CN108181371A - 简单快速检测食品中赭曲霉毒素a的电化传感分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种简单快速检测食品中赭曲霉毒素A的电化学传感分析方法，属于食品安全检测技术领域。上述简单快速检测食品中赭曲霉毒素A的电化学传感分析方法包括：步骤1：基底工作电极的抛光处理；步骤2：基于黑磷烯修饰电极的制备；步骤3：赭曲霉毒素A氧化还原峰值电流和浓度关系的标准曲线的建立；步骤4：实际样品中赭曲霉毒素A定量快速分析。本发明提供的简单快速检测食品中赭曲霉毒素A的电化学传感分析方法，制备简单，操作便捷，检测快速，重复性和重现性好，抗干扰能力强，可用于食品、水果、饮料等实际样品中赭曲霉毒素A定量快速检测。

Description

简单快速检测食品中赭曲霉毒素A的电化传感分析方法
技术领域
本发明涉及食品安全检测技术领域，特别涉及一种简单快速检测食品中赭曲霉毒素A的电化传感分析方法。
背景技术
赭曲霉毒素A(OTA)，N-[(3R)-(5-氯-8-羟基-3-甲基-1-氧代-7-苯并二氢异吡喃基)羰基]-L-苯丙氨酸，是一种由曲霉菌和青霉菌产生的二次代谢产物，常发现于粮食，坚果，葡萄，啤酒等食物中。赭曲霉毒素A主要侵害动物肝脏与肾脏，国际癌症研究机构(IARC)认定OTA是一种致癌剂，为确保消费者健康，建立一种简便、快速检测OTA的方法至关重要。
常用的OTA检测分析方法包括薄层色谱法(TLC)，高效液相色谱法(HPLC)，气相色谱法(GC)，气质联用法(GC–MS)，酶联免疫吸附测定法(ELISA)。薄层色谱法优点是操作简单，但存在检测周期长、灵敏度差等特点，不能满足现代检测要求。高效液相色谱、气相色谱法可以较好的定量，但是仪器设备昂贵、耗时长，而且不能用于现场快速检测。酶联免疫吸附法可以实现现场快速检测，但是这种基于抗原-抗体的检测方法容易受到环境特别是温度的制约而影响其检测稳定性，同时抗原，抗体等制备费时、成本高。此外，这些方法产生的有毒有机溶剂将带来难以避免的环境问题。电化学传感检测方法可有效解决上述问题。电化学传感器不仅灵敏度高，响应快而且分析时间短，操作简便。但是目前赭曲霉毒素A的电化学检测方法基本限于酶联免疫电化学传感方法，而基于酶联免疫电化学传感方法具有不稳定、使用寿命短等缺陷。本发明采用无机材料二维黑磷烯修饰电极并利用差分脉冲法快速检测实际样品中残留的赭曲霉毒素A目前尚未报道。
发明内容
本发明提供一种快速、简便、精确、灵敏、高选择性和高稳定性检测赭曲霉毒素A的电化学方法，克服现有赭曲霉毒素A检测成本高、费时和方案复杂等缺点。
为解决上述技术问题，本发明提供技术方案如下：
本发明提供一种简单快速检测食品中赭曲霉毒素A的电化学传感分析方法，包括：
步骤1：基底工作电极的抛光处理；
步骤2：基于黑磷烯(BP)修饰电极的制备；
步骤3：赭曲霉毒素A氧化还原峰值电流和浓度关系的标准曲线的建立；
步骤4：实际样品中赭曲霉毒素A定量快速检测。
进一步的，所述步骤1包括：
步骤11：电极打磨方法为先用0.05μm氧化铝抛光粉将基底工作电极打磨成镜面，再分别在蒸馏水中、无水乙醇中、蒸馏水中依次超声清洗5min，彻底去除吸附在基底工作电极表面上的氧化铝粉末，随后冷空气中吹干；
步骤12：将吹干的基底工作电极、参比电极、对电极三电极体系置于5ml含有电化学探针的溶液中，采用循环伏安法进行扫描判断是否符合标准，与标准谱对照两峰之间的电位差,在规定范围内即电极打磨合格。
