CN114606304A - 一种高灵敏检测真菌毒素玉米赤霉烯酮的生物传感器 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高灵敏检测真菌毒素玉米赤霉烯酮的生物传感器，该生物传感器基于三条组合发夹探针、一条底物链和一条酶链实现ZEN的快速定性和/或定量检测。本发明中的玉米赤霉烯酮生物传感器检测系统能够准确的智能化检测待测样品中是否含有ZEN并准确定量ZEN浓度，且特异性好，对于其他真菌毒素等类似物均不会产生假阳性。而且该检测方法灵敏度高，检出限可达0.17pM，相比于常规的检测技术更加灵敏，且检测方法简单易行，无需大型仪器，检测成本低。

Description

一种高灵敏检测真菌毒素玉米赤霉烯酮的生物传感器
技术领域
本发明属于分析检测领域，具体涉及一种高灵敏检测真菌毒素玉米赤霉烯酮的生物传感器。
背景技术
玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)是一种真菌毒素，由瘤痤孢科镰刀菌属真菌产生。英文，缩写或ZEA、ZON，又称F-2毒素。镰刀菌也叫镰孢菌，是一类能让植物得病的真菌。玉米赤霉烯酮最早从患赤霉病的玉米中分离而得名，小麦、大麦、水稻、小米和燕麦等谷物中都可找到。根据相关技术中的调查显示，全球有30-40％的谷物被ZEN污染，其中，以玉米作为主。根据调查结果显示，玉米的阳性检出率约为45％，小麦的检出率约为20％，水稻的检出率约为25.4％，其中，以稻壳、米糠和糙米中含量较多，而碾磨后的精米较少。
玉米赤霉烯酮的危害性较强，早在1926年，ZEN被发现具有雌激素样作用，可使家畜，家禽和实验动物发生雌激素亢进症。例如猪吃了被ZEN污染的玉米后，生殖器官和行为会出现异常。可引起发情周期紊乱、流产死胎、假孕不育、受孕率低等问题。而其他动物在妊娠期食用了含ZEN的食物，也容易引起流产、死胎和畸胎。而且，玉米赤霉烯酮的来源并不局限于真菌，不仅真菌能产生ZEN，很多高等植物也可产生。ZEN和赤霉素一样，也是植物的天然的生长调节剂，而且在花期产生较多。草食动物如果大量吃处于花期的新鲜牧草，也同样有可能会导致玉米赤霉烯酮中毒，从而为养殖户带来经济损失。
而且，ZEN一旦通过食物链进入人体，同样会带来极为严重的健康问题，引起恶心、发冷、头痛、抑郁和走路不稳等中毒症状。ZEN化学结构稳定，不易分解。它的耐热性较强，110℃下处理1小时才能基本破坏。而且还耐酸、耐碱。因此，食物中的ZEN仅仅靠煮熟很难去除干净，原粮脱ZEN更是技术难题。基于此，能够快速高效准确的检测ZEN，并能够实现精准定量的方法对于防控ZEN具有极为重要的意义。
相关技术中，用于检测真菌毒素的方法主要包括：高效液相色谱法(HPLC)、薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)和液相色谱串联质谱法(LC-MS)等。但这些方法均存在较为难以克服的缺陷性，如需要大型仪器检测，从而检测成本高昂，而且这些检测方法受到仪器本身的限制，相对耗时，无法满足其智能化高效检测的要求。因此，迫切需要开发一种更加简易易行且检测精准的ZEN检测新方法，将对于食品安全以及人身健康都具有极为重要的意义。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种用于检测玉米赤霉烯酮真菌毒素的生物传感器及其应用。该生物传感器基于三条组合发夹探针、一条底物链和一条酶链实现ZEN的快速定性和/或定量检测，检测效果稳定，检测精度高，检出限低，具有极好的实际应用价值。
本发明的第一个方面，提供一种玉米赤霉烯酮检测试剂。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述发夹探针组由发夹探针A、发夹探针B和发夹探针C组成。
在本发明的一些优选实施方式中，所述发夹探针A中含有ZEN核酸适配体序列和互补序列1；所述发夹探针B中含有互补序列2；所述发夹探针C中含有互补序列3。
所述互补序列1与所述互补序列2中的碱基互补配对；所述互补序列3与所述互补序列2中的碱基互补配对；所述互补序列1与所述互补序列2中的碱基互补配对数小于所述互补序列3与所述互补序列2中的碱基互补配对数。
在本发明的一些优选实施方式中，所述发夹探针A～C的核苷酸序列分别为：
发夹探针A：
Figure BDA0003499130940000021
Figure BDA0003499130940000022
