CN109696462A - 一种用于粮食或饲料中玉米赤霉烯酮检测的电化学传感器制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及霉菌毒素玉米赤霉烯酮检测的电化学传感器的制备方法及应用，属于电化学检测技术领域。其特征在于：首先合成得到Cu@L‑Glu纳米材料，然后将钯铂双金属纳米粒子固载在Cu@L‑Glu纳米材料上，再使信号探针与该复合材料混合，制得生物信号探针；然后通过Au‑PANI‑Au用于玉米赤霉烯酮适配体AP的固载，从而制备了玉米赤霉烯酮检测的电化学传感器，该传感器具有用于食品和饲料中玉米赤霉烯酮检测的潜力。本发明的优点在于灵敏度高，特异性强，检测迅速，方便。本发明为玉米赤霉烯酮污染检测技术的研发提供实验依据，为食品和饲料中玉米赤霉烯酮污染的监测提供新思路和新技术平台。

Description

一种用于粮食或饲料中玉米赤霉烯酮检测的电化学传感器制 备方法

技术领域：

本发明涉及一种定量检测粮食中玉米赤霉烯酮的电化学传感器的制备方法及应用，尤其是基于铜有机配位聚合物及双金属钯铂纳米复合材料作为信号探针制备的生物传感器，并利用核酸适配体对玉米赤霉烯酮的特异性识别功能用于检测玉米赤霉烯酮，属于电化学检测领域。

背景技术：

食源性危害导致的疾病无论是在发达国家还是发展中国家都是危害公众健康的重要因素，而食品污染对居民健康的危害已经引起各国政府和国际社会的广泛关注。玉米赤霉烯酮主要是由禾谷镰刀菌产生的一种霉菌毒素，是污染粮食范围最广的镰刀菌毒素之一，在谷物和农副产品中都可以检测到玉米赤霉烯酮的存在。玉米赤霉烯酮可通过食物链在人或动物体内富集，已经被联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WTO)确定为最危险的自然发生的食品污染物之一，它不仅可直接污染谷类等粮食，直接被摄入人或动物体内，还可通过被饲料污染的肉、奶等动物性食品进入人体，危害人的健康。

有研究证实玉米赤霉烯酮具有雌激素样活性和遗传毒性，会引起儿童的性早熟等体征，对人体的免疫系统、内分泌系统以及生殖系统等多个功能系统造成严重损伤，甚至诱发癌变。同时，由于禾谷镰刀菌本身具有分布广、繁殖快、耐热、代谢产物多、残留时间长、难处理等特点，《食品安全国家标准食品中真菌毒素的限量》规定谷物及其制品中玉米赤霉烯酮的最高限量水平为60μg/kg，另外《饲料卫生标准饲料中赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的允许量》规定饲料中玉米赤霉烯酮的限量水平为500μg/kg。这些法律法规表明即使微量的玉米赤霉烯酮也将危害到居民及动物的健康，甚至影响到经济的发展。因此研究快速灵敏的检测新技术，对于提高食品中玉米赤霉烯酮的痕量检测以及建立食品中监督管理预警系统具有重要意义。

目前用于霉菌毒素检测的常规分析方法包括薄层色谱法、高效液相色谱法和酶联免疫测定。尽管这些方法在食品或饲料样品中能准确检测真菌毒素，但需要熟练的操作人员，繁复的样品预处理和昂贵的设备，并且在痕量分析时难以确保准确性。同时食品和或饲料的常规检测日益需要快速、灵敏且特异性强的分析技术。因此研发快速便携式的玉米赤霉烯酮高灵敏检测技术成为了亟须突破的方向。

