背景技术

孔雀石绿(MG)，一种杀菌性染料，因其对鱼体的水霉病以及鱼卵的水霉病有特效而被广泛用于商业水产养殖以及水产运输中。然而，孔雀石绿具有致癌、致畸的作用，通过食物链进入人体，对人体造成危害。因此，欧洲已给出检测限为不超过2mg kg-1。农业部也已禁用此类抗生素。

传统的孔雀石绿检测方法主要有：高效液相色谱法，酶联免疫法，紫外光谱分析法，微生物法、电化学检测法。电化学检测法由于检测精度高，分析能力强，检测速度快等优点，已经被广泛的应用于孔雀石绿检测中。专利200710070381.0利用适配体快速检测水产品中孔雀石绿的方法，利用特定序列的单链DNA为适配体，采用酶联显色法检测，但其酶联法易产生假阳性的问题没有解决。专利201410008020.3通过电化学适配体传感器来检测孔雀石绿的方法，采用特定序列RNA为识别元件，通过适配体和目标物结合的作用把目标物结合到电极表面，然后再结合上目标物的抗体，构成夹心结构，这种电化学方法避免了一定程度假阳性的问题，但是抗体制备时间长且制备困难，且RNA适配体价格昂贵、不稳定，且标记困难。专利201611175306.6检测孔雀石绿的适配体电化学生物传感器的方法，采用特定序列DNA为识别元件，通过适配体和目标物结合作用把目标物结合到电极表面，然后结合目标物的抗体，构成夹心结构，这种方法解决了RNA适配体标记困难，价格昂贵等缺点，但抗体制备时间长且特异性识别度不高，大大影响了检测精度和检测成本。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测孔雀石绿的核酸适配体电化学生物传感器及制备方法，解决了检测结果易出现假阳性的问题，提高了检测精度，降低了检测成本。

实现本发明目的的技术解决方案为：一种检测孔雀石绿的适配体电化学生物传感器，包括识别元件、丝网印刷电极和基板，所述识别元件包括2个单链DNA适配体，一个为在3’端修饰了-SH-(CH2)6-的适配体1，一个为在5’端修饰了生物素的适配体2。

作为一种具体实施方式，适配体1序列为3′-SH-(CH2)6-TGG AAG GAG GCG TTATGA GGG GGT CCA CG-5′，适配体2序列为5’-bio-GCA CCT TCC TCC GCA ATA CTC CCC CAGGTG C-3’。

作为一种具体实施方式，所述丝网印刷电极包括工作电极、辅助电极和参比电极。

作为一种更具体实施方式，所述工作电极、辅助电极材料为碳，参比电极材料为为Ag/AgCl。

作为一种具体实施方式，所述基板为PVC材料。

一种检测孔雀石绿的适配体电化学生物传感器的制备方法，包括如下步骤：

步骤1、丝网印刷电极预处理：将丝网印刷电极清洗干净后吹干；

步骤2、在工作电极表面修饰纳米金：将印刷电极浸置在1mg/mL的HAuCl4溶液中进行时间电流法扫描，扫描电压为-0.2V，扫描时间为100s，扫描结束后，工作电极表面形成纳米金结构，再将丝网印刷电极清洗干净后吹干；

步骤3、在工作表面固定适配体1：在工作电极表面滴加3ul的1uM的Apt1，在4℃下静置16h，待apt1完全固定在工作电极表面,再将丝网印刷电极清洗干净后吹干；

步骤4、工作电极上滴加目标检测物：在工作电极表面滴加3ul待测浓度的孔雀石绿，待孔雀石绿与适配体1特异性结合；

步骤5、在工作电极上固定适配体2：在工作电极上滴加3ul的1uM有生物素标记的适配体2，静置1h，等待Apt1,MG,bio-Apt2形成三明治夹心结构，再将丝网印刷电极清洗干净后吹干；