进一步的，所述步骤2包括：BP分散液摇匀后，取出5mL的0.50mg/mLBP分散液再超声5min，形成均匀的分散液，用移液枪移取10μL该分散液滴涂于清洁的基底工作电极表面，并在红外灯下烘干，待水分蒸发，在工作电极表面形成一层均匀的BP膜。
进一步的，所述步骤3包括：
步骤31：在电解池中加入一定pH的不参与化学反应且导电的溶液作为电解质溶液；向电解质溶液中通入惰性气体，以防止电解质溶液中的干扰气体的干扰；
步骤32：将赭曲霉毒素A溶于一定体积的可溶解且不与赭曲霉毒素A作用的溶剂中，配成一定浓度的赭曲霉毒素标准母液备用；
步骤33：以修饰好的BP工作电极、参比电极和对电极，置于5mL经惰性气体处理的电解质溶液中，向电解质溶液中加入不同体积，一定浓度的赭曲霉毒素标准溶液，并搅拌均匀，静置后采用差分脉冲法测量，可获得不同浓度的赭曲霉毒素氧化峰电流，以浓度为横坐标，峰电流为纵坐标，建立赭曲霉毒素检测的标准工作曲线。
进一步的，所述基底工作电极为玻碳电极、石墨电极、金电极或铂电极等固体工作电极；
所述对电极为在检测电路中不发生氧化还原反应的不活泼金属中的一种；优选为铂。
所述参比电极通常为饱和甘汞电极或银/氯化银电极。
进一步的，所述电化学探针溶液为含有0.1mol/L KCl的5mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-溶液或含有0.1mol/L KCl的5mmol/L[Ru(NH3)6]2+/3+溶液。
进一步的，所述步骤31中，电解质溶液为磷酸盐缓冲溶液(PBS)或伯瑞坦-罗宾森缓冲溶液(B-R)；所述惰性气体为氮气、氦气或氖气。
进一步的，所述步骤32中，所述溶剂可以是甲醇、乙腈和乙醇中的一种或多种。
进一步的，该方法最低检测限为0.18μg/mL。
进一步的，所述步骤4包括：将已知赭曲霉毒素A浓度加入到含有未知赭曲霉毒素A浓度的实际样品中(包括直接使用含有未知赭曲霉毒素A浓度的实际样品作对照)，调节pH等实验参数条件为标准曲线建立条件，以修饰好的BP工作电极、参比电极和对电极，置于5mL经惰性气体处理的电解质溶液中，静置1min后，采用差分脉冲法平行测量3-6次，求得平均电流值，最后根据测得的峰电流值和标准曲线，减去已知赭曲霉毒素A浓度得到实际样品中得到未知赭曲霉毒素A浓度(包括直接测定得到未知赭曲霉毒素A浓度)。计算变异系数和回收率，并结合两种处理得到的未知赭曲霉毒素A浓度，评估方法的精确度和准确度。
本发明具有以下有益效果：
本发明的简单快速检测食品中赭曲霉毒素A的电化学传感分析方法，分析时间短、操作简单、成本低廉，使用本方法所制备的电化学传感器不仅可以有效的检测赭曲霉毒素A，而且本传感器稳定性好、抗干扰能力强、灵敏度高，最低检测限为0.18μg/mL。
附图说明
图1为本发明具体实施中BP修饰电极与未修饰的基底电极在含有50μg/ml的赭曲霉毒素A的缓冲溶液中的循环伏安曲线图和差分脉冲曲线图(插图)；
图2为为本发明具体实施中BP修饰电极在含有不同浓度的赭曲霉毒素A的缓冲溶液中的差分脉冲曲线图和标准曲线(插图)。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例及附图进行详细描述。
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体产品的情况做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