电化学传感技术的发展和核酸适配体技术的使用为准确和快速的食品玉米赤霉烯酮检测提供了新的思路。核酸适配体是一种经过SELEX技术筛选出来单链核酸，具有精确和确定的三维结构，可以对目标化合物即离子，蛋白质，毒素，微生物和病毒具有高度特异性和选择性，并且解离常数与pM范围内的单克隆抗体相当。而在电化学传感领域，核酸适配体是作为一种生物识别元件，它可以连接到相应的靶标以实现直接的信号转导，诸如光学，电化学或压电感测形式。除此之外，核酸适配体还具有其他性质，例如构象变化对分析物的结合，对单个目标分析物和序列修饰的高度特异性等。目前，研究者将纳米技术与核酸适配体相结合来构建一种全新的电化学传感检测平台，使得检测平台具有更低的检测限、更高的灵敏度和更宽的检测范围，同时具备便携化、操作简单、成本低等特点。因此，基于以下理由我们拟利用核酸适配体和纳米材料构建一种新型生物传感器，用于粮食或饲料中玉米赤霉烯酮的快速、灵敏检测，旨在为霉菌毒素的检测技术研究提供新的思路。

核酸适配体与传统的抗体相比，其具有稳定性好，合成简单，批次间差异小，灵敏度高，适用性广，抗变性能力强，易于标记的优点，并且经SELEX筛选富集后，适体可以高亲和力和特异性地识别它们的目标，并且与抗体亲和力相当。由于这些性质，适配体作为抗体的优异替代品受到了广泛关注，并且它们已用于各种传感技术。基于核酸适配体的这些特性，我们将其玉米赤霉烯酮适配体固载与电极上，并设计与其部分配对的DNA单链作为信号探针与玉米赤霉烯酮适配体通过碱基配对进行识别结合，由于玉米赤霉烯酮与其核酸适配体的结合能力大于核酸适配体与信号探针的结合能力，当有玉米赤霉烯酮存在时与信号探针竞争识别适配体，传感器体系发生电信号的降低，即“信号关闭”，从而检测样品中玉米赤霉烯酮浓度。

在电化学分析技术中，优异的电信号放大材料可以提高检测的灵敏度、降低检测限，来满足对痕量物质的快速定量检测，所以设计一种优异且全新的信号放大复合材料至关重要。钯纳米颗粒(PdNP)和铂纳米颗粒(PtNP)作为传统信号增强剂，它们与生物分子具有优异的生物相容性，并且具有显着良好的电催化活性。然而，金属纳米粒子由于其高表面能而倾向于在催化过程中聚集。为了避免聚集，已经使用各种载体来稳定纳米颗粒。在这些载体中，作为更高组织结构的三维结构(例如纳米花)具有更高的表面积与体积比并且可以加载更多信号增强剂，进一步提高灵敏度电化学传感器。最近，3D花状纳米尺寸的金属-有机配位聚合物(MOCPs)，由于其在催化，发光，药物输送和生物传感等许多领域的应用而备受关注，尤其是含有铜(II)离子的有机配位聚合物由于其易于合成，优异的物理和化学性质而显示出有希望的应用前景。因此，本项目选择铜(II)离子和L-谷氨酸来合成全新的3D樱花形Cu@L-Glu MOCPs，它可以作为装载更多信号增强剂的优秀平台。3D花状片层结构Cu@L-Glu与双金属钯铂形成纳米复合材料后，充分结合两者的优点，可产生有效的电信号放大，从而提高传感器检测的灵敏度，降低检测限。

基于上述的思考，本项目旨在构建一个多元、协同的纳米传感界面，通过引入玉米赤霉烯酮适配体，以实现对玉米赤霉烯酮的高特异性识别和检测。在信号探针的制备上，将金属-有机配位聚合物与双金属钯铂结合，形成纳米复合材料，再与标记了巯基的探针反应，从而获得了具有电化学活性的信号探针。在传感界面的构建上，首先设计合成球形金-聚苯胺-金(Au-PANI-Au)纳米复合材料，将它作为固载基质修饰到玻碳电极上。之后通过金氨键的作用固载玉米赤霉烯酮适配体，然后再利用6-巯基己醇(MCH)来封闭非特异性结合位点，最后信号探针与适配体通过碱基互补配对特异性结合从而产生电信号，紧接着通过玉米赤霉烯酮与信号探针竞争结合玉米赤霉烯酮适配体，最终实现对玉米赤霉烯酮的高灵敏检测。