步骤6、在工作电极上固定亲和素标记的辣根过氧化物酶：在工作电极上滴加过量亲和素标记的辣根过氧化物酶，室温下静置20min，等待生物素与亲和素结合，再将丝网印刷电极清洗干净后吹干。

基于适配体电化学生物传感器的孔雀石绿检测方法，包括如下步骤：

步骤1、待测样本的循环伏安法扫描：将电化学检测仪三个接头分别与待测样本的适配体电化学生物传感器的丝网印刷电极的三个电极相连，将丝网印刷电极放入H₂O₂与TMB的混合溶液中，进行循环伏安法扫描，起始电位0V，最高电位0.7V，终止电位0V，扫描速度0.1V，扫描一周得到循环伏安曲线，与无样本循环伏安法扫描的循环伏安曲线对比定性分析检测物，若样本电流峰值提高，则判定有孔雀石绿进一步检测浓度；

步骤2、待测样本的时间电流法扫描：将待测样本的适配体电化学生物传感器的丝网印刷电极放入H₂O₂与TMB的混合溶液中，进行时间电流法扫描，扫描电位0.1V，扫描时间100s，得到时间电流曲线定量分析检测物浓度：

y＝2.736x+2.338

式种，y为待测样本的浓度的对数值，x为电流稳定后的安培信号量。

本发明与现有技术相比，其显著优点为：本发明制备的核酸适配体电化学生物传感器选择性强，灵敏度高，操作简单快速，适合水产品中孔雀石绿的检测。

附图说明

图1为本发明传感器的构建过程图。

图2为本发明无样本和1mg/L样本的循环伏安法扫描图。

图3为本发明不同浓度样本(1mg/L，100μg/L，10μg/L，1μg/L和0μg/L)时间电流法扫描图。

图4为本发明待检测安培电流量与样本浓度对数值曲线的标定图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明方案。

一种检测孔雀石绿的适配体电化学生物传感器，包括识别元件、丝网印刷电极和基板，所述识别元件包括2个单链DNA适配体，一个为在3’端修饰了-SH-(CH2)6-的适配体1，一个为在5’端修饰了生物素的适配体2。作为一种具体实施方式，适配体1序列为3′-SH-(CH2)6-TGG AAG GAG GCG TTA TGA GGG GGT CCA CG-5′，适配体2序列为5’-bio-GCA CCTTCC TCC GCA ATA CTC CCC CAG GTG C-3’。所述丝网印刷电极包括工作电极、辅助电极和参比电极，工作电极、辅助电极材料为碳，参比电极材料为为Ag/AgCl。所述基板为PVC材料。

如图1所示，制备上述检测孔雀石绿的适配体电化学生物传感器时，首先准备制备材料，包括丝网印刷电极，3’端修饰-SH-(CH2)6-的适配体1，序列为3′-SH-(CH2)6-TGG AAGGAG GCG TTA TGA GGG GGT CCA CG-5′，5’端修饰了生物素的适配体2，序列为5’-bio-GCACCT TCC TCC GCA ATA CTC CCC CAG GTG C-3’，HAuCl4溶液，亲和素标记的辣根过氧化物(Av-HRP)，0.1M的PBS缓冲液；然后按照下述步骤进行制备：

步骤1、丝网印刷电极预处理：将丝网印刷电极(SPE)用超纯水超声清洗1min，清洗干净后吹干。

步骤2、在工作电极表面修饰纳米金：将印刷电极浸置在1mg/mL的HAuCl4溶液中，使用商用电化学仪器进行时间电流法扫描，扫描电压为-0.2V，扫描时间为100s，扫描结束后，工作电极表面形成纳米金结构。