发夹探针B：5'-GGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCCCATGTATCGAGCTCCCTTTACGCCTGTGT-3'(SEQ ID NO.2)；
发夹探针C：5'-TGTGTGTGTGTAAGGGAGCTCGATACATGGGCTCCCTTTACGCCCCATGTATCGA-3'(SEQ ID NO.3)。
其中，发夹探针A中的斜体部分为ZEN的核酸适体的序列，加粗且下划线部分与发夹探针B的部分序列互补配对。
本发明的第二个方面，提供一种玉米赤霉烯酮检测试剂盒。
根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述玉米赤霉烯酮检测试剂盒中含有本发明第一个方面中所述的玉米赤霉烯酮检测试剂、酶链和底物链。
在本发明的一些优选实施方式中，所述酶链的核苷酸序列为：酶链DNA1：5'-ACACAGGCGTAGACTCCGAGCCGGACGAAGTTACCCACACCCC-3'(SEQ ID NO.4)。
在本发明的一些优选实施方式中，所述底物链的核苷酸序列为：底物链DNA2：5'-TCGATACATGGAACTrAGGTCACACACACACA-3'(SEQ ID NO.5)。
在本发明的一些优选实施方式中，所述底物链中的rA代表核酸A修饰，作为酶切位点。
在本发明的一些优选实施方式中，所述底物链上修饰有荧光基团和淬灭基团，所述荧光基团和淬灭基团分别修饰于酶切位点的对立两侧。
在本发明的一些优选实施方式中，所述荧光基团修饰于所述底物链中的第19位碱基T(5’-3’)，所述淬灭基团修饰于所述底物链中的第9位碱基T(5’-3’)。
在本发明的实施例中，所述荧光基团为BHQ2，所述淬灭基团为TAMRA。
当然，本领域技术人员可以根据实际使用需求，将荧光基团TAMRA和淬灭基团BHQ2合理替换为其他荧光基团和淬灭基团，以实现荧光标记的效果。
本发明的第三个方面，提供本发明第一个方面所述的玉米赤霉烯酮检测试剂或本发明第二个方面所述的玉米赤霉烯酮检测试剂盒在食品安全检测中的应用。
本发明的第四个方面，提供一种玉米赤霉烯酮的定性和/或定量检测方法，包括如下步骤：
(1)将本发明第一个方面中的发夹探针A～C加热至92～95℃，然后冷却至室温，使其形成发夹结构；
(2)将检测样品、形成发夹结构的发夹探针A～C、本发明第二个方面中的酶链DNA1和本发明第二个方面中的底物链DNA2在25±2℃条件下孵育90～95min，检测荧光信号。
根据本发明的第四个方面，在本发明的一些实施方式中，所述检测样品为食品。
根据本发明的第四个方面，在本发明的一些实施方式中，所述检测方法的检测体系为：
组分 终含量
检测样品 8～12μL
发夹探针A 200～300nM
发夹探针B 200～300nM
发夹探针C 400～600nM
酶链DNA1 200～300nM
底物链DNA2 200～300nM
镁离子(氯化镁) 8～12mM
ddH<sub>2</sub>O 补至100μL
在本发明的一些优选实施方式中，所述检测方法的检测体系为：
Figure BDA0003499130940000031
Figure BDA0003499130940000041
所述检测方法的检测原理为：
当检测样品中含有ZEN时，ZEN会致使发夹探针A变回线性结构，并使恢复了线性结构的发夹探针A中的核酸适体序列重新与ZEN结合，形成ZEN-A复合物，而发夹探针A中的未与ZEN结合的部分会与体系中的发夹探针B的部分序列互补结合，使发夹探针B也恢复为线性结构。而发夹探针B中未参与ZEN-A复合物结合的部分，则会进一步与体系中的发夹探针C互补结合。而由于发夹探针C与发夹探针B的序列互补数量要多于ZEN-A复合物与发夹探针B的序列互补数量，因此，基于竞争性优势，发夹探针B会与ZEN-A复合物断开，并与发夹探针C结合，形成双链BC复合体，启动后续的酶链DNA1、底物链DNA2介导的催发发夹组装。
双链BC复合体与酶链DNA1、底物链DNA2协同杂交形成超分子复合物[B/C/DNA1/DNA2]n。而当体系中存在镁离子时，超分子复合物[B/C/DNA1/DNA2]n会水解底物链DNA2，导致淬灭基团和荧光基团分离，当反应体系在570～700nm波长存在荧光光谱则说明检测样品中含有玉米赤霉烯酮，根据玉米赤霉烯酮标准曲线和反应体系的荧光强度可定量待测样品中的玉米赤霉烯酮浓度。
而当检测样品中不含有ZEN时，发夹探针A不会解开发卡结构，从而也无法使发夹探针B恢复为线性结构，进而发夹探针B无法进一步与发夹探针C反应，也无法最终形成双链BC复合体，无法启动后续的催发发夹组装过程，淬灭基团和荧光基团不会分开，即体系中不会产生荧光。