本项目建立了一种新型分析方法检测玉米赤霉烯酮，为玉米赤霉烯酮检测技术的研发提供实验依据，为食品和饲料中玉米赤霉烯酮污染的监测提供新思路和新技术平台。

发明内容：

1.本发明的目的是用于检测玉米赤霉烯酮的电化学生物传感器的制备方法与应用，为玉米赤霉烯酮检测技术的研发提供实验依据，为食品和饲料中玉米赤霉烯酮污染的监测提供新思路和新技术平台。其特征包括以下步骤：

(1)铜鳌合谷氨酸有机配位聚合物(Cu@Glu)-双金属钯铂(Pd-Pt NPs)-CP检测探针的制备；

(2)建立电化学生物传感器，测定玉米赤霉烯酮，绘制标准曲线。

2.本发明所述铁的铁铜铜鳌合谷氨酸有机配位聚合物(Cu@Glu)-双金属钯铂(Pd-Pt NPs)-CP复合物的制备过程具体包括以下步骤，其特征包括以下步骤：

(1)Cu@L-Glu纳米材料的制备：

首先，将10mg CuCl 2·2H 2 O和10mg L-Glu分散在5mL磷酸盐缓冲盐水(PBS，0.1M，pH 8.0)中，同时以300rpm搅拌12小时。随后，通过离心纯化所得溶液，并用超纯水洗涤三次，然后分散在1mL超纯水中以供进一步使用。

(2)Pd-Pt NPs纳米复合材料的制备：

首先将90μl H2PtCl6(5％)和119μl Na2PdCl4(5％)加入到10mL超纯水中。然后将10mL NaBH4溶液(0.28mg/mL)缓慢加入到复合溶液中，同时以400rpm搅拌1小时。之后，将混合物溶液以14,000rpm离心并用超纯水和乙醇重复洗涤三次。将最终制剂分散在2mL超纯水中以供进一步使用。

(3)Cu@L-Glu/Pd-PtNPs纳米复合材料的制备：

将50μl的Cu@L-Glu溶液溶解在2ml Pd-Pt NPs溶液中中并在300rpm下连续搅拌12小时来制备Cu@L-Glu/Pt-PdNP的纳米复合材料。随后，将制备的黑色溶液以6000rpm离心3分钟并用超纯水洗涤三次，并将所得的CuL-Glu/Pd-PtNP分散在1mL超纯水中以供进一步使用。

(4)Cu@L-Glu/Pd-PtNPs-CP复合物的制备：

首先将标记了巯基的Complementary DNA在使用前，在室温下在黑暗中放置2小时从而还原其二硫键。随后，将1mL制备的CuL-Glu/Pd-PtNP与200μl，4μM硫醇修饰的CP混合，并在4℃温和搅拌12小时。随后，将CuL-Glu/Pd-PtNPs-CP生物缀合物以8000rpm离心5分钟并用杂交溶液洗涤，然后将获得的CuL-Glu/Pd-PtNPs-CP生物缀合物分散在1mL杂交溶液中，储存在4℃保存。

3.根据权利要求1所述的建立电化学生物传感器，测定玉米赤霉烯酮浓度，绘制标准曲线，其特征在于包括以下步骤：

(1)分别用0.3和0.05mm的Al₂O₃粉末将电极抛光成镜面，然后分别按超纯水、无水乙醇、超纯水的顺序超声电极各5min，室温干燥备用；

(2)将10μl电极修饰材料金-聚苯胺-金(Au-PANI-Au)滴加在电极表面，室温干燥。

(3)将10μl，2μM的AP滴加在干燥后的电极表面(37℃，1.5h)。

(4)用超纯水将电极冲洗干净后滴加10μL，0.25mM的MCH溶液室温孵育30min。

(5)将上述MCH封闭后的电极冲洗干净后滴加10μl的Cu@L-Glu/Pd-PtNPs-CP复合物，37℃孵育2h。

(6)用超纯水将电极冲洗干净后，将不同浓度的玉米赤霉烯酮滴加在电极上并置于37℃孵育2h。

(7)将孵育后的电极用清洗缓冲液冲洗干净后置于氮气中干燥。

(8)将电极置于5mL，0.1M PBS(0.1M Na₂HPO₄，0.1M KH₂PO₄，0.1M KCl)中进行表征，每隔50s加入20μl，2.2M H₂O₂，测量其计时电流变化电流值。

