CN115032252A - 一种检测赭曲霉毒素a的电化学传感分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测赭曲霉毒素A的电化学传感分析方法。本发明基于电活性材料的电化学检测法具有较好的稳定性，以电活性材料Au‑AgPd异质结构纳米材料中Pd2+的电化学还原峰作为检测信号。在光照条件下，基于等离子激元增强效应，电还原信号有明显增强的原理，设计了一种电化学传感器。本发明提供的方法能够通过电化学的方法检测出样品中赭曲霉毒素A的浓度含量，使得检测更为便捷和准确，具有灵敏度高，稳定性好等优点。

Description

一种检测赭曲霉毒素A的电化学传感分析方法
技术领域
本发明属于电分析技术领域，尤其是涉及一种检测赭曲霉毒素A的电化学传感分析方法。
背景技术
赭曲霉毒素由疣孢青霉菌和曲霉菌产生，它是最具毒性和危害性的污染物之一。在赭曲霉毒素中毒性最大，对农产品的污染较重的是赭曲霉毒素A(OTA)。赭曲霉毒素A(OTA)主要污染谷物、葡萄、干果、咖啡豆等，随食物进入人体中，对人类健康构成威胁。
传统检测赭曲霉毒素A(OTA)的方法主要是薄层色谱法，高效液相色谱法，毛细管电泳法，表面增强拉曼散射法，荧光光度计法以及电化学分析法等方法。但目前的检测方法均有一定的局限性，如操作较复杂，样品准备以及检测所需时间较长，需要昂贵的仪器，需专业人员操作等。然而电化学检测法具有操作简单，成本低，检测限低的优点。因此，构建新型基于电化学的赭曲霉毒素A(OTA)检测方法尤为重要。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种检测赭曲霉毒素A的电化学传感分析方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明的第一个目的在于提供一种检测赭曲霉毒素A的电化学传感分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将Au-AgPd janus NPs与赭曲霉毒素A的适配体OTA-Apt混匀孵育，获得Au-AgPd janus NPs/OTA-Apt溶液；
(2)将Au-AgPd janus NPs/OTA-Apt溶液与GO/Fe3O4NSs溶液孵育混合，获得Au-AgPd janus NPs+GO/Fe3O4 NSs组装体；
(3)将Au-AgPd janus NPs+GO/Fe3O4 NSs组装体与含有赭曲霉毒素A的溶液反应，检测反应后所得溶液的差分脉冲伏安信号，进行赭曲霉毒素A的定性或定量分析。
在本发明的一个实施例中，步骤(1)中，所述赭曲霉毒素A的适配体OTA-Apt序列为SH-(CH2)6-GAT-CGG-GTG-TGG-GTG-GCG-TAA-AGG-GAG-CAT-CGG-ACA。
在本发明的一个实施例中，步骤(1)中，所述Au-AgPdjanus NPs的制备方法如下：
S1：将HAuCl4·4H2O水溶液中加入柠檬酸钠，反应后固液分离取固相，即得Au NPs；
S2：向S1中所得Au NPs中加入2-巯基苯并咪唑-5-羧酸，50-70℃下混合孵育，加入对苯二酚和硝酸银混合反应，获得Au-Ag Janus NPs；
S3：将Au-Ag Janus NPs溶于1-3％(w/v)PVP水溶液中，在0-5℃下加入Na2PdCl4进行反应，再加入20-30％(w/v)PVP水溶液结束反应，离心分离Au-AgPd Janus NPs并重新分散在水中；其中第一加入PVP水溶液的作用是作为保护剂，第二次加入PVP水溶液的作用是结束反应，进而控制Au-AgPd Janus NPs的形貌。
在本发明的一个实施例中，步骤S2中，所述硝酸银、对苯二酚和AuNPs的摩尔比为1.0-2.0：4.8-5.0：1.0-1.2。
在本发明的一个实施例中，步骤S3中，所述Au-Ag Janus NPs与Na2PdCl4的摩尔比为1.0:0.6-1.0:0.8。
在本发明的一个实施例中，步骤(1)中，所述Au-AgPd janus NPs与OTA-Apt的摩尔比为1:5-1:15。
在本发明的一个实施例中，步骤(2)中，所述Au-AgPdjanus NPs/OTA-Apt与GO/Fe3O4NSs的摩尔比为1:1-3:1。