本发明的有益效果是：
1.本发明提供了一种ZEN检测试剂和检测试剂盒，该检测试剂盒检测试剂盒基于催化发夹组装驱动的DNAzyme，能够准确的智能化检测待测样品中是否含有ZEN并准确定量ZEN浓度，且特异性好，对于其他真菌毒素等类似物均不会产生假阳性。
2.本发明中的ZEN检测方法灵敏度高，检出限可达0.17pM，相比于常规的检测技术更加灵敏，且检测方法简单易行，无需大型仪器，检测成本低。
附图说明
图1为本发明实施例中的玉米赤霉烯酮生物传感器检测系统的检测原理示意图。
图2为使用本发明实施例中的玉米赤霉烯酮生物传感器检测系统检测不同真菌毒素的特异性检测结果。
图3为使用本发明实施例中的玉米赤霉烯酮生物传感器检测系统检测不同浓度ZEN的检测结果。
图4为使用本发明实施例中的玉米赤霉烯酮生物传感器检测系统检测不同浓度ZEN标准品稀释液的检测结果。
图5为使用本发明实施例中的玉米赤霉烯酮生物传感器检测系统检测不同浓度ZEN标准品稀释液的荧光强度-Lg浓度值关系图。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
玉米赤霉烯酮生物传感器检测系统
在本实施例中的用于检测玉米赤霉烯酮的生物传感器检测系统，其主要基于催化发夹组装驱动的DNAzyme构建得到，从而实现玉米赤霉烯酮的快速、高灵敏、定量化检测。
本实施例中的用于检测玉米赤霉烯酮的生物传感器检测系统主要包括：发夹探针组(由3个发夹探针A-C组成)、酶链组(DNA1)和底物链组(DNA2)。
其中，发夹探针组由3个发夹探针(发夹探针A、发夹探针B、发夹探针C)组成。
上述3个发夹探针的核苷酸序列如下所示：
发夹探针A：
Figure BDA0003499130940000051
Figure BDA0003499130940000052
发夹探针B：5'-GGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCCCATGTATCGAGCTCCCTTTACGCCTGTGT-3'(SEQ ID NO.2)；
发夹探针C：5'-TGTGTGTGTGTAAGGGAGCTCGATACATGGGCTCCCTTTACGCCCCATGTATCGA-3'(SEQ ID NO.3)。
其中，发夹探针A中的斜体部分为ZEN的核酸适体的序列，加粗且下划线部分与发夹探针B的部分序列互补配对。
酶链组由1条酶链(DNA1)组成，其核苷酸序列为：
酶链DNA1：5'-ACACAGGCGTAGACTCCGAGCCGGACGAAGTTACCCACACCCC-3'(SEQ IDNO.4)。
底物链组由1条底物链(DNA2)组成，其核苷酸序列为：
底物链DNA2：5'-TCGATACATGGAACT(BHQ2)rAGGT(TAMRA)CACACACACACA-3'(SEQ IDNO.5)。
其中，底物链中，T(BHQ2)为T碱基上修饰淬灭基团BHQ2；rA代表核酸A修饰，为酶切位点；T(TAMRA)为T碱基上修饰荧光基团TAMRA。
玉米赤霉烯酮生物传感器检测系统的使用方法
上述实施例中的玉米赤霉烯酮生物传感器检测系统可对样品中的玉米赤霉烯酮进行准确的定量检测，具体检测步骤如下：
(1)试验材料的准备与前处理：
将发夹探针组(发夹探针A-C)在Tris-HCl缓冲液(pH 8.0，120mM NaCl,10mMMgCl2,5mM KCl,20mM CaCl2)中加热至95℃，持续5min，然后冷却至室温，即可得到具有发夹结构的发夹探针组。
(2)玉米赤霉烯酮的定量检测：
将检测样品、上述发夹探针组、酶链组、底物链在室温(25±2℃)下孵育90min(反应体系如表1所示)，记录570～700nm(本实施例为585nm)波长(Ex＝545nm，Em＝585nm)下的荧光信号，根据荧光信号实现检测样品中的玉米赤霉烯酮的定量分析。
表1
组分 终含量
检测样品 10μL
发夹探针A 250nM
发夹探针B 250nM
发夹探针C 500nM
酶链DNA1 250nM
底物链DNA2 250nM
镁离子(氯化镁) 10mM
ddH<sub>2</sub>O 补至100μL
玉米赤霉烯酮生物传感器检测系统的检测原理示意图如图1所示。