步骤3、清洗丝网印刷电极：将丝网印刷电极用超纯水清洗3次，去除附着溶液后吹干电极。

步骤4、在工作表面固定适配体1：在工作电极表面滴加3ul的1uM的Apt1，在4℃下静置16h，待Apt1完全固定在工作电极表面；

步骤5、清洗丝网印刷电极：将丝网印刷电极用超纯水清洗3次，去除特异性吸附后吹干电极。

步骤6、工作电极上滴加目标检测物：在工作电极表面滴加3ul待测浓度的孔雀石绿，待孔雀石绿与适配体1特异性结合；

步骤7、在工作电极上固定适配体2：在工作电极上滴加3ul的1uM有生物素标记的适配体2，静置1h，等待Apt1,MG,bio-Apt2形成三明治夹心结构。

步骤8、清洗丝网印刷电极：将丝网印刷电极用超纯水清洗3次，去除特异性吸附后吹干电极。

步骤9、在工作电极上固定亲和素标记的辣根过氧化物酶：在工作电极上滴加过量亲和素标记的辣根过氧化物酶，室温下静置20min，等待生物素与亲和素结合，再将丝网印刷电极清洗干净后吹干。

步骤10、清洗丝网印刷电极：将丝网印刷电极用超纯水清洗3次，去除特异性吸附后吹干电极。

该电化学生物传感器利用电极表面修饰技术，在电极表面修饰纳米金，再通过化学作用将核酸适配体1接在纳米金上，通过适配体与目标物的特异性结合作用将目标物结合到电极表面，然后再接上生物素标记的的核酸适配体2，最后通过亲和素与生物素的结合作用接上有生物素标记的辣根过氧化物酶，构成三明治夹心结构的生物传感器。当检测的溶液中含有目标物时，就能在电极表面固定一定量的目标物和相应的核酸适配体2，构成传感结构。由于适配体2上通过亲和素-生物素的结合修饰了辣根过氧化物酶(HRP)，能催化过氧化氢的分解，从而产生电化学信号的变化，利用电化学信号的变化即可实现对孔雀石绿(MG)的检测。

为了理解检测方案，分别进行不同浓度样本的循环伏安法扫描和时间电流法扫描。图2为对无样本循环伏安法扫描图(实线)和对1mg/L样本循环伏安法扫描图(虚线)，可以看出，当扫描电压约为0.25V时，发现1mg/L的样本电流峰值有显著提高，表明Av-HRP已经成功修饰在工作电极表面。因此可以将循环伏安法扫描的电流峰值作为定性判断的指标。

图3为不同浓度样本(1mg/L，100μg/L，10μg/L，1μg/L和0μg/L)时间电流法扫描曲线，将不同浓度的孔雀石绿置于PBS缓冲液中分别制备1mg/L，100μg/L，10μg/L，1μg/L和0μg/L的溶液，置于电化学检测仪中测试，进行安培法测量，分别读取电流稳定后100s的电流值，进行拟合，如图4所示，得到y＝2.736x+2.338(R2＝0.992)的回归方程，其中y为样本以μg/L为单位的浓度的对数值下的以μA为单位的安培信号量。从检测安培电流量与样本浓度对数值的关系曲线可以发现从1μg/L到1mg/L范围内，安培法测量信号与样本浓度的对数相关，跨越了一个至少3个数量级的响应区域。因此可以将此模型和时间电流法扫描稳定后的电流值作为定量分析的依据。

综上所述，基于适配体电化学生物传感器的孔雀石绿检测方法，包括如下步骤：

步骤1、待测样本的循环伏安法扫描：将电化学检测仪三个接头分别与待测样本的适配体电化学生物传感器的丝网印刷电极的三个电极相连，将丝网印刷电极放入H₂O₂与TMB的混合溶液中，进行循环伏安法扫描，起始电位0V，最高电位0.7V，终止电位0V，扫描速度0.1V，扫描一周得到循环伏安曲线，与无样本循环伏安法扫描的循环伏安曲线对比定性分析检测物，若样本电流峰值提高，则判定有孔雀石绿进一步检测浓度；