在本发明的一个实施例中，步骤(2)中，所述GO/Fe3O4NSs通过以下方法制备得到：将乙酰丙酮铁加入到18-20mL 1％(w/v)氧化石墨烯溶液中，混合均匀，加入乙酸胺继续反应后，在180-200℃下反应；冷却后，借助磁性分别使用乙醇与水对GO/Fe3O4 NSs进行洗涤。
在本发明的一个实施例中，所述乙酰丙酮铁与氧化石墨烯的摩尔比为1:8-1:10。
在本发明的一个实施例中，步骤(3)中，所述定量分析的标准曲线的制备方法如下：
采用三电极系统，以磁性玻碳电极为工作电极，以Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝作为对电极；将Au-AgPd janus NPs+GO/Fe3O4 NSs组装体溶液与不同浓度的赭曲霉毒素A溶液反应后，通过磁性分离组装体材料，将组装体溶液修饰在工作电极表面，光照条件下检测差分脉冲伏安(DPV)信号；取赭曲霉毒素A的浓度的对数值为横坐标，以差分脉冲伏安信号强度为纵坐标，得到所述标准曲线。
在本发明的一个实施例中，所述赭曲霉毒素A溶液的浓度范围为2pM-500nM。
本发明提供的一种基于Au-AgPd纳米材料的赭曲霉毒素电化学检测的原理为：以电活性Au-AgPd异质结构纳米粒子为电化学标签，当目标物赭曲霉毒素A存在时，由于OTA适配体与赭曲霉毒素A间特有的亲和力，导致电活性材料Au-AgPd Janus NPs从基底材料GO/Fe3O4NSs上脱落进而引发电化学信号的减弱，从而实现了对赭曲霉毒素A的精准检测。
本发明的技术方案具有以下优点：
(1)本发明基于电活性材料的电化学检测法具有较好的稳定性，以电活性材料Au-AgPd异质结构纳米材料中Pd2+的电化学还原峰作为检测信号。在光照下，基于等离子激元增强效应，电还原信号有明显增强的原理，设计了一种电化学传感器，可用于检测赭曲霉毒素A。
(2)Au-AgPd Janus NPs作为电活性信标具有稳定的还原峰，同时在光照条件下Au与Ag产生的光电子转移至Pd上，进一步促进了Pd的还原，增强了还原峰的强度，电化学信号的进一步增强可以提高检测的灵敏度与准确性。
(3)本发明提供的方法能够通过电化学的方法检测出样品中赭曲霉毒素A的浓度含量，使得检测更为便捷和准确。基于等离子激元增强效应，电化学传感器的灵敏度有了进一步提升。建立了DPV信号与赭曲霉毒素A浓度之间的线性关系，提高了检测的准确性。本发明提供的电化学检测方法适用于检测赭曲霉毒素A的浓度，具有非常广阔的应用前景。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1是本发明实施例2中制备得到的Au-Ag Janus NPs的TEM图；
图2是本发明实施例2中制备得到的Au-AgPd Janus NPs的TEM图；
图3是本发明实施例2中制备得到的Au-AgPd Janus NPs在有无光照下的DPV曲线；
图4是本发明实施例2中存在不同浓度的OTA时，电化学传感器的DPV曲线及标准曲线；
图5是本发明特异性实验中在1nM的OTA，BPA，FB1，AFB1，MC-LR和BSA存在下，在-0.4V处的DPV电流强度，blank表示未添加任何干扰物质。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1
(1)制备Au-AgPd Janus NPs：
利用柠檬酸钠还原法合成AuNPs：将0.8mL 1％(w/v)的HAuCl4·4H2O加入98mL超纯水中，沸腾状态下迅速加入柠檬酸钠，反应15min后离心处理，将溶液重新分散在水中，即可获得AuNPs。
将3mL的Au NPs溶于36mL超纯水中，加入700μL 2-巯基苯并咪唑-5-羧酸，60℃孵育2h后，加入2mL 10mM对苯二酚和3.2mL 1mM硝酸银，静置2h。离心处理重新分散在水中，获得Au-Ag Janus NPs。
将3mL合成的Au-Ag Janus NPs溶于3mL 1％(w/v)PVP水溶液中，在冰水浴的条件下加入400μL 10mM Na2PdCl4，反应20min后加入600μL 20％(w/v)PVP溶液，继续反应10min。通过离心分离获得Au-AgPd Janus NPs，并使用超纯水洗涤三次后重新分散在2mL超纯水中。