当检测样品中含有ZEN时，ZEN会致使发夹探针A变回线性结构，并使恢复了线性结构的发夹探针A中的核酸适体序列重新与ZEN结合，形成ZEN-A复合物，而发夹探针A中的未与ZEN结合的部分会与体系中的发夹探针B的部分序列互补结合，使发夹探针B也恢复为线性结构。而发夹探针B中未参与ZEN-A复合物结合的部分，则会进一步与体系中的发夹探针C互补结合。而由于发夹探针C与发夹探针B的序列互补数量要多于ZEN-A复合物与发夹探针B的序列互补数量，因此，基于竞争性优势，发夹探针C会与ZEN-A复合物断开，并与发夹探针C结合，形成双链BC复合体，启动后续的酶链DNA1、底物链DNA2介导的催发发夹组装。
双链BC复合体与酶链DNA1、底物链DNA2协同杂交形成超分子复合物[B/C/DNA1/DNA2]n。而当体系中存在镁离子时，超分子复合物[B/C/DNA1/DNA2]n会水解底物链DNA2，导致淬灭基团和荧光基团分离，当反应体系在570～700nm波长存在荧光光谱则说明检测样品中含有玉米赤霉烯酮，根据玉米赤霉烯酮标准曲线和反应体系的荧光强度可定量待测样品中的玉米赤霉烯酮浓度。
而当检测样品中不含有ZEN时，发夹探针A不会解开发卡结构，从而也无法使发夹探针B恢复为线性结构，进而发夹探针B无法进一步与发夹探针C反应，也无法最终形成双链BC复合体，无法启动后续的催发发夹组装过程，淬灭基团和荧光基团不会分开，即体系中不会产生荧光。
玉米赤霉烯酮生物传感器检测系统的使用效果
(1)特异性(选择性)检测：
为了评估上述玉米赤霉烯酮生物传感器检测系统的特异性，发明人分别以ZEN标准品、水(空白对照)、黄曲霉毒素B1(AFB1)标准品、赭曲霉毒素A(OTA)标准品、黄曲霉毒素M1(AFM1)标准品、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(呕吐毒素，DON)、互隔交链孢霉素(altenuene，ALT)作为检测样品(浓度均为1nM)进行测试。上述标准品均购自Sigma Aldrich(中国上海)。
具体检测步骤为：
将发夹探针组(发夹探针A-C)在Tris-HCl缓冲液(pH 8.0，120mM NaCl,10mMMgCl2,5mM KCl,20mM CaCl2)中加热至95℃，持续5min，然后冷却至室温，即可得到具有发夹结构的发夹探针组。将上述检测样品分别与上述发夹探针组、酶链组、底物链在室温(25±2℃)下孵育90min(反应体系如表1所示)，记录570～700nm波长(Ex＝545nm，Em＝585nm)下的荧光信号。
结果如图2所示。
可以发现，使用上述实施例中的检测系统，ZEN标准品与其他毒素样品的荧光强度存在显著差异，且其他毒素样品的荧光强度与空白对照并无显著差异性，从而能够说明上述实施例中的检测系统对于ZEN的检测具有极好的选择性。
(2)灵敏度：
为了检测上述玉米赤霉烯酮生物传感器检测系统的灵敏度，发明人分别选择了不同浓度(0、1pM、10pM、100pM、1nM、10nM和100nM)的ZEN标准品作为样品进行检测。
具体检测步骤为：
将发夹探针组(发夹探针A-C)在Tris-HCl缓冲液(pH 8.0，120mM NaCl,10mMMgCl2,5mM KCl,20mM CaCl2)中加热至95℃，持续5min，然后冷却至室温，即可得到具有发夹结构的发夹探针组。将上述不同浓度的检测样品分别与上述发夹探针组、酶链组、底物链在室温(25±2℃)下孵育90min(反应体系如表1所示)，记录570～700nm波长(Ex＝545nm，Em＝585nm)下的荧光信号。
结果如图3所示。
可以发现，使用上述实施例中的检测系统对ZEN标准品进行检测，从1pM到1nM呈良好的线性关系。检测限为0.17pM(S/N＝3)。说明本发明实施例中的玉米赤霉烯酮生物传感器检测系统对于玉米赤霉烯酮的检测具有极高的灵敏度。
为了进一步验证上述玉米赤霉烯酮生物传感器检测系统的检测有效性，发明人以不同浓度(稀释液采用上述实施例中的Tris-HCl缓冲液，溶液中的玉米赤霉烯酮终浓度为0，2×103，4×103，6×103，8×103和1×104pM)的玉米赤霉烯酮标准品为检测对象使用玉米赤霉烯酮生物传感器检测系统进行检测。
具体检测步骤为：
将发夹探针组(发夹探针A-C)在上述实施例中的Tris-HCl缓冲液中加热至95℃，持续5min，然后冷却至室温，即可得到具有发夹结构的发夹探针组。将不同浓度的玉米赤霉烯酮稀释液作为检测样品分别与上述发夹探针组、酶链组、底物链在室温(25±2℃)下孵育90min(反应体系如表1所示)，记录570～700nm波长(Ex＝545nm，Em＝585nm)下的荧光信号。
结果如图4～5所示。