下述实施例中所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。
本发明提供一种简单快速检测食品中赭曲霉毒素A的电化学传感分析方法，具体实施例如下。
实施例1
本发明还提供一种简单快速检测食品中赭曲霉毒素A的电化学传感分析方法，包括：
步骤1：玻碳电极(GCE)的抛光处理，包括：
步骤11：电极打磨方法为先用0.05μm氧化铝抛光粉将玻碳电极打磨成镜面，再分别在蒸馏水中、无水乙醇中、蒸馏水中依次超声清洗5min，彻底去除吸附在GCE表面上的氧化铝粉末和其它污染物，随后冷空气中吹干；
步骤12：电极打磨判断为将吹干的GCE，饱和甘汞参比电极，铂对电极三电极体系置于5ml含有0.1mol/L KCl的5mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-溶液中，采用循环伏安法(CV)进行扫描判断是否符合标准，与理论标准谱对照两峰之间的电位差(△Ep＝59mV),在规定范围内(59mV到100mV之间)即电极打磨合格。
步骤2：基于黑磷烯(BP)修饰电极的制备
将0.50mg/mL的BP分散液置于超声清洗机中超声5min，形成均匀的悬浊液，用移液枪移取10μL该悬浊液滴涂于清洁的步骤(1)的GCE表面，并在红外灯下烘干，待水分蒸发，在玻碳电极表面形成一层均匀的BP膜。
步骤3：赭曲霉毒素A氧化还原峰值电流和浓度关系的标准曲线的建立，包括：
步骤31：先分别配置0.1mol/L的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠溶液，按照比例混合并加入氯化钠至0.9％(g/100ml)，得到磷酸缓冲溶液，优化后，选取pH 6.0为最佳pH备用；向电解质溶液中通入氮气，以防止电解质溶液中的干扰气体的干扰；
步骤32：将1mg赭曲霉毒素A溶于1ml的无水乙醇中，配成10-3g/ml的赭曲霉毒素标准母液备用；
步骤33：以步骤2修饰好的BP/GCE，饱和甘汞参比电极，铂对电极，置于5mL步骤31经惰性气体处理的0.1mol/L PBS(pH 6.0)溶液中，向电解质溶液中加入不同体积的步骤32制备的赭曲霉毒素标准母液，并搅拌均匀，采用DPV法对不同浓度的赭曲霉毒素A进行检测分析，该传感器可成功检测赭曲霉毒素A，在赭曲霉毒素A的浓度为0.3μg/ml-10μg/ml范围内，该电极对赭曲霉毒素A具有良好的线性关系(R2＝0.999)(见图2插图)，对含有不同浓度的赭曲霉毒素A的0.1mol/L PBS(pH 6.0)标准溶液中的差分脉冲曲线图见图2，由图2可知其检测限低至0.18μg/ml，完全符合国际上限量标准。
赭曲霉毒素A的电化学响应：在含有50μg/ml的赭曲霉毒素A的0.1mol/L PBS(pH6.0)溶液中，BP修饰电极对赭曲霉毒素A在0.928V处有一不可逆氧化峰，表明该修饰电极对赭曲霉毒素A具有良好的电催化氧化活性；且与空白电极相比，BP修饰电极对赭曲霉毒素A的电化学响应较为明显。
电化学传感器检测赭曲霉毒素A的抗干扰评估：制备的BP传感器具有很强的抗干扰能力，乙醇、酒石酸、柠檬酸、蔗糖、赖氨酸和金属离子K+、Mg2+及NO3 -、Cl-、CO3 2-对赭曲霉毒素A的电化学信号无明显影响，即检测无明显干扰。
电化学传感器检测赭曲霉毒素A的重复性评估：用同一根BP玻碳电极在最优的条件下对0.5μg/ml的赭曲霉毒素A溶液平行测定20次，测定峰值电流大小相对标准偏差(RSD)为1.6186％，说明该BP/GCE具有良好的重复性。