(2)制备GO/Fe3O4NSs
将0.12-0.14g的乙酰丙酮铁加入到18-20mL 1％(w/v)氧化石墨烯溶液中，超声30min确保混合均匀。在剧烈搅拌下向混合溶液中迅速加入0.6-0.8g乙酸胺，并持续搅拌20-30min。将混合溶液转移至高压反应釜中，在180-200℃的烘箱中反应20-24h。自然冷却后，借助磁性分别使用乙醇与水对GO/Fe3O4NS进行洗涤。
(3)建立赭曲霉毒素A的电化学传感器
将电活性的Au-AgPd Janus NPs溶液与赭曲霉毒素A的适配体OTA-Apt，序列为SH-(CH2)6-GAT-CGG-GTG-TGG-GTG-GCG-TAA-AGG-GAG-CAT-CGG-ACA)在含有0.05M NaCl的1×TBE溶液中混合，摩尔比为1:5。室温下孵育10h后即获得Au-AgPd janus NPs/OTA-Apt溶液。
赭曲霉毒素A的适配体OTA-Apt序列：
SH-(CH2)6-GAT-CGG-GTG-TGG-GTG-GCG-TAA-AGG-GAG-CAT-CGG-ACA
将Au-AgPd janus NPs/OTA-Apt溶液与GO/Fe3O4NSs溶液(摩尔比为1:1)在20℃下孵育2h混合获得Au-AgPd janus NPs+GO/Fe3O4 NSs组装体。
(4)建立检测赭曲霉毒素A的标准曲线
采用三电极系统，以磁性玻碳电极为工作电极，以Ag/AgCl(KCl sat.)电极作为参比电极，铂丝作为对电极。用氧化铝抛光粉对直径为4mm的磁性玻碳电极进行打磨，打磨干净后分别使用乙醇和水对电极进行清洗，使用氮气吹干电极。将组装体溶液分别与0、2pM、10pM、50pM、100pM、500pM、1nM、10nM、100nM、500nM的赭曲霉毒素A溶液反应后，通过磁性分离组装体材料，将8μL组装体溶液修饰在工作电极表面。在光照条件下，采用三电极系统，以磁性玻碳电极为工作电极，以Ag/AgCl(KCl sat.)电极作为参比电极，铂丝作为对电极，测试差分脉冲伏安(DPV)信号。最后，以OTA浓度的对数值为横坐标，DPV信号强度为纵坐标，绘制得到赭曲霉毒素A的检测标准曲线。
实施例2
(1)制备Au-AgPd Janus NPs
利用柠檬酸钠还原法合成AuNPs：将0.9mL 1％(w/v)的HAuCl4·4H2O加入到99mL超纯水中，沸腾状态下迅速加入柠檬酸钠。反应20min后离心处理，将溶液重新分散在水中，即可获得Au NPs。
将4mL的Au NPs溶于36mL超纯水中，加入800μL 1mM 2-巯基苯并咪唑-5-羧酸，60℃孵育2.5h后，加入2.4mL 10mM对苯二酚和4.8mL 1mM硝酸银，静置2.5h。离心处理重新分散在水中，获得Au-Ag Janus NPs。所述的Au-Ag Janus NPs的TEM图如图1所示。由图1的结果显示Au-Ag janus NPs表现出独特的Au NPs与Ag NPs的相连接异质结构，而不是Au表面包裹Ag的核壳结构。
将3.5mL合成的Au-Ag Janus NPs溶于4mL 1％(w/v)PVP水溶液中，在冰水浴的条件下加入600μL 10mM Na2PdCl4，反应20min后加入700μL 20％(w/v)PVP溶液，继续反应15min。通过离心分离获得Au-AgPd Janus NPs并使用超纯水洗涤三次后重新分散在2.5mL超纯水中。所述的Au-AgPd Janus NPs的表征如图2所示。由图2的结果显示Au-AgPd janusNPs的TEM图像中衬度较深的为Au元素，而Ag岛由原先的均匀形貌的Ag NPs转变为凹凸不平的AgPd NPs，说明了Au-AgPd janus NPs的成功制备。
(2)制备GO/Fe3O4NSs
将0.12-0.14g的乙酰丙酮铁加入到18-20mL 1％(w/v)氧化石墨烯溶液中，超声30min确保混合均匀。在剧烈搅拌下向混合溶液中迅速加入0.6-0.8g乙酸胺，并持续搅拌20-30min。将混合溶液转移至高压反应釜中，在180-200℃的烘箱中反应20-24h。自然冷却后，借助磁性分别使用乙醇与水对GO/Fe3O4NS进行洗涤。
(3)建立赭曲霉毒素A的电化学传感器