可以发现，上述玉米赤霉烯酮生物传感器检测系统对于不同浓度的玉米赤霉烯酮稀释液均能显示出阳性反应，且荧光强度与Lg浓度值关系呈现正相关关系。
玉米赤霉烯酮生物传感器检测系统的实际检测效果
在本实施例中，发明人以市售白葡萄酒(购自中国广州的当地超市中)作为基础材料，将不同浓度(100pM、1nM和10nM)的ZEN加入至葡萄酒样品中，分别使用上述实施例中的玉米赤霉烯酮生物传感器检测系统和液相色谱-质谱(LC-MS/MS)方法对加标样品进行进一步定量检测。
结果如表2所示。
表2
Figure BDA0003499130940000091
其中，a表示表中报告的数据代表五次测量的平均值。
b表示玉米赤霉烯酮生物传感器检测系统vs LC-MC/MS方法。
从表2中可以发现，使用上述实施例中的玉米赤霉烯酮生物传感器检测系统能够有效检测出100pM～10nM的玉米赤霉烯酮，且RSD均小于6.5％。且对比现有技术中的公认的检测效果最为准确的方法之一的LC-MC/MS，其相对误差的绝对值小于7％。尤其是在10nM的浓度下，相对误差的绝对值可以达到3.8％，说明上述实施例中的玉米赤霉烯酮生物传感器检测系统具有极好的检测效果。
此外，对比上述实施例中的玉米赤霉烯酮生物传感器检测系统与LC-MS/MS方法在检测成本以及检测时间上的差异，可以发现上述实施例中的玉米赤霉烯酮生物传感器检测系统在检测时间上远胜于LC-MS/MS方法，且由于上述实施例中的玉米赤霉烯酮生物传感器检测系统无需在大型仪器中进行，因此，也有效降低了检测成本，降低了检测人员的专业度。
玉米赤霉烯酮生物传感器检测系统与现有检测技术的对比
为了进一步体现上述实施例中的玉米赤霉烯酮生物传感器检测系统的高灵敏度检测效果，发明人分别参考不同文献中的ZEN定量检测方法进行对比测试，结果如表3所示。
表3
Figure BDA0003499130940000092
Figure BDA0003499130940000101
参考文献1为：Tian,F.；Zhou,J.；Jiao,B.；He,Y.A nanozyme-based cascadecolorimetric aptasensor for amplified detection of ochratoxin A.Nanoscale2019,11,9547-9555.。
参考文献2为：Zhang,X.；Zhi,H.；Zhu,M.；Wang,F.；Meng,H.；Feng,L.Electrochemical/visual dual-readout aptasensor for ochratoxin Adetectionintegrated into a miniaturized paper-based analyticaldevice.Biosens.Bioelectron.2021,180,113146.。
参考文献3为：Wang,S.；Zhang,Y.；Pang,G.；Zhang,Y.；Guo,S.Tuning theaggregation/disaggregation behavior of graphene quantum dots by structure-switching aptamer for high-sensitivity fluorescent ochratoxin Asensor.Anal.Chem.2017,89,1704-1709.。
参考文献4为：Wang,Z.；Yu,H.；Han,J.；Xie,G.；Chen,S.Rare Co/Fe-MOFsexhibiting high catalytic activity in electrochemical aptasensors forultrasensitive detection of ochratoxin A.Chem.Commun.2017,53,9926-9929.。
从检测时间和检测成本上考量，结合检测限和线性范围，可以发现，上述实施例中的玉米赤霉烯酮生物传感器检测系统相对于目前现有的玉米赤霉烯酮检测技术具有更高的技术优势和实际可用性(检出限更低)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省科学院生态环境与土壤研究所
<120> 一种高灵敏检测真菌毒素玉米赤霉烯酮的生物传感器
<130>
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcatctatct atggtacatt actatctgta atgtgatatg gctcccttta cgccacccac 60
acgatag 67
<210> 2