步骤4：实际样品中赭曲霉毒素A定量快速检测
将一定体积含有未知赭曲霉毒素A的啤酒溶液中加入磷酸盐缓冲溶液并调节pH为6，搅拌均匀，以BP/GCE为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极和铂为对电极浸没在待测溶液中静置1min后采用差分脉冲法测定并计算出未知浓度的赭曲霉毒素A溶液中赭曲霉毒素A的浓度。差分脉冲法条件为：电压扫描范围0.5到1.2V，电位增量为0.004V，振幅为0.05V，脉冲宽度为0.05s，采样宽度为0.0167s。多次重复试验的变异系数为2.71％。BP修饰电极电化学传感器具有高的精确度，可用于实际样品的检测分析。
实施例2：
本发明还提供一种简单快速检测食品中赭曲霉毒素A的电化学传感分析方法，包括：
步骤1：铂电极(Pt electrode)的抛光处理，同实施例1；
步骤2：基于BP修饰的电极制备，同实施例1；
步骤3：赭曲霉毒素A氧化还原峰值电流和浓度关系的标准工作曲线的建立，包括：
步骤31：先配置0.04mol/L的磷酸、硼酸和醋酸混合溶液，得到BR缓冲溶液，用0.2mol/L的氢氧化钠溶液调至不同pH，优化后，选取pH 6.0为最佳pH备用；向电解质溶液中通入氮气，以防止电解质溶液中的干扰气体的干扰；
步骤32：同实施例1；
步骤33：同实施例1；
赭曲霉毒素A的电化学响应：同实施例1；
电化学传感器检测赭曲霉毒素A的抗干扰评估：制备的BP传感器具有很强的抗干扰能力，蔗糖、果糖、抗坏血酸、柠檬酸、苹果酸和金属离子Na+、Zn2+及Cl-、CO3 2-对赭曲霉毒素A的电化学信号无明显影响，即检测无明显干扰。
电化学传感器检测赭曲霉毒素A的重复性评估：用6根不同的BP玻碳电极在最优的条件下对0.5μg/ml的赭曲霉毒素A溶液进行测定，测定峰值电流大小相对标准偏差(RSD)为3.372％，说明该BP铂电极具有良好的重现性。
步骤4：实际样品中赭曲霉毒素A定量快速检测
将已知一定浓度的赭曲霉毒素A加入到含有未知赭曲霉毒素A浓度的葡萄汁溶液中，并用BR缓冲溶液，调节pH至最佳为pH 6，以修饰好的BP/Pt electrode、参比电极和对电极，置于5mL经惰性气体处理的电解质溶液中，静置1min后，采用差分脉冲法平行测量3-6次，求得平均电流值，最后根据测得的峰电流值和标准曲线，减去已知赭曲霉毒素A浓度得到实际样品中得到未知赭曲霉毒素A浓度。差分脉冲法条件为：电压扫描范围0.5到1.2V，电位增量为0.004V,振幅为0.05V，脉冲宽度为0.05s，采样宽度为0.0167s。平均回收率在101.27％-103.30％。BP修饰电极电化学传感器具有高的精确度，可用于实际样品的检测分析。
综上，本发明提供的简单快速检测食品中赭曲霉毒素A的电化学传感分析方法，制备简单，操作简单，检测快速，重复性和重现性好，抗干扰能力强，可用于食品、水果、饮料等实际样品中赭曲霉毒素A定量快速检测。
所举的实验仅是本发明的较佳的实例，并不用于限定本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种简单快速检测食品中赭曲霉毒素A的电化学传感分析方法，其特征在于，包括：
步骤1：基底工作电极的抛光处理；
步骤2：基于黑磷烯修饰电极的制备；
步骤3：赭曲霉毒素A氧化还原峰电流和浓度关系的标准曲线的建立；
步骤4：实际样品中赭曲霉毒素A定量快速检测。
2.根据权利要求1所述的简单快速检测食品中赭曲霉毒素A的电化学传感分析方法，其特征在于，所述步骤1包括：