(9)根据所得电流变化值与玉米赤霉烯酮浓度呈线性关系，绘制工作曲线。

与现有技术相比，本发明的一种定量检测玉米赤霉烯酮的电化学生物传感器的制备方法与应用，其突出的特点是：

(1)将基于Cu@L-Glu/Pd-Pt NPs的纳米复合材料作为信号探针引入到电化学生物传感器的制备中，不仅有效的提高了材料的催化性能，而且提高了生物分子的固载量，进而提高了电化学生物传感器的灵敏度和生物相容性；

(2)通过利用玉米赤霉烯酮适配体可对玉米赤霉烯酮进行特异性识别，确保了玉米赤霉烯酮检测的特异性

(3)本方法制备的电化学生物传感器可为重玉米赤霉烯酮提供新的定量检测方法，旨在为玉米赤霉烯酮检测技术的研发提供实验依据，为食品和饲料中玉米赤霉烯酮的监测提供新思路和新技术平台。

(4)使用完全相同的纳米材料和修饰方法，只需通过改变适配体的类型即可实现多种霉菌毒素的特异性，高灵敏检测，另外，此方法简便，快速，便于实现商品化，从而推进霉菌毒素污染物检测的发展。

附图说明：

图1为本发明的电化学生物传感器的构建示意图。

图2为本发明的信号探针不同合成步骤的投射电镜图和场发射扫描电镜图。EDS图和XPS图。

图3为本发明的电极修饰材料和信号探针的EDS图和XPS图。

图4为本发明的信号探针双金属信号机制比较和电化学生物传感器在检测玉米赤霉烯酮时得到的计时电流变化与浓度的线性关系，以及传感器的稳定性、重现性和特异性。

具体实施方式：

下面结合具体实施例对本发明进行进一步阐述，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

步骤1.将31.66mg的柠檬酸一水合物加入35mL的超纯水中。将溶液保持在80℃并加入170μl 5％HAuCl₄。当混合物的颜色从浅黄色变为粉红色时，加入100μl苯胺。随后，在80℃反应2分钟后，向该溶液中加入125μl 5％HAuCl4，然后加热5分钟。将该混合物溶液在室温下保持2小时。最后，通过离心纯化获得的金-聚苯胺-金(Au-PANI-Au)并用超纯水洗涤；

步骤2.分别用0.3和0.05μm的Al₂O₃粉末将电极抛光成镜面，然后分别按超纯水、无水乙醇、超纯水的顺序超声电极各5min，室温干燥备用；

步骤3.将10μL，电极修饰材料金-聚苯胺-金(Au-PANI-Au，2.4mg/mL)滴加在电极表面，室温干燥；

步骤4.用超纯水将电极冲洗干净后滴加10μL，2μM的AP滴加在干燥后的电极表面；

步骤5.用超纯水将孵育后的电极冲洗干净后滴加10μL，0.25mM的MCH溶液室温孵育30min；

步骤6.将上述MCH封闭后的电极冲洗干净后滴加10μl的Cu@L-Glu/Pd-PtNPs-CP复合物，37℃孵育2h；

步骤7.将孵育后的电极用清洗缓冲液冲洗干净后置于氮气中干燥；

步骤8.将电极置于5mL，0.1M PBS(0.1M Na₂HPO₄，0.1MKH₂PO₄，0.1M KCl)中进行表征，每隔50s加入20μL，2.2M H₂O₂，测量其计时电流变化电流值；

步骤9.根据所得电流变化值与玉米赤霉烯酮浓度呈线性关系，绘制工作曲线；测定结果表明玉米赤霉烯酮浓度在1fg/mL-100ng/mL范围内成线性关系，线性相关系数为0.9972，检测限为0.45fg/mL。

步骤10.将本发明上述传感器于4℃保存，间断检测传感器电流响应，储存28天后电流响应仍为初始电流的93.5％，表示传感器具有良好的稳定性；

步骤11.本发明取同一批次制备的生物传感器5支，在相同条件下对1ng/mL的玉米赤霉烯酮浓度分别进行测定，每一支电极测定3次，结果响应电流的相对标准偏差为1.59％，说明传感器差异小，传感器重现性良好。