步骤2、待测样本的时间电流法扫描：将待测样本的适配体电化学生物传感器的丝网印刷电极放入H₂O₂与TMB的混合溶液中，进行时间电流法扫描，扫描电位0.1V，扫描时间100s，得到时间电流曲线定量分析检测物浓度：

y＝2.736x+2.338

式种，y为待测样本的浓度的对数值，x为电流稳定后的安培信号量。

Claims (7)

1.一种检测孔雀石绿的适配体电化学生物传感器，其特征在于，包括识别元件、丝网印刷电极和基板，所述识别元件包括2个单链DNA适配体，一个为在3’端修饰了-SH-(CH2)6-的适配体1，一个为在5’端修饰了生物素的适配体2。

2.根据权利要求1所述的检测孔雀石绿的适配体电化学生物传感器，其特征在于，适配体1序列为3′-SH-(CH2)6-TGG AAG GAG GCG TTA TGA GGG GGT CCA CG-5′，适配体2序列为5’-bio-GCA CCT TCC TCC GCA ATA CTC CCC CAG GTG C-3’。

3.根据权利要求1所述的检测孔雀石绿的适配体电化学生物传感器，其特征在于，所述丝网印刷电极包括工作电极、辅助电极和参比电极。

4.根据权利要求3所述的检测孔雀石绿的适配体电化学生物传感器，其特征在于，所述工作电极、辅助电极材料为碳，参比电极材料为为Ag/AgCl。

5.根据权利要求1所述的检测孔雀石绿的适配体电化学生物传感器，其特征在于，所述基板为PVC材料。

6.一种检测孔雀石绿的适配体电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1、丝网印刷电极预处理：将丝网印刷电极清洗干净后吹干；

步骤2、在工作电极表面修饰纳米金：将印刷电极浸置在1mg/mL的HAuCl4溶液中进行时间电流法扫描，扫描电压为-0.2V，扫描时间为100s，扫描结束后，工作电极表面形成纳米金结构，再将丝网印刷电极清洗干净后吹干；

步骤3、在工作表面固定适配体1：在工作电极表面滴加3ul的1uM的Apt1，在4℃下静置16h，待apt1完全固定在工作电极表面,再将丝网印刷电极清洗干净后吹干；

步骤4、工作电极上滴加目标检测物：在工作电极表面滴加3ul待测浓度的孔雀石绿，待孔雀石绿与适配体1特异性结合；

步骤5、在工作电极上固定适配体2：在工作电极上滴加3ul的1uM有生物素标记的适配体2，静置1h，等待Apt1,MG,bio-Apt2形成三明治夹心结构，再将丝网印刷电极清洗干净后吹干；

步骤6、在工作电极上固定亲和素标记的辣根过氧化物酶：在工作电极上滴加过量亲和素标记的辣根过氧化物酶，室温下静置20min，等待生物素与亲和素结合，再将丝网印刷电极清洗干净后吹干。

7.基于适配体电化学生物传感器的孔雀石绿检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1、待测样本的循环伏安法扫描：将电化学检测仪三个接头分别与待测样本的适配体电化学生物传感器的丝网印刷电极的三个电极相连，将丝网印刷电极放入H₂O₂与TMB的混合溶液中，进行循环伏安法扫描，起始电位0V，最高电位0.7V，终止电位0V，扫描速度0.1V，扫描一周得到循环伏安曲线，与无样本循环伏安法扫描的循环伏安曲线对比定性分析检测物，若样本电流峰值提高，则判定有孔雀石绿进一步检测浓度；

步骤2、待测样本的时间电流法扫描：将待测样本的适配体电化学生物传感器的丝网印刷电极放入H₂O₂与TMB的混合溶液中，进行时间电流法扫描，扫描电位0.1V，扫描时间100s，得到时间电流曲线定量分析检测物浓度：

y＝2.736x+2.338

式种，y为待测样本的浓度的对数值，x为电流稳定后的安培信号量。