步骤11：电极打磨方法为先用0.05μm氧化铝抛光粉将基底工作电极打磨成镜面，再分别在蒸馏水中、无水乙醇中、蒸馏水中依次超声清洗5min，彻底去除吸附在基底工作电极表面上的氧化铝粉末和其它污染物，随后冷空气中吹干；
步骤12：将吹干的基底工作电极、参比电极、对电极三电极体系置于5ml含有电化学探针的溶液中，采用循环伏安法进行扫描判断是否符合标准，与标准谱对照两峰之间的电位差，在规定范围内即电极打磨合格。
3.根据权利要求1所述的简单快速检测食品中赭曲霉毒素A的电化学传感分析方法，其特征在于，所述步骤2包括：将黑磷晶体液相剥离形成黑磷纳米片，通过离心将黑磷纳米片分离出来，再将分离得到的黑磷纳米片溶于蒸馏水中，形成黑磷烯分散液，使用前取出部分黑磷烯分散液，超声备用，最后将黑磷烯分散液滴涂于清洁的基底工作电极表面，待水分蒸发，在工作电极表面形成一层均匀的黑磷烯膜。
4.根据权利要求3所述的简单快速检测食品中赭曲霉毒素A的电化学传感分析方法，其特征在于，所述液相剥离条件为：在无氧条件下，饱和的银离子的1-甲基-2吡咯烷酮溶液中，超声4h；
所述黑磷烯分散液浓度为0.50mg/mL，取出超声的体积为5mL，所述超声时间为5min；
用移液枪移取10μL黑磷烯分散液滴涂于清洁的基底工作电极表面，并在红外灯下烘干，待水分蒸发，在工作电极表面形成一层均匀的黑磷烯膜。
5.根据权利要求1所述的简单快速检测食品中赭曲霉毒素A的电化学传感分析方法，其特征在于，所述步骤3包括：
步骤31：在电解池中加入一定pH的不参与化学反应且导电的溶液作为电解质溶液；向电解质溶液中通入惰性气体，以防止电解质溶液中的干扰气体的干扰；
步骤32：将赭曲霉毒素A溶于一定体积的可溶解且不与赭曲霉毒素A作用的溶剂中，配成一定浓度的赭曲霉毒素A标准母液备用；
步骤33：以修饰好的黑磷烯工作电极、参比电极和对电极，置于5mL经惰性气体处理的电解质溶液中，向电解质溶液中加入不同体积，一定浓度的赭曲霉毒素标准溶液，并搅拌均匀，静置后采用差分脉冲法测量，可获得不同浓度的赭曲霉毒素氧化峰电流，以浓度为横坐标，峰电流为纵坐标，建立赭曲霉毒素检测的标准工作曲线。
6.根据权利要求2所述的简单快速检测食品中赭曲霉毒素A的电化学传感分析方法，其特征在于，所述电化学探针溶液为含有0.1mol/L KCl的5mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-溶液或含有0.1mol/L KCl的5mmol/L[Ru(NH3)6]2+/3+溶液。
7.根据权利要求5所述的简单快速检测食品中赭曲霉毒素A的电化学传感分析方法，其特征在于，所述基底工作电极通常为玻碳电极、石墨电极、金电极或铂电极；
所述对电极为在检测电路中不发生氧化还原反应的不活泼金属中的一种；
所述参比电极通常为饱和甘汞电极或银/氯化银电极。
8.根据权利要求5所述的简单快速检测食品中赭曲霉毒素A的电化学传感分析方法，其特征在于，所述步骤31中，电解质溶液为磷酸盐缓冲溶液或伯瑞坦-罗宾森缓冲溶液；所述惰性气体为氮气、氦气或氖气。
9.根据权利要求5所述的简单快速检测食品中赭曲霉毒素A的电化学传感分析方法，其特征在于，所述步骤32中，所述溶剂为甲醇、乙腈和乙醇中的一种或多种。
10.根据权利要求7所述的简单快速检测食品中赭曲霉毒素A的电化学传感分析方法，其特征在于，所述对电极为铂、金或钨。
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