将电活性的Au-AgPd Janus NPs溶液与赭曲霉毒素A的适配体(OTA-Apt)在含有0.05M NaCl的1×TBE溶液中混合，摩尔比为1:10。室温下孵育11h后即可获得Au-AgPdjanus NPs/OTA-Apt溶液。
赭曲霉毒素A的适配体OTA-Apt序列：
SH-(CH2)6-GAT-CGG-GTG-TGG-GTG-GCG-TAA-AGG-GAG-CAT-CGG-ACA
将Au-AgPd janus NPs/OTA-Apt溶液与GO/Fe3O4NSs溶液(摩尔比为2:1)在25℃下孵育2.5h混合获得Au-AgPd janus NPs+GO/Fe3O4 NSs的组装体。
(4)建立检测赭曲霉毒素A的标准曲线
采用三电极系统，以磁性玻碳电极为工作电极，以Ag/AgCl(KCl sat.)电极作为参比电极，铂丝作为对电极。用氧化铝抛光粉对直径为4mm的磁性玻碳电极进行打磨，打磨干净后分别使用乙醇和水对电极进行清洗。使用氮气吹干电极。将组装体溶液分别与0、2pM、10pM、50pM、100pM、500pM、1nM、10nM、100nM、500nM的赭曲霉毒素A溶液反应后，通过磁性分离组装体材料，将9μL组装体溶液修饰在电极表面。分别在有光照和无光照的条件下检测差分脉冲伏安(DPV)信号。所述Au-AgPd Janus NPs在有无光照下的DPV曲线如图3所示，由图3的结果显示光照下Au-AgPd Janus NPs具有更强的DPV信号。伴随着OTA浓度的增加(2pM-500nM)，在-0.4V处的电流强度逐渐减弱。最后，以OTA浓度的对数值为横坐标，DPV信号强度为纵坐标，绘制得到赭曲霉毒素A的检测标准曲线，线性方程为Ip＝71.36-10.12lgCOTA/pM。
实施例3
(1)制备Au-AgPd Janus NPs：
利用柠檬酸钠还原法合成AuNPs：将1mL 1％(w/v)的HAuCl4·4H2O加入到100mL超纯水中，沸腾状态下迅速加入柠檬酸钠。反应30min后离心处理将溶液重新分散在水中，即可获得Au NPs。
将5mL的Au NPs溶于36mL超纯水中，加入900μL 1mM 2-巯基苯并咪唑-5-羧酸，60℃孵育3h后，加入2.8mL 10mM对苯二酚和6.4mL 1mM硝酸银，静置3h。离心处理重新分散在水中，获得Au-Ag Janus NPs。
将4mL合成的Au-Ag Janus NPs溶于5mL 1％(w/v)PVP水溶液中，在冰水浴的条件下加入800μL 10mM Na2PdCl4，反应20min后加入800μL 20％(w/v)PVP溶液，继续反应20min。通过离心分离获得Au-AgPd Janus NPs并使用超纯水洗涤三次后重新分散在3mL超纯水中。
(2)制备GO/Fe3O4NSs
将0.12-0.14g的乙酰丙酮铁加入到18-20mL 1％(w/v)氧化石墨烯溶液中，超声30min确保混合均匀。在剧烈搅拌下向混合溶液中迅速加入0.6-0.8g乙酸胺，并持续搅拌20-30min。将混合溶液转移至高压反应釜中，在180-200℃的烘箱中反应20-24h。自然冷却后，借助磁性分别使用乙醇与水对GO/Fe3O4NS进行洗涤。
(3)建立赭曲霉毒素A的电化学传感器
将电活性的Au-AgPd Janus NPs溶液与赭曲霉毒素A的适配体(OTA-Apt)在含有0.05M NaCl的1×TBE溶液混合，摩尔比为1:15。室温下孵育12h后即可获得Au-AgPd janusNPs/OTA-Apt溶液。
将Au-AgPd janus NPs/OTA-Apt溶液与GO/Fe3O4NSs溶液(摩尔比为3:1)在30℃下孵育3h混合获得Au-AgPd janus NPs+GO/Fe3O4 NSs的组装体。
(4)建立检测赭曲霉毒素A的标准曲线
采用三电极系统，以磁性玻碳电极为工作电极，以Ag/AgCl(KCl sat.)电极作为参比电极，铂丝作为对电极。用氧化铝抛光粉对直径为4mm的磁性玻碳电极进行打磨，打磨干净后分别使用乙醇和水对电极进行清洗。使用氮气吹干电极。将组装体溶液分别与0、2pM、10pM、50pM、100pM、500pM、1nM、10nM、100nM、500nM的赭曲霉毒素A溶液反应后，通过磁性分离组装体材料，将10μL组装体溶液修饰在电极表面。在光照条件下，采用三电极系统，以磁性玻碳电极为工作电极，以Ag/AgCl(KCl sat.)电极作为参比电极，铂丝作为对电极，测试差分脉冲伏安(DPV)信号。最后，以OTA浓度的对数值为横坐标，DPV信号强度为纵坐标，绘制得到赭曲霉毒素A的检测标准曲线。