步骤12.将本发明上述传感器用于在T-2毒素、赭曲霉毒素、黄曲霉毒素和伏马毒素存在下对玉米赤霉烯酮进行检测，结果干扰物的电流响应相对于玉米赤霉烯酮相差较大，说明传感器的特异性好，可以很好区分目标检测物。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提条件下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种用于粮食或饲料中玉米赤霉烯酮检测的电化学传感器制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)铜鳌合谷氨酸有机配位聚合物(Cu@Glu)-双金属钯铂(Pd-Pt NPs)-CP检测探针的制备；

(2)建立电化学生物传感器，测定玉米赤霉烯酮，绘制标准曲线。

2.根据权利要求1所述Cu@L-Glu/Pd-PtNPs-CP复合物的制备过程，其特征包括以下步骤：

(1)Cu@L-Glu纳米材料的制备：

首先，将10mg CuCl2·2H₂O和10mg L-Glu分散在5mL磷酸盐缓冲盐水(PBS，0.1M，pH8.0)中，同时以300rpm搅拌12小时。随后，通过离心纯化所得溶液，并用超纯水洗涤三次，然后分散在1mL超纯水中以供进一步使用。

(2)Pd-Pt NPs纳米复合材料的制备：

首先将90μl H₂PtCl₆(5％)和119μl Na₂PdCl₄(5％)加入到10mL超纯水中。然后将10mLNaBH₄溶液(0.28mg/mL)缓慢加入到复合溶液中，同时以400rpm搅拌1小时。之后，将混合物溶液以14,000rpm离心并用超纯水和乙醇重复洗涤三次。将最终制剂分散在2mL超纯水中以供进一步使用。

(3)Cu@L-Glu/Pd-PtNPs纳米复合材料的制备：

将50μl的Cu@L-Glu溶液溶解在2mlPd-Pt NPs溶液中中并在300rpm下连续搅拌12小时来制备Cu@L-Glu/Pt-PdNP的纳米复合材料。随后，将制备的黑色溶液以6000rpm离心3分钟并用超纯水洗涤三次，并将所得的CuL-Glu/Pd-PtNP分散在1mL超纯水中以供进一步使用。

(4)Cu@L-Glu/Pd-PtNPs-CP复合物的制备：

首先将标记了巯基的Complementary DNA在使用前，在室温下在黑暗中放置2小时从而还原其二硫键。随后，将1mL制备的CuL-Glu/Pd-PtNP与200μl，4μM硫醇修饰的CP混合，并在4℃温和搅拌12小时。随后，将CuL-Glu/Pd-PtNPs-CP生物缀合物以8000rpm离心5分钟并用杂交溶液洗涤，然后将获得的CuL-Glu/Pd-PtNPs-CP生物缀合物分散在1mL杂交溶液中。

3.根据权利要求1所述的建立电化学生物传感器，测定玉米赤霉烯酮浓度，绘制标准曲线，其特征在于包括以下步骤：

(1)分别用0.3和0.05μm的Al₂O₃粉末将电极抛光成镜面，然后分别按超纯水、无水乙醇、超纯水的顺序超声电极各5min，室温干燥备用；

(2)将10μL电极修饰材料金-聚苯胺-金(Au-PANI-Au)滴加在电极表面，室温干燥。

(3)将10μL，2μM的AP滴加在干燥后的电极表面(37℃，1.5h)。

(4)用超纯水将电极冲洗干净后滴加10μL，0.25mM的MCH溶液室温孵育30min。

(5)将上述MCH封闭后的电极冲洗干净后滴加10μL的Cu@L-Glu/Pd-PtNPs-CP复合物，37℃孵育2h。

(6)用超纯水将电极冲洗干净后，将不同浓度的玉米赤霉烯酮滴加在电极上并置于37℃孵育2h。

(7)将孵育后的电极用清洗缓冲液冲洗干净后置于氮气中干燥。

(8)将电极置于5mL，0.1M PBS(0.1M Na₂HPO_4x0.1M KH₂PO₄，0.1M KCl)中进行表征，每隔50s加入20μL，2.2M H₂O₂，测量其计时电流变化电流值。

(9)根据所得电流变化值与玉米赤霉烯酮浓度呈线性关系，绘制工作曲线。