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggggtgtggg tggcgtaaag ggagcccatg tatcgagctc cctttacgcc tgtgt 55
<210> 3
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgtgtgtgtg taagggagct cgatacatgg gctcccttta cgccccatgt atcga 55
<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
acacaggcgt agactccgag ccggacgaag ttacccacac ccc 43
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tcgatacatg gaactaggtc acacacacac a 31

Claims (10)

1.一种玉米赤霉烯酮检测试剂，其特征在于，所述试剂中含有发夹探针组，所述发夹探针组由发夹探针A、发夹探针B和发夹探针C组成；
所述发夹探针A中含有ZEN核酸适配体序列和互补序列1；
所述发夹探针B中含有互补序列2；
所述发夹探针C中含有互补序列3；
所述互补序列1与所述互补序列2中的碱基互补配对；
所述互补序列3与所述互补序列2中的碱基互补配对；
所述互补序列1与所述互补序列2中的碱基互补配对数小于所述互补序列3与所述互补序列2中的碱基互补配对数。
2.根据权利要求1所述的玉米赤霉烯酮检测试剂，其特征在于，所述发夹探针A～C的核苷酸序列分别为：
发夹探针A：5'-TCATCTATCTATGGTACATTACTATCTGTAATGTGATATGGCTCCCTTTACGCCACCCACACGATAG-3'(SEQ ID NO.1)；
发夹探针B：5'-GGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCCCATGTATCGAGCTCCCTTTACGCCTGTGT-3'(SEQ ID NO.2)；
发夹探针C：5'-TGTGTGTGTGTAAGGGAGCTCGATACATGGGCTCCCTTTACGCCCCATGTATCGA-3'(SEQ ID NO.3)。
3.一种玉米赤霉烯酮检测试剂盒，其特征在于，所述玉米赤霉烯酮检测试剂盒中含有权利要求1～2中任一项所述的玉米赤霉烯酮检测试剂、酶链和底物链。
4.根据权利要求3所述的玉米赤霉烯酮检测试剂盒，其特征在于，所述所述酶链的核苷酸序列为：
酶链DNA1：5'-ACACAGGCGTAGACTCCGAGCCGGACGAAGTTACCCACACCCC-3'(SEQ ID NO.4)。
5.根据权利要求3所述的玉米赤霉烯酮检测试剂盒，其特征在于，所述底物链的核苷酸序列为：
底物链DNA2：5'-TCGATACATGGAACTrAGGTCACACACACACA-3'(SEQ ID NO.5)；其中，rA代表核酸A修饰。
6.根据权利要求5所述的玉米赤霉烯酮检测试剂盒，其特征在于，所述底物链上修饰有荧光基团和淬灭基团，所述荧光基团和淬灭基团分别修饰于酶切位点的对立两侧。
7.根据权利要求1～2任一项所述的玉米赤霉烯酮检测试剂或权利要求3～6任一项所述的玉米赤霉烯酮检测试剂盒在食品安全检测中的应用。
8.一种玉米赤霉烯酮的定性和/或定量检测方法，包括如下步骤：
(1)将权利要求1或2中的发夹探针A～C加热至92～95℃，然后冷却至室温，使其形成发夹结构；
(2)将检测样品、形成发夹结构的发夹探针A～C、权利要求4中的酶链DNA1和权利要求5中的底物链DNA2在25±2℃条件下孵育90～95min，检测荧光信号。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述检测样品为食品。
10.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法的检测体系为：
组分 终含量 检测样品 8～12μL 发夹探针A 200～300nM 发夹探针B 200～300nM 发夹探针C 400～600nM 酶链DNA1 200～300nM 底物链DNA2 200～300nM 镁离子(氯化镁) 8～12mM ddH<sub>2</sub>O 补至100μL
。
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