特异性试验
利用(实施例2的标准曲线)对赭曲霉毒素A的特异性进行检测
将1nM的OTA，BPA，FBI，AFB1，MC-LR和BSA加入到反应体系孵育后，测试材料的差分脉冲伏安(DPV)信号。本发明检测方法的特异性如图5所示，由图5的结果显示可以看出，由于OTA适配体与OTA之间具有特有的亲和力，其他危害物质对DPV信号几乎没有影响。因此，本发明所开发的电化学传感器具有优异的抗干扰能力。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种检测赭曲霉毒素A的电化学传感分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将Au-AgPdjanus NPs与赭曲霉毒素A的适配体OTA-Apt混匀孵育，获得Au-AgPdjanus NPs/OTA-Apt溶液；
(2)将Au-AgPdjanus NPs/OTA-Apt溶液与GO/Fe3O4NSs溶液孵育混合，获得Au-AgPdjanus NPs+GO/Fe3O4 NSs组装体；
(3)将Au-AgPdjanus NPs+GO/Fe3O4 NSs组装体与含有赭曲霉毒素A的溶液反应，检测反应后所得溶液的差分脉冲伏安信号，进行赭曲霉毒素A的定性或定量分析。
2.根据权利要求1所述的电化学传感分析方法，其特征在于，步骤(1)中，所述赭曲霉毒素A的适配体OTA-Apt序列为SH-(CH2)6-GAT-CGG-GTG-TGG-GTG-GCG-TAA-AGG-GAG-CAT-CGG-ACA。
3.根据权利要求1所述的电化学传感分析方法，其特征在于，步骤(1)中，所述Au-AgPdjanus NPs的制备方法如下：
S1：将HAuCl4·4H2O水溶液中加入柠檬酸钠，反应后固液分离取固相，即得AuNPs；
S2：向S1中所得AuNPs中加入2-巯基苯并咪唑-5-羧酸，50-70℃下混合孵育，加入对苯二酚和硝酸银混合反应，获得Au-Ag Janus NPs；
S3：将Au-Ag Janus NPs溶于1-3％(w/v)PVP水溶液中，在0-5℃下加入Na2PdCl4进行反应，再加入20-30％(w/v)PVP水溶液结束反应，离心分离Au-AgPd Janus NPs并重新分散在水中。
4.根据权利要求3所述的电化学传感分析方法，其特征在于，步骤S2中，所述硝酸银、对苯二酚和AuNPs的摩尔比为1.0-2.0：4.8-5.0：1.0-1.2。
5.根据权利要求3所述的电化学传感分析方法，其特征在于，步骤S3中，所述Au-AgJanus NPs与Na2PdCl4的摩尔比为1.0:0.6-1.0:0.8。
6.根据权利要求1所述的电化学传感分析方法，其特征在于，步骤(1)中，所述Au-AgPdjanus NPs与OTA-Apt的摩尔比为1:5-1:15。
7.根据权利要求1所述的电化学传感分析方法，其特征在于，步骤(2)中，所述Au-AgPdjanus NPs/OTA-Apt与GO/Fe3O4NSs的摩尔比为1:1-3:1。
8.根据权利要求1所述的电化学传感分析方法，其特征在于，步骤(2)中，所述GO/Fe3O4NSs通过以下方法制备得到：将乙酰丙酮铁加入到氧化石墨烯溶液中，混合均匀，加入乙酸胺继续反应后，在180-200℃下反应，得到所述GO/Fe3O4NSs。
9.根据权利要求1所述的电化学传感分析方法，其特征在于，步骤(3)中，所述定量分析的标准曲线的制备方法如下：
将Au-AgPdjanus NPs+GO/Fe3O4 NSs组装体溶液与不同浓度的赭曲霉毒素A溶液反应后，通过磁性分离组装体材料，将组装体溶液修饰在工作电极表面，光照条件下检测差分脉冲伏安信号；取赭曲霉毒素A的浓度的对数值为横坐标，以差分脉冲伏安信号强度为纵坐标，得到所述标准曲线。
10.根据权利要求1所述的电化学传感分析方法，其特征在于，所述赭曲霉毒素A溶液的浓度范围为2pM-500nM。
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